Abstract
Synaptiske vesikler frigive neurotransmittere ved kemiske synapser gennem en dynamisk cyklus af fusion og genfinding. Overvågning synaptisk aktivitet i realtid og dissekere de forskellige trin i exo-endocytose på enkelt-vesikel niveau er afgørende for forståelsen af synaptiske funktioner i sundhed og sygdom.
Genetisk kodede pH-følsomme sonder direkte målrettet til synaptiske vesikler og total intern refleksion Fluorescens mikroskopi (TIRFM) giver den spatio-temporale opløsning nødvendigt at følge vesikel dynamik. Den flygtige felt genereret af total intern refleksion kan kun excitere fluorophorer anbragt i et tyndt lag (<150 nm) over glasafdækning som adhærerer, præcis hvor processerne exo-endocytose finde sted. De resulterende billeder med høj kontrast er velegnet til vesikler sporing og kvantitativ analyse af fusion begivenheder.
I denne protokol, SH-SY5Y human neuroblastoma celler foreslås som et værdifuldt model til at studere neurotransmitterfrigivelse på enkelt-vesikel niveau ved TIRFM grund af deres flad overflade og tilstedeværelse af dispergerede vesikler. Metoderne til dyrkning SH-SY5Y som klæbende celler og for transfektion dem med synapto-pHluorin er forudsat, samt teknikken til at udføre TIRFM og billeddannelse. Endelig er en strategi, der sigter mod at vælge, tælle, og analysere Fusion begivenheder på hel-celle og enkelt vesikel niveauer præsenteres.
For at validere imaging procedure og dataanalyse tilgang, er dynamikken i pHluorin-mærkede vesikler analyseret under hvile og stimuleret (depolariserende kaliumkoncentrationer) betingelser. Membrandepolarisering øger hyppigheden af fusionsbegivenheder og forårsager en parallel raise netmaskerne fluorescenssignal optaget i hele celler. Single-vesikel analyse viser modifikationer af fusion-event adfærd (øget peak højde og bredde). Disse data tyder på thpå kalium depolarisering ikke kun inducerer en massiv neurotransmitterfrigivelse men også ændrer mekanisme vesikelfusion og genanvendelse.
Med passende fluorescerende probe, kan denne teknik anvendes i forskellige cellulære systemer til at dissekere de mekanismer, konstitutiv og stimuleret sekretion.
Introduction
Kemisk synaptisk transmission mellem neuroner er en vigtig mekanisme for kommunikation i nervesystemet. Den er afhængig af frigivelse af neurotransmittere gennem en dynamisk cyklus af vesikelfusion og hentning på den præsynaptiske sted. Mange af de involverede i vesikel dynamik proteiner er blevet identificeret; men deres bidrag til fænomenet uafklaret 1.
Vores forståelse er delvist begrænset af, at de mest anvendte assays for exo / endocytose er ikke altid den mest hensigtsmæssige. Adskillige undersøgelser vedrørende vesikelfusion og dynamik afhængige elektrofysiologiske teknikker. Denne teknik giver en optimal tidsmæssig opløsning og er fremragende til at undersøge den indledende fusion af vesikler til plasmamembranen, men er ude af stand til at detektere mange af de underliggende molekylære begivenheder, der understøtter præsynaptiske funktion. Elektronmikroskopi, på den anden side tilvejebringer den fineste morphological beskrivelse af hver ental skridt, men det dynamiske aspekt af begivenheden kan ikke lagres, fordi prøverne skal fastsættes for at blive analyseret.
Fremkomsten af nye optiske optagelse teknikker 2,3, kombineret med fremskridt inden for fluorescerende molekylære prober udvikling 4-6, muliggør visualisering af eksocytiske processer i levende celler, hvilket giver nye niveauer af information om den synaptiske struktur og funktion.
Indledende undersøgelser udnyttede aktivitet-afhængige styrylfarvestoffer (FM1-43 og beslægtede organiske farvestoffer) 7,8. State-of-the-art billeddiagnostiske teknikker ansætte pH-følsomme varianter af grønt fluorescerende protein (GFP) (pHluorin) tøjret til luminale blærer proteiner 9. Disse prober normalt slukket, når til stede i vesiklerne på grund af den lave luminale pH. Efter fusion med plasmamembranen, er vesiklen indre udsat for neutral ekstracellulære rum, pH brat stiger, lindrer proton-afhængige quenching af pHluorin og det fluorescerende signal hurtigt frem. Som ændringen i pHluorin er hurtigere end fusion begivenhed, ved at overvåge fluorescens stiger, kan måles og analyseres vesikelfusion med membranen. Fordi overfladen pHluorin-mærkede molekyler endocytoseres, fluorescenssignalet efterfølgende vender tilbage til basisniveauet, derfor den samme konstruktion kan også anvendes til at overvåge vesikel genanvendelse 9.
Mens vesikel-mærkede pH-sensor sikrer visualisering kun af disse blærer, der virkelig fusionere med plasmamembranen, er billedbehandling ved høj rumlig og tidsmæssig opløsning kræves for at beskrive i detaljer de trin, der er involveret i exo / endocytiske processer. Den optiske teknik, der giver den nødvendige spatio-temporale opløsning er total intern refleksion fluorescensmikroskopi (TIRFM), en anvendelse af fluorescensmikroskopi 10.
"> Samlet indre refleksion opstår ved grænsefladen mellem glasset cover-slip og prøven. Når lysbanen når glasdæksel-slip med en hændelse vinkel større end den kritiske vinkel, er excitationslyset ikke overføres til prøven, men er fuldstændigt reflekteret tilbage. Under disse betingelser en flygtige lys bølgeformer ved grænsefladen og udbreder i mediet med mindre optisk tæthed (prøven). Da intensiteten af det flygtige felt henfalder eksponentielt med afstanden fra grænsefladen (med en indtrængningsdybde ca. 100 nm) kun fluoroforer i nærmeste nærhed til cover-slip kan exciteres mens dem længere væk fra grænsen er ikke. I celler transficeret med GFP-konstruktioner, denne dybde svarer til proteiner udtrykt på plasmamembranen eller i vesikulære strukturer nærmer det. Som fluoroforer i cellens indre ikke kan exciteres, er baggrundsfluorescens minimeres, og et billede med et meget højt signal / baggrund rotteio dannes 11.Flere egenskaber gør TIRFM teknikken med valg til overvågning vesikler dynamik. Den perfekte kontrast og høj signal-til-støj-forholdet muliggør påvisning af meget lave signaler stammer fra enkelte vesikler. Chip-baserede billedoptagelse i hver ramme giver den tidsmæssige opløsning er nødvendige for at detektere meget dynamiske processer. Endelig er minimal eksponering af celler for lys på noget andet plan i prøven kraftigt reducerer fototoksicitet og muliggør langvarig tidsforskudt optagelse 12.
Dataanalyse fortsat det mest udfordrende og afgørende aspekt af denne teknik. Den enkleste måde at overvåge vesikelfusion er at måle akkumulering af reporter fluorescerende proteiner på celleoverfladen, over tid 13. Som fusionsproteiner stiger, netto fluorescenssignal stiger såvel. Imidlertid kan denne metode undervurdere processen, især i store celler og i hviletilstande,fordi endocytose og fotoblegning processer opveje stigningen i fluorescensintensitet grund vesikel exocytose. En alternativ metode er at følge hver begivenhed enkelt fusion 14. Denne sidstnævnte fremgangsmåde er meget følsom og kan afsløre vigtige oplysninger om mekanismerne fusion. Men det kræver manuel udvælgelse af enkelte begivenheder, fordi helt automatiske procedurer til at følge vesikler og registrere udsving i deres fluorescerende signaler er ikke altid tilgængelige. Observation af vesikel dynamik kræver prøveudtagning celler ved høj frekvens. Dette genererer en stor mængde data, der næppe kan analyseres manuelt.
Forslaget med dette oplæg er at optimere TIRFM imaging teknik til overvågning af basal og stimuleret neurotransmitterfrigivelse i SH-5YSY neuroblastomcellelinje, og beskrive, trin-for-trin, en procedure udviklet i laboratoriet for at analysere data, både ved hel-celle og enkelt vesikel niveauer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cellekultur og transfektion
- SH-SY5Y cellekultur
BEMÆRK: Forsøgene er blevet udført under anvendelse af den humane neuroblastom SH- SY5Y (ATCC # CRL-2266) 15. SH-SY5Y-celler vokser som en blanding af flydende klynger og adhærente celler. Følg anvisningerne rapporteret i protokollen (celletæthed, splitting forhold osv.) For at have celler, der vokser solidt fastgjort til glas dækning, som er afgørende for TIRFM.- Før start under laminar strømning biosikkerhed kabinet, gør det rette volumen sterilt phosphatbuffer saltopløsning (PBS) og dyrkningsmedium.
- Lav 50 ml PBS med koncentrationer på 150 mM NaCl, 24 mM phosphatbuffer, pH 7,4. Opløsningen filtreres.
- Lav 50 ml celle medium fra Dulbeccos modificerede Eagle medium (DMEM) med højt glucoseindhold, 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum (FBS), penicillin (100 U / ml), streptomycin (100 ug / ml), L-glutamin ( 2 mM), ognatriumpyruvat (1 mM). Opløsningen filtreres.
- Fjern fuldstændigt vækstmedium og vask af cellerne med 3 ml PBS.
- Cellerne inkuberes med 2 ml 0,05% trypsin-ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) (for 6 cm petriskål) i 5 minutter ved 37 ° C, 5% CO 2 og frigøre celler ved anvendelse af pipette.
- Inaktivere trypsin ved tilsætning af 2 ml DMEM, og indsamle cellerne ved centrifugering ved 300 xg i 5 minutter.
- Fjern supernatanten, tilsættes 1 ml DMEM til pelleten og pipette opløsningen op og ned tilstrækkeligt til at sprede celler i en enkelt cellesuspension.
- Splitte dem 1: 4 i en ny 6 cm diameter petriskål indeholdende 3 ml komplet medium. Oprethold celler i kultur i 6 cm diameter petriskåle ved 37 ° C i en 5% CO 2-inkubator. Subkultur en gang om ugen, eller når de har dækket 80-90% af overfladearealet.
- Før start under laminar strømning biosikkerhed kabinet, gør det rette volumen sterilt phosphatbuffer saltopløsning (PBS) og dyrkningsmedium.
- SH-SY5Y celleudpladning til billeddannelse
- For TIRFM eksperimenter pladeceller på glas dækker. Ansæt glas dækker med 0,17 ± 0,005 mm tykkelse og en 1,5255 ± 0,00015 brydningsindeks. Før du starter, forberede dækglas som følger:
- Rengør glas dækker med 90% ethanol, O / N.
- Skyl grundigt i destilleret vand (tre ændringer i destilleret vand). Tør glas dækker i en tørreovn.
- Place dækker glaspetriskåle og sterilisere i en forvarmet ovn ved 200 ° C i 3 timer.
- Dagen før transfektion sted hvert dækglas i en 3,5 cm petriskål, tilsættes 1 ml dyrkningsmedium og inkuberes ved 37 ° C i en 5% CO 2-inkubator.
- Trypsinisér celler som beskrevet i trin 1.1.3 - 1.1.5, suspendere cellepelleten i 1 ml komplet medium og tælle. Beregn den korrekte mængde cellesuspension at tilføje til hver petriskål, hvilket gav 3 x 10 5 celler / brønd. Denne tæthed er påkrævet for optimal cellevækst og effektiv transfektion. Der inkuberes ved 37 ° Ci en 5% CO 2-inkubator O / N.
- For TIRFM eksperimenter pladeceller på glas dækker. Ansæt glas dækker med 0,17 ± 0,005 mm tykkelse og en 1,5255 ± 0,00015 brydningsindeks. Før du starter, forberede dækglas som følger:
- SH-SY5Ytransfection af polyethylenimin (PEI)
BEMÆRK: For at visualisere synaptiske vesikler dynamik, har pCB6 vektor indeholdende synapto-pHluorin blevet brugt. Den synapto-pHluorin er frembragt ved i ramme fusion af en pH-følsom variant af grønt fluorescerende protein (GFP) 16 og vesikulær membranprotein synaptobrevin 2. Konstruktionen er blevet grundigt anvendt til at undersøge synaptiske vesikel egenskaber inden neuroner 9.- Før du starter transfektion, gør 10 ml af følgende løsninger. Hold løsninger maksimal som 1 måned.
- Lav en 150 mM NaCl-opløsning. Juster til pH 5,5 med 0,01 N HCI.
- Foretag en PEI-opløsning ved 10% polyethylenimin (PEI, 25 kDa lineær) i 150 mM NaCl-opløsning. PH af opløsningen stiger til 8,8. Indstil pH til 7,8 med 0,01 N HCI.
- 24 timer efter plating, fjern mediet og opdatere med 1,5 mlkomplet medium. Hold cellerne ved 37 ° C i en 5% CO 2-inkubator.
- Under laminar strømning biosikkerhed kabinet, i et 1,5 ml mikrofugerør, tilsættes 3 ug plasmid-DNA til 25 pi 150 mM NaCI-opløsning og 100 pi PEI opløsning pr 3,5 cm petriskål.
- Vortex for 10 sek, derefter inkubere DNA / PEI blandingen i 30 minutter ved stuetemperatur.
- Derefter tilsættes forsigtigt DNA / PEI blandingen til petriskålen indeholdende dækglas med celler og forsigtigt ryste på lige distribuere reagenset i petriskålen.
- Efter 4 timer ændre medium og inkuber cellerne O / N ved 37 ° C i en 5% CO 2-inkubator. Udfør billeddannelse eksperimenter 24-48 timer efter transfektion.
- Før du starter transfektion, gør 10 ml af følgende løsninger. Hold løsninger maksimal som 1 måned.
2. Cell Imaging af total intern refleksion Fluorescens mikroskopi (TIRFM)
- Imaging opsætning
- Udfør TIRF billeddannelse med opsætningen beskrevet i figur 1. Den omfatter en motoriseret omvendtmikroskop (figur 1, indsat A), laserkilden (figur 1, indsat B) og TIRF-skyderen (figur 1, indsat C). Nå TIRFM belysning gennem en høj numerisk apertur (NA 1.45 Alpha Plan-Fluar) 100X olie, objektiv fordybelse.
- For TIRFM belysning, beskæftiger flere linjer (458/488/514 nm) 100 mW argon-ion laser. Ved hjælp af en mono-mode fiber, indføre lineært polariseret laserlys ind i strålegangen, via TIRF skyderen. Sæt TIRF skyderen i den lysende feltblændet plan af det reflekterede lys stråle sti.
- For bredt belysning, slutte mikroskop til en konventionel kviksølv kort bue lampe HBO hvidt lys. En polarisationsbevarende dobbelt prisme i skyderen sikrer den samtidige kombination af TIRF belysning og hvidt lys.
- Filtreres laserlys med en excitationsfilter (båndbredde 488/10 nm) monteret på et filterhjul, indføres i laseren sti. Ansæten høj hastighed, software-kontrolleret, lukker for at tillade hurtig styring af laser belysning. For pHluorin analyse, montere et band pass 525/50 nm emission filter. Capture digitale billeder (512 x 512 pixels) på en afkølet Fast CCD-kamera med Image ProPlus softwaren.
- Opnåelse TIRF belysning (figur 2)
- Tænd laserne, computeren kameraet filterhjulet, og lukkeren controllers; så vent 20 min før start eksperimentet som lasere har brug for at varme op og stabiliseres.
- Før billeddannelse, får belejligt volumen af følgende løsninger.
- Lav 50 ml Krebs (KRH) opløsning ved 125 mM NaCl, 5 mM KCI, 1,2 mM MgSO4, 1,2 mM KH 2 PO4, 25 mM 4- (2-hydroxyethyl) piperazin-1-ethansulfonsyre (HEPES) (bufret til pH 7,4), 2 mM CaCl2 og 6 mM glucose.
- Lav 10 ml KCI-KRH-opløsning (pH 7,4) ved 80 mM NaCl, 50 mM KCI, 1,2 mM MgSO4, 1,2 mM KH 2 PO 4, 25 mM HEPES (pufret til pH 7,4), 2 mM CaCl2 og 6 mM glucose.
- Fjern dækslet glas med transficerede celler og indsætte det i den rigtige imaging kammer. Saml kammeret og tilsættes 500 pi KRH opløsning i midten af glasset.
- Tilføj olie over målet. Placer imaging kammer på scenen af mikroskopet og placer målet under dækglas. Placer sikker dækning over prøven.
- I epifluorescens tilstand, fokus på dækglasset (øvre overflade), og vælg transficerede celler placeret i kammeret center. Vælg celler, hvis fluorescerende signal kan tydeligt registreres ved hjælp af en eksponeringstid under 80 ms.
- Under software kontrol, skifte til TIRF belysning i levende tilstand.
- For at indstille TIRF konfiguration, kontrollere placeringen af bjælken, der dukker op ud af det formål, på prøven igen (figur 2B). Når strålen er placeret i centrum af than objektiv (figur 2A, til venstre), en plet er synlig i midten af TIRF prøve dæksel (figur 2B, venstre) og cellen afbildes i epifluorescens tilstand (flere fokusplaner høj baggrundsfluorescens, figur 2C, venstre) .
- For at nå den kritiske vinkel, flytte den fokuserede plet i Y-retningen (fremad eller bagud, figur 2B i midten) under anvendelse af vinkeljustering skruen på TIRF skyderen (figur 1C). Når strålen konvergerer på prøveplanet i en vinkel større end den kritiske vinkel (figur 2A, højre), forsvinder plet og en lige, tynd, fokuseret linje er tydelig i midten af prøven dækslet (figur 2B, højre).
- At finjustere TIRF vinkel bruge celleprøve (figur 2C). Se fluorescens billedet på videoen, på dette stadium, en epifluorescens-lignende billede er stadig synlige. Forsigtigt, flytte skruen indtil TIRF conbetingelse opnås: kun én optisk plan af cellen er i fokus (dvs. plasmamembranen i kontakt med en cover-slip), resulterer dette i et fladt billede med høj kontrast (figur 2C, højre).
- Prøve imaging
- Indstil single-channel time-lapse eksperiment. For at minimere fotoblegning, tage billedet ved hjælp af lav eksponering tid og høj gevinst. Passende eksponering er mellem 40-80 ms. Anskaf billeder til 1 - 2 Hz sampling frekvens. Vesikel kinetik kan være bedre værdsat prøveudtagning på højere frekvens (10 Hz). Den regelmæssige tid for observation er normalt 2 min.
- Tilføj 500 pi KRH opløsning og optage celler i TIRFM mode. Dette er den hvilende tilstand. Spare den tid sekventielle billeder.
- Fokus på den samme celle og spor, og de samme betingelser for at hvile (laser magt, tid eksponering, frame nummer). Efter fem rammer, tilsættes 500 pi KCl-KRH løsning og holde KCI i kammeret.Dette er den stimulerede tilstand; spare den tid sekventielle billeder.
3. billedanalyse og databehandling
BEMÆRK: For at analysere billeder, er makroer er udviklet i laboratoriet, baseret på eksisterende funktioner i billedanalyse software; lignende makroer er tilgængelige online (URL i Tabel af materialer og udstyr).
- Fluorescensintensitet kvantificering
- Bruge en "Sequence fluorescensintensitet" makro til fluorescensintensitet kvantificering i et område af interesse (ROI) af billedet, i løbet af filmen.
- Åbn tid-sekventielle billeder. Gå til makro menuen og vælge "Sequence fluorescensintensitet«. I "Analyse" vises "vælg ROI".
- Vælg en af de markeringsværktøjerne i menuen for at skabe ROI. Placer 3 ROI'er i regioner i cellemembranen uden pletter (baggrund ROI). Ansæt this "baggrund ROI" for at vurdere fotoblegning og at fastsætte tærsklen for fusion begivenhed analyse (figur 3A).
- Fotoblegning korrektion og tærskel bestemmelse (figur 3B)
- For at evaluere fotoblegning Åbn fluorescensintensiteten rækker "baggrund ROIs" (Figur 3BA). Normalisere fluorescensintensitet værdier i hver ramme til den oprindelige intensitet værdi (F0) (F / F0) (figur 3BB). Gennemsnittet af værdierne.
- Fremhæv de gennemsnitlige data og skabe en linje plot ved hjælp af diagrammet menupunkter.
- Fra dataanalyse menuen, vælg "tendenslinje" for at åbne dialogen plottet analyse. Vælg typen af regression. Indstil "eksponentiel" regression. Vælg derefter "display ligning på chart". I grafen vinduet, vises den eksponentielle ligning og parameterværdierne tildeles automatisk, (figur 3BC
- Påfør den eksponentielle korrektion intensitetsværdierne i hver ramme som følger:
Fn (korrigeret) = Fn / exp (-n * a)
Fn = eksperimentel fluorescensintensitet målt ved ramme n; n = antal rammer; a = blegning faktor (konstant udtrykker hastigheden af intensitet tab på grund af fotoblegning; Figur 3Bd). - For at indstille tærsklen åbne en normaliseret og korrigeret "baggrund ROI", beregne den gennemsnitlige fluorescens signal og dens standardafvigelse (SD). Den gennemsnitlige værdi plus 3 SD repræsenterer tærsklen (figur 3BE). Brug denne tærskel for dataanalyse.
- Udvælgelse af fusionsbegivenheder hjælp af en halvautomatisk procedure
- Åbn tid-sekventielle billeder med billedanalyse-software. Anvend en gaussisk filter til det aktive billede sekvens.
- Analyser billeder hjælp af "tælle objekter" eller en makro, der tillader valgaf et objekt, hvis pixels har gennemsnitlig fluorescensintensitet inden for et afgrænset område. Sæt intensiteten range manuelt ved hjælp af tærsklen funktionen (gå til linjen i menuen til at indstille foranstaltning → tærskel fremhæve det interessante område). En passende tærskel er 30% over det lokale fluorescerende baggrund signal.
- Anvend en makro "Filtre objekter" til kun at vælge objekter, der opfylder følgende kriterier:
- Anvend intervaller mulighed (min og max inklusive) for aspekt. Aspect rapporterer forholdet mellem storaksen og lilleaksen af ellipsen svarer til objektet. Aspect er altid ≥1. Passende værdier er min = 1, max = 3.
- Ansøg intervaller for diameter. Diameter rapporterer den gennemsnitlige længde af diametre måles ved to graders intervaller forbinder to outline point og passerer gennem det geometriske tyngdepunkt af objektet. Indstil området i pixel (eller i um, hvis anvendelse af en kalibreret system).
- Definer det optimale område i prelimindære eksperimenter: Vælg manuelt pletter af interesse og derefter måle deres diameter ved hjælp plottet profilen funktionen.
- Vælg "Display objekter": markerede objekter vil blive vist overlejret til TIRFM billede (figur 4B).
- Medtag i analysen kun de pletter, der viser en kort (1-3 rammer) forbigående stigning i fluorescensintensitet, umiddelbart efterfulgt af et markant tab af signal (forbigående lokationer). Ansæt den cirkulære udvælgelse at oprette en ROI ca. en spot diameter radialt omkring de udvalgte vesikel / spots (eksperimentel ROIs). Udfør dette trin manuelt.
- Med ROI'er valgt, beregne den gennemsnitlige fluorescensintensitet af hver ROI i løbet af filmen.
- Dataanalyse (figur 3C-D)
- Eksport tidsforløbet af fluorescensen ændringer målt i hver "eksperimentel ROI" til et regneark; (Figur 3Da). Normalisere intensiteten værdi i hver ramme til den oprindelige fluorescensintensitet (F / F0) (figur 3Db).
- Påfør den eksponentielle korrektion intensitetsværdierne i hver ramme som rapporteret i trin 3.2.4 (figur 3Dc).
- For at beregne det samlede antal fusionsbegivenheder (peak nummer), den tid, hver fusion forekommer (peak bredde) og amplituden af fluorescerende top (top højde og AUC) anvende logiske funktioner ved hjælp regneark eller matematiske pakker. Et eksempel fusion event analyse under anvendelse af logiske formler af er rapporteret i figur 3Dd og 3De.
- Antag forøgelse af fluorescensintensitet over tærskelværdien (gennemsnitlig baggrund fluorescensintensitet ± 3SD) som vesikelfusion til plasmamembranen og den resulterende top som en fusion begivenhed.
- Beregn topbredden som forskellen mellem den sidste og den første x-værdi af hver top. Gang denne værdi for 1 / (sampling frekvens). Overvej denne værdi as tidspunktet for vesikelfusion og vedhæftning på plasmamembranen før vesikel re-forsuring og genanvendelse (figur 3Dd).
- Beregn helcelle-AUC som en sum af værdier over tærskelværdien. Overvej dette værdi som netto fluorescerende ændring under optagetiden på grund af den spontane (hviler) eller fremkaldt (stimuleret) synaptisk aktivitet.
- Beregn tophøjden som forskellen mellem den maksimale y-værdien af hver top og tærsklen. Betragt denne værdi som udtryk for den fusion type (enkelt vs. samtidig / sekventiel fusion eller forbigående vs. fuld fusion).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Procedurerne TIRF billedbehandling og dataanalyse beskrevne er designet til at studere vesikler dynamik i cellulære systemer. Denne teknik kan anvendes til at bestemme virkningerne af signalmolekyler og lægemidler på Fusion begivenheder og neurotransmitter vesikel dynamik 17. Brug af GFP-mærkede plasmamembranproteiner har TIRFM analyse været ansat til at karakterisere den konstitutive handel med GFP-mærkede glutamat transportører i glia og epitelceller 18,19.
For at validere imaging procedure og dataanalyse strategi rapporteret, registreres fusionsbegivenheder under basal og stimuleret forhold (kalium-induceret depolarisering), i SH-SY5Y neuroblastomaceller transficeret med synapto-pHluorin. (Video 1, 2, henholdsvis). To forskellige analyser udføres: hel-celle (figur 4) og enkeltstrenget vesikel analyser (figur 5).
Hele celleanalyse meager det samlede antal Fusion begivenheder i cellen og de deraf netto fluorescens forandringer som følge af stimulation. I figur 4 er synapto-pHluorin transficerede celler registreret under hvile og stimuleret betingelser (KCl stimulation), ved hjælp af den samme forsøgsprotokol (tid eksponering, laser magt, osv). Figur 4A viser, at synapto-pHluorin akkumuleres i fluorescerende puncta spredt på cellemembranen. Som beskrevet i litteraturen, en svag fluorescerende signal er også til stede på plasmamembranen 9; dette signal er nyttige til at identificere celler, der skal afbildes. I figur 4B, er pletter udvalgt af den automatiske procedure er beskrevet i papiret (afsnit 3.3) overlejret til TIRFM billedet rapporteret i figur 4A. Figur 4C viser de normaliserede fluorescensintensitet profiler af udvalgte pletter under hvile forhold. Disse profiler afsløre tilstedeværelsen af enkelte toppe af lignende fluorescerende intensity der kommer ud på forskellige tidspunkter under optagelsen og sandsynligvis svarer til vesikler, der lejlighedsvis fusionere med membranen. Figur 4D viser virkningerne af KCl stimulation. Som forventet depolarisering med 25 mM KCl fremkalder et hurtigt svar og flere meget lyse fluorescerende puncta vises cellemembranen (Video 2). Disse puncta svarer til 'let udløselige' pulje af synaptiske vesikler til stede under plasmamembranen. Tidsforløbet analyse af fluorescerende ændringer målt i korrespondance enkelte pletter indikerer tilstedeværelsen af toppe, variabel fluorescensintensitet, der vises pludselig efter anvendelse af de sekretoriske stimulus (figur 4D og 4F). Resultater af hel celle analyse i den tid af optagelsen er rapporteret i figur 4E-H. KCl stimulering forårsager en hurtig markant stigning i antallet af fusionsbegivenheder (2,5 fold stigning i forhold til hvilende forhold) (Figur 4E-F) og i de resulterende fluorescens intensitet ændringer (9,3 fold stigning i forhold til hvilende betingelser) (figur 4G-H), hvilket således indikerer massive neurotransmitterfrigivelse.
Single-peak analyse tillader karakterisering af single-fusionsbegivenheder (figur 5). Figur 5A viser den sekventielle billeder af en repræsentant "eksperimentel ROI" indspillet under hvilende forhold. Den særlige fremhæver et synapto-pHluorin mærket vesikel der sikringer med membranen under TIRF zone. Efter to rammer, forsvinder det fluorescerende signal, der angiver sandsynlig vesikel hentning og re-forsuring. Den normaliserede fluorescens profil regionen af interesse (figur 5B) måler en stigning i fluorescerende signal i korrespondance stedet udseende i TIRF zone. Omvendt fluorescensen vender tilbage til basisniveauet efter spot forsvinden (enkelt topgennemsnitlig bredde 1,91 ± 0,32 sek; gennemsnitlig tophøjde 0,042 ± 0,005 normaliseret fluorescens intensitet). figur 5C og 5D viser sekventielle billeder af en "eksperimentel ROI" indspillet under KCl stimulering og den tilsvarende normaliserede fluorescensintensitet profil. Bemærk stigningen i flytning af vesikler i og ud af TIRF zone efter KCl depolarisering.
40 Fusion begivenheder udvælges og analyseres i hvile og stimulerede betingelser. Følgende parametre måles: gennemsnitlig peak AUC, peak bredde og højde. Peak bredde angiver tidspunktet for vesikelfusion, arrest og endocytose, inden en ny forsuring og genbrug, figur 5G. Tophøjde måler fluorescensintensiteten ændringer induceret af vesikelfusion, figur 5F. Ændringer i disse parametre er indikative for forskellige exocytose mekanismer. Single-peak analyse afslører, at KCl depolarisering modificerertilstand af vesikelfusion til plasmamembranen. Faktisk stigning i den gennemsnitlige topareal (3,8 ± 0,2 fold stigning i forhold hviletilstande, P <0,01 ved parret t-test, figur 5E), peak højde (2,75 ± 0,03 gange stigning, P <0,01 ved parret t-test, figur 5F) og bredde (2,6 ± 0,5 gange stigning, P <0,05 ved parret t-test. Figur 5G) detekteres under stimulerede betingelser. Flere forklaringer kan overvejes for disse resultater. En mulighed er, at KCl depolarisering bevirker samtidig og / eller sekventiel fusion af vesikler i et begrænset område af cellerne. En alternativ forklaring er, at stærk depolarisering favoriserer fuld fusion versus forbigående fusion. Under basale betingelser, den fremherskende mekanisme er en forbigående fusion: a fusion pore former pH i vesiklen stiger, og det fluorescerende signal vises, men pore straks lukker, således at en hurtig re-forsuring og genanvendelse. Understimulerede forhold, vesikel helt sikringer med plasmamembranen, peak højde og bredde stigning som genbeskatning af membranvesikel komponenter, re-forsuring og genbrug kan kræve en længere periode. Et lignende resultat er for nylig blevet opnået analysere synaptisk-lignende mikrovesikel exocytose i endokrine β-celler 20.
Figur 1. TIRF mikroskop oprettet. Skematisk visning og billede (indsat) i TIRF mikroskop system. Opsætningen omfatter den Axio Observer Z1 motoriseret inverteret mikroskop (A), en multi-line 100 mW Argon-ion laser (B) og en TIRF-skyderen (C). Laserlyset (grøn linje) og hvidt lys (gul linie) er vist. Celler filmede med en 100 × olieimmersion mål. Digitale billeder er fanget på en afkølet RetigaSRV Fast CCD-kamera. DommerenLector modul, emissionen (488/10 nm) og excitation (band pass 525/50 nm) filtre, kollimatoren (L1) og fokusering er angivet (L2) linse. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 2. Kom TIRFM konfiguration. (A) Skematisk tegneserie, der illustrerer det mål, cover-slip, prøven og positionen af laserstrålen (blå linje). Venstre, excitationsstrålen bevæger direkte gennem cover-slip-prøve-interface . Prøven er spændt som i epifluorescens mode. Center, excitationsstrålen formularer med prøven en hændelse vinkel lavere end den kritiske vinkel, den lyser prøven med en variabel vinkel. Højre, excitationsstrålen danner en incident vinkel større end den kritiske vinkel, lyset er afsluttet reflekteres tilbage ind i objektivlinsen og en evanescerende felt udbreder i prøven. (B) Cartoon viser prøven dæksel og position excitationsstrålen (blå cirkel), der tegner sig af målet, under overgangen fra epifluorescens (venstre) mod TIRF belysning (til højre). (C) epifluorescens (venstre) og TIRFM (til højre) billeder af synapto-pHluorin fluorescens i en live SH-SY5Y celle. Scale bar:. 10 um Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 3. Databehandling og analyse. (A) TIRFM billede af synapto-pHluorin fluorescens i en live SH-SY5Y celle. Den grønne firkant viser en repræsentativ "baggrund ROI". Scale bar 10 pm. (B) Foreslået workflow til baggrund ROI. Fra top til bund:.... Et tidsforløb for fluorescensintensitet ændringer målt i baggrunden ROI b normalisering af fluorescens ændringer til den oprindelige fluorescens (F / F0) c anvendelse af den eksponentielle regression d korrektion for fotoblegning, e. tærskel evaluering (gennemsigtig grå firkant). (C) TIRFM billede af synapto-pHluorin fluorescens i en live SH-SY5Y celle. Den hvide firkant angiver en repræsentant "eksperimentel ROI". Scale bar 10 pm. (D) Foreslået workflow for eksperimentel ROI. Fra top til bund:.. Et tidsforløb for fluorescensintensiteten ændringer b data normalisering til den oprindelige fluorescens (F / F0) c. korrektion. de anvendelse af logiske funktioner at opdage peak nummer, AUC, bredde og højde. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 4. Hele celleanalyse. (A) TIRFM billede af synapto-pHluorin fluorescens i en levende SH-SY5Y celle. Celler registreres under hvile og stimuleret (25 mM KCl ansøgning) forhold (stikprøven ved 1 Hz). Scale bar: 10 pm. (B) pletter identificeret af den automatiske procedure er vist overlejret (grøn farve) på TIRFM billedet. (C) Normaliserede fluorescensintensitet profiler (F / F0) af pletter udvalgt af den automatiske procedure i hele cellen under hvilende betingelser. (D) Normalized fluorescens intensitetsprofiler (F / F0) af udvalgte pletter under stimulerede forhold. Baren over spor indikerer KCl ansøgning. (EH) Antal begivenheder og fluorescens intensitetsændringer registreret i hele celle under hvile (blå) og stimuleret (rød) betingelser. (E) Histogrammer der viser det samlede antal fusionsproteiner begivenheder optaget i cellen. (F) tidsmæssige fordeling af fusion begivenheder. (G) Histogrammer repræsenterer ændringer i pHluorin fluorescensintensitet forekommer i helcelle (Total AUC). (H) Kurver, der viser de kumulative pHluorin fluorescens intensitet ændrer sig som funktion af tid. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Video 2. SH-SY5Y celler, der udtrykker synapto-pHluorin registreres under stimulerede betingelser (stikprøven ved 1 Hz). KCl perfusion er indikeret. Klik her for at se denne video.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne artikel præsenterer en protokol til billede og analysere vesikler dynamik i secernerende celler, ved hjælp af fluorescerende cDNA-kodet vektorer og TIRFM. Centrale elementer i en vellykket billeddannelse ved TIRFM er valget af den cellulære model og celletransfektion med genetisk kodede optiske indikatorer for vesikel frigivelse og genbrug.
TIRFM er ideel til celler, der vokser klæbende til et glas cover og tilstrækkelig flad til at tillade stabil visualisering af membraner og fusion begivenheder. Vesikler bør ideelt spredes i cellen, således at deres handel, fusion og endocytose kan afbildes og kvantificeres ved single-vesikel niveau. Desværre har neuroner ikke opfylder disse kriterier: de har uregelmæssige former, neuritter som ofte krydser over hinanden, og blærer fusion prevalently koncentreret i små områder (aktive zoner). For disse regioner er meget vanskeligt at studere vesikel dynamik ved TIRFM i primære kulturer af neuroner.
Mens oplysninger om de forskellige transfektionsreagenser og procedurer gør transfektion næsten en standard procedure i SH-SY5Y og selv i primære neuronale kulturer, skal man passe på, når du optager, analyse og fortolkning TIRFM data. TIRFM letter indsamling af oplysninger om processer, der forekommer ved eller i nærheden af membranen i levende celler, og muliggør analysen af enkelte molekylære begivenheder ved detektion af ændringer i fluorescerende signal afledt fra mærkede proteiner som bevæger sig i eller ud af udklingende indgivet. Dog kan flere faktorer ændre de fluorescerende signaler i denne zone, uden nødvendigvis at indebære exo / endocytiske begivenheder, og dette skal tagen i betragtning, når du optager og analyse af data. Blandt disse er morfologiske ændringer i cellen, især vedrørende flyet i fokus under den kortvarige felt og fluoroforen ændringer under optagelse.
Morfologiske ændringer
Den høje opløsning af TIRF teknik afhængig af excitation af fluoroforer inden den kortvarige felt, med dybde 100 nm fra glasset interfacet 11. Dette er en meget tynd zone og umærkelige morfologiske ændringer forventes at ændre celle plan i fokus. Dette gælder især for neuroner og celler, der præsenterer flere processer og udviser udtalt ruffling. I disse celler, membranarealet i kontakt med en cover-slip under optagelse er ukorrekte og kan hurtigt ændre sig, hvilket førte unøjagtig vurdering af exocytose. Af denne grund, når det er muligt, er det vigtigt at vælge den cellulære model af undersøgelsen. For at begrænse celle movemeNTS kan være nyttigt at overtrække glas-covers med ekstracellulære matrix-proteiner eller poly-L-lysin. Men man skal huske på, at disse substrater kan ændre celle adfærd og vesikel dynamik.
Andre mulige kilder til morfologiske ændringer under optagelse er cellestimulering, tilsætning af løsninger, og temperaturændringer. Stimuli stand til at inducere massiv vesikler frigivelse (dvs. KCl depolarisering) ofte medføre cellekrympning hvilket naturligvis ændrer celleoverfladen under TIRF zone. Det er derfor vigtigt at vælge nøjagtigt den type, koncentration og anvendelse tidspunktet for stimulering i indledende forsøg.
Den enkle indførelse af opløsninger i badet med en pipette, uafhængigt af sammensætningen, kan forårsage ændring af cellemorfologi ved forskydningsspænding. For at løse dette artefakt, tilføje medium fortrinsvis under anvendelse af et perfusionssystem, eventuelt forbundet med en vakuumpumpe for at reducere støj.
Fluorophor
Ændring af fluorescerende signaler kan også skyldes modifikation af fluoroforen under optagelse. Det vigtigste er fotoblegning 23. Fotoblegning foton-induceret nedbrydning af en fluorofor. Det forårsager generelt en permanent tab af fluorescens og dæmpning af den observerede prøve over tid. I TIRFM kun fluorforer lukket til oprindelsen af den kortvarige felt kan Lysblegede og GFP-mærkede membranproteiner er Lysblegede fordi de bor i dette område. Forebyggelse af svækkelsen af fluorescensemission intensitet er meget vigtigt at få billeder i høj kvalitet, og obligatoriske for kvantitativ fluorescensmikroskopi. Med en rimelig tilnærmelse til et givet molekyle i en konstant miljø, fotoblegning afhænger af tiden og den cyklus af eksponering for excitationskilden. I mange tilfælde, fotoblegning følger en simpel eksponentiel henfald funktion, som foretager sin vurdering og korrektion nemmere ved at udføre kontrol optagelser 23. Forskellige korrektion formler / makroer er tilgængelige online (se tabel af materialer og udstyr); i protokollen en simpel exponential funktioner har været anvendt.
Der er flere strategier til at overvinde fotoblegning. En god strategi er at forhindre fotoblegning ved kilden, for eksempel ved anvendelse af fluoroforer med høj fotostabilitet. Desværre lige nu, valget af DNA-kodet prober er stadig begrænset. I dette tilfælde tab af aktivitet forårsaget af fotoblegning kan minimeres under billedbehandling erhvervelse, optimering tidsrum af lys eksponering, foton energi af input lys og hyppigheden af prøveudtagningen.
Ved brug af pH-følsomme prober, en yderligere kilde til fluorofor modifikation under optagelse er pH-skift i mediet. Væskevolumenet af optagelsen kammeret er normalt meget lav, og lægemiddel ansøgning, kan celleaktivitet og metabolisme ændre pH i mediet, især i lille volumen mellem cellen og overfladen af dækglasset. Dette vil til gengæld ændrer pHluorin fluorescerende signal, hvilket førte over / under-skøn over vesikel release. For eksempel kan stærke stimulationer føre til en calcium-afhængig forsuring af cytosolen og spejlet alkaliseringen i det ekstracellulære rum, hvilket resulterer i en overdrevet stigning i fluorescerende signal 24.
For at undgå dette problem, skal du altid bruge bufrede opløsninger og overvåge mulige pH ændringer, som den etablerede protokol, i indledende forsøg. For en mere præcis vurdering af fremkaldte vesikel frigivelse, når man analyserer data, overvåge fluorescenssignalet i et område af cellens overflade uden Fusion begivenheder og anvende modifikationer af det fluorescerende signal i denne region som justeringsfaktor.
Afslutningsvis har en metode til overvågning og analyse af vesikelfusion og dynamik blevet beskrevet. Denne teknik kan anvendes i forskellige celletyper (neuroner og endokrine celler) til at visualisere og dissekere de forskellige trin af exo / endocytose, til at afsløre den rolle af proteiner og deres pathogenic mutanter i reguleringen af vesikel dynamik og for at afsløre de virkningsmekanismer af lægemidler rettet mod konstitutiv og reguleret exocytose.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne anerkende Università degli Studi di Milano for støtte til Eliana Di Cairano (Post-ph.d.-stipendium) og Stefania Moretti (ph.d.-stipendium). Dette arbejde blev støttet af universitetet Research Program PUR til CP
Vi vil gerne takke professor Jeremy M. Henley, School of Biochemistry, University of Bristol, England, for pHluorin konstruere og Dr. Dotti Francesco for assistance i dataanalyse, og Silvia Marsicano til teknisk bistand.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Axio Observer Z1 |  Zeiss |
491912-9850-000 | inverted microscope |
| Multiline Argon Laser Lasos 77 | Lasos |
00000-1312-752 | multi-line (458/488/514 nm), 100 mW argon-ion laser |
| Laser TIRF slider | Zeiss |
423681-9901-000 | |
| 100X Objective | Zeiss |
421190-9900-000 | Oil, NA 1.45 Alpha-Plan |
| CCD Camera RetigaSRV Fast 1394 | QImaging |
||
| LAMBDA 10-3 optical filter changer with SmartShutter | Sutter Instrument Company |
||
| Software | |||
| Image ProPlus 6.3 Software | Media Cybernetics |
spot selection, ROI selection, fluorescence intensity determination | |
| Excel | Microsoft |
photobleaching correction, whole-cell and single-vesicle analyses | |
| GraphPad Prism 4.00 | GraphPad Software, Inc. |
statistical analysis | |
References
- Sudhof, T. C.
- Denk, W., Svoboda, K. Photon upmanship: why multiphoton imaging is more than a gimmick. Neuron. 18 (3), 351-357 (1997).
- Helmchen, F., Svoboda, K., Denk, W., Tank, D. W. In vivo dendritic calcium dynamics in deep-layer cortical pyramidal neurons. Nat Neurosci. 2 (11), 989-996 (1999).
- Tsien, R. Y.
- Matz, M. V., et al. Fluorescent proteins from non bioluminescent Anthozoa species. Nat Biotechnol. 17 (10), 969-9673 (1999).
- Ribchester, R. R., Mao, F., Betz, W. J. Optical measurements of activity-dependent membrane recycling in motor nerve terminals of mammalian skeletal muscle. Proc Biol Sci. 255 (1342), 61-66 (1994).
- Polo-Parada, L., Bose, C. M., Landmesser, L. T. Alterations in transmission, vesicle dynamics, and transmitter release machinery at NCAM-deficient neuromuscular junctions. Neuron. 32 (5), 815-828 (2001).
- Gaffield, M. A., Betz, W. J. Imaging synaptic vesicle exocytosis and endocytosis with FM dyes. Nat Protoc. 1 (6), 2916-2921 (2006).
- Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Axelrod, D. Total internal reflection fluorescence microscopy. Methods Cell. Biol. 89, 169-221 (2008).
- Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. The Use of pHluorins for Optical Measurements of Presynaptic Activity. Biophys. J. 79, 2199-2208 (2000).
- Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. J. Cell Sci. 123, 3621-3628 (2010).
- Wyatt, R. M. Balice-Gordon R.J. Heterogeneity in Synaptic Vesicle Release at Neuromuscular Synapses of Mice Expressing SynaptopHluorin. J. Neurosci. 28 (1), 325-335 (2008).
- Tsuboi, T., Rutter, G. A. Multiple forms of "kiss-and-run" exocytosis revealed by evanescent wave microscopy. Curr Biol. 13, 563-567 (2003).
- Miloso, M., et al. Retinoic Acid-Induced Neuritogenesis of Human Neuroblastoma SH-SY5Y Cells Is ERK Independent and PKC Dependent. J. Neurosci. Res. 75, 241-252 (2004).
- Jaskolski, F., Mayo-Martin, B., Jane, D., Henley, J. M. Dynamin-dependent Membrane Drift Recruits AMPA Receptors to Dendritic Spines. J Biol Chem. 284 (18), 12491-12503 (2009).
- Treccani, G., et al. Stress and corticosterone rapidly increase the readily releasable pool of glutamate vesicles in synaptic terminals of prefrontal and frontal cortex. Mol Psychiatry. 19 (4), 433-443 (1038).
- D'Amico, A., et al. The surface density of the glutamate transporter EAAC1 is controlled by interactions with PDZK1 and AP2 adaptor complexes. Traffic. 11 (11), 1455-1470 (2010).
- Perego, C., Di Cairano, E. S., Ballabio, M., Magnaghi, V. Neurosteroid allopregnanolone regulates EAAC1-mediated glutamate uptake and triggers actin changes in Schwann cells. J Cell Physiol. 227 (4), 1740-1751 (2012).
- Bergeron, A., Pucci, L., Bezzi, P., Regazzi, R. Analysis of synaptic-like microvesicles exocytosis of B-cells using a live imaging technique. PlosOne. 9, e87758 (2014).
- Encinas, M., et al. Sequential treatment of SH-Sy5Y cells with retinoic acid and brain-derived neurotrophic factor gives rise to fully differentiated, neutrophic factor-dependent, human neuron-like cells. J. Neurochem. 75 (3), 991-1003 (2000).
- Kume, T., et al. Dibutyryl cyclic AMP induces differentiation of human neuroblastoma SH-SY5Y cells into a noradrenergic phenotype. Neurosci Lett. 443 (3), 199-203 (2008).
- Diaspro, A., Chirico, G., Usai, C., Ramoino, P., Dobrucki, J. Photobleaching. Handbook of Biological Confocal Microscopy. Pawley, J. B. , Springer-Verlag New York, Inc.. New York. 690-699 (2006).
- Rossano, A. J., Chouhan, A. K., Macleod, G. M. Genetically encoded pH-indicators reveal activity-dependent cytosolic acidification of Drosophila motor nerve termini in vivo. J Physiol. 591 (7), 1691-1706 (2013).
