Isolement et immortalisation de lignées cellulaires de patients dérivé de la biopsie musculaire pour la modélisation des maladies

Protocol

NOTE: Protocoles pour la collecte de tissus humains doivent être examinés et approuvés par le comité institutionnel de la CISR. Collection de rebut, les tissus humains de-identifié a été approuvé par l'Hôpital pour enfants de Boston et des comités hôpital Brigham and Women de la CISR. Les méthodes décrites ci-dessous ont été appliquées pour l'isolement de cellules myogéniques de dépersonnalisés, jetés tissus. Les méthodes décrites sont applicables aux tissus prélevés à partir de matériaux patients consenti.

1. Isolement cellulaire

1. La dissociation de la biopsie musculaire et la purification de cellules myogéniques
   1. Pré-peser un tissu plaque de culture de 10 cm dans une culture tissulaire biosécurité capot, puis re-peser la plaque contenant la biopsie musculaire pour calculer la quantité de tissu à être dissocié.
   2. Utilisation de scalpels stériles, tissus mince musculaire finement et ajoutez quelques gouttes de HBSS stérile 1x à empêcher le tissu de se dessécher.
   3. Ajouter 3,5 ml chacune de dispase II et de la collagénase D par gramme de tissu musculaire à être digérés. Pipeter le tissu haché et une solution d'enzyme à travers une pipette de 25 ml stérile à plusieurs reprises. Incuber la plaque dans un incubateur de culture de tissu à 37 ° C avec 5% de CO ₂ pendant 15 minutes et à digérer le tissu jusqu'à ce que la suspension passe facilement si une pipette stérile 5 ml.
      REMARQUE: la dissociation des tissus est habituellement obtenue par digestion enzymatique dans les 45 à 90 min. Se il vous plaît se référer à la section 'Les résultats représentatifs de pour plus de détails.
   4. Ajouter deux volumes de milieu de croissance stérile à un tissu dissocié, filtre à travers un tamis de 100 um de la cellule sur une 50 ml à tubes coniques et granulés pendant 10 min à 329 x g (~ 1100 tours par minute), la température ambiante. Se il vous plaît se référer à la table des matières pour la composition des médias.
   5. Remettre en suspension le culot dans 1 volume de milieu de croissance stérile et ajouter sept volumes solution rouge sang de lyse cellulaire. Filtrer la solution à travers un tamis cellulaire 40 um, puis sédimenter tes cellules pendant 10 min à 329 xg, la température ambiante.
   6. Compter les cellules dans un hémocytomètre et remettre en suspension les cellules dans du HBSS 1x 0,5% de BSA à une concentration de 1 x 10 ⁶ cellules / 100 ul. Mettez de côté ~ 250 000 cellules dans un seul tube qui seront utilisés comme un contrôle négatif (non colorées). Régler une seule couleur colorées tubes de contrôle de côté supplémentaires pour l'iodure de propidium et de CD56, qui sont nécessaires pour le bon déclenchement de cellules positives CD56 par tri FACS. Se il vous plaît se référer à la cellule manuels de tri ou de consulter FACS tri experts des installations de base pour assurer des contrôles appropriés sont inclus.
   7. Colorer les cellules à trier avec 5 pi / 10 ⁶ cellules d'anticorps anti-CD56. Incuber tous les échantillons (y compris les contrôles) sur la glace pendant 30 min.
   8. Laver les échantillons dans 10 ml 1x HBSS et un culot de cellules pendant 10 min à 329 xg (~ 1100 rpm) dans une centrifugeuse réfrigérée, 4 ° C la température.
   9. Ajouter l'iodure de propidium à une concentration finale de 1 pg / ml de l'échantillon à être sorTed d'exclusion des cellules mortes. On purifie des cellules positives CD56 de cellules myogéniques non myogéniques en utilisant le trieur de cellules activé par fluorescence.
2. La dissociation de la biopsie de la peau
   NOTE: fibroblastes dermiques peuvent être isolés à partir d'un coup de poing de la peau des patients lors des biopsies musculaires ne sont pas disponibles. Les fibroblastes dermiques peuvent être utilisés comme biomatériau pour de nombreuses études, y compris la transduction avec MyoD pour générer des cellules myogéniques. En outre, les fibroblastes dermiques peuvent être utilisés pour générer des cellules iPS, qui peuvent être différenciées en divers types de cellules pour une étude plus approfondie.
   1. Transports la biopsie de la peau au laboratoire dans un milieu de transport. Une fois que l'échantillon est reçu, effectuer la culture primaire dès que possible. Si la culture primaire ne peut être établie le même jour, stocker l'échantillon à température ambiante jusqu'au lendemain.
   2. Transférer la biopsie de la peau à une boîte de Pétri de 35 mm dans la hotte stérile à flux laminaire.
   3. Rincer la biopsie de la peau dans une boîte de Pétri avec une stérilex PBS pour éliminer le sang et les débris. Retirer le tissu adipeux avec un scalpel stérile.
   4. Ajouter une solution de collagénase de 2 ml et hacher le tissu avec un scalpel, incuber à 37 ° C pendant 45 min à 1 h, en fonction de la taille du tissu.
   5. Transférer le tissu digéré dans un tube conique de 15 ml, rincer la boîte de Pétri avec 2 ml de milieu de culture de fibroblastes de deux fois, et de recueillir le milieu dans le même tube.
   6. Pellet les cellules à 200 xg pendant 5 min à température ambiante.
   7. Jeter le surnageant et laver le culot avec 3 ml de milieu de fibroblastes de retirer la collagénase, puis les cellules granules nouveau. Se il vous plaît se référer à la table des matières pour la composition des médias.
   8. Répétez l'étape 1.2.7 une fois de plus.
   9. Remettre en suspension le culot dans des cellules de fibroblastes de taille et de la plaque 5 ml sur un T25 culture tissulaire stérile ballon. Incuber le flacon à 37 ° C avec 5% de CO _2.
   10. Évaluer la culture pour la fixation des fibroblastes et la croissance au cours des 1-3 prochains jours. <br /> NOTE: Certains petits morceaux de tissus peuvent également se attacher à la plaque et les fibroblastes migrer hors de ces morceaux de tissu.
   11. Maintenir la culture dans les mêmes conditions jusqu'à ce que les fibroblastes sont cultivés jusqu'à confluence d'environ 80%.
   12. Recueillir fibroblastes par trypsinisation et transfert sur des flacons de culture frais d'expansion supplémentaire. Effectuer trypsinisation par lavage des cultures 3 fois en PBS 1x sans Ca ⁺⁺ et Mg ^++. Ajouter la trypsine-EDTA (voir Matériaux Table) pour les cellules (2 ml / fiole T25) pendant 2 minutes à 37 ° C.
   13. Diviser les cellules individuelles dans des flacons supplémentaires. Si des morceaux de tissu restent attachés aux flacons T25 originaux, ajouter 5 ml de milieu de culture frais à ce ballon en plus de fibroblastes migrent hors continuellement.
       NOTE: La culture de fibroblastes élargi peut être congelé bas que P1 et stocké dans l'azote liquide pour des expériences futures.

2. L'immortalisation des cellules myogéniques

1. les cellules d'alimentation 30 min avant la transfection avec 5 ml de milieu frais supplémenté avec 10 mM de caféine.
2. Homogénéiser un mélange de 2 pg d'ADN de plasmide à partir d'une préparation midi (CDK4 ou plasmide hTERT) et Polyjet et incuber à température ambiante pendant 15 min, tel que recommandé par le fabricant.
3. Ajouter le mélange plasmide / Polyjet aux cellules PE nuit.
4. Cellules nourrir avec du milieu frais (DMEM et moyennes 199 dans un rapport de 4: 1, complété avec du sérum de veau à 10%). Douze heures plus tard, recueillir le surnageant contenant le virus et la filtrer à travers un filtre de taille de pore de 0,45 um.
5. Utiliser 1 ml de surnageant recueilli pendant une nuit à infecter la cellule d'encapsidation amphotrope PA317 ligne ⁵ et à obtenir une lignée de cellules productrices de virus stables après sélection avec soit 0,5 mg / ml de néomycine (G418) pour CDK4 ou 0,5 mg / ml d'hygromycine pour hTERT.
6. Préparer travailler surnageants viraux par la croissance des cellules d'emballage stables à près de confluence, puis en récoltant le surnageant chaque matin, soir et matin pour trois récoltes.
7. Filtrer les surnageants viraux et soit utiliser directement ou de les diviser en aliquots de 1 ml et conserver à -80 ° C pour une utilisation ultérieure. Notez que surnageant viral perd 50% d'efficacité de l'infection par chacun de congélation-décongélation. Ne oubliez pas de blanchir de lavage avant de jeter tout ce qui a touché les particules virales.
   NOTE: La lignée cellulaire PA317 virus produisant stable peut être congelé et maintenu à -150 ° C pour le stockage permanent (milieu de congélation est de 10% de DMSO; 90% de sérum).
8. Plate-purifiée FACS des cellules myogéniques (décrite dans les étapes 1.1 à 1.9) à une densité de 5 x 10 ⁴ cellules / puits dans des plaques à 6 puits revêtues de gélatine à 0,1%. Se assurer que les cellules sont fixées à la plaque avant de procéder à l'infection virale.
9. Ajouter 400 ul filtré, freshly produit surnageant viral ou aliquotes congelées à chaque plaque à six puits nuit (garder deux puits comme témoins).
10. Changer moyen en alimentant les cellules avec 2,5 ml / puits de milieu frais musculaire (4: 1 de milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) et le milieu 199 supplémenté avec du sérum bovin fœtal à 15%; 0,02 M tampon HEPES; 1,4 mg / L de vitamine B12; 0,03 mg / L ZnSO4, 0,055 mg / L de dexaméthasone, 2,5 ug / l facteur de croissance des hépatocytes et 10 ug / L fibroblastes basique facteur de croissance). Jeter les médias et les pipettes contenant les particules virales dans un récipient de blanchiment. Laissez cellules dans le même milieu pendant 3 jours pour se remettre de l'infection, puis traitent pour la sélection en utilisant soit 400 pg / ml de néomycine (infection de CDK4) ou 300 pg / ml d'hygromycine (infection de hTERT).
11. Maintenir cellules dans la sélection des médicaments jusqu'à ce que les cellules dans le plat de commande filière (1-2 semaines).
12. Passage cellules avant qu'elles ne deviennent confluentes (60-80% de confluence; utilisant 0,05% de trypsine EDTA), même pendant la selectisur la période. Réensemencement cellules dans plusieurs plats 10cm avec un milieu de myoblastes frais (comme décrit dans 2.11) complétés avec le médicament de sélection. Maintenir des cellules immortalisées sélectionnées comme étant une population hétérogène ou cloner d'obtenir un fond génétique complètement homogène (même de l'insertion du transgène dans chaque cellule).
13. Effectuer la sélection clonale utilisant les étapes suivantes:
    1. Ensemencer les cellules à une faible densité (par exemple 300 à 500 cellules dans des plats de 10 cm) et les maintenir pendant environ deux semaines, jusqu'à ce que de petites colonies sont formées (10 à 20 cellules).
    2. Enlever la plupart du milieu à ce point, laissant seulement un film mince pour empêcher les cellules de se dessécher.
    3. Placez un anneau de clonage (avec une fin trempé dans la graisse à vide de silicone) sur chaque clone désiré et ajouter quelques gouttes de trypsine / EDTA.
    4. cellules de récolte une fois qu'ils sont arrondis en aspirant soigneusement les cellules en utilisant une pointe de 1 ml ou une pipette Pasteur et de les transférer à la plus petite pla multipuits disponibleste (96 ou 48, ou 24 plaques de 12 puits).
    5. Développer clones comme nécessaire pour éviter la confluence locale.

Representative Results

La figure 1 illustre certaines des étapes clés impliquées dans la dissociation de tissu primaire: le montant exact du tissu est pesé dans un plat culture de tissus de Pétri stérile (Figure 1A, B). Le tissu est ensuite finement hachée à l'aide de scalpels stériles, jusqu'à ce qu'une suspension de tissu est obtenu (figure 1C, D). Après l'addition des enzymes de la digestion, les muscles primaire dissociation tissulaire est habituellement obtenue par digestion enzymatique à l'intérieur de 45 à 90 min. La progression de la digestion de tissu est typiquement contrôlé toutes les 15-20 minutes pour empêcher une digestion excessive et la mort cellulaire. La digestion enzymatique peut être doucement pipetté et mixé quelques fois toutes les 15-20 minutes. A la fin de l'étape de digestion, les cellules sont filtrées à travers un 100 um (figure 1E, F), puis un filtre 40 um. Selon le montant de départ tissu musculaire et si l'échantillon est obtenue à partir légèrement ou gravement muscle affecté, le cel primaire dissociéls seront hétérogène. Figure 1G illustre un exemple de cellules mononucléaires en suspension tout de suite après la digestion, alors que la figure 1H illustre un exemple de cellules primaires dissociées 3-6 h après la digestion et le placage dans des boîtes de culture tissulaire. Les cellules myogéniques sont généralement mélangés avec des fibroblastes et des cellules adipogènes. Les cellules immunitaires peuvent également être présents dans les cas où l'inflammation est associée à la maladie du patient. Par conséquent, la séparation des potentiels différents types de cellules pourrait être souhaitable. Pour l'isolement prospective des cellules myogéniques humaines, CD56 ou N-CAM a été largement utilisé comme un marqueur fiable ^6-9. Cette purification peut être bénéfique peu de temps après l'isolement d'enrichissement des progéniteurs myogéniques et avant le processus d'immortalisation cellulaire. En variante, l'immortalisation de cellules primaires peut être effectuée dans un premier temps, des cellules myogéniques ensuite immortalisées peuvent être sélectionnés sur la base de l'expression de CD56 par FACS. A sur schématiqueles étapes nécessaires avant de tri FACS et un exemple d'un profil FACS sont illustrées sur la figure 2. Brièvement, les cellules primaires sont comptées et remises en suspension à une concentration élevée, comme indiqué, puis l'anticorps primaire (par exemple anti- CD56) est ajouté aux cellules et incubé pendant 30 minutes sur la glace. Après un lavage, les cellules sont analysées au moyen d'un trieur de cellules activé par fluorescence et purifiées (figure 2) .Le rendement approximatif de cellules positives CD56 varie d'un échantillon à l'autre, allant de 40 à 70% des cellules mononucléaires totales. Le rendement varie en fonction de l'âge de l'individu et si les cellules myogéniques sont extraites du muscle affecté ou malade. Insensible musculaire a généralement pourcentage élevé de cellules myogéniques, tandis que le muscle dystrophique a souvent faibles pourcentages de cellules positives CD56. Les cellules purifiées sont étalées dans un milieu complet de croissance myogénique (voir tableau des matériaux). Les cellules peuvent être passées par trypsinisation quand ils REACh 60 à 70% de confluence. les cellules exprimant CD56 sont myogénique et capable de former des myotubes in vitro ^10,11 .Le immortalisation de cellules myogéniques nécessite la transfection séquentielle de deux gènes ^12,13 (comme schématisé sur la figure 3). Cycline kinase dépendante 4 (CDK4) est utilisé pour surmonter le stress de la culture tissulaire due à l'insuffisance des conditions de culture, et de la télomérase humaine transcriptase inverse (hTERT) empêche le raccourcissement des télomères en raison du phénomène de réplication d'extrémité ^12. Les deux plasmides pré-virales sont dans le squelette vecteur pBabe. Le produit d'assemblage d'ADNc de souris CDK4 contient le gène de résistance à la néomycine et construction d'ADNc de hTERT contient le gène de résistance à l'hygromycine. Ce dernier contient également un Herpès simplex virus thymidine kinase (TK) de cassette et les sites loxP placées aux deux extrémités de la cassette hTERT / TK. Ceci permet l'excision de l'unité d'expression par l'ensemble de la recombinase Cre ¹⁴ et de contre-sélection à l'aide gancyclovir.

Nouveaux cellules immortalisées peuvent être maintenus en tant que population où les virus sont intégrés dans différents sites, ou clones, afin d'obtenir un fond complètement homogenic génétique (insertion unique dans le génome de la cellule et sa descendance). Dans la plupart des cas, l'isolement des clones d'une population principal se traduit par de légères différences entre les clones en fonction de l'insertion de la cassette dans le génome de la cellule. En outre, la culture tissulaire étendue favorisera la sélection de cellules ayant un avantage de croissance plutôt que ceux qui différencient. Jesolation de clones individuels se fait simplement par ensemencement des cellules à faible densité (par exemple: 300 à 500 cellules en boîtes de 10 cm) et de cultiver pendant environ deux semaines jusqu'à ce que de petites colonies sont formées (10 à 20 cellules). La majeure partie du milieu est ensuite retiré, laissant seulement une fine pellicule pour empêcher les cellules de se dessécher. Les clones sont trypsinisées en utilisant des anneaux de clonage et ensuite étendre selon les besoins. Clones immortalisés expansé peuvent être testés pour l'expression de marqueurs de cellules myogéniques courantes, telles que par FACS CD56, la desmine et l'expression de MyoD par immunofluorescence, ou myotubes formation sur la différenciation. Myotubes sont plus apparent lorsque les cellules myogéniques confluentes (90% de confluence) sont placés dans un milieu de différenciation (DMEM Milieu 199 et dans un rapport de 4: 1, complété avec du sérum de cheval 2%) après 3 à 5 jours (Figure 4). Aucune différence n'a été observée dans les myotubes et formation en myotubes capacité de contraction entre les cellules de contrôle non-immortalisées et les cellules immortalisées de (Vidéos 1 et 2).

(figure 5). Exemples de courbes de croissance sont présentés dans la figure 5A, où le raccourcissement des télomères a été observé que les cellules ont été élargies pour le nombre étendu de passages. Inversement, immortalisation réussie est associée à une activité accrue de la télomérase (Figure 5)

Figure 1:.. Illustrations d'étapes critiques pour la dissociation du tissu primaire musculaire humaines (A) pesée de la plaque de culture vide, avant le placement de tissus et (B) après la pose du tissu (C) scalpels stériles sont utilisés pour hacher la tissu, jusqu'à ce que (D) le tissu ilsoi est réduite à une suspension. La collagénase et la dispase sont ajoutés et le tissu est digéré pendant 45 à 90 min, puis la digestion est filtré à travers un filtre à mailles de nylon de se défaire des débris (E, F). (G, H) des exemples de cellules fraîchement dissociées plaquées immédiatement après dissociation (G ) ou 3 heures après la dissociation, lorsque les cellules primaires commencent à se installer (H).

Figure 2:. Workflow des procédures impliquées dans la coloration des myoblastes humains avant la purification par l'intermédiaire de cellules activées par fluorescence trieuse Les étapes critiques pour la coloration des cellules humaines avant l'analyse FACS sont mis en évidence. Des exemples de parcelles FACS sont également présentés. Le contrôle négatif (panneau de gauche) est utilisé pour établir la grille de tri. Dans les panneaux de droite, les cellules positives exprimant CD56 sont déclenchés et le pourcentage de cellules positives se affiche. Cette stratégie peut être utilisée pour purifier des cellules myogéniques soit avant ou après immortalisation la procédure d'immortalisation.

Figure 3: Représentation schématique de la production de virus pour myoblastes immortalisation. Flux de la production de rétrovirus utilisé pour immortaliser myoblastes. Une construction de plasmide contenant soit CDK4 ou la cassette hTERT-TK floxé dans un squelette de pBabe (à gauche) est transfecté dans la écotrope Phoenix (PE) lignée cellulaire de conditionnement pendant une nuit (8 à 12 h) à l'aide Polyjet. Le surnageant est ensuite transféré, après filtration, sur la lignée cellulaire d'encapsidation amphotrope Phoenix (PA317). Le surnageant de ces cellules peut être utilisé soit directement, soit les cellules peuvent être sélectionnées soit avec de la néomycine ou à l'hygromycine pour générer une lignée cellulaire stable pour une utilisation future. Des aliquotes de la filtEred surnageant peut être conservé à -80 ° C pour une utilisation ultérieure (avec une perte de 50% d'efficacité). Bleach est utilisé pour nettoyer tous les consommables utilisés à tous les points de la procédure.

Figure 4:. Schéma d'immortalisation réversible myoblastes workflow de la procédure d'immortalisation (en haut): Les cellules primaires sont d'abord transfectées avec CDK4. Après la sélection de néomycine, les myoblastes sont transfectées avec une cassette de hTERT floxé contenant deux marqueurs de sélection; HSV-TK et Hygromycine. Si on le désire à une date ultérieure, la cassette de hTERT peut être "floxé" par exprimant la recombinase Cre et la sélection pour l'excision avec le gancyclovir. Cela permet à la «re-mortalization" des myoblastes et la ré-ouverture de raccourcissement des télomères. Si les télomères sont 20 kb de long, ce qui permet encore des centaines de doublements, et évite t il complication de la sur-expression de hTERT. Enfin, les clones isogéniques de la population immortalisées peuvent être isolés. Le myogenicity des cellules nouvellement immortalisées peut être montrée en utilisant des marqueurs spécifiques des cellules musculaires tels que la desmine (panneau en bas à gauche, les cellules dans un milieu de croissance colorées avec anti-desmine, clone D33, vert). Ce clone est si myogénique que les cellules différenciées sont considérées même si les cellules sont maintenues dans des conditions de prolifération. Lorsque les cellules sont différenciées dans un milieu de différenciation (avec 2% de sérum de cheval, le milieu et les panneaux de droite) myotubes formation devient très étendue. Presque toutes les cellules colorées avec l'anticorps MF20 à embryonnaires chaîne lourde de myosine (vert) et myotubes ont plusieurs noyaux par coloration DAPI (bleu, toutes les images). Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 5: La vérification de la procédure d'immortalisation. (A) courbes de clones isogéniques de myoblastes primaire, la population immortelle (myoblastes hTERT-CDK4) et clone re-mortalized croissance (myoblastes Floxé hTERT-CDK4) sont présentés à titre d'exemples. Pas de différences dans les taux de croissance étaient détectables avant que les cellules atteignent la sénescence. Le raccourcissement des télomères a été contrôlée en fonction de doublements de population et la longueur des télomères a été mesurée par la Fondation. (B) myoblastes TRF montré sont des exemples de points de temps précoces et la réplication à la fin de myoblastes (5 points de temps de PD 13-75), re-mortalized après hTERT excision (3 points de temps de PD 62-152) et myoblastes immortalisés (PD 75 et 200). (C) l'infection de hTERT réussie se traduit par une augmentation de l'activité de la télomérase. l'activité de la télomérase a été évaluée par ddTRAP (ddTRAP lecture, à droite, la quantification de l'essai, gauche) ¹⁵ dans les cellules avant et après HteRT infection. hTERT excision aboli l'activité de la télomérase du seuil initial vu dans les myoblastes. Les résultats sont présentés comme des produits totaux de la télomérase générés par équivalent cellulaire (fond corrigée). Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Vidéos 1 et 2. Les myotubes ont été générées à partir des cellules avant et après le processus d'immortalisation. Les cellules ont été cultivées jusqu'à confluence dans des milieux de croissance et commutés à des milieux de différenciation pendant 10 jours. Dans les deux vidéos, contractions fonctionnelles d'un ou plusieurs myotubes sont détectables. Enregistrement de la secousses spontanéequi a été fait en utilisant une lentille 20X. Aucune différence n'a été observée entre les cellules immortalisées et non-immortalisées.

Discussion

Cellules comme une ressource utile

L'isolement et la culture de populations de cellules myogéniques est extrêmement utile lors de l'établissement des phénotypes de la maladie ou dans des modèles in vitro de la maladie. La procédure d'isolement des cellules myogéniques décrite ici permet l'isolement des myoblastes et fibroblastes à partir d'échantillons de muscle squelettique, qui peuvent ensuite être propagées, différenciée, ou immédiatement analysés. Structure et la fonction myoblastes peuvent être évalués par un examen microscopique, l'évaluation de la survie cellulaire, l'évaluation de la fusion cellulaire, ou par des études moléculaires de l'ARN ou de l'expression des protéines. En outre, les myoblastes peuvent être différenciées en myotubes qui partagent de nombreuses caractéristiques de myofibres immatures, ce qui permet l'évaluation directe de la fonction de myoblastes dans le contexte du développement musculaire et la récupération après une lésion des tissus. Bien que tous ces phénotypes ont tendance à être assez reproductible dans les premiers passages de cellules myogéniques, le comportement d'un grand nombre m primairelignées cellulaires yogenic peuvent être modifiés au cours de nombreux passages. En conséquence, il est parfois souhaitable d'immortaliser une lignée cellulaire myogène donnée (comme décrit ici), qui peut faciliter la facilité de mise en place de la culture et la production de résultats reproductibles sur une période de temps plus longue.

Sélection de populations cellulaires spécifiques

Ce protocole décrit l'isolement de cellules myogéniques de tissu musculaire squelettique en utilisant FACS comme un schéma de purification. La stratégie proposée de sélection de cellules comprend l'utilisation de l'iodure de propidium (un indicateur de cellules mortes) et CD56 (un marqueur des cellules myogéniques) pour différencier vivantes, des cellules myogéniques de cellules mortes, les débris et les cellules non myogéniques. Cellules contenues dans la population CD56 positif comprendront progéniteurs myogéniques capables de myotubes formant, tandis que la population de CD56 négatif comprendra cellules non myogéniques y compris les fibroblastes et les cellules éventuellement adipogéniques. Chacune de ces fractions peutindépendamment être cultivées pour produire des cultures de cellules de myoblastes ou des fibroblastes, ainsi que la possibilité d'établir des cultures de cellules de fibroblastes parallèles peuvent être utiles pour cellules ou de l'ADN bancaires exercices indépendants ou des conditions de commande supplémentaire pour les dosages étant effectués sur les cultures de cellules myogéniques. Il ya plusieurs autres options pour la sélection des cultures spécifiques de cellules fibroblastiques myoblastiques et du tissu musculaire digéré, dans les cas où tri FACS est indésirable ou indisponible, qui sont décrits ailleurs ^16,17. Une autre méthode pour séparer les cellules fibroblastiques myoblastiques et implique l'utilisation de propriétés d'adhérence différentielles entre ces deux types de cellules pour enrichir des passages successifs des cellules d'un type cellulaire donné. Comme les fibroblastes adhèrent au plastique beaucoup plus facilement que les myoblastes, permettant aux suspensions de cellules à incuber sur de la matière plastique pendant environ une heure lors de l'établissement ou de repiquage des cellules et le surnageant a ensuite placage sur un plat différent, resull dans l'élimination de nombreux fibroblastes de la suspension cellulaire ^18.

Utilitaire des fibroblastes vs myoblastes

Muscle biopsies provenant de patients sont généralement utilisés pour la purification des cellules musculaires primaires, cependant myoblastes malades peuvent pas proliférer efficacement et ne peuvent subir un petit nombre de divisions in vitro, ce qui nécessite l'immortalisation de cellules pour atteindre le nombre de divisions nécessaires. Étant donné que les fibroblastes et les myoblastes peuvent être isolés à partir de biopsies musculaires, les deux fractions de cellules doivent être enregistrés à partir d'échantillons de patients, car ils peuvent être utiles à la fois et offrir plus de polyvalence pour les applications en aval. Par exemple, les fibroblastes peuvent être utilisés pour la génération de cellules souches pluripotentes induites (CISP), qui sont très prometteurs pour générer des nombres de cellules illimité et le potentiel d'être induites à se différencier en plusieurs lignées cellulaires. Ces caractéristiques sont hautement souhaitables pour les cellules obtenues à partir de patientss avec des maladies rares, qui peuvent potentiellement être corrigées in vitro ou utilisés dans des projections de médicaments expérimentaux à la recherche de composés thérapeutiques. Myoblastes immortalisés peuvent également être utilisés dans le dépistage basée sur la drogue. Fibroblastes peuvent aussi être efficacement convertis vers un destin myogénique par infection avec un virus exprimant MyoD ^19-21. Cette méthode a été testée en utilisant des fibroblastes efficacement extraites de patients atteints de maladies musculaires et confirmé que des fibroblastes exprimant MyoD peuvent former des myotubes efficace qui expriment des protéines musculaires matures. Ainsi, les deux types de cellules peuvent être efficacement utilisés dans plusieurs applications en aval et fournir du matériel précieux pour les études de diagnostic et thérapeutiques.

Impact de immortalisation

L'immortalisation des cellules diploïdes normales, permet de préparer une lignée cellulaire humaine stable qui peut être entièrement caractérisé et étudié par de nombreux laboratoires différents. Les cultures primaires de indépendanteisolements peuvent varier et leur capacité globale de prolifération peuvent être variables lorsque le dommage est introduit dans le processus de dissociation ou par digestion excessive, qui peut fausser le comportement de la culture. L'immortalisation des cellules en utilisant l'expression de la sous-unité catalytique de la télomérase (hTERT) a l'avantage de maintenir un phénotype cellulaire stable et les cellules diploïdes restent. Il ya eu des rapports sur des souris que la télomérase peut moduler la voie Wnt ^22. Nous ne avons pas observé ce phénomène dans les cellules humaines. Cependant, pour éviter une telle complication potentielle, la cassette de hTERT a été flanquée par des sites lox, de sorte qu'il peut être retiré après télomères ont été allongées. Télomères longs confèrent des centaines de divisions supplémentaires, généralement suffisant pour réaliser la plupart des expériences.

Parce que l'expansion cellulaire continue fournit toujours un avantage sélectif pour une croissance rapide, le phénotype cellulaire peut devenir parfois biaisée en raison de la prolifération de la division la plus rapidecellules, plutôt que les meilleures cellules de différenciation. Bien que cela n'a pas encore révélé être un problème significatif en utilisant le procédé décrit, il peut être remédié en décongelant les cellules qui ont été congelées au début de leur historique de culture ou par sélection clonale des cellules présentant le phénotype souhaité.

Enfin, bien que l'expansion des cellules myogéniques de numéros près illimitées présente des avantages pour le criblage de médicaments et de la modélisation de la maladie du possible, les techniques actuelles ont aussi des inconvénients intrinsèques qui empêchent l'utilisation de ces cellules en tant que véhicules thérapeutiques dans la thérapie à base de cellules, ou des outils de diagnostic comme primaires. Tant l'étendue dans la culture et immortalisation étapes vitro changer le phénotype des cellules musculaires par rapport à leur état ​​natif. Fait important, ces cellules sont développées dans un milieu qui est très différent du milieu naturel des cellules satellites primaires dans leur niche. Par conséquent, les cellules immortalisées exigent des tests de sécurité intense et éventuellement dévepement de nouvelles techniques se ils doivent être réintroduits dans le muscle de patient humain.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Tissue culture biosafety hood	Baker Company, Inc.	Model SterilGuard Hood
Benchtop centrifuge, such as Beckman Model	Beckman Coulter	Model Allegra 6R	If cell sorting is performed, a centrifuge with refrigeration is preferred
Microscope	Nikon	Model Eclipse TS100
Tissue culture incubator, connected to a CO2 source	Forma Scientific	Series II
Fluorescence-activated cell sorter (FACS)	Becton Dickinson	Model Aria
Reagents for isolation of primary myoblasts from tissue
Dispase II	Roche Applied Science	#04942078001	Prepare a sock solution of 2.4U/ml in DMEM
Collagenase D	Roche Applied Science	#088882001	Prepare a stock solution of 10 mg/ml
1x Sterile Hank’s Balanced Saline Solution (HBSS), calcium and magnesium free	GIBCO Life Technologies	#14185-052
Bovine serum albumin, fraction V	Sigma	#05470	Prepare a sterile  solution of 1X HBSS 0.5% BSA for FACS sorting
Sterile growth medium for myoblasts: Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) with high glucose (4.5 g) supplemented with 30% fetal bovine serum	GIBCO Life Technologies	11965-092	Contains L- glutamine
RBC lysis solution	Qiagen	158904
Propidium Iodide stock 10mg/ml	Sigma	P4170	Prepare the stock solution by diluting the powder in sterile distilled water
Anti-human CD56 antibody for flow cytometry	Biolegend	318310	APC-conjugated antibody, other labels are avaialable
Reagents for immortalization of primary myoblasts
Ecotropic packaging cell line PE	Cell Biolabs	RV-101
Amphotropic packaging cell line PA3174	Cell Biolabs	RV-102
Pig skin gelatin	Sigma	G1890-500g	Prepare a stock solution of 0.1% gelatin in water. Coat the dish with the solution at 37°C for one hour. Remove the solution and add medium.
PolyJet	Signagen	SL100688
G418	Fisher	345812
Hygromycin	EMD Biosciences	400051
pBabe plasmids containing mCDK4 and hTERT	not commercially available		Stadler et al, 2013
Qiagen plasmid midiprep kit	Qiagen	12143
Medium 199	Life Technologies	Medium 199 (31150022)
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM)	Life Technologies	DMEM (11965-092)	Mix 4:1 DMEM:199
Myoblast growth medium: 4:1 Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) and Medium 199 supplemented with 15% fetal bovine serum; 0.02 M HEPES buffer; 1.4 mg/L vitamin B12; 0.03 mg/L ZnSO4, 0.055 mg/L dexamethasone, 2.5 μg/L hepatocyte growth factor and 10 μg/L beta fibroblast growth factor.	Life technologie (DMEM, F199); Atlanta Biological (FBS); Invitrogen (Hepes); Fisher (ZincSulfate); Sigma (Vit.B12, Dexamethasone); Chemicon international (HGF); Biopioneer (betaFGF)	#15630-080 (Hepes); #Z68-500 (ZnSO); #V2876.#D4902 (Vit.B12, Dex); GF116 (HGF); HRP-0011 (bFGF).	Prepare media and stock solution Vit. B12 (20mg/ml); ZincSulfate (60µg/ml); Dex (55µg/µl) separately for easier use. HGF stock solution (5µg/ml) and FGF (20µg/ml) should be added freshly every week at the final working concentration.
TrypLE express	GIBCO Life Technologies	12605-010
Myosin heavy chain antibody for immunostaining	Developmental Hybridoma Bank	MF20	Clone MF20
Desmin Antibody for immunostaining	Thermo Scientific	MS-376-S0	Clone D33
Horse serum	Invitrogen	26050-088
Reagents for primary skin fibroblast isolation
Transport medium: RPMI 1640 supplemented with 10% fetal bovine serum and 0.2% penicillin/streptomycin	RPMI medium 1640: GIBCO Life Technologies	11875-093
Human primary fibroblast culture medium: RPMI 1640 supplemented with 10% fetal bovine serum and 1% penicillin/streptomycin	Fetal bovine serum: Thermo Scientific	SH30071.03
Collagenase solution: Collagenase type 2 (100 mg) resuspended in 12.5 ml of fibroblast culture medium and filter-sterilized	Worthington	4176
Sterile 1X Phosphate Buffer Saline (PBS) calcium and magnesium free	Lonza	17-516F
Materials for isolation of primary myoblasts
50 ml and 15 ml sterile conical tubes	GeneMate/Bioexpress	C-3394-4 (50 ml) ; C3394-1 (15 ml))
Sterile scalpels	Aspen Surgical	372610
Hemocytometer	Hausser Scientific	1492
Sterile 5, 10, and 25 ml pipettes	Bellco glass	1226-05010 (5 ml); 1200-10010 (10 ml) ;1228-25050 (25 ml)	Reusable pipettes are washed, cotton plugged and autoclaved before use
Sterile tissue culture-treated plastic dishes (10 cm)	BD Falcon	353003
Sterile nylon cell strainers (100 µm and 40 µm size)	BD Falcon	352340 (40µm); 352360 (100µm)
Materials for myoblast immortalization
Sterile 0.45 µm filters	Millipore	SLHV013SL
Cloning rings	Corning	#3166-8	To be cleaned and autoclaved before and after use
Materials for fibroblast cell lines
Sterile 35 mm tissue culture-treated plastic dishes	Greiner bio-one	628160
Sterile scalpels	DeRoyal	D4510A
Sterile T25 tissue culture flasks	Techno Plastic Product, TPP	90026	sold in the USA by MIDSCI
TrypLE express	GIBCO Life Technologies	12605-010