ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Protocol
הערה: פרוטוקולים לאוסף של רקמות אדם צריכים להיות נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המוסדית IRB. אוסף של רקמה אנושית שהושלכה, מזוהה de אושר על ידי בית החולים לילדים בבוסטון וועדות IRB Brigham and בית החולים לנשים. השיטות שתוארו להלן יושמו בבידוד של תאי myogenic מדה-מזוהה, שהושלך רקמה. השיטות שתוארו חלות על רקמה שנאספו מחומר מטופל הסכים.
1. בידוד תא
- ניתוק של ביופסיה של שריר וטיהור של תאי myogenic
- טרום לשקול צלחת תרבית רקמת 10 סנטימטרים במנדף בטיחות ביולוגי בתרבית רקמה, ולאחר מכן לשקול מחדש את הצלחת המכילה את הביופסיה של השריר כדי לחשב את כמות הרקמה שניתק.
- באמצעות אזמלים סטריליים, רקמת שריר בשר טחון דק ולהוסיף כמה טיפות של סטרילית 1x HBSS כדי למנוע רקמות מהתייבשות.
- להוסיף 3.5 מיליליטר כל אחת מdispase השני וcollagenase D לגרם של רקמת שריר להתעכל. פיפטה רקמות טחונות ופתרון אנזים באמצעות פיפטה 25 מיליליטר סטרילי כמה פעמים. דגירה את הצלחת בתרבית רקמת חממה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 במשך 15 דקות ולעכל רקמה עד slurry עובר בקלות אם כי טפטפת מיליליטר סטרילי 5.
הערה: ניתוק רקמות מושגים בדרך כלל על ידי עיכול אנזימטי בתוך 45-90 דקות. עיין בסעיף 'נציגי התוצאות "לפרטים נוספים. - הוסף 2 כרכים של מדיום גידול סטריליים לרקמה ניתק, מסנן דרך מסננת 100 מיקרומטר תא מעל 50 מיליליטר תאי צינור וגלול חרוטי במשך 10 דקות ב 329 XG (~ 1,100 סל"ד), בטמפרטורת חדר. אנא עיין בטבלת חומרים להרכב תקשורת.
- Resuspend גלולה בנפח של 1 מדיום גידול סטרילי ולהוסיף 7 כרכים פתרון תמוגה תא דם אדום. סנן את הפתרון דרך מסננת תא 40 מיקרומטר, אז גלולה tהוא תאים במשך 10 דקות ב 329 XG, בטמפרטורת חדר.
- ספירת התאים בhemocytometer וresuspend תאי BSA 0.5% 1x HBSS בריכוז של 1 x 10 6 תאים / μl 100. מניח בצד ~ 250,000 תאים בצינור אחד שישמשו כשלילית שליטה (בלא כתם). הגדר צינורות צד נוספים חד-צבע מוכתם שליטה ליודיד propidium ולCD56, הנדרשים לgating התקין של תאים חיוביים CD56 על ידי מיון FACS. אנא עיין בתא מדריכים למיון או להתייעץ עם FACS מיון מומחי מתקן ליבה כדי להבטיח בקרה נאותה כלולים.
- כתם התאים להיות מסודרים עם 5μl / 10 6 תאים של נוגדן אנטי CD56. דגירה כל הדגימות (כולל בקרות) על קרח למשך 30 דקות.
- לשטוף דגימות ב 10 מיליליטר 1x HBSS ותאים גלולה במשך 10 דקות ב 329 XG (~ 1,100 סל"ד) בצנטריפוגה בקירור, 4 ° C טמפרטורה.
- להוסיף יודיד propidium בריכוז סופי של 1μg / מיליליטר המדגם להיות sorטד להרחקה של תאים מתים. לטהר תאים חיוביים myogenic CD56 מהתאים שאינם myogenic באמצעות סדרן תא הקרינה הופעלה.
- ניתוק של ביופסיה של עור
יכול להיות מבודד fibroblasts Dermal מאגרוף עור מחולים כאשר ביופסיות שריר אינן זמינות: הערה. fibroblasts עורי יכול לשמש כחומר ביולוגי למחקרים רבים, כוללים התמרה עם Myod לייצר תאי myogenic. בנוסף, ניתן להשתמש fibroblasts עורי ליצירת תאי iPS, אשר יכול להיות מובחן לסוגי תאים שונים למחקר נוסף.- להעביר את הביופסיה של העור למעבדה במדיום תחבורה. לאחר המדגם הוא קיבל, לבצע את התרבות העיקרית בהקדם האפשרי. אם התרבות העיקרית לא ניתן לקבוע באותו היום, לאחסן המדגם בטמפרטורת חדר למשך לילה.
- העבר את הביופסיה של העור לצלחת פטרי 35 מ"מ סטרילי בזרימה למינרית.
- יש לשטוף את הביופסיה של העור בצלחת פטרי עם 1 סטריליx PBS להסיר דם ופסולת. הסר את רקמת השומן עם אזמל סטרילי.
- הוסף פתרון collagenase 2 מ"ל ולקצץ את הרקמה עם אזמל, לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות לשעה 1, תלוי בגודל של הרקמה.
- העברת הרקמה מתעכל לצינור חרוטי 15 מיליליטר, לשטוף את צלחת פטרי עם 2 מיליליטר של מדיום תרבות פיברובלסטים פעמיים, ולאסוף את המדיום באותו הצינור.
- גלולה תאים ב XG 200 במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר.
- בטל supernatant ולשטוף את הכדור עם 3 מיליליטר של מדיום פיברובלסטים להסיר collagenase, אז תאי גלולה שוב. אנא עיין בטבלת חומרים להרכב תקשורת.
- חזור על השלב 1.2.7 עוד פעם אחת.
- להשעות מחדש גלולה בתאים בינוניים פיברובלסטים וצלחת 5 מיליליטר על בקבוק תרבות רקמת T25 סטרילי. דגירה הבקבוק ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2.
- להעריך את התרבות לקובץ מצורף פיברובלסטים וצמיחה מעל 1-3 הימים הקרובים. <br /> הערה: חלק פיסות רקמה קטנה עשויות גם לצרף הצלחת וfibroblasts להעביר את חתיכות רקמה אלה.
- לשמור על התרבות באותם תנאים עד fibroblasts גדלים למפגש כ -80%.
- לאסוף fibroblasts ידי trypsinization ולהעביר על גבי צלוחיות תרבות טריות להרחבה נוספת. בצע trypsinization ידי שטיפת התרבויות 3 פעמים ב1x PBS ללא Ca ++ Mg ++. להוסיף טריפסין-EDTA (ראו לוח חומרים) לתאים (2ml / בקבוק T25) למשך 2 דקות על 37 מעלות צלזיוס.
- פיצול תאים מנותקים לתוך צלוחיות נוספות. אם כמה חתיכות רקמה נשארות צמודות לצלוחיות T25 המקוריות, להוסיף 5 מיליליטר מדיום תרבות הטרי לבקבוק זה ועוד fibroblasts יעבור את הרף.
הערה: תרבות פיברובלסטים המורחבת אפשר להקפיא למטה כמו P1 ומאוחסנות בחנקן נוזלי לניסויים עתידיים.
2. הנצחה של תאי myogenic
- תאי Feed 30 דקות לפני transfection עם 5 מיליליטר של תקשורת טרי בתוספת קפאין 10 מ"מ.
- Homogenize תערובת של 2 מיקרוגרם של ה- DNA פלסמיד מהכנת midi (פלסמיד cdk4 או hTERT) וPolyjet ודגירה בטמפרטורת חדר במשך 15 דקות, כפי שהומלץ על ידי היצרן.
- מוסיף את תערובת פלסמיד / Polyjet לתאי PE הלילה.
- תאים להאכיל עם מדיום חדש (DMEM ובינוני 199 על יחס של 4: 1, בתוספת 10% עגל בסרום). שתים עשרה שעות מאוחר יותר, לאסוף את supernatant המכיל וירוסים ולסנן אותה דרך מסנן גודל 0.45 מיקרומטר נקבובית.
- השתמש 1 מיליליטר של supernatant נאסף להדביק לילה PA317 קו תא אריזת amphotropic 5 ולקבל שורת תאים לייצר וירוס יציב לאחר בחירה עם או 0.5 מ"ג / מיליליטר נאומיצין (G418) לcdk4 או 0.5 מ"ג / מיליליטר hygromycin לhTERT.
- הכן עובד supernatants ויראלי על ידי גידול תאי אריזה היציב לconfluency הקרוב, ולאחר מכן קציר supernatant בכל בוקר, ערב ובוקר לשלושה יבולים.
- סנן את supernatants ויראלי ובמישרין או להשתמש לחלק אותם ל1 aliquots מיליליטר ולאחסן ב -80 ° C לשימוש מאוחר יותר. שים לב שsupernatant ויראלי מאבד 50% יעילות הדבקה בכל להקפיא להפשיר. זכור כדי להלבין שטיפה לפני השלכת כל מה שנגע בחלקיקים הנגיפיים.
הערה: שורת התאים-ייצור וירוס PA317 היציבה יכולה להיות קפוא ונשמרה ב-150 מעלות צלזיוס במשך אחסון קבוע (הקפאה בינונית היא DMSO 10%; סרום 90%). - מטוהר FACS צלחת תאי myogenic (מתואר בצעדים 1.1-1.9) בצפיפות של 5 x 10 4 תאים / גם ב6-גם צלחות מצופות ג'לטין 0.1%. ודא כי תאים המחוברים לצלחת לפני שימשיכו עם זיהום ויראלי.
- להוסיף 400 μl מסונן, freshly מיוצר supernatant הנגיפי או aliquots הקפוא לכל צלחת שש היטב לילה (לשמור 2 בארות כפקדים).
- שנה בינונית על ידי האכלת תאים עם 2.5 מיליליטר / גם של תקשורת טרי שריר (4: 1 בינוני הנשר (DMEM) שונה Dulbecco ובינוני 199 בתוספת 15% בסרום שור עוברי; 0.02 M HEPES חיץ; ויטמין 1.4 מ"ג / L B12; 0.03 מ"ג / L ZnSO4, dexamethasone 0.055 מ"ג / L, גורם גדילת hepatocyte / l 2.5 מיקרוגרם וגורם גדילת 10 מיקרוגרם / L פיברובלסטים בסיסיים). מחק את התקשורת וטפטפות המכילה חלקיקים הנגיפיים במכל אקונומיקה. לצאת מתאים באותו בינוני במשך 3 ימים להתאושש מזיהום, אז להתייחס לבחירה או באמצעות 400 מיקרוגרם / מיליליטר נאומיצין (זיהום cdk4) או 300 מיקרוגרם / מיליליטר hygromycin (זיהום hTERT).
- שמור על תאים תחת בחירת תרופה עד שהתאים במנה למות שליטה (1-2 שבועות).
- תאי מעבר לפני שהן הופכות מחוברות (confluency 60-80%; באמצעות 0.05% טריפסין EDTA), גם בselectiבתקופה. תאי Replate במנות 10 ס"מ מרובים עם מדיום myoblast טרי (כמתואר ב2.11) בתוספת תרופת הבחירה. לשמור הנציחו תאים שנבחרו כאוכלוסייה הטרוגנית או לשכפל להשיג רקע הומוגנית לחלוטין גנטי (אותו החדרת transgene בכל תא).
- לבצע בחירה משובט באמצעות השלבים הבאים:
- זרעי התאים בצפיפות נמוכה (למשל 300 עד 500 תאים 10 מנות סנטימטר) ולשמור אותם במשך כשבועיים, עד מושבות קטנות נוצרות (10-20 תאים).
- הסר ביותר של המדיום בשלב זה, ומשאיר רק סרט דק כדי למנוע את התאים מהתייבשות.
- מניחים טבעת שיבוט (עם קצה אחד טבול בשומן ואקום סיליקון) על כל שיבוט רצוי ולהוסיף כמה טיפות של טריפסין / EDTA.
- קציר תאים ברגע שהם הופכים מעוגלים ידי aspirating בזהירות את התאים באמצעות קצה מיליליטר 1 או pipet פסטר והעביר לPLA multiwell הכי הקטןte (96 או 48, 24 או 12 צלחות גם).
- להרחיב שיבוטים לפי צורך כדי למנוע confluency המקומי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 1 מדגים כמה מהשלבים העיקריים המעורבים בניתוק הרקמה העיקרי: כמות הרקמה המדויקת נשקלה בצלחת פטרי תרבית רקמה סטריליים (איור 1 א ', ב'). הרקמה אז דק טחון באמצעות אזמלים סטריליים, עד slurry רקמה מתקבל (איור 1 ג, ד). בעקבות תוספת של אנזימי העיכול, ניתוק רקמת שריר העיקרי מושגים בדרך כלל על ידי עיכול אנזימטי בתוך 45-90 דקות. ההתקדמות של מערכת עיכול רקמה מנוטרת בדרך כלל כל 15-20 דק 'על מנת למנוע overdigestion ומוות של תאים. עיכול אנזימטי יכול להיות בעדינות pipetted ומעורב כמה פעמים בכל דקות 15-20. בסופו של שלב העיכול, מסוננים דרך התאים 100 מיקרומטר (איור 1E, F) ולאחר מכן מסנן 40 מיקרומטר. בהתאם לכמות של החל רקמת שריר והאם המדגם מתקבל ממעט או חמור שריר הפגוע, cel העיקרי ניתקls יהיה הטרוגנית. איור 1G מראה דוגמא של תאי mononuclear בהשעיה הבא העיכול באופן מיידי, ואילו איור 1H מציג דוגמא של תאים ראשוניים ניתקו שעות 3-6 הבא עיכול וציפוי במנות בתרבית רקמה. תאי myogenic יהיו בדרך כלל להיות מעורבים עם fibroblasts ותאי adipogenic. תאי מערכת חיסון עשויים גם להיות נוכחים במקרים בהם דלקת קשורה למחלתו של המטופל. לכן, הפרדה פוטנציאלי של תאים מהסוגים השונים עשויה להיות רצויה. לבידוד פוטנציאלי של תאי myogenic אנושיים, CD56 או N-CAM כבר בשימוש נרחב כסמן אמין 6-9. טיהור זה עשויה להיות מועילה בסמוך לאחר בידוד להעשרה של אבות myogenic ולפני תהליך הנצחת תא. לחלופין, הנצחה של תאים ראשוניים יכולה להתבצע בהתחלה, ניתן לבחור תאי myogenic אז הנציחו מבוססים על ביטוי של CD56 ידי FACS. על סכמטיהצעדים נדרשים לפני FACS מיון ודוגמא של פרופיל FACS מתואר באיור 2. בקצרה, תאים ראשוניים נספרים וresuspended בריכוז גבוה כפי שצוינו, ולאחר מכן את הנוגדן הראשוני (CD56 אנטי כלומר) הוא הוסיף לתאים וטופחו במשך 30 דקות על קרח. בעקבות לשטוף, מנותחים תאים באמצעות סדרן תא הקרינה המופעל ומטוהרים (איור 2) .the תשואה משוערת של תאים חיוביים CD56 משתנה ממדגם מדגם, הנע בין 40-70% מכלל תאי mononuclear. התשואה משתנה בהתאם לגילו של האדם והאם תאי myogenic מופקים משריר מושפע או חולה. שריר מושפע בדרך כלל יש אחוז הגבוה של תאי myogenic, תוך שריר dystrophic לעתים קרובות יש אחוזים קטנים יותר של תאים חיוביים CD56. התאים המטוהרים הם מצופים במדיום גידול myogenic מלא (ראה לוח חומרים). ניתן passaged תאים על ידי trypsinization כאשר הם reac מפגש 60-70% h. תאי CD56 להביע הם myogenic ומסוגל להרכיב myotubes במבחנה 10,11 .the הנצחה של תאי myogenic דורשת transfection רציף של שני גנים 12,13 (כschematized באיור 3). Cyclin תלוי קינאז 4 (cdk4) משמש כדי להתגבר על הלחץ של תרבית רקמה בשל תנאי תרבות לקויים, והטלומרז אנושיים הפוכים transcriptase (hTERT) מונע התקצרות הטלומרים בשל תופעת שכפול סוף 12. שני פלסמידים מראש נגיפיים נמצאים בעמוד שדרת וקטור pBAbe. מבנה cDNA cdk4 העכבר מכיל את גן התנגדות נאומיצין ומבנה hTERT cDNA מכיל את גן התנגדות hygromycin. האחרון מכיל גם קלטת kinase thymidine וירוס הרפס סימפלקס (TK) ואתרי loxP ממוקם בשני הקצוות של קלטת hTERT / TK. זה מאפשר הכריתה של כל יחידת הביטוי על ידי recombinase Cre 14 ונגד הבחירה באמצעות gancyclovir.
class = "jove_content"> להנצחה, עובד supernatants ויראלי שהוכן על ידי גידול תאי אריזה היציב לconfluency הקרוב, ולאחר מכן supernatant שנקטפו בבוקר, בערב, ובוקר לשלושה יבולים. Supernatants ויראלי מסונן וגם להשתמש בם ישירות או מחולק ל1 aliquots מ"ל ומאוחסן ב -80 ° C לשימוש מאוחר יותר. supernatants ויראלי יכול לאבד 50% מיעילות הדבקה בכל להקפיא להפשיר.
חדש יכולים להישמר תאים הונצחו כאוכלוסייה שבו הווירוסים משולבים באתרים שונים, או משובט, לקבל רקע Homogenic לחלוטין גנטי (הכנסה יחידה בגנום התא וצאצאים שלה). ברוב המקרים, בידוד שיבוטים מאוכלוסייה אחת העיקרית תהיה תוצאות בהבדלים קלים בין שיבוטים בהתאם להכנסה של הקלטת בגנום התא. בנוסף, תרבית רקמה נרחבת תעדיף מבחר של תאים עם יתרון צמיחה ולא את אלה שמבדילים. אני solation של שיבוטים בודדים מתבצע פשוט על ידי זריעת תאים בצפיפות נמוכה (למשל: 300 עד 500 תאים 10 מנות סנטימטר) וטיפוח למשך כשבועיים עד מושבות קטנות נוצרות (10-20 תאים). רוב הבינוני לאחר מכן הוסר, ומשאירים רק סרט דק כדי למנוע את התאים מהתייבשות. שיבוטים הם trypsinized באמצעות טבעות שיבוט ולאחר מכן הרחיבו במידת הצורך. הרחיבו שיבוטים הונצחו יכולים להיבדק על ביטוי של סמנים נפוצים myogenic תא, כגון CD56 ידי FACS, desmin וביטוי Myod ידי immunofluorescence, או myotube היווצרות על בידול. Myotubes הם בולט ביותר כאשר תאים ומחוברות myogenic (confluency 90%) ממוקמים במדיום בידול (DMEM ובינוני 199 על יחס של 4: 1, בתוספת 2% בסרום סוס) לאחר 3-5 ימים (איור 4). שום הבדל לא נראה בmyotube היווצרות וביכולת התכווצות myotube בין תאים שאינם הונצח שליטה ותאים הונצחו (וידאו 1 ו -2).
> אימות של צעדי ההנצחה ניתן assayed על ידי מספר שיטות, כוללים עקומות גדילת תאים, מדידת אורך הטלומרים והערכה של פעילות הטלומרז (איור 5). דוגמאות לעקומות גדילה מוצגות באיור 5 א ', שבו התקצרות הטלומרים נצפתה תאים הורחבו למספר מורחב של מעברים. לעומת זאת, הנצחה מוצלחת קשורה פעילות הטלומרז מוגברת (איור 5)
איור 1:.. איורים של שלבים קריטיים לניתוק של רקמת שריר אנושית ראשונית (A) במשקל של צלחת התרבות הריקה, לפני מיקום רקמה ו( B) הבאים מיקום של רקמת האזמלים סטרילי (C) משמשים לבררו רקמה, עד (ד ') את רקמתהעצמי מצטמצם slurry. Collagenase וdispase מתווספים ורקמה מתעכלת ל45-90 דקות, ולאחר מכן את העיכול מסונן דרך מסנן רשת ניילון להשליך פסולת (E, F). (G, H) דוגמאות של תאים טריים ניתקו מצופים מייד לאחר הניתוק (G ) או 3 שעות לאחר ניתוק, כאשר תאים ראשוניים מתחילים להתיישב (H).
איור 2:. Workflow של נהלים העוסקים בצביעת היצמדות למנגנון אנושית לפני הטיהור באמצעות סדרן תא הקרינה הופעלה הצעדים הקריטיים לצביעת תאים אנושיים לפני ניתוח FACS מודגשים. דוגמאות למגרשי FACS גם מוצגות. הבקרה השלילית (פנל משמאל) משמשת כדי לקבוע את שער המיון. בלוחות מימין, תאים חיוביים להביע CD56 הם מגודרים והמספרים האחוזיםGE של תאים חיוביים מוצג. אסטרטגיה זו יכולה לשמש כדי לטהר את תאי myogenic או לפני הנצחה או ביצוע הליך ההנצחה.
איור 3: סכמטי של ייצור וירוס להנצחת היצמדות למנגנון. זרימת עבודה של ייצור רטרו-הווירוס המשמשת להנציח myoblasts. מבנה פלסמיד המכיל גם cdk4 או קלטת hTERT-TK floxed בעמוד שדרת pBabe (משמאל) הוא transfected לecotropic הפניקס (PE) שורת תאי אריזת הלילה (8-12 שעות) באמצעות Polyjet. Supernatant מועבר לאחר מכן לאחר סינון על קו פניקס amphotropic תא אריזה (PA317). Supernatant מהתאים אלה יכולים לשמש באופן ישיר או ניתן לבחור את התאים עם או נאומיצין או hygromycin כדי ליצור שורת תאים יציבה לשימוש עתידי. Aliquots של filtsupernatant ered ניתן לאחסן ב -80 ° C לשימוש מאוחר יותר (עם איבוד של 50% ביעילות). משמשת אקונומיקה כדי לנקות כל מתכלה בשימוש בכל הנקודות של ההליך.
איור 4:. סכמטי של הנצחת היצמדות למנגנון הפיכה Workflow של הליך ההנצחה (למעלה): תאים ראשוניים הם transfected ראשון עם cdk4. לאחר בחירת נאומיצין, myoblasts הם transfected עם קלטת hTERT floxed מכילה שני סמני בחירה; HSV-TK וhygromycin. אם ארצה במועד מאוחר יותר, את קלטת hTERT ניתן "floxed" על ידי מבטא recombinase Cre ובחירה לכריתה עם gancyclovir. זה מאפשר "מחדש mortalization" של myoblasts ומחדש הייזום של התקצרות הטלומרים. אם הטלומרים ארוכים 20 kb, זה עדיין מאפשר מאות הכפלות, ונמנע t הוא הסיבוך של ביטוי היתר של hTERT. לבסוף, שיבוטים isogenic מהאוכלוסייה הונצחה יכולים להיות מבודדים. Myogenicity של התאים הונצחו החדש ניתן לראות באמצעות סמנים ספציפיים של תאי שריר כגון desmin (פנל שמאלי תחתון, תאים במדיום גידול מוכתמים אנטי desmin, D33 שיבוט, ירוק). שיבוט זה כל כך myogenic כי תאים מובחנים נראים גם אם תאים נשמרים בתנאי התפשטות. כאשר תאים נבדלים במדיום בידול (עם 2% בסרום סוס, אמצע ולוחות מימין) myotube היווצרות הופכת להיות מאוד נרחבת. כמעט כל התאים מוכתמים עם נוגדן MF20 לשרשרת עוברית שרירן כבד (ירוק) וmyotubes גרעינים מרובים על ידי מכתים DAPI (כחולה, את כל התמונות). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
les / ftp_upload / 52,307 / 52307fig5highres.jpg "/>
איור 5: אימות של הליך ההנצחה. (א) עקומות גדילה של שיבוטים Isogenic מהיצמדות למנגנון עיקרי, אוכלוסייה אלמותית (היצמדות למנגנון hTERT-cdk4) ושיבוט מחדש mortalized (Myoblast floxed hTERT-cdk4) מוצג כדוגמאות. לא נמצא הבדלים בשיעורי צמיחה היו להבחין לפני התאים להגיע הזדקנות. התקצרות הטלומרים הייתה פיקוח כפונקציה של הכפלות אוכלוסייה ואורך הטלומרים נמדדה על ידי TRF. myoblasts (B) דוגמאות TRF המוצגים הם של נקודות זמן מוקדם ומאוחר בשכפול myoblasts (5 נקודות זמן מPD 13-75), מחדש mortalized לאחר כריתת hTERT (3 נקודות זמן מPD 62-152) וmyoblasts הונצח (PD 75 ו -200). (ג) זיהום hTERT מוצלח מתורגמת לעלייה בפעילות הטלומרז. פעילות הטלומרז הוערכה על ידי ddTRAP (קריאת ddTRAP, נכונה; כימות של assay, משמאל) 15 בתאים לפני ואחרי hteזיהום RT. כריתת hTERT בוטלה פעילות הטלומרז לסף המקורי ראה בmyoblasts. תוצאות מוצגות כמוצרים הטלומרז הכולל שנוצרו לשווה ערך תא (רקע מתוקן). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון זה.
אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון זה.
וידאו 1 ו -2 myotubes נוצרו מהתאים לפני ואחרי תהליך ההנצחה. תאים גדלו למפגש בתקשורת צמיחה ועברו לתקשורת בידול במשך 10 ימים. בשני קטעי הווידאו, התכווצויות תפקודיות של myotubes אחד או יותר הן לגילוי. הקלטה של עוויתות הספונטניותנעשה באמצעות עדשת 20X. לא נצפו הבדלים בין תאים הנציחו ולא הונצחו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
תאים כמשאב שימושי
הבידוד והתרבות של אוכלוסיות תאי myogenic הוא מאוד שימושי כאשר הקמת פנוטיפים מחלה או במודלים חוץ גופית של מחלה. הליך בידוד תא myogenic המתואר כאן מאפשר הבידוד של myoblasts ופיברובלסטים מדגימות שרירי שלד, אז מה שיכול להיות מופצת, הבדיל, או מייד ניתחו. מבנה ותפקוד Myoblast ניתן להעריך באמצעות בדיקה מיקרוסקופית, הערכה של הישרדות תא, הערכה של איחוי תאים, או באמצעות מחקרים מולקולריים של RNA או ביטוי חלבון. בנוסף, יכול להיות מובחן myoblasts לmyotubes שחולקים תכונות רבות של myofibers לא בוגר, המאפשר ההערכה הישירה של פונקצית היצמדות למנגנון בהקשר של פיתוח שרירים והתאוששות הבא נזק לרקמות. בעוד כל פנוטיפים אלה נוטים להיות די לשחזור בקטעים המוקדמים של תאי myogenic, התנהגותם של רבים מ 'עיקריניתן לשנות שורות תאי yogenic במהלך קטעים רבים. כתוצאה מכך, זה לפעמים רצוי להנציח שורת תאי myogenic נתון (כפי שמתואר כאן), אשר יכול להקל על הקלות של הקמת התרבות והדור של תוצאות לשחזור על פני תקופה ארוכה של זמן.
בחירה של אוכלוסיות תאים ספציפיות
פרוטוקול זה מתאר את הבידוד של תאי myogenic מרקמת שריר שלד באמצעות FACS כתכנית טיהור. האסטרטגיה המוצעת של תאי בחירה כוללת שימוש ביודיד propidium (חיווי של תאים מתים) וCD56 (סמן של תאי myogenic) כדי לבדל את תאי חיים, myogenic מהתאים מתים, פסולת, ותאים הלא-myogenic. תאים כלולים באוכלוסייה החיובית CD56 יכללו אבות myogenic מסוגלים myotubes יוצרים, בעוד שאוכלוסיית CD56-שלילי תכלול תאים שאינם myogenic כולל fibroblasts ותאים אולי adipogenic. כל אחד משברים אלה יכוליםלהיות עצמאי בתרבית כדי לייצר תרביות תאים של myoblasts או fibroblasts, והפוטנציאל להקמת תרביות תאי פיברובלסטים מקבילים יכול להיות שימושי עבור תרגילי תא או בנקאות DNA עצמאיים או תנאי שליטה נוספים כמו למבחנים המבוצעים על תרביות תאי myogenic. ישנן מספר אפשרויות אחרות לבחירת תרביות תאי myoblastic וfibroblastic ספציפיות מרקמת שריר מתעכלת, במקרים בהם מיון FACS אינו רצוי או לא זמין, אשר מתוארות במקומות אחרים 16,17. שיטה חלופית אחת להפריד תאי myoblastic וfibroblastic כרוך בשימוש בתכונות הידבקות ההפרש בין שני סוגי התאים להעשיר מעברים רצופים של תאים לסוג תא מסוים. כfibroblasts לדבוק פלסטיק הרבה יותר בקלות מאשר myoblasts, המאפשר השעיות התא כדי לדגור על פלסטיק כ 1 שעה בעת ההקמה או passaging התאים ולאחר מכן ציפוי supernatant על צלחת שונה result בהסרת fibroblasts רב מהשעית תא 18.
שירות של Fibroblasts לעומת myoblasts
ביופסיות שריר מחולים משמשות בדרך כלל לטיהור תאי שריר העיקריים, עם זאת myoblasts החולה לא יכול להתרבות באופן יעיל ויכולות רק לעבור כמה מספר החטיבות במבחנה, וכן הוא מחייב הנצחת תא כדי להגיע למספר הגבוה של חטיבות הכרחיות. בהתחשב בכך שניתן לבודד שני fibroblasts וmyoblasts מביופסיות שריר, צריכים להישמר שני השברים התא מדגימות חולים, כפי שהם יכולים גם להיות שימושיים ומציעים הרבה צדדיות עבור יישומים במורד הזרם. לדוגמא, fibroblasts יכול לשמש לייצור תאים המושרה pluripotent גזע (iPSCs), המחזיקים הרבה הבטחה ליצירת מספרים סלולריים בלתי מוגבלים והפוטנציאל ללהיגרם להתמיין שושלות תאים מרובות. תכונות אלה רצויות מאוד עבור תאים המתקבלים ממטופלים עם מחלות נדירות, שניתן לתקן פוטנציאל במבחנה או בשימוש בהקרנות תרופה ניסיוניות בחיפוש אחרי תרכובות טיפוליות. גם myoblasts הונצח ניתן להשתמש בהקרנה מבוססת תרופה. Fibroblasts ניתן גם להמיר ביעילות כלפי גורל myogenic על ידי זיהום בוירוס להביע Myod 19-21. שיטה זו נבדקה ביעילות באמצעות fibroblasts מופק מחולים עם מחלות שריר ואישרה כי fibroblasts להביע Myod יכול למעשה ליצור myotubes המבטא חלבוני שריר בוגרים. לפיכך, שני סוגי התאים ניתן להשתמש ביעילות במספר יישומים במורד הזרם ולספק חומר רב ערך ללימודי אבחון וטיפול.
השפעה של הנצחה
ההנצחה של תאי דיפלואידי נורמלים מאפשרת לאדם להכין קו יציב של תאי אדם שניתן לאפיין באופן מלא ונחקר על ידי מעבדות רבות ושונות. תרבויות עיקריות מעצמאיבידודים יכולים להשתנות ויכולת השגשוג הכוללת שלהם יכולה להיות משתנה כאשר נזק הוא הציג בתהליך הניתוק או על ידי overdigestion, אשר יכול לעוות את תרבות ההתנהגות. ההנצחה של תאים באמצעות הביטוי של תת-היחידה הקטליטית של telomerase (hTERT) יש את היתרון כדי לשמור על הפנוטיפ סלולארי יציב ותאים נשארים דיפלואידי. היו דיווחים בעכברים שהטלומרז יכול לווסת את מסלול ה- Wnt 22. יש לנו לא נתקל בתופעה זו בתאים אנושיים. עם זאת, כדי להימנע מסיבוך פוטנציאלי כזה, קלטת hTERT כבר מוקפת באתרי לקס, כך שהוא יכול להיות הוסר לאחר הטלומרים כבר מוארכים. הטלומרים ארוכים להעניק מאות חטיבות נוספות, בדרך כלל מספיק כדי לבצע את רוב הניסויים.
בגלל הרחבת תא רציפה תמיד מספקת יתרון סלקטיבי לצמיחה מהירה, פנוטיפ הסלולרי יכול לעתים להיות מוטה עקב צמיחת יתר של החלוקה בקצב מהיר ביותרתאים, ולא תאי ההבחנה הטובים ביותר. אמנם זה עדיין לא הוכיח את עצמו בבעיה משמעותית בשיטה המתוארת, ניתן לתיקון זה על ידי הפשרת תאים שהוקפאו בשלב מוקדם בהיסטוריה התרבות שלהם או על ידי בחירה משובט לתאים המציגים את הפנוטיפ הרצוי.
לבסוף, תוך התרחבות של תאי myogenic למספרים בלתי מוגבלים ליד יש יתרונות להקרנת סמים ודוגמנות מחלה אפשרית, יש לי הטכניקות הנוכחיות גם חסרונות מהותיים המונעים את השימוש בתאים אלה ככלי רכב טיפוליים בטיפול המבוסס על תא, או כלי אבחון ראשוניים כ. שני נרחבים בצעדי תרבות והנצחת מבחנה לשנות את הפנוטיפ של תאי שריר בהשוואה למצב הטבעי שלהם. חשוב לציין, תאים אלה הרחיבו בסביבה שהוא שונה מאוד מהסביבה הטבעית של תאי לווין העיקרי בתוך הנישה שלהם. לכן, תאים הונצחו דורשים בדיקה אינטנסיבית בטיחות ואולי development של טכניקות חדשות אם ברצונם להיות שוב הציג לתוך השריר של המטופל אנושי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Tissue culture biosafety hood | Baker Company, Inc. | Model SterilGuard Hood | |
| Benchtop centrifuge, such as Beckman Model | Beckman Coulter | Model Allegra 6R | If cell sorting is performed, a centrifuge with refrigeration is preferred |
| Microscope | Nikon | Model Eclipse TS100 | |
| Tissue culture incubator, connected to a CO2 source | Forma Scientific | Series II | |
| Fluorescence-activated cell sorter (FACS) | Becton Dickinson | Model Aria | |
| Reagents for isolation of primary myoblasts from tissue | |||
| Dispase II | Roche Applied Science | #04942078001 | Prepare a sock solution of 2.4U/ml in DMEM |
| Collagenase D | Roche Applied Science | #088882001 | Prepare a stock solution of 10 mg/ml |
| 1x Sterile Hank’s Balanced Saline Solution (HBSS), calcium and magnesium free | GIBCO Life Technologies | #14185-052 | |
| Bovine serum albumin, fraction V | Sigma | #05470 | Prepare a sterile solution of 1X HBSS 0.5% BSA for FACS sorting |
| Sterile growth medium for myoblasts: Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) with high glucose (4.5 g) supplemented with 30% fetal bovine serum | GIBCO Life Technologies | 11965-092 | Contains L- glutamine |
| RBC lysis solution | Qiagen | 158904 | |
| Propidium Iodide stock 10mg/ml | Sigma | P4170 | Prepare the stock solution by diluting the powder in sterile distilled water |
| Anti-human CD56 antibody for flow cytometry | Biolegend | 318310 | APC-conjugated antibody, other labels are avaialable |
| Reagents for immortalization of primary myoblasts | |||
| Ecotropic packaging cell line PE | Cell Biolabs | RV-101 | |
| Amphotropic packaging cell line PA3174 | Cell Biolabs | RV-102 | |
| Pig skin gelatin | Sigma | G1890-500g | Prepare a stock solution of 0.1% gelatin in water. Coat the dish with the solution at 37°C for one hour. Remove the solution and add medium. |
| PolyJet | Signagen | SL100688 | |
| G418 | Fisher | 345812 | |
| Hygromycin | EMD Biosciences | 400051 | |
| pBabe plasmids containing mCDK4 and hTERT | not commercially available | Stadler et al, 2013 | |
| Qiagen plasmid midiprep kit | Qiagen | 12143 | |
| Medium 199 | Life Technologies | Medium 199 (31150022) | |
| Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) | Life Technologies | DMEM (11965-092) | Mix 4:1 DMEM:199 |
| Myoblast growth medium: 4:1 Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) and Medium 199 supplemented with 15% fetal bovine serum; 0.02 M HEPES buffer; 1.4 mg/L vitamin B12; 0.03 mg/L ZnSO4, 0.055 mg/L dexamethasone, 2.5 μg/L hepatocyte growth factor and 10 μg/L beta fibroblast growth factor. | Life technologie (DMEM, F199); Atlanta Biological (FBS); Invitrogen (Hepes); Fisher (ZincSulfate); Sigma (Vit.B12, Dexamethasone); Chemicon international (HGF); Biopioneer (betaFGF) | #15630-080 (Hepes); #Z68-500 (ZnSO); #V2876.#D4902 (Vit.B12, Dex); GF116 (HGF); HRP-0011 (bFGF). | Prepare media and stock solution Vit. B12 (20mg/ml); ZincSulfate (60µg/ml); Dex (55µg/µl) separately for easier use. HGF stock solution (5µg/ml) and FGF (20µg/ml) should be added freshly every week at the final working concentration. |
| TrypLE express | GIBCO Life Technologies | 12605-010 | |
| Myosin heavy chain antibody for immunostaining | Developmental Hybridoma Bank | MF20 | Clone MF20 |
| Desmin Antibody for immunostaining | Thermo Scientific | MS-376-S0 | Clone D33 |
| Horse serum | Invitrogen | 26050-088 | |
| Reagents for primary skin fibroblast isolation | |||
| Transport medium: RPMI 1640 supplemented with 10% fetal bovine serum and 0.2% penicillin/streptomycin | RPMI medium 1640: GIBCO Life Technologies | 11875-093 | |
| Human primary fibroblast culture medium: RPMI 1640 supplemented with 10% fetal bovine serum and 1% penicillin/streptomycin | Fetal bovine serum: Thermo Scientific | SH30071.03 | |
| Collagenase solution: Collagenase type 2 (100 mg) resuspended in 12.5 ml of fibroblast culture medium and filter-sterilized | Worthington | 4176 | |
| Sterile 1X Phosphate Buffer Saline (PBS) calcium and magnesium free | Lonza | 17-516F | |
| Materials for isolation of primary myoblasts | |||
| 50 ml and 15 ml sterile conical tubes | GeneMate/Bioexpress | C-3394-4 (50 ml) ; C3394-1 (15 ml)) | |
| Sterile scalpels | Aspen Surgical | 372610 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 1492 | |
| Sterile 5, 10, and 25 ml pipettes | Bellco glass | 1226-05010 (5 ml); 1200-10010 (10 ml) ;1228-25050 (25 ml) | Reusable pipettes are washed, cotton plugged and autoclaved before use |
| Sterile tissue culture-treated plastic dishes (10 cm) | BD Falcon | 353003 | |
| Sterile nylon cell strainers (100 µm and 40 µm size) | BD Falcon | 352340 (40µm); 352360 (100µm) | |
| Materials for myoblast immortalization | |||
| Sterile 0.45 µm filters | Millipore | SLHV013SL | |
| Cloning rings | Corning | #3166-8 | To be cleaned and autoclaved before and after use |
| Materials for fibroblast cell lines | |||
| Sterile 35 mm tissue culture-treated plastic dishes | Greiner bio-one | 628160 | |
| Sterile scalpels | DeRoyal | D4510A | |
| Sterile T25 tissue culture flasks | Techno Plastic Product, TPP | 90026 | sold in the USA by MIDSCI |
| TrypLE express | GIBCO Life Technologies | 12605-010 |
References
- Flanigan, K. M. The muscular dystrophies. Semin Neurol. 32, 255-263 (2012).
- Mercuri, E., Muntoni, F. Muscular dystrophies. Lancet. 381, 845-860 (2013).
- Sharples, A. P., Stewart, C. E. Myoblast models of skeletal muscle hypertrophy and atrophy. Curr Opin Clin Nutr Metab Care. 14, 230-236 (2011).
- Tran, T., Andersen, R., Sherman, S. P., Pyle, A. D. Insights into skeletal muscle development and applications in regenerative medicine. Int Rev Cell Mol Biol. 300, 51-83 (2013).
- Miller, A. D., Buttimore, C. Redesign of retrovirus packaging cell lines to avoid recombination leading to helper virus production. Mol Cell Biol. 6, 2895-2902 (1986).
- Schubert, W., Zimmermann, K., Cramer, M., Starzinski-Powitz, A. Lymphocyte antigen Leu-19 as a molecular marker of regeneration in human skeletal muscle. Proc Natl Acad Sci U S A. 86, 307-311 (1989).
- Mechtersheimer, G., Staudter, M., Moller, P. Expression of the natural killer (NK) cell-associated antigen CD56(Leu-19), which is identical to the 140-kDa isoform of N-CAM, in neural and skeletal muscle cells and tumors derived therefrom. Ann N Y Acad Sci. 650, 311-316 (1992).
- Pavlath, G. K., Gussoni, E. Human myoblasts and muscle-derived SP cells. Methods Mol Med. 107, 97-110 (2005).
- Boldrin, L., Muntoni, F., Morgan, J. E. Are human and mouse satellite cells really the same. J Histochem Cytochem. 58, 941-955 (2010).
- Belles-Isles, M., et al. Rapid selection of donor myoblast clones for muscular dystrophy therapy using cell surface expression of NCAM. Eur J Histochem. 37, 375-380 (1993).
- Meng, J., Adkin, C. F., Xu, S. W., Muntoni, F., Morgan, J. E. Contribution of human muscle-derived cells to skeletal muscle regeneration in dystrophic host mice. PLoS One. 6, e17454 (2011).
- Zhu, C. H., et al. Cellular senescence in human myoblasts is overcome by human telomerase reverse transcriptase and cyclin-dependent kinase 4: consequences in aging muscle and therapeutic strategies for muscular dystrophies. Aging Cell. 6, 515-523 (2007).
- Mamchaoui, K., et al. Immortalized pathological human myoblasts: towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders. Skelet Muscle. 1, 34 (2011).
- Sigmund, C. D., Stec, D. E. Genetic Manipulation of the Renin-Angiotensin System Using Cre-loxP-Recombinase. Methods Mol Med. 51, 53-65 (2001).
- Ludlow, A. T., et al. Quantitative telomerase enzyme activity determination using droplet digital PCR with single cell resolution. Nucleic Acids Res. 42, e104 (2014).
- Jankowski, R. J., Haluszczak, C., Trucco, M., Huard, J. Flow cytometric characterization of myogenic cell populations obtained via the preplate technique: potential for rapid isolation of muscle-derived stem cells. Hum Gene Ther. 12, 619-628 (2001).
- Gharaibeh, B., et al. Isolation of a slowly adhering cell fraction containing stem cells from murine skeletal muscle by the preplate technique. Nat Protoc. 3, 1501-1509 (2008).
- Qu, Z., et al. Development of approaches to improve cell survival in myoblast transfer therapy. J Cell Biol. 142, 1257-1267 (1998).
- Choi, J., et al. MyoD converts primary dermal fibroblasts, chondroblasts, smooth muscle, and retinal pigmented epithelial cells into striated mononucleated myoblasts and multinucleated myotubes. Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 7988-7992 (1990).
- Huard, C., et al. Transplantation of dermal fibroblasts expressing MyoD1 in mouse muscles. Biochem Biophys Res Commun. 248, 648-654 (1998).
- Lattanzi, L., et al. High efficiency myogenic conversion of human fibroblasts by adenoviral vector-mediated MyoD gene transfer. An alternative strategy for ex vivo gene therapy of primary myopathies. J Clin Invest. 101, 2119-2128 (1998).
- Park, J. I., et al. Telomerase modulates Wnt signalling by association with target gene chromatin. Nature. 460, 66-72 (2009).
Tags
רפואה גיליון 95 ביופסיה שרירי שלד עור רקמת ניתוק טיהור והיצמדות למנגנון הנצחה והיצמדות למנגנון הקפאת תאErratum
Formal Correction: Erratum: Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling
Posted by JoVE Editors on 11/12/2016.
Citeable Link.
A correction was made to the authors section in: Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling
One of the authors names was corrected from:
Stacy C. Cossette
to:
Stacy A. Cossette
