ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Protocol
注：协议收集人体组织必须审查和批准的机构IRB委员会。收集丢弃，去识别人体组织已经批准了波士顿儿童医院和布里格姆妇女医院IRB委员会。以下描述的方法已经应用于用于从去标识肌细胞的分离，丢弃的组织。所描述的方法适用于组织从患者同意收集材料。
1.细胞分离
- 肌肉活检和肌原细胞的纯化的离解
- 预先称重10cm的组织培养板在组织培养生物安全罩，然后重新称重含有肌肉活检来计算组织的量的板被解离。
- 使用无菌手术刀，肉的肌肉组织和细加几滴无菌1X HBSS以防止组织干燥。
- 添加每个迪为3.5mlspase II和每克肌肉组织胶原酶ð被消化。通过无菌25毫升吸管几次吸取的组织糜和酶溶液。孵育板在组织培养培养箱中于37℃，5％CO 2的15分钟和消化组织直至浆料容易传递虽然灭菌的5毫升吸管。
注：组织离解，通常通过酶消化内45-90分钟达到。请参阅'代表结果“部分了解更多详细信息。 - 添加2倍体积的无菌生长培养基分离的组织，滤波器的通过100微米的细胞过滤过50ml锥形管中，沉淀的细胞10分钟，在329×g离心（〜1100转），室温。请参考材料表介质组合物。
- 重悬沉淀在1体积的无菌生长培养基并加入7倍体积的红血细胞溶解液。过滤通过40微米的细胞过滤的溶液中，然后沉淀吨他的细胞10分钟，在329×g离心，室温。
- 计数细胞在血细胞计数器和重悬细胞于1×HBSS中的0.5％BSA的1×10 6个细胞/ 100微升的浓度。预留〜250,000个细胞在单管，将用作为负（未染色）的控制。预留额外的单色染控制管碘化丙啶和CD56，这是必需的CD56阳性细胞的FACS分选合适的门。请参考细胞分选说明书或FACS分拣核心设施的专家，以确保适当的控制包括咨询。
- 染色的细胞进行排序与5微升/ 10 6细胞抗CD56抗体。在冰上孵育所有样品（包括对照）处理30分钟。
- 在10ml 1×HBSS洗涤样品并沉淀细胞在329×g离心（〜1100转）在冷冻离心机，4℃下10分钟。
- 以1微克/ ml的终浓度添加碘化丙啶至样品为SOR泰德排除死细胞。净化从使用荧光激活细胞分选仪的非肌细胞肌CD56阳性细胞。
- 皮肤活检的解离
注：真皮成纤维细胞可以从皮肤拳打患者进行隔离时，肌肉活检不可用。真皮成纤维细胞可以被用作生物材料的许多研究，包括转导的MyoD，以产生肌原细胞。另外，皮肤成纤维细胞可用于产生iPS细胞，这可以分化成为进一步研究各种细胞类型。- 运输皮肤活检在输送介质实验室。一旦接收样本，尽快进行原代培养。如果主培养不能在同一天被建立，存储所述样品在室温下过夜。
- 转移的皮肤活检在层流罩中的无菌35mm平皿。
- 冲洗皮肤活检在培养皿用无菌1X PBS以清除血液和碎片。用无菌解剖刀除去脂肪组织。
- 加入2 ml胶原酶溶液和剁碎用手术刀将组织，孵育在37℃下45分钟到1小时，这取决于组织的大小。
- 转移消化的组织到15ml锥形管中，冲洗培养皿以2 ml成纤维细胞培养基中两次，并收集在同一个管中的介质。
- 沉淀细胞，在200×g离心5分钟，在室温下进行。
- 弃去上清液，并用3 ml成纤维细胞培养基洗涤沉淀，再次除去胶原酶，然后沉淀细胞。请参考材料表介质组合物。
- 重复步骤1.2.7一次。
- 重新悬浮的沉淀在5ml成纤维细胞培养基和细胞板到一个T25的无菌组织培养烧瓶中。孵育烧瓶在37℃，5％的CO 2。
- 评价培养成纤维细胞附着和生长在未来1-3天。<BR />注：一些小的组织块也可以连接到板和成纤维细胞移植这些组织片段。
- 维持培养相同的条件下，直至成纤维细胞生长至约80％汇合。
- 通过胰酶消化收集成纤维细胞和转移到新鲜培养瓶中额外的扩展。通过洗涤的文化在1X PBS 3次游离Ca ++和Mg ++的执行胰酶消化。加入胰蛋白酶-EDTA（见材料表），以将细胞（2毫升/ T25培养瓶中）为2分钟，在37℃。
- 分裂细胞分离到额外的瓶中。如果一些组织片保持附着到原始T25烧瓶，加入5 ml新鲜培养基到该烧瓶中，并更成纤维细胞会迁移出不断。
注：扩展成纤维细胞培养物可以被冷冻下来为P1，并存储在液氮中未来的实验。
2.永生肌细胞
- 料的细胞30分钟前，转染用5ml新鲜培养基补充了10mM咖啡因。
- 从一个MIDI准备（CDK4或hTERT基因的质粒）和均匀的PolyJet的2微克质粒DNA的混合物中，并在室温下孵育15分钟，如制造商推荐的。
- 质粒/混合的PolyJet添加到PE细胞过夜。
- 喂细胞用新鲜的培养基（DMEM培养基和199中的4：1的比例，补充有10％小牛血清）。 12小时后，收集含病毒的上清液，并通过0.45μm孔径过滤器过滤。
- 使用1毫升回收的上清的感染过夜嗜包装细胞系PA317 5和选择后获得稳定的病毒产生细胞系与任一为0.5mg / ml的新霉素（G418），用于CDK4或0.5毫克/毫升潮霉素为端粒酶。
- 准备通过发展稳定的包装细胞融合附近，然后收获上清液每天早晨，傍晚和清晨的三丰收工作病毒上清。
- 过滤病毒上清，要么在-80直接使用或把它们分为1ml等份并储存℃下以备后用。需要注意的是病毒上清失去50％的感染效率与每个冻融。记得漂白洗丢弃一切已经触及病毒颗粒之前。
注：稳定PA317病毒产生细胞系可以被冻结，并保持在-150℃下的永久存储（冷冻培养基在10％的DMSO; 90％血清）。 - 板的FACS纯化的肌细胞以5×10 4个细胞/孔在6孔板涂有0.1％明胶的密度（1.1-1.9中的步骤描述）。确保细胞被附着在板继续进行病毒感染之前。
- 加入400微升过滤，女reshly制备病毒上清或冷冻等分试样，以每6孔板过夜（保持2孔作为对照）。
- 通过用2.5ml /孔的新鲜肌肉媒体（4喂食细胞改变介质：; 0.02M的HEPES缓冲液; 1.4毫克/升维生素B12; 1 Dulbecco改进的Eagle培养基（DMEM）和培养基199补充有15％胎牛血清0.03毫克/ L的硫酸锌，0.055毫克/ L的地塞米松，2.5微克/升的肝细胞生长因子与10μg/ L的碱性成纤维细胞生长因子）。丢弃含有漂白剂容器中的病毒颗粒的媒体和吸管。离开细胞在相同培养基中3天，以从感染中恢复，然后用任一400微克/ ml的新霉素（CDK4感染）或300微克/毫升潮霉素（hTERT的感染）治疗供选择。
- 保持在药物选择细胞直至细胞在对照培养皿模具（1-2周）。
- 传代细胞，才成为汇合（60-80％汇合;采用0.05％胰蛋白酶的EDTA），即使是在selecti上期。 Replate细胞多10cm培养皿新鲜的成肌细胞的培养基（如2.11所述）补充与选择的药物。保持永生选择细胞作为异质群体或克隆，以获得完全均匀的遗传背景（转基因的每一个细胞都在相同的插入）。
- 使用以下步骤进行克隆选择：
- 种子的细胞以低密度（ 例如 300到500个细胞于10cm菜），并保持它们为约两周，直到小菌落形成（10-20个细胞）。
- 除去大部分介质在这一点上，只留下一薄膜，防止细胞干燥。
- 将一个克隆环（有机硅真空硅脂一端蘸上）在每个需要的克隆，并添加几滴胰蛋白酶/ EDTA的。
- 收获细胞一旦成为用1毫升提示或巴斯德吸管吸仔细的细胞，并将它们转移到最小可用多孔解放军杀进德（96或48，24或12孔板）。
- 根据需要，以防止局部融合展开克隆。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
图1示出的一些参与了主组织离解的关键步骤：组织的确切量在无菌组织培养培养皿称重（ 图1A，B）。然后将组织细使用无菌手术刀切碎，直到组织浆料得到（ 图1C，D）。下列另外的消化酶，主要肌肉组织离解，通常通过酶消化内45-90分钟达到。组织消化的进展通常监视每15-20分钟，以防止过量酶切和细胞死亡。酶消化可以轻轻吸入混合几次每次15-20分钟。在消化步骤结束时，将细胞用100微米（ 图1E，F），然后用40μm的过滤器过滤。取决于起始肌肉组织的量，以及是否将样品从轻度或严重受影响的肌肉中，解离的主CEL得到LS将是不均匀的。 图1G示出了紧接在消化之后的单核细胞在悬浮液中的一个例子，而图1H示出了以下的消化和镀在组织培养皿的解离原代细胞3-6小时的一个例子。肌细胞通常与成纤维细胞和成脂细胞混合。免疫细胞也可以存在于其中炎症是与患者的疾病相关的案例。因此，不同的细胞类型的潜在的分离可能是可取的。对于人类肌细胞的准隔离，CD56或N-CAM已被广泛地用作可靠的标志6-9。隔离生肌祖细胞富集和之前细胞永生化过程后不久，这可能净化是有益的。替代地，原代细胞的永生化可以先执行，可以基于CD56的通过FACS表达来选择然后永生成肌细胞。示意图上之前的FACS分选和FACS分布的示例所必需的步骤示于图2。简言之，原代细胞进行计数，并再悬浮在高浓度所指示的，则第一抗体（ 即抗CD56）被加入到细胞中，并温育在冰上30分钟。以下洗涤，将细胞通过荧光活化细胞分选仪进行分析和纯化（ 图2）CD56阳性细胞.The产率约从样本变化来样，从总的单核细胞的40-70％。产率的变化取决于个体的年龄和是否生肌细胞从不受影响或患病的肌肉萃取。不受影响肌肉通常具有肌细胞的高百分比，而营养不良的肌肉中往往有CD56阳性细胞的比例较低。纯化的细胞铺板在完整肌生长培养基（见材料表 ）。细胞可通过胰蛋白酶消化进行传代时，他们REACħ60-70％汇合。 CD56表达细胞是成肌和能够形成在体外 10,11肌管肌细胞的.The永生化需要两个基因12,13的顺序转染（如系统化在图3中）的。细胞周期蛋白依赖性激酶4（CDK4）被用于克服组织培养的应力由于培养条件不足，人端粒酶逆转录酶（hTERT）防止端粒缩短由于结束复制现象12。这两种预病毒质粒是在pBAbe骨干载体。鼠标CDK4的cDNA构建体含有新霉素抗性基因和hTERT cDNA的构建体含有潮霉素抗性基因。后者还包含一个单纯疱疹病毒胸苷激酶（TK）盒和loxP位点放置在hTERT启动/ TK盒的两端。这允许整个表达单位的使用更昔洛韦Cre重组酶14和反选择的切除。
新近永生化细胞可以保持作为一个群体，其中所述的病毒被集成在不同的位点，或克隆，以获得完全均质的遗传背景（单次插入中的细胞基因组中和其后代）。在多数情况下，分离的克隆从一个主人口将导致依赖于在细胞基因组中的磁带盒的插入克隆中略有不同。此外，广泛的组织文化将有利于选拔细胞生长优势，而不是那些与众不同的。我（300至500个细胞于10cm菜如 ），培养约两个星期，直到小菌落形成（10-20个细胞）的单克隆溶胶化是由种子细胞以低密度简单地完成。大多数培养基然后除去，只留下一个薄膜以防止细胞干燥。克隆利用克隆环胰蛋白酶处理，然后根据需要扩大。膨胀永生克隆可以用于普通生肌细胞标记物，如CD56通过FACS，结蛋白和MyoD的表达通过免疫荧光，或基于分化肌管形成的表达进行测试。肌管是最明显的，当汇合肌原细胞（90％汇合）置于分化培养基（DMEM培养基和199中的4：1的比例，补充有2％马血清）后3-5天（ 图4）。没有差异，看到在肌管形成和非永生化的对照细胞和永生化细胞间肌管收缩的能力（视频1和2）。
图5）来测定。的生长曲线的实例显示在图5A中 ，在那里，观察端粒缩短作为细胞扩增为通道的扩展号码。相反地，成功永生化与增加端粒酶活性相关（ 图5）
图1：下面的组织的放置为原发性人体肌肉组织离解的关键步骤插图（A）中称量空培养板，前组织放置和（B）（C）的无菌手术刀用于剁碎的组织，直到（D）组织它自被还原成浆液。胶原酶和分散酶加入并组织消化45-90分钟，然后将消化是通过尼龙网过滤器过滤，以丢弃碎屑（E，F）。（G，H）的新鲜分离细胞解离之后立即镀的例子（G ）或3离解后小时，当主细胞开始沉降（H）。
图2：通过荧光激活细胞分选仪纯化之前参与人类成肌细胞染色程序的工作流被突出显示用于FACS分析之前人类细胞染色的关键步骤。也显示FACS图的例子。阴性对照（左图）用于建立分拣门。在右侧面板，表达CD56阳性细胞被门控和percenta显示阳性细胞GE。这种策略可以用于之前永生或以下的永生化过程要么纯化肌原细胞。
图3：示意病毒生产的永生成肌细胞 。逆转录病毒的生产工作流程中使用不朽成肌细胞。无论是含有CDK4或两侧装接loxP的hTERT-TK磁带在pBabe骨干质粒构建（左）转染到凤凰亲嗜性（PE）包装细胞系过夜（8-12小时）使用的PolyJet。上清液过滤后，然后转移到凤凰嗜包装细胞系（PA317）。来自这些细胞的上清液可以直接使用，或者所述细胞可以与任一新霉素或潮霉素进行选择，以产生一个稳定的细胞系以供将来使用。在FILT的等份ERED上清液可以储存在-80℃以备后用（具有失去50％的效率）。漂白用于清洁在该过程的所有点使用的每消耗的。
图4：示意图可逆永生成肌细胞的工作流的永生化步骤（顶部）的：主细胞首先转染CDK4。后新霉素选择时，成肌细胞转染与含有两个选择标记一两侧装接loxP hTERT基因盒; HSV-TK和潮霉素。如果需要的话，在稍后的时间，该端粒酶盒可以被“两侧装接loxP”由表达Cre重组酶和与更昔洛韦选择用于切除。这允许“再mortalization”的成肌细胞和再启动端粒缩短的。如果端粒是20 kb的长，这仍然允许数百倍增，避免吨他复杂的过表达端粒酶的。最后，从永生化人口等基因的克隆可被分离。新近永生化细胞的myogenicity可以使用肌细胞特异性标记例如结蛋白（左下面板，将细胞在生长培养基用抗结蛋白，克隆D33，绿色）显示。此克隆是这样生肌分化的细胞被认为即使细胞维持在增殖的条件。当细胞分化在分化培养基（含2％马血清，中，右面板）肌管形成变得非常广泛。几乎所有沾上MF20抗体胚胎肌球蛋白重链（绿色）和肌管细胞有多个细胞核DAPI染色（蓝色，所有图像）。 请点击此处查看该图的放大版本。
LES / ftp_upload / 52307 / 52307fig5highres.jpg“/>
图5：永生化过程的验证。 （A）从小学成肌细胞，不朽的人口（成肌细胞的hTERT-CDK4），并重新mortalized克隆等基因克隆的生长曲线（成肌两侧装接loxP的hTERT-CDK4）显示为例子。在增长率没有差异，检测前的细胞达到衰老。端粒缩短监测作为群体倍增和端粒长度是由TRF测定的功能。（B）的早期时间点，并在成肌细胞（5个时间点从PD 13至75）晚复制示出的是实施例的TRF，重新mortalized成肌细胞后hTERT的切除（3个时间点从PD 62至152）和永生成肌细胞（PD 75和200）。（C）的成功hTERT的感染转化为增加的端粒酶活性。 15细胞前后HTE;通过ddTRAP（量化分析的，左ddTRAP读出，右）端粒酶活性进行了评估RT感染。端粒酶切除废除端粒酶活性，出现在成肌细胞原有阈值。结果显示为每个细胞当量（背景校正）产生的总端粒酶的产品。 请点击此处查看该图的放大版本。
画1和2从肌管细胞之前和永生化过程之后产生的。细胞生长在生长培养基中至汇合，并切换到分化培养基10天。在这两个视频，一个或多个功能性肌管收缩是可检测的。自发抽搐记录做使用20X镜头。永生化和非永生化细胞之间没有观察到差异。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
细胞作为一种有用的资源
建立疾病表型或疾病的体外模型时，肌细胞群的分离和培养是非常有用的。此处所描述的生肌细胞分离过程允许从骨骼肌标本，然后可以被传播，分化，或立即分析成肌细胞和成纤维细胞的分离。成肌细胞的结构和功能可以通过显微镜检查来评价，细胞存活，细胞融合的评价的评价，或者通过RNA或蛋白质表达的分子研究。此外，成肌细胞可以分化成肌管共享未成熟的肌纤维，这使得成肌细胞功能的肌肉发育和恢复之后组织损伤的情况下的直接评估的许多功能。虽然所有这些表型的往往是在肌细胞的早期传代相当重现性，许多主米的行为yogenic细胞系，可以改变在许多通道的过程。其结果，有时希望以永恒给定生肌细胞系（如这里描述的），这可以促进培养建立的容易性和在一段较长的时间可再现的结果的产生。
选择特定的细胞群
这个协议描述了从骨骼肌组织使用FACS作为纯化方案肌细胞的分离。选择细胞的提出的策略包括使用碘化丙啶（死细胞的指标）和CD56（肌原细胞的标记物），以区分死细胞，碎片，和非肌细胞活，生肌细胞。中所含的CD56阳性细胞群将包括能够形成肌管的生肌祖细胞，而CD56阴性群体将包括非肌细胞，包括成纤维细胞和可能的成脂细胞。每个级分的可是独立地培养，以产生成肌细胞或成纤维细胞，以及潜在的细胞培养物来建立并行的成纤维细胞的细胞培养物可用于独立的细胞或DNA银行练习或对肌细胞培养物正在执行的额外的控制条件对测定中。还有其他几种选择特定的成肌细胞和成纤维细胞培养，从消化肌肉组织的选择，在情况下，FACS分选是不可取的或者不可用，这在其他地方16,17描述。一种可供选择的方法来分离成肌细胞和成纤维细胞涉及使用这两种细胞类型之间的差的粘合性，以丰富的细胞连续传代对于给定的细胞类型。如成纤维细胞附着于塑料更容易比成肌细胞，使细胞悬浮液孵育塑料为约1小时建立或传代的细胞时，然后电镀上清液到一个不同的菜将RESULT在从细胞悬浮液18除去许多成纤维细胞。
成纤维细胞与成肌细胞的效用
通常用于从患者肌肉活检原发性肌肉细胞的纯化，但患病成肌细胞未必能有效地增殖，并可以仅经历体外分割数数，因此要求细胞永生化，达到高数必要分割。鉴于这两个成纤维细胞和成肌细胞可以从肌肉活检中分离，这两种细胞的级分应该从患者样品被保存，因为它们既可以是有用的，并提供多多功能为下游应用。例如，成纤维细胞可用于诱导多能干细胞（iPS细胞），其持有很大希望以产生无限的细胞数目和电势的产生被诱导分化成多种细胞谱系。这些特征是用于从患者获得的细胞高度期望s的罕见疾病，其可以潜在地在体外或校正用实验药物掩护寻找用于治疗的化合物。永生成肌细胞也可以用在基于药物的筛选中使用。成纤维细胞也可有效地转换朝向生肌命运由感染用表达MyoD的19-21病毒。此方法已被使用的成纤维细胞从患者肌肉疾病萃取有效测试和证实MyoD的表达成纤维细胞可有效地形成该表达成熟肌肉肌管的蛋白质。因此，这两种类型的细胞，可以有效地在多个下游应用使用并用于诊断和治疗的研究提供了宝贵的材料。
永生化的影响
正常二倍体细胞的永生化允许一个以制备稳定的人细胞系，可以充分表征和研究了许多不同的实验室。从独立的原代培养隔离可以改变，并且当破坏设置在离解过程中或通过过量酶切，可扭曲培养行为引入其整体增殖能力是可变的。使用端粒酶（hTERT基因）的催化亚基的表达细胞的永生化的优点在于，以维持稳定的细胞表型和细胞保持二倍体。曾有报道小鼠端粒酶可以调节Wnt通路22。我们没有观察到这种现象在人类细胞。然而，为了避免这种潜在的复杂化，hTERT的磁带盒已被侧翼具有lox位点，以便它可以端粒已拉长之后被移除。长端粒赋予额外的数百个师，通常就足够了开展大多数实验。
由于连续的细胞膨胀总是会为快速增长的选择性优势，细胞表型可以偶尔成为偏由于最迅速分裂增生细胞，而不是最好的分化细胞。虽然这还没有被证明是使用所描述的方法的显著问题，它可以通过解冻已冻结的早在其培养历史或由克隆选择为表现出所需表型的细胞的细胞进行补救。
最后，虽然扩张肌细胞对邻近无限数量方面具有优势用于药物筛选和可能疾病建模，目前的技术还具有防止利用这些细胞作为治疗的车辆中的基于细胞的疗法，或作为主要诊断工具的固有缺点。无论是在体外培养和永生化的步骤广泛改变肌细胞的表型相比，它们的天然状态。重要的是，这些细胞中的环境下，从主卫星细胞小生其内的天然环境非常不同的扩展。因此，永生化细胞需要强烈的安全测试，并可能开发板新技术pment如果它们要被重新引入到人类患者的肌肉。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Tissue culture biosafety hood | Baker Company, Inc. | Model SterilGuard Hood | |
| Benchtop centrifuge, such as Beckman Model | Beckman Coulter | Model Allegra 6R | If cell sorting is performed, a centrifuge with refrigeration is preferred |
| Microscope | Nikon | Model Eclipse TS100 | |
| Tissue culture incubator, connected to a CO2 source | Forma Scientific | Series II | |
| Fluorescence-activated cell sorter (FACS) | Becton Dickinson | Model Aria | |
| Reagents for isolation of primary myoblasts from tissue | |||
| Dispase II | Roche Applied Science | #04942078001 | Prepare a sock solution of 2.4U/ml in DMEM |
| Collagenase D | Roche Applied Science | #088882001 | Prepare a stock solution of 10 mg/ml |
| 1x Sterile Hank’s Balanced Saline Solution (HBSS), calcium and magnesium free | GIBCO Life Technologies | #14185-052 | |
| Bovine serum albumin, fraction V | Sigma | #05470 | Prepare a sterile solution of 1X HBSS 0.5% BSA for FACS sorting |
| Sterile growth medium for myoblasts: Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) with high glucose (4.5 g) supplemented with 30% fetal bovine serum | GIBCO Life Technologies | 11965-092 | Contains L- glutamine |
| RBC lysis solution | Qiagen | 158904 | |
| Propidium Iodide stock 10mg/ml | Sigma | P4170 | Prepare the stock solution by diluting the powder in sterile distilled water |
| Anti-human CD56 antibody for flow cytometry | Biolegend | 318310 | APC-conjugated antibody, other labels are avaialable |
| Reagents for immortalization of primary myoblasts | |||
| Ecotropic packaging cell line PE | Cell Biolabs | RV-101 | |
| Amphotropic packaging cell line PA3174 | Cell Biolabs | RV-102 | |
| Pig skin gelatin | Sigma | G1890-500g | Prepare a stock solution of 0.1% gelatin in water. Coat the dish with the solution at 37°C for one hour. Remove the solution and add medium. |
| PolyJet | Signagen | SL100688 | |
| G418 | Fisher | 345812 | |
| Hygromycin | EMD Biosciences | 400051 | |
| pBabe plasmids containing mCDK4 and hTERT | not commercially available | Stadler et al, 2013 | |
| Qiagen plasmid midiprep kit | Qiagen | 12143 | |
| Medium 199 | Life Technologies | Medium 199 (31150022) | |
| Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) | Life Technologies | DMEM (11965-092) | Mix 4:1 DMEM:199 |
| Myoblast growth medium: 4:1 Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) and Medium 199 supplemented with 15% fetal bovine serum; 0.02 M HEPES buffer; 1.4 mg/L vitamin B12; 0.03 mg/L ZnSO4, 0.055 mg/L dexamethasone, 2.5 μg/L hepatocyte growth factor and 10 μg/L beta fibroblast growth factor. | Life technologie (DMEM, F199); Atlanta Biological (FBS); Invitrogen (Hepes); Fisher (ZincSulfate); Sigma (Vit.B12, Dexamethasone); Chemicon international (HGF); Biopioneer (betaFGF) | #15630-080 (Hepes); #Z68-500 (ZnSO); #V2876.#D4902 (Vit.B12, Dex); GF116 (HGF); HRP-0011 (bFGF). | Prepare media and stock solution Vit. B12 (20mg/ml); ZincSulfate (60µg/ml); Dex (55µg/µl) separately for easier use. HGF stock solution (5µg/ml) and FGF (20µg/ml) should be added freshly every week at the final working concentration. |
| TrypLE express | GIBCO Life Technologies | 12605-010 | |
| Myosin heavy chain antibody for immunostaining | Developmental Hybridoma Bank | MF20 | Clone MF20 |
| Desmin Antibody for immunostaining | Thermo Scientific | MS-376-S0 | Clone D33 |
| Horse serum | Invitrogen | 26050-088 | |
| Reagents for primary skin fibroblast isolation | |||
| Transport medium: RPMI 1640 supplemented with 10% fetal bovine serum and 0.2% penicillin/streptomycin | RPMI medium 1640: GIBCO Life Technologies | 11875-093 | |
| Human primary fibroblast culture medium: RPMI 1640 supplemented with 10% fetal bovine serum and 1% penicillin/streptomycin | Fetal bovine serum: Thermo Scientific | SH30071.03 | |
| Collagenase solution: Collagenase type 2 (100 mg) resuspended in 12.5 ml of fibroblast culture medium and filter-sterilized | Worthington | 4176 | |
| Sterile 1X Phosphate Buffer Saline (PBS) calcium and magnesium free | Lonza | 17-516F | |
| Materials for isolation of primary myoblasts | |||
| 50 ml and 15 ml sterile conical tubes | GeneMate/Bioexpress | C-3394-4 (50 ml) ; C3394-1 (15 ml)) | |
| Sterile scalpels | Aspen Surgical | 372610 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 1492 | |
| Sterile 5, 10, and 25 ml pipettes | Bellco glass | 1226-05010 (5 ml); 1200-10010 (10 ml) ;1228-25050 (25 ml) | Reusable pipettes are washed, cotton plugged and autoclaved before use |
| Sterile tissue culture-treated plastic dishes (10 cm) | BD Falcon | 353003 | |
| Sterile nylon cell strainers (100 µm and 40 µm size) | BD Falcon | 352340 (40µm); 352360 (100µm) | |
| Materials for myoblast immortalization | |||
| Sterile 0.45 µm filters | Millipore | SLHV013SL | |
| Cloning rings | Corning | #3166-8 | To be cleaned and autoclaved before and after use |
| Materials for fibroblast cell lines | |||
| Sterile 35 mm tissue culture-treated plastic dishes | Greiner bio-one | 628160 | |
| Sterile scalpels | DeRoyal | D4510A | |
| Sterile T25 tissue culture flasks | Techno Plastic Product, TPP | 90026 | sold in the USA by MIDSCI |
| TrypLE express | GIBCO Life Technologies | 12605-010 |
References
- Flanigan, K. M. The muscular dystrophies. Semin Neurol. 32, 255-263 (2012).
- Mercuri, E., Muntoni, F. Muscular dystrophies. Lancet. 381, 845-860 (2013).
- Sharples, A. P., Stewart, C. E. Myoblast models of skeletal muscle hypertrophy and atrophy. Curr Opin Clin Nutr Metab Care. 14, 230-236 (2011).
- Tran, T., Andersen, R., Sherman, S. P., Pyle, A. D. Insights into skeletal muscle development and applications in regenerative medicine. Int Rev Cell Mol Biol. 300, 51-83 (2013).
- Miller, A. D., Buttimore, C. Redesign of retrovirus packaging cell lines to avoid recombination leading to helper virus production. Mol Cell Biol. 6, 2895-2902 (1986).
- Schubert, W., Zimmermann, K., Cramer, M., Starzinski-Powitz, A. Lymphocyte antigen Leu-19 as a molecular marker of regeneration in human skeletal muscle. Proc Natl Acad Sci U S A. 86, 307-311 (1989).
- Mechtersheimer, G., Staudter, M., Moller, P. Expression of the natural killer (NK) cell-associated antigen CD56(Leu-19), which is identical to the 140-kDa isoform of N-CAM, in neural and skeletal muscle cells and tumors derived therefrom. Ann N Y Acad Sci. 650, 311-316 (1992).
- Pavlath, G. K., Gussoni, E. Human myoblasts and muscle-derived SP cells. Methods Mol Med. 107, 97-110 (2005).
- Boldrin, L., Muntoni, F., Morgan, J. E. Are human and mouse satellite cells really the same. J Histochem Cytochem. 58, 941-955 (2010).
- Belles-Isles, M., et al. Rapid selection of donor myoblast clones for muscular dystrophy therapy using cell surface expression of NCAM. Eur J Histochem. 37, 375-380 (1993).
- Meng, J., Adkin, C. F., Xu, S. W., Muntoni, F., Morgan, J. E. Contribution of human muscle-derived cells to skeletal muscle regeneration in dystrophic host mice. PLoS One. 6, e17454 (2011).
- Zhu, C. H., et al. Cellular senescence in human myoblasts is overcome by human telomerase reverse transcriptase and cyclin-dependent kinase 4: consequences in aging muscle and therapeutic strategies for muscular dystrophies. Aging Cell. 6, 515-523 (2007).
- Mamchaoui, K., et al. Immortalized pathological human myoblasts: towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders. Skelet Muscle. 1, 34 (2011).
- Sigmund, C. D., Stec, D. E. Genetic Manipulation of the Renin-Angiotensin System Using Cre-loxP-Recombinase. Methods Mol Med. 51, 53-65 (2001).
- Ludlow, A. T., et al. Quantitative telomerase enzyme activity determination using droplet digital PCR with single cell resolution. Nucleic Acids Res. 42, e104 (2014).
- Jankowski, R. J., Haluszczak, C., Trucco, M., Huard, J. Flow cytometric characterization of myogenic cell populations obtained via the preplate technique: potential for rapid isolation of muscle-derived stem cells. Hum Gene Ther. 12, 619-628 (2001).
- Gharaibeh, B., et al. Isolation of a slowly adhering cell fraction containing stem cells from murine skeletal muscle by the preplate technique. Nat Protoc. 3, 1501-1509 (2008).
- Qu, Z., et al. Development of approaches to improve cell survival in myoblast transfer therapy. J Cell Biol. 142, 1257-1267 (1998).
- Choi, J., et al. MyoD converts primary dermal fibroblasts, chondroblasts, smooth muscle, and retinal pigmented epithelial cells into striated mononucleated myoblasts and multinucleated myotubes. Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 7988-7992 (1990).
- Huard, C., et al. Transplantation of dermal fibroblasts expressing MyoD1 in mouse muscles. Biochem Biophys Res Commun. 248, 648-654 (1998).
- Lattanzi, L., et al. High efficiency myogenic conversion of human fibroblasts by adenoviral vector-mediated MyoD gene transfer. An alternative strategy for ex vivo gene therapy of primary myopathies. J Clin Invest. 101, 2119-2128 (1998).
- Park, J. I., et al. Telomerase modulates Wnt signalling by association with target gene chromatin. Nature. 460, 66-72 (2009).
Tags
医药，第95，活组织检查，骨骼肌，皮肤，组织离解，成肌细胞纯化，成肌细胞永生化，细胞冷冻Erratum
Formal Correction: Erratum: Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling
Posted by JoVE Editors on 11/12/2016.
Citeable Link.
A correction was made to the authors section in: Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling
One of the authors names was corrected from:
Stacy C. Cossette
to:
Stacy A. Cossette
