Isolatie en immortaliseren van Patient afgeleide cellijnen van spierbiopsie for Disease Modeling

Protocol

OPMERKING: Protocollen voor het verzamelen van menselijk weefsel moet worden beoordeeld en door de Institutional IRB commissie goedgekeurd. Inzameling van afgedankte, de-geïdentificeerde menselijk weefsel is goedgekeurd door het ziekenhuis de Boston Children's en Brigham en Women's Hospital IRB Comités. De hieronder beschreven methoden zijn toegepast voor de isolatie van myogene cellen van de-geïdentificeerde, weggegooid weefsel. De beschreven methoden zijn geschikt voor weefsel vanuit ingestemd patiënt materiaal.

1. celisolatie

1. Dissociatie van spierbiopsie en zuivering van myogene cellen
   1. Pre-wegen een 10 cm weefselkweek plaat in een weefselkweek bioveiligheid kap, en vervolgens opnieuw af te wegen de plaat met de spierbiopsie om de hoeveelheid weefsel te berekenen worden losgekoppeld.
   2. Met behulp van steriele scalpels, gehakt spierweefsel fijn en voeg een paar druppels steriele 1x HBSS om weefsel niet uitdroogt.
   3. Voeg elk van di 3,5 mlspase II en collagenase D per gram spierweefsel te worden verteerd. Pipetteer het gehakt weefsel en enzym oplossing door een steriele 25 ml pipet een paar keer. Incubeer de plaat in een weefselkweek incubator bij 37 ° C met 5% _CO2 gedurende 15 min en verteren weefsel totdat de slurry gaat gemakkelijk hoewel een steriele 5 ml pipet.
      OPMERKING: Weefsel dissociatie wordt gewoonlijk bereikt door enzymatische digestie binnen 45-90 min. Verwijzen wij u naar het gedeelte 'Representatieve resultaten' voor meer informatie.
   4. Voeg 2 volumina steriel groeimedium gedissocieerde weefsel, filter door een 100 um zeef cel over een 50 ml conische buis en pellet cellen gedurende 10 min bij 329 xg (~ 1100 rpm), kamertemperatuur. Verwijzen wij u naar de Materialen Tafel voor media samenstelling.
   5. Resuspendeer de pellet in 1 volume steriel kweekmedium en voeg 7 volumes rode bloedcellen lysisoplossing. Filtreer de oplossing door een 40 um cel zeef, pellet vervolgens thij cellen gedurende 10 min bij 329 xg, kamertemperatuur.
   6. Tel de cellen in een hemocytometer en resuspendeer de cellen in 1 x HBSS met 0,5% BSA in een concentratie van 1 x 10 ⁶ cellen / 100 ul. Vernietiging ~ 250.000 cellen in een enkele buis die wordt gebruikt als een negatieve (ongekleurd) controle. Vernietiging extra eenkleurige gekleurd controlebuizen voor propidium iodide en CD56, die voor het correct gating van CD56 positieve cellen door FACS-sortering. Verwijzen wij u naar het sorteren handleidingen cel of overleggen met FACS sortering kernfaciliteit deskundigen om de nodige controles te waarborgen zijn inbegrepen.
   7. Vlekken op de cellen worden gesorteerd met 5 ui / 10 ⁶ cellen van anti- CD56 antilichaam. Incubeer alle monsters (inclusief controles) op ijs gedurende 30 min.
   8. Was monsters in 10 ml 1 x HBSS en pellet cellen gedurende 10 min bij 329 xg (~ 1100 rpm) in een gekoelde centrifuge bij 4 ° C geroerd.
   9. Voeg propidiumjodide in een eindconcentratie van 1 ug / ml van het monster naar zijn sorted voor uitsluiting van dode cellen. Zuiveren myogene CD56 positieve cellen van niet-myogene cellen met behulp van de fluorescentie-geactiveerde cel sorteerder.
2. Dissociatie van huidbiopsie
   OPMERKING: dermale fibroblasten kunnen worden geïsoleerd uit een huid pons van patiënten wanneer spierbiopten niet beschikbaar zijn. Dermale fibroblasten kunnen worden gebruikt als biomateriaal voor vele studies, waaronder transductie met MyoD naar myogene cellen te genereren. Bovendien kan dermale fibroblasten worden gebruikt iPS cellen, die kunnen worden gedifferentieerd in verschillende celtypes voor verdere studie te genereren.
   1. Vervoeren de huid biopsie naar het laboratorium in het transport medium. Nadat het monster is ontvangen, voert de primaire kweek zo spoedig mogelijk. Als de primaire cultuur niet kan worden vastgesteld op dezelfde dag, bewaar het monster bij kamertemperatuur gedurende de nacht.
   2. Breng de huidbiopsie van een steriele 35 mm petrischaal in de laminaire stroming kap.
   3. Spoel de huid biopsie in een petrischaal met steriele 1x PBS om bloed en vuil te verwijderen. Verwijder het vetweefsel met een steriele scalpel.
   4. Voeg 2 ml collagenase oplossing en gehakt het weefsel met scalpel, incuberen bij 37 ° C gedurende 45 minuten tot 1 uur, afhankelijk van de grootte van het weefsel.
   5. Breng het gedigereerde weefsel een 15 ml conische buis, spoel de petrischaal met 2 ml van fibroblast kweekmedium tweemaal en verzamel het medium in dezelfde buis.
   6. Pellet cellen bij 200 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
   7. Verwijder het supernatant en was het pellet met 3 ml van fibroblast medium om de collagenase weer te verwijderen, vervolgens pellet cellen. Verwijzen wij u naar de Materialen Tafel voor media samenstelling.
   8. Herhaal de stap 1.2.7 nog een keer.
   9. Re-schorten de pellet in 5 ml fibroblast medium en plaat cellen op een T25 steriele weefselkweekkolf. Incubeer de kolf bij 37 ° C met 5% _CO2.
   10. Evalueer de cultuur voor fibroblast aanhechting en groei in de komende 1-3 dagen. <br /> OPMERKING: Sommige kleine stukken weefsel kunnen zich ook hechten aan de plaat en fibroblasten migreren uit deze stukken weefsel.
   11. Handhaaf de kweek onder dezelfde omstandigheden tot fibroblasten worden gekweekt tot ongeveer 80% confluentie.
   12. Verzamel fibroblasten door trypsinisatie en overzetten naar kweekflessen vers voor extra uitbreiding. Voer trypsinisatie door het wassen van de kweken 3 keer in 1x PBS zonder Ca ⁺⁺ en Mg ^++. Voeg Trypsine-EDTA (zie Materialen tabel) naar de cellen (2 ml / T25 kolf) gedurende 2 min bij 37 ° C.
   13. Splitsen vrijstaande cellen in extra flesjes. Als sommige stukken weefsel gehecht blijven aan de originele T25 flessen, voeg 5 ml vers kweekmedium naar deze kolf en meer fibroblasten zal voortdurend migreren uit.
       OPMERKING: De geëxpandeerde fibroblast cultuur te worden ingevroren als P1 en opgeslagen in vloeibare stikstof voor toekomstige experimenten.

2. immortaliseren van Myogene Cellen

1. Feed cellen 30 min voor transfectie met 5 ml vers medium aangevuld met 10 mM cafeïne.
2. Homogeniseer een mengsel van 2 ug plasmide DNA uit een midi prep (CDK4 of hTERT plasmide) en PolyJet en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 min, zoals aanbevolen door de fabrikant.
3. Voeg de plasmide / PolyJet mengsel aan de PE-cellen 's nachts.
4. Feed cellen met vers medium (DMEM Medium en 199 in een verhouding van 4: 1, aangevuld met 10% kalfsserum). Twaalf uur later, verzamel de virus supernatant en filtreer door een 0,45 urn poriegrootte.
5. Gebruik 1 ml supernatant verzameld overnacht de amfotrope verpakkingscellijn PA317 te infecteren en ⁵ verkrijgen van een stabiele virus-producerende cellijn na selectie met ofwel 0,5 mg / ml neomycine (G418) voor CDK4 of 0,5 mg / ml hygromycine voor hTERT.
6. Bereid te werken virale bovenstaande vloeistoffen door het kweken van de stabiele verpakking cellen tot bijna samenvloeien, dan is het oogsten van de bovendrijvende elke ochtend, avond en ochtend voor drie oogsten.
7. Filter de virale supernatanten en ofwel direct gebruik of verdelen ze in 1 ml porties en bewaar bij -80 ° C voor later gebruik. Merk op dat virale supernatant verliest 50% infectie-efficiëntie met elkaar vries-dooi. Vergeet niet om te bleken te wassen voordat het teruggooien alles wat de virusdeeltjes heeft aangeraakt.
   OPMERKING: De stabiele PA317 virus-producerende cellijn kan worden ingevroren en gehandhaafd op -150 ° C voor permanente opslag (bevriezing medium is 10% DMSO; 90% Serum).
8. Plate-FACS gezuiverde myogene cellen (beschreven in stappen 1,1-1,9) bij een dichtheid van 5 x 10 ⁴ cellen / putje in 6-putjesplaten bekleed met 0,1% gelatine. Zorg ervoor dat cellen aan de plaat alvorens de virale infectie.
9. Voeg 400 ul gefilterd, freshly geproduceerd viraal supernatant of ingevroren monsters aan elke zes-well plaat 's nachts (houd 2 putten als controles).
10. Verander medium door het voeren cellen met 2,5 ml / putje van vers spier medium (4: 1 Dulbecco's gemodificeerd Eagle medium (DMEM) en Medium 199 aangevuld met 15% foetaal runderserum, 0,02 M HEPES-buffer, 1,4 mg / l vitamine B12 0,03 mg / l ZnSO4, 0,055 mg / l dexamethason, 2,5 g / l hepatocyt groeifactor en 10 ug / L basic fibroblast growth factor). Gooi de media en pipetten die de virusdeeltjes in een bleekmiddel container. Laat cellen in hetzelfde medium gedurende 3 dagen om te herstellen van infectie vervolgens behandelen selectie met behulp van 400 ug / ml neomycine (CDK4 infectie) of 300 ug / ml hygromycine (hTERT infectie).
11. Handhaaf cellen onder geneesmiddelselectie totdat de cellen in de controle schaal matrijs (1-2 weken).
12. Passage cellen voordat ze samenvloeiing (60-80% samenvloeiing; met behulp van 0,05% trypsine-EDTA), zelfs tijdens de selectiop de periode. Replate cellen in meerdere 10cm gerechten met vers myoblasten medium (zoals beschreven in 2.11) aangevuld met de selectie geneesmiddel. Handhaaf onsterfelijk geselecteerde cellen als een heterogene populatie of klonen een geheel homogene genetische achtergrond (zelfde insertie van het transgen in elke cel) te verkrijgen.
13. Voeren kloonselectie met behulp van de volgende stappen:
    1. Zaad de cellen bij lage dichtheid (bijvoorbeeld 300 tot 500 cellen in schalen van 10 cm) en te handhaven ongeveer twee weken tot kleine kolonies zijn gevormd (10-20 cellen).
    2. Verwijder meeste van het medium op dit punt, waardoor er slechts een dunne film te voorkomen dat de cellen uitdrogen.
    3. Plaats een klonen ring (met een uiteinde gedoopt in siliconen vacuüm vet) over elke gewenste kloon en voeg een paar druppels van trypsine / EDTA.
    4. Oogst cellen zodra zij afgerond door zorgvuldig aspireren de cellen met behulp van een 1 ml tip of een Pasteur pipet en over te dragen naar de kleinste beschikbare multi- plaTE (96 of 48, 24 of 12 well platen).
    5. Expand klonen zoals nodig om lokale confluentie voorkomen.

Representative Results

Figuur 1 toont een aantal van de belangrijkste stappen die betrokken zijn bij de primaire weefsel dissociatie: het exacte bedrag van weefsel wordt afgewogen in een steriele weefselkweek petrischaal (Figuur 1A, B). Het weefsel wordt vervolgens fijngemaakt met steriele scalpels, tot een weefsel suspensie wordt verkregen (Figuur 1C, D). Na toevoeging van verteringsenzymen, wordt primaire spierweefsel dissociatie gewoonlijk bereikt door enzymatische digestie binnen 45-90 min. De progressie van weefsel digestie wordt typisch gecontroleerd elke 15-20 min overdigestion en celdood. De enzymatische afbraak kan voorzichtig gepipetteerde zijn en gemengd een paar keer om de 15-20 min. Aan het einde van de digestie stap worden de cellen gefiltreerd door een 100 pm (Figuur 1E, F) en een 40 urn filter. Afhankelijk van de hoeveelheid uitgangsmateriaal spierweefsel en of het monster wordt verkregen van mild of ernstig aangetaste spieren, het gedissocieerde primaire CELls zal heterogeen zijn. Figuur 1G toont een voorbeeld van mononucleaire cellen in suspensie onmiddellijk na de digestie, terwijl figuur 1H toont een voorbeeld van gedissocieerde primaire cellen 3-6 uur na digestie en uitplaten in weefselkweekschalen. Myogene cellen zullen gewoonlijk worden gemengd met fibroblasten en adipogene cellen. Immune cellen kunnen ook in gevallen waarin ontsteking geassocieerd met de ziekte van de patiënt. Daarom zou prospectieve scheiding van de verschillende celtypes wenselijk zijn. Voor toekomstige isolatie van humane myogene cellen is CD56 of N-CAM wijd gebruikt als een betrouwbare parameter ^6-9. Deze zuivering kan gunstig zijn kort na isolatie voor verrijking van myogene progenitors en voordat de cellen onsterfelijk proces. Alternatief immortalisatie van primaire cellen kunnen eerst worden uitgevoerd, kan vervolgens onsterfelijk myogene cellen worden geselecteerd op basis van expressie van CD56 door FACS. Een schema opde stappen die nodig zijn voorafgaand aan FACS sorteren en een voorbeeld van een FACS profiel is weergegeven in figuur 2. In het kort worden primaire cellen geteld en geresuspendeerd in hoge concentraties zoals aangegeven, dan het primaire antilichaam (bijvoorbeeld anti CD56) toegevoegd aan de cellen en geïncubeerd gedurende 30 minuten op ijs. Na een wasbeurt worden de cellen geanalyseerd door middel van een fluorescentie geactiveerde cel sorteerder en gezuiverd (figuur 2) .De gemiddelde rendement van CD56 positieve cellen varieert van monster tot monster, variërend 40-70% van de totale mononucleaire cellen. Het rendement is afhankelijk van de leeftijd van het individu en of myogene cellen worden gewonnen uit onaangetast of zieke spieren. Onaangetast spier heeft meestal hoog percentage van myogene cellen, terwijl dystrofische spieren heeft vaak lagere percentages van CD56 positieve cellen. Het gezuiverde cellen worden uitgeplaat in volledige myogene groeimedium (zie Materialen tabel). Cellen kunnen worden gepasseerd door trypsinisatie wanneer ze reach 60-70% samenvloeiing. CD56 expressie brengende cellen myogene en kunnen vormen myotubes in vitro ^10,11 .De immortalisatie van myogene cellen vereist de sequentiële transfectie van twee genen ^12,13 (zoals schematisch in figuur 3). Cycline afhankelijke kinase 4 (CDK4) wordt gebruikt om de stress van weefselkweek overwinnen door onvoldoende kweekomstandigheden en humaan telomerase reverse transcriptase (hTERT) voorkomt telomeerverkorting door het einde replicatie fenomeen ^12. Zowel pre-virale plasmiden in de pBabe vector backbone. De muis CDK4 cDNA construct het neomycine resistentiegen en hTERT cDNA construct bevat de hygromycine-resistentiegen. Deze bevat ook een Herpes Simplex Virus thymidinekinase (TK) cassette en loxP plaatsen geplaatst aan beide zijden van de hTERT / TK cassette. Hierdoor kan de uitsnijding van de gehele expressie-eenheid door het Cre recombinase ¹⁴ en contra-selectie met behulp van gancyclovir.

Nieuw geïmmortaliseerde cellen kunnen worden gehandhaafd als een populatie waarbij de virussen zijn geïntegreerd in verschillende sites of gekloneerd, een volledig homogene genetische achtergrond (enkel insertie in het genoom en de nakomelingen) te verkrijgen. Meestal isoleren klonen uit een grote populatie zal resulteert in kleine verschillen tussen klonen afhankelijk van het inbrengen van de cassette in het genoom. Daarnaast zal uitgebreide weefselkweek selectie van cellen met groei voordeel dan degene die differentiëren bevorderen. Iktroost enkelvoudige klonen eenvoudig door enten cellen bij lage dichtheid (bijvoorbeeld: 300 tot 500 cellen in schalen van 10 cm) en kweken gedurende ongeveer twee weken tot kleine kolonies zijn gevormd (10-20 cellen). Het merendeel van het medium wordt vervolgens verwijderd, waardoor slechts een dunne film te voorkomen dat de cellen uitdrogen. Klonen worden getrypsiniseerd met kloneringsringen en vervolgens geëxpandeerd indien nodig. Uitgebreide onsterfelijk klonen kunnen worden getest op expressie van gemeenschappelijke myogene celmerkers zoals CD56 door FACS, desmine en MyoD expressie door immunofluorescentie of myotube vorming na differentiatie. Myotubes meest duidelijk wanneer confluente myogene cellen (90% confluentie) in differentiatiemedium geplaatst (DMEM Medium en 199 in een verhouding van 4: 1, aangevuld met 2% paardenserum) na 3-5 dagen (figuur 4). Er werden geen verschillen waargenomen in myotube totstandkoming als myotube samentrekking vermogen tussen niet-geïmmortaliseerde controlecellen geïmmortaliseerde cellen ('s 1 en 2).

(Figuur 5). Voorbeelden van groeicurven zijn weergegeven in figuur 5A, waarbij telomeerverkorting werd waargenomen cellen werden geëxpandeerd voor uitgebreide aantal passages. Omgekeerd is succesvol onsterfelijk geassocieerd met verhoogde telomerase-activiteit (Figuur 5)

Figuur 1:.., Illustraties kritische stappen voor de dissociatie van primaire humane spierweefsel (A) Het wegen van de lege petrischaal voor weefsel plaatsing en (B) na plaatsing van de weefsel (C) Steriele scalpels worden gebruikt voor het gehakt weefsel, tot (D) van het weefsel hetzelf wordt tot een slurrie. Collagenase en dispase toegevoegd en weefsel gedigereerd gedurende 45-90 min, wordt de digestie wordt gefiltreerd door een nylon mesh filter vuil (E, F). (G, H) voorbeelden van net losgemaakte cellen direct uitgeplaat na dissociatie (G gooi ) of 3 uur na dissociatie, wanneer primaire cellen beginnen te bezinken (H).

Figuur 2:. Workflow procedures betrokken bij humane myoblasten kleuring voor zuivering via fluorescentie geactiveerde cel sorteerder De kritische stappen voor kleuring van humane cellen voor FACS-analyse worden gemarkeerd. Voorbeelden van FACS plots worden ook getoond. De negatieve controle (linker paneel) wordt gebruikt voor het sorteren hek vast. In de juiste panelen, zijn positieve cellen die CD56 gated en de procentenage positieve cellen getoond. Deze strategie kan worden gebruikt voor myogene cellen te zuiveren hetzij voor immortalisatie of na de immortalisatie procedure.

Figuur 3: Schematische virus productie myoblasten immortalisatie. Workflow van de productie van retrovirussen gebruikt om myoblasts vereeuwigen. Een plasmideconstruct die ofwel CDK4 of de floxed hTERT-TK-cassette in een pBabe backbone (links) wordt getransfecteerd in de Phoenix ecotropische (PE) inpakcellijn nachts (8-12 uur) met behulp van PolyJet. De bovenstaande vloeistof wordt vervolgens overgebracht na filtratie op de Phoenix amfotrope inpakcellijn (PA317). Het supernatant van deze cellen kan direct worden gebruikt of de cellen kunnen worden geselecteerd met ofwel neomycine of hygromycine een stabiele cellijn voor toekomstig gebruik genereren. Porties van het filtEred supernatans worden opgeslagen bij -80 ° C voor later gebruik (met een verlies van 50% rendement). Bleach wordt gebruikt om elke hulpstoffen die op alle punten van de procedure reinigen.

Figuur 4:. Schema van omkeerbare myoblast onsterfelijk Workflow van de onsterfelijk procedure (boven): Primaire cellen worden eerst getransfecteerd met CDK4. Na neomycine selectie worden de myoblasten getransfecteerd met een floxed hTERT cassette die twee selectiemerkers; HSV-TK en hygromycine. Indien gewenst op een later tijdstip kan de hTERT cassette "IoxP-plaatsen voorziene" door expressie Cre recombinase en het selecteren op excisie met gancyclovir. Hierdoor kan de "re-mortalization" van de myoblasts en het opnieuw starten van telomeerverkorting. Als de telomeren zijn 20 kb lang, is dit nog mogelijk honderden verdubbelingen, en vermijdt t Hij complicatie van de over-expressie van hTERT. Ten slotte kan isogeen klonen uit de vereeuwigd bevolking worden geïsoleerd. De myogenicity van de nieuw vereeuwigd cellen kunnen worden aangetoond met behulp van specifieke markers van spiercellen zoals desmine (linksonder paneel, cellen in groeimedium gekleurd met anti-desmine, kloon D33, groen). Deze kloon is zo myogene dat gedifferentieerde cellen worden waargenomen, zelfs wanneer cellen worden gehandhaafd proliferatie omstandigheden. Wanneer cellen worden gedifferentieerd differentiatie medium (met 2% paard serum, midden en rechts panelen) myotube formatie wordt zeer uitgebreid. Bijna alle cellen gekleurd met de MF20 antilichaam aan embryonale myosine zware keten (groen) en myotubes hebben meerdere kernen door DAPI kleuring (blauw, alle afbeeldingen). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

les / ftp_upload / 52307 / 52307fig5highres.jpg "/>
Figuur 5: Verificatie van de onsterfelijk procedure. (A) Groeikrommen van Isogene klonen uit primaire myoblast, onsterfelijke bevolking (myoblast hTERT-CDK4) en re-mortalized kloon (myoblast floxed hTERT-CDK4) getoond als voorbeelden. Geen verschillen in groeitempo detecteerbaar waren voordat de cellen te bereiken veroudering. Telomeerverkorting werd gevolgd als functie van populatieverdubbelingen en telomeerlengte werd gemeten TRF. (B) TRF voorbeeld voorbeelden van vroege en late tijdstippen replicatie in myoblasten (5 tijdstippen van PD 13-75), opnieuw mortalized myoblasten na hTERT- excisie (3 tijdstippen van PD 62-152) en vereeuwigd myoblasts (PD 75 en 200). (C) Succesvolle hTERT- infectie vertaalt zich in een toename van telomerase activiteit. Vóór en na hte ¹⁵ in cellen; telomerase activiteit werd beoordeeld door ddTRAP (kwantificering van de test linker ddTRAP uitlezing, rechts)RT infectie. hTERT excisie afgeschaft telomerase activiteit de oorspronkelijke drempel gezien in myoblasten. De resultaten worden weergegeven als de totale telomerase producten gegenereerd per cel equivalent (achtergrond gecorrigeerde). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Klik dan hier om deze video te bekijken.
Klik dan hier om deze video te bekijken.

Video 1 en 2. myotubes werden gegenereerd uit cellen vóór en na de immortalisatie proces. Cellen werden gekweekt tot confluentie in groeimedia overgegaan op differentiatie media gedurende 10 dagen. In beide video functionele contracties van één of meer myotubes detecteerbaar. Opname van het spontane spiertrekkingenwerd uitgevoerd met een 20X objectief. Er werden geen verschillen waargenomen tussen onsterfelijk en niet-geïmmortaliseerde cellen.

Discussion

Cellen als een nuttige bron

De isolatie en cultuur van myogene celpopulaties is zeer nuttig bij het ​​vaststellen van ziekte fenotypes of in vitro modellen van ziekte. De myogene beschreven celisolatie procedure maakt de isolatie van myoblasten en fibroblasten van skeletspieren specimens, die vervolgens kan worden vermeerderd, onderscheiden, of onmiddellijk geanalyseerd. Myoblasten structuur en functie kunnen worden beoordeeld via microscopisch onderzoek, evaluatie van celoverleving, evaluatie van celfusie of door moleculaire studies van RNA of eiwitexpressie. Bovendien kunnen myoblasten worden onderscheiden in myotubes dat vele kenmerken van onrijpe myovezels, die de directe bepaling van myoblasten functie in de context van spierontwikkeling en herstel na weefselbeschadiging toelaat delen. Hoewel al deze fenotypes neiging om tamelijk reproduceerbaar vroege passages myogene cellen zijn, het gedrag van vele primaire myogenic cellijnen kunnen in de loop van vele passages worden gewijzigd. Bijgevolg is het soms wenselijk om een ​​bepaalde myogene cellijn immortaliseren (zoals hier beschreven), die het gemak van de cultuur vestiging en het genereren van reproduceerbare resultaten over een langere periode kan vergemakkelijken.

Selectie van specifieke cel populaties

Dit protocol beschrijft de isolatie van myogene cellen van skeletspieren weefsel met behulp van FACS als zuiveringsschema. De voorgestelde strategie van het selecteren van cellen omvat met propidium jodide (een indicator van dode cellen) en CD56 (een marker van myogene cellen) om levende, myogene cellen van dode cellen, puin, en niet-myogene cellen differentiëren. Cellen die in de CD56 positieve populatie zal myogene voorouders kan vormen myotubes, terwijl de CD56-negatieve bevolking zal omvatten niet-myogene cellen waaronder fibroblasten en eventueel adipogenic cellen. Elk van deze fractiesonafhankelijk worden gekweekt om celculturen van myoblasten of fibroblasten, en de potentiële produceren parallelle fibroblast celkweken vast kan nuttig zijn voor onafhankelijke cellen of DNA bank- oefeningen of extra controle voorwaarden assays uitgevoerd op de myogene celkweken. Er zijn verschillende andere mogelijkheden voor de selectie van specifieke myoblastic en fibroblastische celculturen van gedigereerd spierweefsel, wanneer FACS-sortering ongewenst of niet beschikbaar is, die elders ^16,17 beschreven. Een alternatieve methode voor myoblastic en fibroblastische cellen scheiden omvat het gebruik van differentiële hechtingseigenschappen tussen deze twee celtypen opeenvolgende passages van cellen te verrijken voor een bepaald celtype. Fibroblasten zich aan plastic veel sneller dan myoblasts, waardoor de cel schorsingen te broeden op plastic voor ongeveer 1 uur bij de vaststelling of de passage van de cellen en vervolgens plating het supernatant naar een ander gerecht zal RESUlt in het verwijderen van vele fibroblasten van de celsuspensie ^18.

Nut van fibroblasten versus myoblasts

Spier biopten van patiënten worden doorgaans gebruikt voor de zuivering van primaire spiercellen, maar zieke myoblasten niet doeltreffend prolifereren en slechts een paar aantal verdelingen in vitro ondergaan, waardoor het nodig cel immortalisatie het grote aantal verdelingen noodzakelijk bereiken. Aangezien zowel fibroblasten en myoblasten kunnen worden geïsoleerd uit spier biopsieën, moeten beide celfracties gered van patiënt monsters, aangezien zij zowel nuttig en bieden veel veelzijdigheid voor verdere toepassingen. Bijvoorbeeld kan fibroblasten worden gebruikt voor het genereren van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs), dat veelbelovend vasthouden onbeperkt aantal cellen en het potentieel genereren worden geïnduceerd om te differentiëren tot meerdere cellijnen. Deze eigenschappen zijn zeer gewenst voor cellen verkregen van patiënts met een zeldzame ziekte, die mogelijk kan worden gecorrigeerd in vitro of gebruikt in experimentele drug screenings op zoek naar therapeutische verbindingen. Onsterfelijk myoblasten kan ook worden gebruikt in drug screening. Fibroblasten kan ook effectief worden omgezet naar een myogene lot door infectie met een virus dat MyoD ^19-21. Deze methode is effectief getest met fibroblasten geëxtraheerd van patiënten met spierziekten en bevestigde dat MyoD-expressie fibroblasten effectief myotubes die rijpe spier-eiwitten tot expressie kunnen vormen. Aldus kunnen beide celtypen effectief worden gebruikt in verschillende toepassingen en downstream van onschatbare waarde voor een diagnostische en therapeutische studies.

Impact van immortaliseren

Het onsterfelijk maken van normale diploïde cellen kan men een stabiele humane cellijn die volledig kan worden gekarakteriseerd en onderzocht door verschillende laboratoria bereiden. Primaire culturen uit onafhankelijkeisolaties kunnen variëren en hun algehele proliferatieve capaciteit kan variabel zijn wanneer de schade wordt geïntroduceerd in de dissociatie proces of door overdigestion, die de cultuur gedrag kan verstoren. Het onsterfelijk maken van cellen via de expressie van de katalytische subeenheid van telomerase (hTERT) heeft het voordeel dat een stabiele cellulaire fenotype te behouden en cellen blijven diploïde. Er zijn meldingen bij muizen die telomerase de Wnt-route ²² kunnen moduleren geweest. Wij hebben dit verschijnsel waargenomen in menselijke cellen. Echter, dergelijke potentiële complicaties te vermijden, heeft de hTERT cassette werd geflankeerd door lox plaatsen, zodat het kan worden verwijderd nadat telomeren zijn verlengd. Lange telomeren verlenen honderden extra divisies, meestal voldoende om de meeste experimenten uit te voeren.

Omdat continue cel expansie biedt altijd een selectief voordeel voor snelle groei, kan de cellulaire fenotype af en toe bevooroordeeld geworden als gevolg van overmatige groei van de meest snel delendecellen, eerder dan de beste differentiërende cellen. Hoewel dit nog niet bewezen significant probleem met de beschreven methode kan worden verholpen door ontdooien cellen die vroeg in hun cultuur geschiedenis of door klonale selectie van de cellen vertonen het gewenste fenotype zijn bevroren.

Tenslotte, omdat de ontwikkeling van myogene cellen near onbeperkt aantal voordelen heeft voor drug screening en eventuele ziektemodel, de huidige technieken ook intrinsieke nadelen die het gebruik van deze cellen als therapeutische voertuigen in celtherapie of als primaire diagnostische hulpmiddelen voorkomen. Zowel de uitgebreide in vitro cultuur en immortalizatie stappen wordt het fenotype van spiercellen in vergelijking met hun natieve toestand. Belangrijker is, zijn deze cellen uitgebreid in een omgeving die is heel anders dan het natuurlijke milieu van de primaire satelliet-cellen binnen hun niche. Daarom vereeuwigd cellen intens testen van de veiligheid en eventueel ontwik vereisenpment nieuwe technieken indien zij opnieuw worden ingebracht spier menselijke patiënt.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Tissue culture biosafety hood	Baker Company, Inc.	Model SterilGuard Hood
Benchtop centrifuge, such as Beckman Model	Beckman Coulter	Model Allegra 6R	If cell sorting is performed, a centrifuge with refrigeration is preferred
Microscope	Nikon	Model Eclipse TS100
Tissue culture incubator, connected to a CO2 source	Forma Scientific	Series II
Fluorescence-activated cell sorter (FACS)	Becton Dickinson	Model Aria
Reagents for isolation of primary myoblasts from tissue
Dispase II	Roche Applied Science	#04942078001	Prepare a sock solution of 2.4U/ml in DMEM
Collagenase D	Roche Applied Science	#088882001	Prepare a stock solution of 10 mg/ml
1x Sterile Hank’s Balanced Saline Solution (HBSS), calcium and magnesium free	GIBCO Life Technologies	#14185-052
Bovine serum albumin, fraction V	Sigma	#05470	Prepare a sterile  solution of 1X HBSS 0.5% BSA for FACS sorting
Sterile growth medium for myoblasts: Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) with high glucose (4.5 g) supplemented with 30% fetal bovine serum	GIBCO Life Technologies	11965-092	Contains L- glutamine
RBC lysis solution	Qiagen	158904
Propidium Iodide stock 10mg/ml	Sigma	P4170	Prepare the stock solution by diluting the powder in sterile distilled water
Anti-human CD56 antibody for flow cytometry	Biolegend	318310	APC-conjugated antibody, other labels are avaialable
Reagents for immortalization of primary myoblasts
Ecotropic packaging cell line PE	Cell Biolabs	RV-101
Amphotropic packaging cell line PA3174	Cell Biolabs	RV-102
Pig skin gelatin	Sigma	G1890-500g	Prepare a stock solution of 0.1% gelatin in water. Coat the dish with the solution at 37°C for one hour. Remove the solution and add medium.
PolyJet	Signagen	SL100688
G418	Fisher	345812
Hygromycin	EMD Biosciences	400051
pBabe plasmids containing mCDK4 and hTERT	not commercially available		Stadler et al, 2013
Qiagen plasmid midiprep kit	Qiagen	12143
Medium 199	Life Technologies	Medium 199 (31150022)
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM)	Life Technologies	DMEM (11965-092)	Mix 4:1 DMEM:199
Myoblast growth medium: 4:1 Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) and Medium 199 supplemented with 15% fetal bovine serum; 0.02 M HEPES buffer; 1.4 mg/L vitamin B12; 0.03 mg/L ZnSO4, 0.055 mg/L dexamethasone, 2.5 μg/L hepatocyte growth factor and 10 μg/L beta fibroblast growth factor.	Life technologie (DMEM, F199); Atlanta Biological (FBS); Invitrogen (Hepes); Fisher (ZincSulfate); Sigma (Vit.B12, Dexamethasone); Chemicon international (HGF); Biopioneer (betaFGF)	#15630-080 (Hepes); #Z68-500 (ZnSO); #V2876.#D4902 (Vit.B12, Dex); GF116 (HGF); HRP-0011 (bFGF).	Prepare media and stock solution Vit. B12 (20mg/ml); ZincSulfate (60µg/ml); Dex (55µg/µl) separately for easier use. HGF stock solution (5µg/ml) and FGF (20µg/ml) should be added freshly every week at the final working concentration.
TrypLE express	GIBCO Life Technologies	12605-010
Myosin heavy chain antibody for immunostaining	Developmental Hybridoma Bank	MF20	Clone MF20
Desmin Antibody for immunostaining	Thermo Scientific	MS-376-S0	Clone D33
Horse serum	Invitrogen	26050-088
Reagents for primary skin fibroblast isolation
Transport medium: RPMI 1640 supplemented with 10% fetal bovine serum and 0.2% penicillin/streptomycin	RPMI medium 1640: GIBCO Life Technologies	11875-093
Human primary fibroblast culture medium: RPMI 1640 supplemented with 10% fetal bovine serum and 1% penicillin/streptomycin	Fetal bovine serum: Thermo Scientific	SH30071.03
Collagenase solution: Collagenase type 2 (100 mg) resuspended in 12.5 ml of fibroblast culture medium and filter-sterilized	Worthington	4176
Sterile 1X Phosphate Buffer Saline (PBS) calcium and magnesium free	Lonza	17-516F
Materials for isolation of primary myoblasts
50 ml and 15 ml sterile conical tubes	GeneMate/Bioexpress	C-3394-4 (50 ml) ; C3394-1 (15 ml))
Sterile scalpels	Aspen Surgical	372610
Hemocytometer	Hausser Scientific	1492
Sterile 5, 10, and 25 ml pipettes	Bellco glass	1226-05010 (5 ml); 1200-10010 (10 ml) ;1228-25050 (25 ml)	Reusable pipettes are washed, cotton plugged and autoclaved before use
Sterile tissue culture-treated plastic dishes (10 cm)	BD Falcon	353003
Sterile nylon cell strainers (100 µm and 40 µm size)	BD Falcon	352340 (40µm); 352360 (100µm)
Materials for myoblast immortalization
Sterile 0.45 µm filters	Millipore	SLHV013SL
Cloning rings	Corning	#3166-8	To be cleaned and autoclaved before and after use
Materials for fibroblast cell lines
Sterile 35 mm tissue culture-treated plastic dishes	Greiner bio-one	628160
Sterile scalpels	DeRoyal	D4510A
Sterile T25 tissue culture flasks	Techno Plastic Product, TPP	90026	sold in the USA by MIDSCI
TrypLE express	GIBCO Life Technologies	12605-010