Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

ما يفعل وما يترك من المجهري البرد الإلكترون: وهو أول كتاب عن تحضير العينة وجمع البيانات عالية الجودة للتعمير الجزيئات 3D

Published: January 9, 2015 doi: 10.3791/52311
Automatic Translation
1, 1
1Department of Physiology and Biophysics, Virginia Commonwealth University

Introduction

هدف cryoEM هو الحصول على الإلكترون صور مجهرية من الجزيئات في ولاية المائية الأصلية الخاصة بهم. بحكم تضمين جزيء في الماء المزجج، عينة المجمدة-المائية يمكن إدخالها مباشرة وتصور في الصك TEM. التزجيج، من خلال تجميد فلاش (10،000 س C / ثانية) التي تحققت، يتجمد العينة دون تبلور الماء ويضمن إعادة ترتيب الجزيئية خلال تجميد ضئيلة. فائض نثر الإلكترون من العينة فيما يتعلق عازلة المحيطة يضفي تباين صغيرة ولكنها كافية لرؤية جزيء في غياب أي وصمة عار 1. ويمكن بعد ذلك معالجة الصور محوسب استخدامها لإعادة جزيء في هيكل 3D. الجزيئات الكبيرة في نطاق ~ 500 kDa- متعددة نجمة داود الحمراء هي عينات مثالية لcryoEM (تمثل أكثر من 80٪ من الضفة المجهر الإلكتروني البيانات (بنك المعلومات) إدخالات)؛ وتشمل هذه البروتينات والمجمعات البروتين، البروتين النووي حمض جomplexes، وبروتينات الغشاء جزءا لا يتجزأ من طبقة ثنائية. وهذه الجزيئات أقل عرضة للتبلور (مع إدخالات أقل من 2٪ في قاعدة البيانات PDB) ومع ذلك هو الحال في كثير من الأحيان أن أجزاء أصغر حلها عن طريق البلورات بالأشعة السينية أو NMR يمكن رست في المغلف 3D التي أنشأتها cryoEM. من ناحية أخرى، فإن بعض من أكبر الهياكل حلها عن طريق cryoEM هي التعرف داخل الخلية الكاملة رقيقة المقطع TEM 2. وهكذا، cryoEM الجسور فعال الفجوة حجم والقرار بين الهياكل التحت خلوية وذرية.

CryoEM يعكس أفضل هيكل الأصلي للجزيء لمن طريقة أكثر كلاسيكية من تلطيخ السلبية (NS)، حيث جزيء هو المجففة وتحيط به طبقة من وصمة عار المعادن الثقيلة حيث المنطقة من وصمة عار الإقصاء يخلق يتناقض بشدة "سلبية" صورة 3. في كلتا الحالتين ينتج شعاع الالكترون 2D صور الإسقاط من الجزيئات تسمى الجزيئات، حيث قHAPE يعتمد على التوجه للجزيء فيما يتعلق شعاع الالكترون. العديد من الجسيمات، على الأقل ~ 1،000 وبدون حد أقصى، يمكن تحليلها على الكمبيوتر مع "تحليل واحد الجسيمات" (SPA) برنامج لزيادة إشارة إلى نسبة الضوضاء (SNR) على الرغم من المتوسط، وإيجاد المعلمات الجسيمات التوجه المكاني هناك حاجة لإعادة هيكل 3D على جزيء من قبل الظهر 4-7 الإسقاط. NS، مع ارتفاع SNR، ويستخدم لعينة التوصيف الأولي وتوليد دي نوفو إعادة الإعمار 3D. قرارها نادرا ما يتجاوز 20 Å، التي تفرضها الجفاف وحجم الحبوب والمعادن الثقيلة. بشكل عام، من أجل تقرير الهيكلي cryoEM 3D، ويتم الحصول على إعادة الإعمار 3D منخفضة الدقة أول من NS ثم يستخدم cryoEM لصقل هذه منخفضة الدقة خريطة أولية لمواصلة دراسة جزيء في حالته المائية الأم، لنرى هيكلها الداخلي، وزيادة قرارها. لاالشركة المصرية للاتصالات أنه إذا تم تشويه نموذج NS (على سبيل المثال الأكثر شيوعا هو تسطيح الناجمة عن الجفاف 8)، وكان للجسيمات cryoEM SNR منخفضة، ثم تشويه يمكن أن تحمل في نموذج cryoEM (القطع الأثرية نموذج التحيز، وهو أمر شائع في البلدان المنخفضة SNR مجموعات البيانات 9). أن التشوه الهيكلي تؤدي إلى عدم تطابق بين NS وcryoEM الجسيمات الأولية وبين الجسيمات cryoEM الخام والتوقعات المقابلة من نموذج 3D متعامد على اتجاه التسوية. قد نموذج التحيز حل في حد ذاته كما يخضع نموذج 3D دورات الصقل المتعاقبة. يجب أن لا تحدث، والتي سيتم الكشف عن عدم وجود مراسلات بين الجسيمات cryoEM الخام والتوقعات المناظرة من نموذج 3D، ثم يجب أن تبنى نموذج دي نوفو من البيانات cryoEM. وثمة نهج جيد يمكن أن يكون لاستخدام خوارزمية إعادة الزاوي 10، والتي قد تسفر عن عدة مجلدات 3D ممكن، ومن ثم استخدام نموذج NS 3D لتحديد أفضل نموذج ممكن cryoEMالتي ستكون مزيد من الصقل 11. استراتيجية أفضل هو زيادة SNR من مجموعة البيانات cryoEM (انظر قسم مخصص في مناقشة).

جودة البيوكيميائية للجزيء النقى لها تأثير أقصى في النتيجة النهائية. وجزيء، تنقيته من الأنسجة أو المعبر عنها في أنظمة مغاير، تحتاج إلى وجود درجة عالية من النقاء وأن تكون سليمة من الناحية الهيكلية. لا ينبغي أن تشكيل المجاميع ولا ينبغي أن تفصيل. لتحديد التشكل معين، ينبغي للظروف التحضير تعزيز دولة بتكوين موحدة. لدراسة المجمعات، فمن الأمثل أن لهم ك D هو في حدود نانومتر، وقد استخدمت على خلاف ذلك مثبتات بنجاح لتحقيق الاستقرار في أقل التفاعلات تقارب 12،13.

الصور cryoEM غير المجهزة تعطي معلومات قيمة عن أبعاد، المخطط العام، وحالة التجميع / multimerization، والتجانس، والبنية الداخلية للmacromolecuجنيه. ومع ذلك ومما يعزز من إمكانات تقنية إلى حد كبير مع معالجة الصور. هيكل يكشف 3D الهندسة المعمارية الشاملة للجزيء، وموقع 3D من بروابط ومفارز، والتغيرات متعلق بتكوين، وتمكن لرسو السفن هياكل ذرية تحددها البلورات بالأشعة السينية أو NMR. كمية المعلومات لإعادة الإعمار 3D يزيد تدريجي كما القرار هو زيادة: في العام 15-20 قرار Å يسمح لرسو السفن لا لبس فيه هياكل ذرية، في 9-10 اللوالب Å ألفا هي مرئية كما قضبان، في 5 Å فمن الممكن أن نستشف أوراق بيتا، وعلى قرارات 3.5 Å وأفضل أنه من الممكن بناء النموذج الذري 14.

إمكانية الحصول على صور بالمعلومات وإعادة الإعمار 3D باستخدام SPA من كميات صغيرة نسبيا من عينة جعل cryoEM تقنية جذابة، كما 3-5 ميكرولتر من 0.05 على الأقل ملغ / مل تكفي لإعداد شبكة واحدة TEM. متطلبات الحد الأدنى مفيدةلcryoEM هي البرد الغطاس محلية الصنع أو التجارية، ومجهر الكتروني مع فراغ عالية جدا، ووسائل الإعلام تسجيل صورة وعدة جرعة منخفضة، والبرد حامل مع محطة الضخ لديها، وهو جهاز التفريغ توهج، والمبخر. الميزات غير الضرورية ولكن أبعد من المرغوب فيه على TEM هي كاميرا CCD (موجودة في جميع الحقوق الحديثة) أو كاشف الإلكترون المباشر، بندقية الانبعاثات الميدان (FEG)، والترشيح الطاقة، والإنتاجية العالية البرمجيات جمع البيانات. هذا البرنامج من حيث المبدأ تمكن جمع عشرات الآلاف من الجزيئات في جلسة واحدة cryoEM 15، ولكن زيادة احتياجات تخزين البيانات واللاحقة تحت إشراف تحتاج إلى وقت ما بعد المعالجة إلى أن تؤخذ بعين الاعتبار. FEG جنبا إلى جنب مع وظيفة نقل النقيض (CTF) تصحيح يكمن وراء معظم عمليات إعادة البناء 3D التي وصلت إلى قرار كاف لتصور اللوالب ألفا. في تلك المرحلة، ومستوى القرار هو أيضا عينة التي تعتمد على: بلغت 10 قرار Å هو أقل شيوعا للبروتينات الغشاء في حين إذاترتيب عال من التماثل موجود ثم قرار الذري هو أكثر تحقيقه. وقد مكنت التطورات الأخيرة في كشف الإلكترون مباشرة قرار الذري حتى بالنسبة الجزيئات مع انخفاض (4X) أو أي التماثل، حيث جودة cryoEM خرائط كثافة الإلكترونات مباريات هذه مستمدة من بيانات حيود الأشعة السينية 16،17.

وتقدم أمثلة عملية توضح قدرات تقنية هنا لمدة أربع أنواع من الجزيئات الهامة حيث يوجد cryoEM كبير دورا مستمرا في تقرير الهيكلي. (ط) مع التماثل icosahedral في أن يزيد من مجموعة البيانات بنسبة 60 أضعاف وحجم كبير في أن يسمح المؤمنين والمواءمة استنساخه، قد تم حلها هياكل عدة فيروسات icosahedral بقرار شبه الذرية التي كتبها cryoEM تليها SPA 18. وتبين لنا مثالا على فئة من الفيروسات icosahedral، والفيروسات الغدة المرتبطة (AAVs)، والتي هياكل شبه الذرية التي كتبها cryoEM وcryoEM HY / الأشعة السينيةطرق brid توجد 19،20. (ب) تشمل الجزيئات مع بنية حلزونية الأنابيب الدقيقة، خيوط والفيروسات. الوحدات المتكررة على طول محور حلزونية يمكن تحليلها بواسطة إصدار أكثر تعقيدا من SPA تكييفها وفقا لهندسة حلزونية 21. في المثال نظهر فيروس تبرقش التبغ (TMV)، وفيروس RNA التي تم حلها بقرار النووي بحلول cryoEM 22. (ج) وقد درس البروتينات القابلة للذوبان كبيرة بما فيه الكفاية. ومن بين هذه الجزيئات تشكيل اسطوانات multimeric متناظرة تشكل بنية المتكررة في كثير من الأحيان حلها في قرار subnanometer 23،24. هنا نعرض صور KLH، حاملة الأكسجين رخو، حيث تم إنشاء نموذج الجزيئي الهجين من cryoEM / الأشعة السينية طرق البلورات الهجين 25. (د) بروتينات الغشاء هي فئة هامة من البروتينات. أنها تشكل حوالي 1/3 من البروتينات المشفرة بواسطة الجينوم البشري، ولكنها من الصعب تميز هيكليا بسبب التعقيدات المرتبطة TRاستقرار نطاق ansmembrane 26، التي تشكل أقل من 1.5٪ من الهياكل حلها عن طريق أي تقنية الهيكلية مجتمعة. ويتمثل دور cryoEM و 3D إعادة الإعمار في تقرير الهيكلي مع مستقبلات ryanodine (RYR)، وهي كبيرة حقيقية النواة الكالسيوم داخل الخلايا 2+ قناة مهمة في تقلص العضلات وإشارات الدماغ. أعلى الهياكل قرار cryoEM حتى الآن، مع 10 قرار Å، تكشف عن هيكل الثانوي 27.

Protocol

1. كرو حامل إعداد وصيانة

ملاحظة: محطة ضخ الجافة، ويتكون من محطة ضخ توربو واحد أو أكثر من وحدات التحكم مرحلة الباردة، ويستخدم في المقام الأول لثلاثة أغراض: أ) إنه مكان آمن لتخزين أصحاب البرد عندما لا يتم استخدامها. الطريقة الصحيحة لتخزين حاملي هي تركهم في محطة تحت فراغ. ب) أن تتبخر الصقيع والرطوبة تراكم الذي يحدث عند إزالة النيتروجين السائل من ديوار وغيض من حامل البرد يتعرض؛ ويتحقق هذا مع دورة الاحماء. ج) تجديد المجففة الزيوليت، وتحقيق فراغ عالية في دوار cryoholder. وهذا أمر ضروري لعقد درجة حرارة ثابتة عند القيام المجهري البرد الإلكترون.

  1. الاحماء دورة.
    1. إدراج حامل البرد في أحد منافذ الضخ من محطة الضخ. عقف واحد من الأنابيب اخلاء إلى منفذ المعادن تحت صمام فراغ حامل. جعلتأكد من أن جميع الصمامات في محطة (V1، V2، V3 و) وعلى حامل البرد مغلقة.
    2. تشغيل وحدة تحكم مرحلة البارد وتوصيله إلى حامل من خلال سلك التحكم. بدوره على مفتاح الطاقة من محطة الضخ توربو.
    3. بدء الخيار دورة الإحماء في وحدة تحكم مرحلة البارد. عندما الفراغ في محطة ضخ توربو يقرأ 10 -3 عربة أو أفضل، وفتح صمام V2 فراشة، والانتظار حتى تستقر فراغ، ثم قم بفتح V1 صمام فراشة.
    4. تشغيل دورة الاحماء لمدة حوالي 30 دقيقة حتى درجة الحرارة في حامل مستقرة فوق 20 درجة مئوية. وثيق V1، ثم وقف دورة.
  2. دورة الزيوليت. تشغيل دورة الزيوليت بين 4 ساعات وO / N قبل جلسة CryoEM، ومرة ​​واحدة في الأسبوع إذا لم يتم استخدامها.
    1. بدء الخيار دورة الزيوليت وتحديد الوقت اللازم للوصول الى فراغ جيدة، في حدود 1-2 × 10 -4 عربة، وبالتالي عقد طويل الوقت. عندما الفراغ يصل 10 -3عربة، افتح صمام ديوار الإخلاء، V3. سوف محطة الضخ ثم إخلاء الخط إلى حامل. انتظر حتى تستقر على فراغ.
    2. فتح صمام على حامل البرد. عندما دورة كاملة، إغلاق الصمامات بالترتيب العكسي التي تم فتحها: صمام على حامل، ثم V3، V2، وأخيرا V1. إيقاف تشغيل محطة الضخ وتوربو وحدة تحكم مرحلة البارد، وقطع حامل البرد من وحدة تحكم مرحلة البارد ومحطة ضخ توربو.

2. إعداد الشبكة

  1. التنظيف.
    ملاحظة: عند استخدام شبكات هولي التجارية، فمن المستحسن لتنظيفها قبل الاستخدام، من أجل إزالة أي البوليمر المتبقية التي تم استخدامها في عملية التصنيع. القيام بذلك في طبق بتري الزجاج مع 5 طبقات من ورق الترشيح وضعت في أسفل.
    1. وضع شبكات على ورقة الترشيح مع الجانب الكربون هولي مواجهة.
    2. باستخدام الزجاج ماصة باستير، والرطب ورقة مع عدة قطرات سو الكلوروفورم حول شبكات حتى نبدأ العائمة.
    3. تغطية طبق بيتري مع الغطاء مفتوحا قليلا في غطاء الدخان O / N.
  2. ملاحظة: الدعم الكربون رقيقة (الخطوات 2،2-2،3) يمكن حذف كطبقة الجليد يمكن تشكيلها مباشرة عبر ثقوب صغيرة في الشبكة الكربون هولي.
    1. باستخدام زوج من ملاقط، يلتصق قطعة من الميكا لفضح سطحين جديدة. وضع الأسطح الجديدة المكشوفة من الميكا وجها حتى على قطعة من الورق الأبيض في طبق بتري.
    2. وضع طبق بتري في جرة الجرس من المبخر الكربون. بدء ضخ أسفل التسلسل حتى الفراغ هو أقل من 2 × 10 -6 عربة. لتتبخر أي شوائب على سطح قضيب الكربون، وإجراء ما قبل التبخر مع طبق بيتري المغطاة. ثم الهواء جرة الجرس وإزالة الغطاء من طبق بيتري.
    3. أداء مضخة أسفل التسلسل حتى الفراغ هو أقل من 10 -6 عربة ومعطف الميكا مع طبقة رقيقة (~ 5 نانومتر) من الكربون. استخدام حماية العين أثناء الكربونالتبخر. مراقبة سمك الفيلم الكربون بنسبة الظلام الناتجة عن الورقة التي كانت قد وضعت تحت صفائح الميكا.
  3. نقل رقيقة الكربون إلى الشبكة TEM.
    1. قطع 0.5 × 1 سم قطعة من الميكا المغلفة وتعويم الكربون من على سطح مستو من تصفيتها، دي المتأينة المياه. استخدام ورقة عدسة بصرية للحصول على سطح الماء مسطح. باستخدام الملقط، وطرح الجانب الكربون هولي من الشبكة في اتصال مع السطح العلوي للطبقة الكربون العائمة ويستلم السلعة.
    2. كرر الخطوات من 2.3.1 و2.3.2 حتى يتم إعداد عدد كاف من الشبكات.
  4. توهج التفريغ.
    ملاحظة: التفريغ توهج تحويل طبقة الكربون طلاء مسعور بشكل طبيعي من الشبكات إلى محبة للماء. هذه الخطوة اختيارية.
    1. وضع شبكات مع الجانب الكربون تواجه حتى على شريحة زجاجية 7.5 × 2.5 سم مغطاة بارافيلم. وضعه في غرفة المعدات توهج التفريغ وإغلاق الغرفة.
    2. مضخةجرة الجرس وتوهج التفريغ لمدة 20 ثانية في 25 مللي أمبير و 7 × 10 -2 mbars.
      ملاحظة: وخلال هذا الوقت يصبح توهج الأرجواني الضوء المرئي. إزالة شريحة زجاجية مع شبكات واستخدامها في حدود 1 ساعة، وإلا، سوف تحتاج إلى أن تكون تفريغها توهج مرة أخرى.

3. عينة يغرق التجميد

ملاحظة: استخدام النظارات الواقية والأحذية المناسبة عند استخدام هذه الأداة للحماية من النيتروجين والإيثان البقع السائلة.

  1. بدوره على جهاز تجميد يغرق. ملء خزان المرطب بالماء المقطر. ضبط درجة الحرارة المطلوبة، والرطوبة النسبية والشروط تغرق لطخة الوقت، قوة صمة عار والوقت الامتزاز (22 ° C، 95٪، 2 ثانية و 2 و 40 ثانية في المثال المقدمة هنا). مكان جديد رقة الترشيح النشاف.
  2. تبريد الحاويات الإيثان بنسبة ملء الخزان الخارجي مع النيتروجين السائل حتى يتحقق الاستقرار (حوالي 10 دقيقة). مرة واحدة يتوقف النيتروجين السائل boilinز، ضع غيض من أنبوب القادمة من خزان الإيثان في الغرفة الداخلية وفتح صمام ببطء شديد. تسييل الإيثان في الغرفة الداخلية وملئه إلى 1 ملم من أعلى. تجنب تجميد الإيثان. تنبيه: الإيثان هو قابل للاشتعال للغاية والمتفجرات.
  3. جعل تتماشى ملاقط متأكد من داخل جهاز الهبوط التجمد.
  4. بدوره على الرطوبة. تحميل الشبكة على ملاقط، وتحميل 3-5 ميكرولتر من العينة على سطح الكربون (الجانب مملة) من الشبكة هولي. انتظر العينة إلى كثف إلى الشبكة وأداء النشاف لتحقيق طبقة السائل رقيقة.
  5. فلاش-تجميد الشبكة التي تغرق به إلى الإيثان السائل. إزالة التجمع ملاقط الشبكة من الإيثان السائل عقد ملاقط بشكل مطرد، ونقله إلى غرفة الخارجي مع النيتروجين السائل. نقل الشبكة إلى مربع شبكة صغيرة مغمورة في النيتروجين السائل. تأكد للحفاظ على عينة المزجج في النيتروجين السائل في كل وقت أثناء نقل إما إلى خزانأو لصاحب البرد.
    ويمكن تخزين صناديق الشبكة في سعة كبيرة (35-50 L) ديوار النيتروجين السائل على الأقل 1 سنة: ملاحظة. لتخزين مريحة يمكن وضعها في أنبوب 50 مل الصقر مع اثنين من حفر ثقوب في أعلى وخط الصيد تعلق على غطاء والتي يمكن سحبها من فم ديوار.

4. نقل كرو الشبكة إلى TEM

  1. إدراج حامل البرد في محطة البرد النقل. والحرص على عدم تلف غيض من حامل أثناء الإدراج. تحقق من وجود ألياف صغيرة والغبار على قضيب وO-حلقة من صاحب البرد باستخدام العدسة، إذا كان هناك أي إزالته مع ورقة عدسة بصرية.
  2. ملء ديوار من صاحب البرد والسفينة محطة عمل مع النيتروجين السائل. تجنب إراقة النيتروجين السائل باستخدام قمع المحاصرين الذي يأتي مع محطة العمل.
  3. ربط حامل البرد إلى وحدة تحكم مرحلة البارد لمراقبة درجة الحرارة، والحفاظ على إضافة السائل النيتروجين & #160؛ حتى تستقر درجة الحرارة في حوالي -194 درجة مئوية. تأكد من أن مستوى النيتروجين السائل تحت مستوى ختم فراغ سواء في سفينة محطة العمل وحامل البرد ديوار. قبل تبريد ملاقط الشبكة، الحلقة كليب ونهاية حادة من أداة كليب عصابة على محطة العمل. أيضا قبل الباردة مجموعة من ملاقط كبيرة ومفك البراغي في ديوار أخرى مليئة النيتروجين السائل.
  4. نقل بسرعة مربع شبكة البرد التي تحتوي على الشبكات المائية المجمدة الى النيتروجين السائل في محطة العمل باستخدام ملاقط كبيرة. فتح مربع شبكة البرد مع مفك البراغي، واتخاذ الشبكة المائية المجمدة ووضعها في الفتحة صاحب العينة.
  5. ضع حلقة كليب على رأس الشبكة واضغط برفق مع نهاية حادة من أداة كليب حلقة حتى تستقر بحزم في مكانه. إغلاق البرد مصراع. إزالة مربع الأدوات والبرد الشبكة من محطة العمل.
  6. نقل محطة عمل كامل مع حامل والشبكة إلى وحدة المجهر من أجل مصغرةتقليل ما أمكن من الوقت نقل الشبكة في هواء الغرفة.
  7. أعلى قبالة TEM مكافحة contaminator مع النيتروجين السائل، والذي كان قد شغل وتبريده لمدة 20 دقيقة على الأقل قبل. قبل إمالة مرحلة المجهر ل-60 درجة.
    ملاحظة: هذا تقليل الخسائر في النيتروجين السائل كما تم إدراج حامل في غرفة معادلة الضغط.
  8. بدء دورة القفل قبل المضخة على المجهر. تأكد من أن صمام للبندقية الإلكترون مغلق (لا سيما إذا كان هو FEG TEM). انتظر تسلسل غرفة معادلة الضغط قبل مضخة لإنهاء (حوالي 2 دقيقة) قبل إدراج حامل البرد.
    ملاحظة: ويدل على ذلك الضوء الأحمر على المسرح يجري تنطفئ.
  9. إدراج حامل في غرفة معادلة الضغط وتناوب عليها 90 درجة في اتجاه عقارب الساعة. ربط الحبل البارد تحكم مرحلة لصاحب البرد لمراقبة درجة الحرارة. الانتظار مرة أخرى حتى يتم إطفاء الضوء الأحمر وتناوب كل من مرحلة وحامل مرة أخرى إلى 0 درجة موقف لإدراج حامل في مرحبا في TEM لGH العمود فراغ.
  10. تأكد من أن درجة الحرارة لم يذهب فوق -160 ° C لتجنب تشكيل الجليد البلورية.
  11. إعادة ملء ديوار من صاحب البرد. الانتظار 15-45 دقيقة حتى معايرتها صاحب حراريا وعثرت الفراغ TEM قبل تسجيل الصور.
  12. إذا تم الكشف عن محتدما من النيتروجين السائل، وتغيير السائل ذروة ملء النيتروجين، أو بلطف لمس أصل محتدما مع مسحة القطن.

5. انخفاض جرعة لجمع البيانات

ملاحظة: يتم استخدام هذه التقنية جمع البيانات جرعة منخفضة للحد من أضرار الأشعة الإلكترون إلى عينة عن طريق الحد من التعرض ل20 الإلكترونات / 2. ويتحقق ذلك عن طريق بالتناوب بين ثلاثة تكوينات: "البحث"، مع تضخم منخفض (~ 5،000X) وحقل واسع من الرأي، "التركيز"، مع تضخم عالية (~ 150،000X) وحقل صغير للعرض، و "التعرض"، مع ماغني النهائي المطلوبfication وتحتوي على مجال الاهتمام ليتم تسجيلها. فارغة شعاع بين وسائط.

  1. إعداد برنامج جرعة منخفضة TEM و
    1. التراجع عن البرد مصراع الكاميرا وفتح الصمامات العمود.
    2. توسيط المرحلة، وتعيين ارتفاع eucentric (Z) باستخدام المتذبذب ألفا لموسيقى الروك المرحلة ± 15 درجة. ضبط الموقف Z حتى يكون هناك أي تحرك ملموس في حين أن المرحلة هو هزاز. تفعيل برنامج جرعة منخفضة وحدد كاشف لكل واسطة.
    3. في وضع التعرض تجد منطقة من الشبكة التي لا يوجد لديه الكربون، وضبط الإضاءة عن طريق تحديد فتحة المكثف وبقعة الأمثل حجم بحيث يتم مضاءة بالكامل في المنطقة ليتم تسجيلها. مما لا شك فيه أن ينشر شعاع في الاتجاه overcondensation.
    4. في وضع البحث، والعثور على ميزة صغيرة من شأنها أن تكون التعرف بسهولة على أعلى التكبير. في وضع التعرض، ومركز هذه الميزة مع عصا التحكم (وحدة تحكم مرحلة س ص). تبدأ في أقل التكبير إذا كان الفذلدى عودتهم ليس في مجال الرؤية.
    5. في وضع البحث، وجلب هذه الميزة إلى وسط الميدان باستخدام جرعة منخفضة س ص ضوابط تحول الصورة. اذهب إلى وضع التعرض ونقل ميزة على طول محور الميل باستخدام عصا التحكم حتى يتم الخروج من منطقة ليتم تسجيلها (0،5-3 ميكرون). الذهاب إلى التركيز وضع وتوسيط ميزة استخدام س ص ضوابط تحول الصورة. تبدأ في أقل التكبير إذا ميزة ليست في مجال الرؤية.
    6. الحفاظ على شعاع تركزت في جميع الأوقات.
  2. جمع البيانات
    1. التراجع عن البرد مصراع الكاميرا وفتح الصمامات العمود. تفعيل برنامج جرعة منخفضة.
    2. في وضع البحث، وتحديد مربع الشبكة التي تحتوي على رقيقة، والجليد متجانسة.
    3. اختر حفرة مناسبة ووضعه في وسط الميدان. التحول إلى التركيز وضع وتركيز الصورة. ثم underfocus الصورة بين 0،5-4،5 ميكرون.
    4. التبديل إلى وضع التعرض وتسجيل الصورة.
    5. التبديل إلى بحث الوضع وكرر الخطوات 5.2.3-5.2.4.التحرك عبر الساحة الشبكة تجنب ما قبل تعريض ثقوب جيدة ليتم تسجيلها.
    6. إنهاء مربع الشبكة والانتقال إلى آخر واحد جيد.
    7. إعادة ضبط ارتفاع (Z) ومواصلة جمع البيانات.

Representative Results

تنفيذ دقيق لجميع الخطوات بروتوكول المبينة في الشكل 1 يمكن تصور المجمدة رطب، الجزيئات غير الملطخة. وأظهرت نتائج أربع عينات تمثيلية ذات الخصائص الهيكلية المختلفة. تتم مقارنة الصور المجهرية التي تم الحصول عليها عن طريق أساليب NS وcryoEM (الشكل 2). الصور (ط) NS من AAV5 تكشف جزيئات الفيروسات مثل من نحو 130 Å القطر. التعايش بين الهياكل الكاملة وفارغة يتوافق مع كسر (أي السماح بدخول صمة عار) وcapsids سليمة من الناحية الهيكلية، على التوالي. CryoEM معارض هياكل فارغة بشكل موحد. في الواقع هذه الجسيمات الفيروسية لا تحتوي على مادة وراثية 28. NS معارض الجسيمات جولة السائدة في حين cryoEM معارض جزيئات معظمها سداسية، مما يعكس شكل icosahedral بهم. (ب) صور من المعرض TMV قضبان حلزونية من قطر 180 ألف وطول متغير، وغالبا ما يعد من 0.1 ميكرون، مع تكرار حلزونية من 23 Å مرئية على حد سواءفي NS وcryoEM. يتم تعبئة القناة المركزية 40 Å مع وصمة عار في الصور NS وفارغة في الصور cryoEM. (ج) الأصلية KLH، وهو didecamer من 8 نجمة داود الحمراء، يجمع في براميل المميزة لقطر Å 350 و 400 طول Å. NS وcryoEM تكشف في وجهات النظر KLH الجانب مستطيلة ودائرية نهاية في وجهات النظر. كلا تقنيات تكشف ستة التصدعات عمودي على محور التناظر والوحدات الصرفية متباعدة بالتساوي داخل كل الطبقة. CryoEM يكشف عن البنية الداخلية فارغة. (د) مستقبلات Ryanodine، قناة داخل الخلايا رباعي القسيمات كبيرة من 2.26 نجمة داود الحمراء، وينظر إليه على أنه مربع من 275 X 275 Å 2. السمات السطحية المعقدة مثل الصليب مركزي والاكتئاب المركزي واضح كما تراكم وصمة عار كتبها NS، وكما أقل المناطق كثافة من قبل cryoEM. في حين يظهر NS النقيض مماثلة في جميع العينات الأربع اختبارها، والمقارنة بين فريقي cryoEM تعرض السفلي SNR (النقيض) من RyR1 بسبب وجود المنظفات لذوبان هذا البروتين الغشاء.

وتظهر أمثلة نموذجية من التحف cryoEM لRyR1: الجليد البلورية، وتلوث الجليد، الاستجماتيزم، وهياكل تشبه شبكة الإنترنت (الشكل 3). ويرد تبيان أسبابها والوقاية في قسم المناقشة.

SPA و 3D إعادة إعمار المجمدة-رطب RyR1 يكشف هيكل متماثل أربعة أضعاف، والذي يعكس تنظيم homotetrameric البروتين (الشكل 4A). يشكل المجال حشوية المنشور مربع من 275 X 275 × 120 Å 3 ويحتوي على العديد من المجالات كروي استنساخه تشكيل بنية تشبه سقالة. يشكل المجال عبر الغشاء المنشور مربع مدبب أصغر مع أقصى قدر من الأبعاد 115 × 115 × 60 Å 3. وفي 10 قرار Å أنه من الممكن تصور اللوالب ألفا (الشكل 4B). رسم الخرائط الفرق 3D يمكن أن تكشف عن موقف بروابط مهمة، في هذه الحالة خريطة 3D اختلاف FKBP12، وهو conside 12 بروتين دينار كويتيالحمراء حدة فرعية من RyR1، وفرضه على RyR1 (الشكل 4C) 29. وأخيرا، توفر التغييرات متعلق بتكوين وجهة نظر الديناميكي للجزيء. في هذه الحالة RyR1 استقرت سابقا في ظروف إما مغلقة أو مفتوحة يكشف عن النبات الشامل من مغلقة إلى حالة فتح (الشكل 4D) 27.

الشكل (1)
الشكل 1. مخطط تدفق تقنية المجهر البرد الإلكترون. ويبرز الرسم البياني الخطوات الرئيسية للبروتوكول.

الشكل 2
الشكل 2. مقارنة بين NS وcryoEM لمجموعة متنوعة من العينات. (A) AAV5، وهو فيروس icosahedral. (B) TMV، فيروس حلزونية. وتبين إدراجات تكرار حلزونية، من 23 Å. (C) الأصلية KLH(D) RyR1. ويسلط الضوء على وجهات نظر التمثيلية (و، عرض والصورة على اربعة اضعاف عرض الجانب). يتم تصوير جميع العينات في ظل ظروف جرعة منخفضة وفي نفس التكبير من 50،000X وتحت الجهد تسريع 200 كيلو فولت. على نطاق والحانات، و 10 نانومتر. جميع العينات NS هي على دعم الكربون، وعينات cryoEM A، C، D هي على الكربون رقيقة على quantifoil، وعينة cryoEM B هو مباشرة عبر الثقوب quantifoil. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. معرض الصور تظهر التحف cryoEM المشتركة على عينة RyR1 cryoEM. (A) بلوري الجليد. التلوث (B) الثلج (السهام). (C) الاستجماتيزم. RyR1s في الصورة اللابؤرية هي بالكاد مرئية. وأقحم على اليمين يظهر SPECT السلطةالروم من الصورة مع حلقات ثون غير المتماثلة. وأقحم على اليسار يظهر طيف الطاقة من صورة غير اللابؤرية كمرجع. (D) هياكل شبيهة الويب. الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الرقم 4. CryoEM و 3D إعادة بناء مستقبلات ryanodine. . (A) تمثيل Isosurface (B) الإرساء هيكل الكريستال من RyR1 في N-30 محطة يظهر اتفاق جيد بين إحداثيات الذرية والمغلف cryoEM. وتشير الأسهم لاثنين من اللوالب ألفا التي تبرز من هيكل. رأس السهم يشير إلى واحدة من اللوالب الأربعة التي تحيط المسام للقناة أيون. الخطوط المنقطة تشير إلى حدود الغشاء. (C) RyR1 و 3D لوالموجبة ليجند FKBP12 (اللون البرتقالي). (D) التغييرات متعلق بتكوين لRyR1 في الانتقال من مغلق (البرتقالي) لالمفتوحة (أسود شبكة) التشكل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

وقد ساهم TEM تليها SPA العديد من هياكل 3D الجزيئات، تقترب من 2،000 الإدخالات في بنك المعلومات بحلول منتصف عام 2014. وبصفة عامة، لجزيء معين، يتم تحديد هيكل 3D منخفضة الدقة أولا من البيانات NS، الأمر الذي قد يعقبه المرتفع هيكل قرار cryoEM 3D. على النقيض عال من حدود الجزيئية التي تقدمها NS، مما يسهل إعادة الإعمار 3D الأولى، ويتم تكرير في وقت لاحق من قبل cryoEM مع قدرته على رسم خريطة للهيكل الداخلي للجزيء في حالته المائية بالكامل، وإمكانية لتحقيق دقة أعلى من ذلك بكثير. ميزة أخرى لcryoEM هي القضاء على الإجهاد والجفاف التي قد تؤدي إلى انهيار جزيء. وبالإضافة إلى ذلك، هناك إمكانية لحذف الدعم الكربون، الذي يلغي آثار امتصاص السطح ممكن، ويدل على التشكل التي يعتمد جزيء في الحل. تلطيخ البرد سلبي، وهو مزيج من cryoEM وNS، يتيح التباين العالي في HYD بالكاملتصنيف العينة، ويمكن أن يؤدي أيضا إلى إعادة الإعمار 3D باستخدام SPA، ومع ذلك فقد كان أقل استخداما، مع أقل من 10 إدخالات بنك المعلومات، وذلك جزئيا بسبب وصمة عار في حد ذاته قد تتداخل مع سلامة جزيء 31. اثنين من التقنيات TEM أخرى تفضي إلى إعادة الإعمار 3D هي البلورات الإلكترون 2D والتصوير المقطعي الإلكترون. 2D البلورات الإلكترون يتطلب مستو أو أنبوبي وضوح الشمس. يستخدم حيود الإلكترون الكريستال لإعادة الإعمار 3D مما قد يؤدي إلى قرار الذري 32. في التصوير المقطعي الإلكترون العينات الثابتة المزجج أو تقليديا، يتم تدوير عنصر جزيء أو دون الخلوي داخل TEM لاحق إعادة بناء التصوير المقطعي 33، مع ميزة أن الأجسام المفرد يمكن إعادة بنائها. ولكن في الوقت الحاضر هذه التقنية لديها الحد قرار تتراوح 40-20 Å 34،35. بين كل هذه التقنيات الجزيئية TEM، كان SPA من NS وcryoEM البيانات الأكثر على نطاق واسعالمستخدمة. وتكرس بروتوكول يتضح هنا للحصول على صور cryoEM مناسبة لتحليل SPA. مع ذلك معظم بروتوكول ينطبق على cryoEM من 2D البلورات وعينات تصوير الشعاعي الطبقي أيضا.

جلسة cryoEM الناجحة تعتمد على نجاح الجمع بين العديد من الخطوات الحاسمة. جوانب مهمة أن نأخذ في الاعتبار، شرح التحف cryoEM المشترك وكيفية تجنب وصفها لهم في الفقرات التالية. يصف هذا القسم أيضا مبادئ توجيهية جمع البيانات للحصول على جودة عالية 3D اعادة البناء باستخدام طريقة SPA.

تجنب التحول إلى البلورية الجليد. وهناك جانب المركزي هو أن عينة تحتاج إلى البقاء في ولاية زجاجي من لحظة في جميع أنحاء الملاحظة TEM-تغرق البرد. وهكذا بعد تغرق العينة في الإيثان السائل يتم تنفيذ جميع الخطوات اللاحقة في النيتروجين السائل (-196 درجة مئوية) أو الهليوم السائل (-269 درجة مئوية) درجات الحرارة. ارتفاع درجات الحرارة إلى أعلى -135 ° C يحول الماء الزجاجي فيعلى المياه البلورية. ثم إعادة ترتيب الجزيئات قد يستغرق مكان وبلورات الماء تهيمن على صورة (الشكل 3A)؛ يجب التخلص من العينة. عرضي عينة الاحماء يمكن أن يحدث إذا البرد تغرق، ونقل الشبكة المجمدة بين حاويات (حتى لو كان يحميها gridbox)، و / أو البرد حامل الإدراج في TEM بطيئة جدا، أو إذا كانت ملاقط معالجة ما قبل كاف تبريد. هام تدهور فراغ في TEM على البرد نقل (العينة الفخاخ الباردة أكثر دفئا الهواء الداخل) قد يصبح دافئا أيضا العينة. وأخيرا، والإفراط في التشعيع من العينة يمكن أن يؤدي أيضا إلى الانتقال إلى البلورية الجليد.

تقليل التلوث الجليد. ونظرا لحجم العينة صغير (3-5 ميكرولتر) تطبق على الشبكة TEM، قد تبخر التركيز مكونات عازلة (الملح والمنظفات الصناعية)، وبالتالي يؤثر على سلامة الجزيئات بما في ذلك فقدان الدولة multimeric. ارتفاع نسبة الرطوبة النسبية (RH) المكروية أو غرفة تحايلالصورة هذه المشكلة. بدلا من ذلك البرد تغرق يمكن القيام به في غرفة باردة البيئية التهوية بما فيه الكفاية. بعد تغرق البرد RH يجب أن تكون في أدنى مستوى ممكن لمنع التلوث الجليد، أو التكثيف من الرطوبة المحيطة على البرد الشبكة، مثل البرد الشبكة نفسها بمثابة فخ بارد. يتكون الجليد تلوث الجسيمات مع التباين العالي وليس طيدة مع أحجام تتراوح ما بين 5 ~ نانومتر، وعدة ميكرون التي تتداخل مع أو حتى منع تماما الصورة. تجنب مسودات الهواء، والحديث / التنفس نحو الشبكة البرد أثناء نقل الهواء، والحد المحيطة RH. وينبغي أيضا تجاهل مفتوحة حاويات النيتروجين السائل مع الماء المكثف (مرئية كما الجسيمات العالقة البيضاء).

تعظيم التوجهات الجزيئات / وجهات النظر. للحصول على الدعم العينة، وهو خيار أن يكون جعلت هو بين شبكات هولي الحقيقية والكربون رقيقة على شبكات هولي. هذا يعتمد على (ط) كيف تنتشر العينة على فيلم الكربون مقابل الثقوب الكربون، (ب) عينة المتاحة بغية دراسته واقرارهntration، والثقوب العارية قد تتطلب تركيز 100X أعلى من الدعم الكربون لكثافة الجسيمات مماثلة على الصورة (من ~ ،02-2 ميكرومتر)، و (ج) كيف عشوائي هو توزيع التوجهات جزيء. لاحظ أن التفريغ توهج، مما يجعل محبة للماء الكربون، سيكون لها أثر هام في جميع الجوانب الثلاثة وأن هذا سيكون عينة التي تعتمد على. وفيما يتعلق التوجه للجزيء، في حين أن عرض المتكرر أمر مرغوب فيه لتحديد الهيكلي الأولي من إعادة الإعمار المخروطية عشوائي، عشوائية في وجهات النظر الجزيئات أمر مرغوب فيه عند تنقيح إعادة الإعمار 3D إلى دقة أعلى. في مثالنا، يتفاعل RyR1 مع الكربون بهدف المفضل "أربعة أضعاف" (الشكل 2D) ويتطلب شبكات هولي لالعشوائية من التوجهات ودقة أعلى 36.

تعظيم SNR. إن أفضل استراتيجية لزيادة SNR هو الحد من مصادر خلفية من الضوضاء. الجليد المفرطسمك و(إذا كان موجودا) سمك الفيلم الكربون يتجاوز ما هو مطلوب لدعم وترسيخ والبروتين إضافة الضوضاء إضافية. وهكذا ينبغي خفض سماكة الجليد لأدنى حد الضرورة عن طريق التحكم النشاف الوقت، الضغط، RH، ونوعية ورق الترشيح. للحصول على الدعم الكربون، والطبقات رقيقة (~ 5 نانومتر) فيلم الكربون على الفيلم سمكا الكربون هولي: يوفر الكربون هولي سميكة مقاومة ميكانيكية بينما يتم تصوير العينة على حفرة مغطاة الكربون رقيقة. من ناحية أخرى، لاحظ أن الجليد رقيقة للغاية و / أو قد ينتج الكربون في دعم كسر بسهولة يمكن أن تتحول إلى شبكة الإنترنت (الشكل 3D). لتعظيم SNR، وينبغي تجنب أي مكون من مكونات عازلة غير الضرورية. للبروتينات الغشاء، المنظفات يأخذ عدد كبير على النقيض من ذلك (انظر الشكل 2D، اللوحة اليمنى). وبالإضافة إلى ذلك عن طريق تقليل التوتر السطحي المنظفات يغير الطريقة التي تنتشر العينة على الدعم. بعض البروتينات الغشاء تتطلب وجود الدهون بالإضافة إلى ديتergent، مما يقلل كذلك التباين. للتغلب على هذه العينة يمكن أن تضعف في منطقة عازلة مع انخفاض تركيز المنظفات وبدون دهن قبل البرد تغرق 37. تظهر المنظفات البديلة الجديدة 16 واستخدام nanodisks 38 لتحقيق الاستقرار في مكون مجال الغشاء أن يكون النهج الناجحة للبروتينات غشاء التصوير من قبل cryoEM.

السعي لصور ذات جودة عالية والاستعداد لتصحيح CTF. عينات المزجج تتطلب القيم يزيل التباؤر عالية لتوليد صورة كافية (المرحلة) على النقيض حيث CTF، وظيفة التي تتعلق كثافة لتردد، لديها العديد من الصفر التحولات، وعند هذه النقطة لا يوجد المعلومات. في حين تصحيح CTF ليس من الضروري لإعادة الإعمار 3D منخفضة الدقة، عندما تهدف لدقة أعلى، لاسترداد تمثيل دقيق للكائن 3D، الصور مع defoci مختلفة تحتاج إلى جمعها بحيث يمكن أن يتم تصحيح تمويل الإرهاب الحسابية.يتم تضمين تقرير CTF والتصحيح في حزم البرمجيات SPA الرئيسية 4-7. تفاصيل يمكن العثور في أماكن أخرى 39. لتصحيح CTF الأمثل، واستخدام مجموعة من defoci. استراتيجية جيدة لبالتناوب بين 3-4 القيم يزيل التباؤر. قيم تعتمد على حجم جزيء (أحجام أكبر تتطلب كميات أقل من يزيل التباؤر)، وسمك الجليد / الكربون (يتطلب عينة أرق أقل يزيل التباؤر)، والجهد (انخفاض الجهد يتطلب أقل يزيل التباؤر). 200 كيلو فولت، مجموعة بداية جيدة من القيم هو 2.5 و 3 و 3.5 و 4 ميكرون يزيل التباؤر. وCTF يظهر كما بالتناوب حلقات من كثافة عالية ومنخفضة (ثون يرن 40) في تمثيل الفضاء المتبادل، طيف الطاقة. عرض طيف الطاقة سوف تكشف عن إمكانية حلها؛ تردد أوسع حلقة ثون مرئية هو الأقرب تقدير مسبق للقرار يمكن بلوغه. يجب فحص طيف الطاقة بشكل دوري، واللابؤرية (غير التعميم) حلقات ثون (الشكل 3C) ينبغي تصحيحه مع stigmator الهدف. وينبغي أن تكون حلقات ثون مرئية على الأقل حتى القرار المطلوب.

وهناك مجموعة البيانات cryoEM تم الحصول عليها باستخدام هذا البروتوكول يمكن معالجتها مباشرة من قبل SPA من أجل توليد إعادة الإعمار 3D. حتى مع وجود عينة مثالية، فإن نوعية إعادة الإعمار 3D تعتمد على الأداء ومواصفات المعدات TEM، وعلى معالجة الصور. مع استمرار التحسن في كل من هذه الجبهات، ومع إشارة خاصة إلى كشف الإلكترون مباشرة وضعت مؤخرا، وإمكانية الحصول على اعادة البناء 3D في قرار الذري أكثر اتساقا هو أقرب مما كانت عليه في أي وقت مضى.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ethane Airgas 371745 99.99% purity very important, impurities can lead to high-contrast contaminants on the grid. CAUTION: flammable
Liquid nitrogen Airgas 27135 99% purity. CAUTION: handling liquid nitrogen in a cold room poses a serious asphyxia hazard since nitrogen displaces oxygen without any warning signs.
Dumont no. 5 Antimagnetic tweezers Ted Pella 5326
Mica sheets, 1 x 4 cm Ted Pella 54
Graphite rods, presharpened size 1/8” dia x 2 ¼” long tip 0.039” dia neck type Electron Microscopy Sciences 70220-45
350 ml cryo-dewars Pope 8600
Cu 400 mesh holey grids  Quantifoil Quantifoil Q10525
Cu 400 mesh holey grids C-Flat Protochips CF-1.2/1.3-4C
Glow discharge device Electron Microscopy Sciences Model E7620
Turbo pumping station Gatan Model 655
Carbon evaporator Denton Vaccum Model 502B
Freeze plunger FEI Vitrobot Mark IV
Transmission electron microscope 200 kV FEI Model Tecnai F20
CCD Camera 4k x 4k Gatan UltraScan 4000 UHS
Image Processing software CTFFIND3/CTFTILT http://grigoriefflab.janelia.org/ctf
Image Processing software EMAN http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2
Image Processing software Spider http://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html
Image Processing software Freealign  http://grigoriefflab.janelia.org/frealign
3D visualization software Chimera http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/
Native Keyhole Limpet Hemocyanin Biosyn

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Adrian, M., Dubochet, J., Lepault, J., McDowall, A. W. Cryo-electron microscopy of viruses. Nature. 308 (5954), 32-36 (1984).
  2. Franzini-Armstrong, C. RyRs: Their Disposition, Frequency, and Relationships with Other Proteins of Calcium Release Units. Curr Top Membr. 66C, 3-26 (2010).
  3. Booth, D. S., Avila-Sakar, A., Cheng, Y. Visualizing proteins and macromolecular complexes by negative stain EM: from grid preparation to image acquisition. J Vis Exp. (58), (2011).
  4. Shaikh, T. R., et al. SPIDER image processing for single-particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs. Nat Protoc. 3 (12), 1941-1974 (2008).
  5. Grigorieff, N. FREALIGN: high-resolution refinement of single particle structures. J Struct Biol. 157 (1), 117-125 (2007).
  6. Scheres, S. H. RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. J Struct Biol. 180 (3), 519-530 (2012).
  7. Ludtke, S. J. 3-D structures of macromolecules using single-particle analysis in EMAN. Methods Mol Biol. 673, 157-173 (2010).
  8. Radermacher, M., et al. Cryo-electron microscopy and three-dimensional reconstruction of the calcium release channel/ryanodine receptor from skeletal muscle. J Cell Biol. 127 (2), 411-423 (1994).
  9. Stewart, A., Grigorieff, N. Noise bias in the refinement of structures derived from single particles. Ultramicroscopy. 102, 67-84 (2004).
  10. Serysheva, I. I., et al. Electron cryomicroscopy and angular reconstitution used to visualize the skeletal muscle calcium release channel. Nat Struct Biol. 2, 18-24 (1995).
  11. Cheng, Y., et al. Single particle reconstructions of the transferrin-transferrin receptor complex obtained with different specimen preparation techniques. J Mol Biol. 355 (5), 1048-1065 (2006).
  12. Stark, H. GraFix: stabilization of fragile macromolecular complexes for single particle cryo-EM. Methods Enzymol. 481, 109-126 (2010).
  13. Wang, L., Lashuel, H. A., Walz, T., Colon, W. Murine apolipoprotein serum amyloid A in solution forms a hexamer containing a central channel. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (25), 15947-15952 (2002).
  14. Amunts, A., et al. Structure of the yeast mitochondrial large ribosomal subunit. Science. 343 (6178), 1485-1489 (2014).
  15. Suloway, C., et al. Automated molecular microscopy: the new Leginon system. J Struct Biol. 151 (1), 41-60 (2005).
  16. Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy. Nature. 504 (7478), 107-112 (2013).
  17. Bai, X. C., Fernandez, I. S., McMullan, G., Scheres, S. H. Ribosome structures to near-atomic resolution from thirty thousand cryo-EM particles. Elife. 2, e00461- (2013).
  18. Grigorieff, N., Harrison, S. C. Near-atomic resolution reconstructions of icosahedral viruses from electron cryo-microscopy. Curr Opin Struct Biol. 21, 265-273 (2011).
  19. Lerch, T. F., et al. Structure of AAV-DJ, a retargeted gene therapy vector: cryo-electron microscopy at 4.5 A resolution. Structure. 20 (8), 1310-1320 (2012).
  20. Govindasamy, L., et al. Structural insights into adeno-associated virus serotype 5. J Virol. 87 (20), 11187-11199 (2013).
  21. Egelman, E. H. A robust algorithm for the reconstruction of helical filaments using single-particle methods. Ultramicroscopy. 85 (4), 225-234 (2000).
  22. Ge, P., Zhou, Z. H. Hydrogen-bonding networks and RNA bases revealed by cryo electron microscopy suggest a triggering mechanism for calcium switches. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (23), 9637-9642 (2011).
  23. Clare, D. K., et al. ATP-triggered conformational changes delineate substrate-binding and -folding mechanics of the GroEL chaperonin. Cell. 149 (1), 113-123 (2012).
  24. Fonseca, P. C., He, J., Morris, E. P. Molecular model of the human 26S proteasome. Mol Cell. 46 (1), 54-66 (2012).
  25. Gatsogiannis, C., Markl, J. Keyhole limpet hemocyanin: 9-A CryoEM structure and molecular model of the KLH1 didecamer reveal the interfaces and intricate topology of the 160 functional units. J Mol Biol. 385 (3), 963-983 (2009).
  26. Torres, J., Stevens, T. J., Samso, M. Membrane proteins: the 'Wild West' of structural biology. Trends Biochem Sci. 28 (3), 137-144 (2003).
  27. Samso, M., Feng, W., Pessah, I. N., Allen, P. D. Coordinated Movement of Cytoplasmic and Transmembrane Domains of RyR1 upon Gating. PLoS Biology. 7 (4), 980-995 (2009).
  28. DiMattia, M., et al. purification, crystallization and preliminary X-ray structural studies of adeno-associated virus serotype 5. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 61 (Pt 10), 917-921 (2005).
  29. Samso, M., Shen, X., Allen, P. D. Structural characterization of the RyR1-FKBP12 interaction. J Mol Biol. 356 (4), 917-927 (2006).
  30. Lobo, P. A., Van Petegem, F. Crystal structures of the N-terminal domains of cardiac and skeletal muscle ryanodine receptors: insights into disease mutations. Structure. 17 (11), 1505-1514 (2009).
  31. De Carlo, S., Harris, J. R. Negative staining and cryo-negative staining of macromolecules and viruses for TEM. Micron. 42 (2), 117-131 (2011).
  32. Kuhlbrandt, W. Introduction to electron crystallography. Methods Mol Biol. 955, 1-16 (2013).
  33. Yahav, T., Maimon, T., Grossman, E., Dahan, I., Medalia, O. Cryo-electron tomography: gaining insight into cellular processes by structural approaches. Curr Opin Struct Biol. 21 (5), 670-677 (2011).
  34. Briggs, J. A. Structural biology in situ--the potential of subtomogram averaging. Curr Opin Struct Biol. 23 (2), 261-267 (2013).
  35. Harapin, J., Eibauer, M., Medalia, O. Structural analysis of supramolecular assemblies by cryo-electron tomography. Structure. 21 (9), 1522-1530 (2013).
  36. Samso, M., Wagenknecht, T., Allen, P. D. Internal structure and visualization of transmembrane domains of the RyR1 calcium release channel by cryo-EM. Nat Struct Mol Biol. 12 (6), 539-544 (2005).
  37. Sharma, M. R., et al. Cryoelectron microscopy and image analysis of the cardiac ryanodine receptor. J Biol Chem. 273 (29), 18429-18434 (1998).
  38. Denisov, I. G., Grinkova, Y. V., Lazarides, A. A., Sligar, S. G. Directed self-assembly of monodisperse phospholipid bilayer Nanodiscs with controlled size. J Am Chem Soc. 126 (11), 3477-3487 (2004).
  39. Zhu, J., Penczek, P. A., Schroder, R., Frank, J. Three-dimensional reconstruction with contrast transfer function correction from energy-filtered cryoelectron micrographs: procedure and application to the 70S Escherichia coli ribosome. J Struct Biol. 118 (3), 197-219 (1997).
  40. Thon, F. Phase contrast electron microscopy. , Academic Press. New York. (1971).

Tags

علم الأحياء الهيكلي، العدد 95، المجهر الإلكتروني 3D، المجهري البرد الإلكترون، والبروتينات الغشاء، مستقبلة الريانودين، واحد الجسيمات معالجة الصور، ونقل الإلكترون المجهري
ما يفعل وما يترك من المجهري البرد الإلكترون: وهو أول كتاب عن تحضير العينة وجمع البيانات عالية الجودة للتعمير الجزيئات 3D
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cabra, V., Samsó, M. Do's and… More

Cabra, V., Samsó, M. Do's and Don'ts of Cryo-electron Microscopy: A Primer on Sample Preparation and High Quality Data Collection for Macromolecular 3D Reconstruction. J. Vis. Exp. (95), e52311, doi:10.3791/52311 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter