Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Gjøre og ikke gjøre av Cryo-elektronmikroskopi: En Primer på Prøvepreparering og High Quality datainnsamling for Macromolecular 3D Rekonstruksjon

Published: January 9, 2015 doi: 10.3791/52311
Automatic Translation
1, 1
1Department of Physiology and Biophysics, Virginia Commonwealth University

Introduction

Målet med cryoEM er å få elektron mikroskopiske bilder av makromolekyler i sitt opprinnelige hydrert tilstand. I kraft av å bygge den makromolekyl i forglassede vann, kan en frossen hydrert prøven innføres direkte og visualisert i TEM instrument. Vitrifikasjon, oppnås ved flash frysing (10.000 o C / sek), fryser prøven uten vann krystallisering og sikrer at molekylære rearrangements under frysepunktet er ubetydelig. Overskuddet av elektron spredning av prøven i forhold til det omgivende buffer tilveiebringer en liten, men tilstrekkelig kontrast for å vise makromolekylet i fravær av en hvilken som helst flekken 1. Datastyrt bildebehandling kan deretter brukes til å gjenskape makromolekylet 3D-struktur. Store makromolekyler i ~ 500 kDa- multi MDA serien er ideelle prøver for cryoEM (som representerer over 80% av Elektronmikrosdatabanken (EMDB) oppføringer); disse inkluderer proteiner, proteinkomplekser, protein-nukleinsyre complexes og membranproteiner innebygd i en bilaget. Disse makromolekyler er mindre sannsynlig å bli krystallisert (med mindre enn 2% oppføringer i PDB databasen), men det er ofte slik at mindre biter løses ved Røntgenkrystallografi eller NMR kan plasseres inn i 3D konvolutt skapt av cryoEM. På den annen side er noen av de største strukturer løses ved cryoEM er identifiserbare innenfor hele cellen ved tynn-seksjonen TEM 2. Dermed cryoEM broer effektivt størrelsen og oppløsningen gap mellom subcellulære og atomstruktur.

CryoEM reflekterer bedre makromolekylet native struktur enn de mer klassiske metode for negativ farging (NS), hvor makromolekylet er dehydrert, og er omgitt av et lag av tungt metall flekken hvorved området for flekken uttrekk gir en sterk kontrast "negativt" bilde 3. I begge tilfeller frembringer elektronstrålen 2D projeksjonsbilder av makromolekyler, kalt partikler, hvor shape avhenger av orienteringen av makromolekylet i forhold til elektronstrålen. Mange partikler, minst ~ 1000 og med ingen øvre grense, kan analyseres på datamaskinen med "single partikkelanalyse" (SPA) programvare for å øke signal til støyforholdet (SNR) selv om gjennomsnitts, og for å finne den partikkel romlige orientering parametere nødvendig for å gjenskape macromolecule 3D struktur etter tilbake projeksjon 4-7. NS, med høyere SNR, brukes for innledende karakterisering prøve og for å generere en de novo 3D rekonstruksjon; dens oppløsning sjelden overstiger 20 Å, som er pålagt av dehydrering og størrelsen av den tunge metallkorn. Generelt, for cryoEM 3D strukturbestemmelse, en lav oppløsning 3D rekonstruksjon oppnås først fra NS og deretter cryoEM blir brukt til å raffinere denne lavoppløselig innledende kart for ytterligere å studere makromolekylet i det opprinnelige hydratiserte tilstand, for å vise dens indre struktur, og for å øke oppløsningen. Ikkete at dersom NS-modellen ble forvrengt (det mest vanlige eksempel flater som følge av dehydratisering 8) og cryoEM partiklene hadde lav SNR, deretter forvrengningen kunne bære inn i cryoEM modell (modell-skjevhet gjenstand, noe som er vanlig i lav SNR datasett 9). Strukturelle forvrengning ville resultere i mismatch mellom NS og cryoEM rå partikler og mellom rå cryoEM partikler og tilsvarende anslag av 3D-modellen ortogonale til utflating retning. Modell skjevhet kan løse seg selv som 3D-modellen gjennomgår påfølgende raffinement sykluser. Bør det ikke forekomme, noe som ville bli oppdaget som manglende samsvar mellom rå cryoEM partikler og tilsvarende anslag fra 3D-modellen, deretter en de novo modell bør være konstruert fra cryoEM data. En god tilnærming kan være å bruke vinkel rekonstituering algoritmen 10, noe som kan gi flere mulige 3D-volumer, og bruke NS 3D-modell deretter å velge den best mulige cryoEM modellsom vil bli ytterligere raffinert 11. En enda bedre strategi er å øke SNR av cryoEM datasettet (se egen seksjon i diskusjon).

Den biokjemiske kvaliteten på den rensede makromolekyl har en ytterst innflytelse i det endelige utfallet. Den makromolekyl, renset fra vev eller uttrykt i heterologe systemer, må ha en høy grad av renhet og å være strukturelt intakt. Det bør heller ikke danner aggregater og bør heller disaggregert. Å definere en spesiell konformasjon, bør prepareringsbetingelsene fremme en ensartet conformational tilstand. Å studere komplekser, er det optimalt at deres k D er i nM rekkevidde, ellers fiksativ har blitt brukt for å stabilisere lavere affinitet interaksjoner 12,13.

Ubearbeidede cryoEM bilder gi verdifull informasjon om dimensjonene, generell oversikt, state of aggregering / multimerization, homogenitet, og interne strukturen i macromolecule. Likevel potensialet av teknikken er vesentlig forbedret med bildebehandling. En 3D-struktur avslører macromolecule samlede arkitektur, 3D plassering av ligander og underenheter, konformasjonsendringer, og gjør det mulig for docking av atomstrukturer bestemmes av x-ray krystallografi eller NMR. Mengden av informasjon av en 3D-rekonstruksjon øker trinnvis som oppløsningen er økt: generelt 15-20 Å oppløsning tillater entydig dokking av atomstrukturer på 9-10 Å alfa-helikser er synlige som stenger, 5 Å er det mulig å skjelne beta ark, og en oppløsning på 3,5 Å og bedre er det mulig å bygge en atommodell 14.

Muligheten for å oppnå informative bilder og en 3D-rekonstruksjon ved bruk av SPA fra relativt små mengder av prøven gjør cryoEM en attraktiv teknikk, som 3-5 ul av minst 0,05 mg / ml er tilstrekkelig for å fremstille en TEM rutenett. Minste instrumentale kravfor cryoEM er en hjemmelaget eller kommersiell cryo-stempelet, et elektronmikroskop med ultra høyt vakuum, bildeopptaksmedier og lavdose kit, en cryo-holder med sin pumpestasjon, en glød utslipp apparat, og en fordamper. Ikke-essensielle, men ytterligere ønskelige funksjoner på TEM er CCD-kamera (til stede i alle moderne TEMs) eller en direkte elektrondetektor, pistol felt utslipp (FEG), energi filtrering, og høy gjennomstrømning datainnsamling programvare. Denne programvaren i prinsippet gjør det mulig å samle titusenvis av partikler i en enkelt sesjon cryoEM 15, men den økte datalagerbehov og påfølgende overvåket etterbehandlingstiden må tas i betraktning. FEG kombinert med kontrast transfer funksjon (CTF) korreksjon ligger til grunn for de fleste 3D rekonstruksjoner som nådde oppløsning tilstrekkelig til å visualisere alfa-helikser. På dette punktet, er nivået for oppløsning også prøve avhengig: når 10 Å oppløsning er mindre vanlig for membran proteiner mens hvishøy rekkefølge av symmetri er til stede da atom oppløsning er mer oppnåelig. Den siste utviklingen av direkte elektron detektorer har aktivert atom oppløsning selv for makromolekyler med lav (4x) eller ingen symmetri, der kvaliteten på cryoEM elektrontetthetskart de matcher disse stammer fra x-ray diffraksjonsdata 16,17.

Praktiske eksempler som illustrerer egenskapene til teknikken er gitt her i fire viktige typer makromolekyler der cryoEM fortsatt har en sjefsrolle i deres strukturelle besluttsomhet. , Strukturer av flere icosahedral virus har blitt løst (i) Med sin icosahedral symmetri som øker datasettet med 60-fold og sin store størrelse som tillater trofast og reproduserbar justering til nær-atom oppløsning av cryoEM fulgt av SPA 18. Vi viser et eksempel på en klasse av icosahedral virus, de adeno-assosierte virus (AAVs), hvor det nær-atomstrukturer med cryoEM og etter cryoEM / x-ray hyBrid metoder finnes 19,20. (Ii) Macromolecules med spiralstruktur inkluderer mikrotubuli, filamenter og virus. Deres repeterende enheter langs den skruelinjeformede aksen kan bli analysert av en mer kompleks versjon av SPA tilpasset den skrueformede geometri 21. I eksempelet viser vi tobakk mosaikkvirus (TMV), en RNA-virus som har blitt løst i atom oppløsning av cryoEM 22. (Iii) Store oppløselige proteiner er blitt rikelig studert. Blant disse makromolekyler som danner symmetriske multimeriske sylindere utgjør et tilbakevendende arkitektur ofte løses ved subnanometer oppløsning 23,24. Her viser vi bilder av KLH, en invertebrate oksygenbærer, hvor en hybrid molekylær modell ble opprettet fra cryoEM / Røntgenkrystallografi hybridmetoder 25. (Iv) Membranproteiner er en viktig klasse av proteiner; de utgjør omtrent 1/3 av proteinene kodet av det humane genom, men de er vanskelige å karakterisere strukturelt grunn av kompleksiteten i forbindelse med transmembrane domene stabilisering 26, som utgjør mindre enn 1,5% av strukturene løses ved en hvilken som helst konstruksjonsteknikk kombinert. Rollen til cryoEM og 3D rekonstruksjon i sin strukturbestemmelse er eksemplifisert med ryanodine reseptor (RyR), en stor eukaryot intracellulær Ca2 + kanal viktig muskelkontraksjon og hjerne-signalering. De høyeste oppløsning cryoEM strukturer til dags dato, med 10 A-oppløsning, avslører sekundærstruktur 27.

Protocol

1. Cryo-holderen Utarbeidelse og vedlikehold

MERK: Den tørre pumpestasjon, som består av en turbo pumpestasjon og en eller flere kalde scene kontrollere, brukes primært for tre formål: a) Det er et trygt sted å lagre kryo holdere når de ikke er i bruk. Den riktige måten å lagre innehaverne er å forlate dem i stasjonen under vakuum. b) å fordampe fuktighet frost og oppbygning som oppstår når det flytende nitrogenet fjernes fra Dewar og spissen av cryo holderen er eksponert; Dette oppnås med oppvarmingssyklus. c) For å regenerere zeolitt tørkemiddel, og for å oppnå et høyt vakuum i cryoholder dewars. Dette er nødvendig for å holde en konstant temperatur når gjør kryo elektronmikroskopi.

  1. Warm-up Cycle.
    1. Sett cryo holderen inn i en av pumpeportene til pumpestasjon. Hekte en av evakuerings rør til metall utløp under vakuum ventil av holderen. GjøreKontroller at alle ventiler på stasjonen (V1, V2, og V3) og på cryo holderen er lukket.
    2. Slå på den kalde scenen kontrolleren og koble den til innehaveren gjennom kontrollkabelen. Slå på strømbryteren på turbo pumpestasjon.
    3. Start Warm-up syklus alternativ i den kalde scenen kontrolleren. Når vakuumet i turbo pumpestasjon leser 10 -3 Torr eller bedre, åpner sommerfugl ventil V2, vente til vakuum stabiliserer seg, og deretter åpne butterfly ventil V1.
    4. Kjør varme opp syklus for rundt 30 min før temperaturen i holderen er stabil over 20 ° C. Lukk V1, og deretter stoppe syklusen.
  2. Zeolitt syklus. Kjør Zeolite Cycle Mellom 4 timer og O / N Før en CryoEM Session, og en gang i uken hvis de ikke brukes.
    1. Start Zeolite syklus alternativ og velger den nødvendige tid for å oppnå et godt vakuum, i området fra 1-2 x 10 -4 Torr, og dermed lang holdetid. Når vakuumet når 10 -3Torr, åpner dewar evakueringsventilen, V3. Pumpestasjon vil deretter evakuere linjen til innehaveren; vent vakuum stabiliseres.
    2. Åpne ventilen på cryo holderen. Når syklusen er fullført, lukker ventilene i motsatt rekkefølge som de ble åpnet: ventilen på holderen, så V3, V2, og til slutt V1. Slå av turbo pumpestasjon og kulde scenen kontrolleren, og koble fra cryo holderen fra den kalde scenen kontrolleren og turbo pumpestasjon.

2. Grid Forberedelse

  1. Rengjøring.
    MERK: Når du bruker kommersielle holey nett, anbefales det å rengjøre dem før bruk, for å fjerne eventuelle gjenværende polymer som ble brukt i fabrikasjonsprosessen. Gjøre dette på en glasspetriskål med fem lag av filterpapir er lagt på bunnen.
    1. Plasser nett på filterpapiret med holey karbon siden opp.
    2. Ved hjelp av et glass Pasteur pipette, fukte papiret med flere dråper of kloroform rundt nett før de bare begynne flytende.
    3. Dekke petriskål med lokket litt åpen i et avtrekksskap O / N.
  2. MERK: det tynne karbonbærer (trinn 2.2 til 2.3) kan utelates som islaget kan være direkte dannet på tvers av de små hullene i den hullete karbongitteret.
    1. Ved hjelp av en pinsett, kløyve et stykke glimmer å avsløre to nye overflater. Plasser den nye utsatte overflater av glimmer siden opp på en hvit papirlapp i en petriskål.
    2. Plasser petriskål i glassklokke av en karbon fordamperen. Start pumpen ned rekkefølge inntil vakuum er under 2 x 10 -6 Torr. Å fordampe eventuelle urenheter på overflaten av karbonstaven, utføre et forhånds fordampning med petriskål dekket. Deretter lufte glassklokke og ta av dekselet fra petriskål.
    3. Utføre den nedpumpede rekkefølge inntil vakuumet er under 10 -6 Torr og belegge glimmer med et tynt lag (~ 5 nm) karbon. Bruk vernebriller under karbonfordampning. Overvåke tykkelsen av karbon film av den resulterende mørke på papir som var blitt plassert under glimmer ark.
  3. Overføre Thin Carbon til TEM Grid.
    1. Skjær en 0,5 x 1 cm stykke belagt glimmer og flyte karbon av på den flate overflaten av filtrert, de-ionisert vann. Bruke optisk linsepapir for å få en flat vannoverflaten. Ved hjelp av pinsetter, sette hullete karbon side av gitteret i kontakt med den øvre overflate av det flytende lag av kull og plukke den opp.
    2. Gjenta trinn 2.3.1 og 2.3.2 inntil et tilstrekkelig antall rutenett er forberedt.
  4. Glow Discharge.
    MERK: glødeutladnings konverterer naturlig hydrofobe karbon-belegg lag av nett i hydrofile. Dette trinnet er valgfritt.
    1. Plasser rutenett med karbon siden opp på en 7,5 x 2,5 cm glass lysbilde dekket med Parafilm. Plassere det inn i kammeret av gløden-utslippet utstyr og lukke kammeret.
    2. Pumpbell jar og glow-utslipp for 20 sek ved 25 mA og 7 x 10 -2 mbar.
      MERK: I løpet av denne tiden en lys lilla glød blir synlig. Fjern glass-slide med nett og bruke dem innen en time, ellers vil de trenger for å være gløden utladet igjen.

3. Prøve Plunge-frysing

MERK: Bruk vernebriller og passende fottøy når du bruker dette instrumentet for å beskytte mot flytende nitrogen og etan sprut.

  1. Slå på stup-frysing apparat. Fyll luftfukter reservoar med destillert vann. Still inn ønsket temperatur, relativ fuktighet og stuper vilkår for blot tid, blot kraft og adsorpsjonstid (22 ° C, 95%, 2 sek, 2 og 40 sek i eksemplet presenteres her). Plassere ny blotting filter papir.
  2. Avkjøl etan beholderen ned ved å fylle den ytre reservoar med flytende nitrogen inntil stabilitet er oppnådd (ca. 10 min). Når flytende nitrogen stopper boiling, plassere spissen av røret som kommer fra etan tanken i det indre kammeret og åpne ventilen meget langsomt. Flytende etan i det indre kammeret og fylle den i en mm fra toppen. Unngå å fryse etan. FORSIKTIG: etan er ekstremt brannfarlig og eksplosiv.
  3. Sørg for at pinsett er justert innenfor satse fryseapparat.
  4. Slå på fuktighet. Laste et rutenett på pinsett, og legg 3-5 mL av prøven på karbonflaten (kjedelig siden) av holey rutenettet. Vent til prøven for å adsorbere til nettet og utfører blotting for å oppnå et tynt væskesjikt.
  5. Flash-fryse rutenettet ved stuper den i flytende etan. Ta av pinsett-grid enheten fra flytende etan holder pinsett jevnt og trutt, og overføre den til den ytre kammer med flytende nitrogen. Overfør risten til en liten gitter box nedsenket i flytende nitrogen. Sørg for å holde den forglassede prøven i flytende nitrogen hele tiden under overføring til enten lagertankeller til den kryo holderen.
    MERK: Grid bokser kan lagres i en stor kapasitet (35-50 L) flytende nitrogen dewar i minst ett år. For praktisk oppbevaring kan de plasseres i et 50 ml Falcon rør med to borede hull på toppen og en fiskeline festet til sin hette som kan trekkes fra munningen av Dewar.

4. Overfør Cryo-rutenettet til TEM

  1. Sett cryo holderen inn i cryo-overføringsstasjonen. Vær forsiktig så du ikke skader tuppen av holderen under innføring. Kontroller for tilstedeværelsen av små fibre og støv på stangen og O-ringen av cryo holderen ved hjelp av en lupe, hvis det er noen fjerne det med optisk linsepapir.
  2. Fyll dewar av cryo holderen og arbeidsstasjonen beholder med flytende nitrogen. Unngå å søle flytende nitrogen ved hjelp av fanget trakt som følger med arbeidsstasjonen.
  3. Koble cryo holderen til kuldetrinn-kontrolleren for å overvåke temperaturen og holde legge flytende nitrogen & #160, til temperaturen stabiliserer seg på rundt -194 ° C. Være sikker på at nivået av flytende nitrogen befinner seg under nivået av vakuum tetning både i arbeidsstasjonen fartøyet og kryo holderen dewar. Pre-kjøle nett pinsett, klippet ring og den butte enden av klippet ring verktøyet på arbeidsstasjonen. Også pre-kjøle et sett av store pinsett og en skrutrekker i en annen dewar fylt med flytende nitrogen.
  4. Raskt overføre cryo grid boks som inneholder de frosne hydrerte nett til flytende nitrogen i arbeidsstasjon ved å bruke de store pinsett. Åpne cryo grid boks med skrutrekkeren, ta den frosne hydrert rutenett og plassere den i prøveholderen sporet.
  5. Plassere klippet ring på toppen av rutenettet og trykk den med den butte enden av klippet ring verktøy til det sitter ordentlig på plass. Lukk cryo-lukkeren. Ta av verktøy og cryo grid boks fra arbeidsstasjonen.
  6. Flytt hele arbeidsstasjon med holder og rutenettet til mikroskop konsollen for å minimere overføringstiden av rutenettet i romluften.
  7. Toppen av TEM anti-contaminator med flytende nitrogen, som tidligere var blitt fylt, og avkjølt i minst 20 min. Pre-vipp mikroskop scenen til -60 °.
    MERK: Dette vil minimalisere tap av flytende nitrogen som holderen er satt inn i luftslusen.
  8. Begynn pre-pumpe luftslusen syklus på mikroskopet. Kontroller at ventilen til elektronkanonen er lukket (spesielt hvis det er en FEG TEM). Vent til pre-pumpe luftslusen sekvens til slutt (ca 2 min) før du setter inn cryo holderen.
    MERK: Dette er indikert ved det røde lyset på scenen blir slukket.
  9. Sett holderen inn i luftslusen og rotere den 90 ° med klokken; koble kuldetrinn kontrolleren ledningen til cryo holderen for å overvåke temperaturen. Vent igjen før det røde lyset er slukket og rotere både scenen og innehaveren tilbake i 0 ° posisjon til å sette holderen inn i TEM high vakuum kolonne.
  10. Pass på at temperaturen aldri går over -160 ° C for å unngå dannelse av krystallinsk is.
  11. Etterfyll dewar av cryo holderen. Vent 15 - 45 min før innehaveren har termisk likevekt og TEM vakuum har kommet seg før opptak av bilder.
  12. Hvis boblende av flytende nitrogen er oppdaget, endre flytende nitrogen fyllhøyde, eller forsiktig berøre bobler opprinnelse med en bomullspinne.

5. Low-dose Datainnsamling

MERK: lavdose datainnsamling teknikken brukes til å minimere elektronstråleskader til prøven ved å begrense eksponeringen til 20 elektroner / A 2. Dette oppnås ved å alternere mellom tre konfigurasjoner: "Søk", med lav forstørrelse (~ 5,000X) og bredt synsfelt, "fokus", med høy forstørrelse (~ 150,000X) og lite synsfelt, og "eksponering", med den ønskede endelige magnifiseringen og inneholder området av interesse å bli registrert. Blank bjelken i mellom moduser.

  1. Sette opp TEM og Low-dose Program
    1. Trekke tilbake cryo-lukker og åpner ventilene kolonne.
    2. Sentrere scenen og sette eucentric høyde (Z) ved hjelp av alfa wobbler for å rocke scenen ± 15 °. Juster Z stilling til det ikke er nevneverdig bevegelse mens den fasen er rocking. Aktivere lavdose-programmet og velge detektoren for hver modus.
    3. I eksponeringsmodus finne et område av gitteret som ikke har noe karbon, justere belysningen ved å velge et optimalt kondensator åpningen og punktstørrelsen, slik at det område som skal registreres er fullt belyst. Sørg for å spre strålen i overcondensation retning.
    4. I søkemodus, finne en liten funksjon som vil være lett identifiserbar på høyere forstørrelse. I eksponeringsmodus, sentrere denne funksjonen med styrespaken (xy scenen controller). Begynn nederst forstørrelse dersom prestasjonure er ikke i synsfeltet.
    5. I søkemodus, bringe denne funksjonen til midten av feltet med de lave dose xy bildeskift kontroller. Gå til eksponeringsmodus og flytte funksjonen langs vippeaksen ved hjelp av joysticken til den er ute av området som skal registreres (0,5 til 3 mikron). Gå å fokusere modus og sentrere funksjonen ved hjelp av xy bildeskift kontroller. Begynn nederst forstørrelse hvis funksjonen er ikke i synsfeltet.
    6. Holde bjelken sentrert til enhver tid.
  2. Datainnsamling
    1. Trekke tilbake cryo-lukker og åpner ventilene kolonne. Aktiver lavdose-programmet.
    2. I søkemodus, identifisere et rutenett som inneholder tynn, homogen is.
    3. Velg et passende hull og plassere den i midten av feltet. Bytt til fokusere modus og fokusere bildet. Deretter underfocus bildet mellom 0,5 til 4,5 mikron.
    4. Bytt til eksponeringsmodus og ta bildet.
    5. Bytt til søkemodus og gjenta trinn 5.2.3-5.2.4.Bevege seg over rutenett unngå pre-eksponere gode hull for å bli registrert.
    6. Fullfør rutenett og flytte til en annen god en.
    7. Juster høyde (Z) og fortsette å samle data.

Representative Results

Forsiktig kjøring av alle protokoll trinnene i figur 1 aktiverer visualisering av frossen hydrert, ikke-farget makromolekyler. Resultater for fire representative prøver med ulike strukturelle egenskaper er vist. Deres mikroskopiske bilder som oppnås ved fremgangsmåtene ifølge NS og cryoEM blir sammenlignet (figur 2). (I) NS bilder av AAV5 avsløre viruslignende partikler i størrelsesorden 130 Å i diameter. Sameksistens av fulle og tomme strukturer tilsvarer brutt (som tillater flekken oppføring) og strukturelt intakt capsids, henholdsvis. CryoEM viser jevnt tomme strukturer; faktisk disse viruspartikler ikke inneholder genetisk materiale 28. NS viser dominerende runde partikler mens cryoEM viser stort sett sekskantede partikler, noe som reflekterer deres icosahedral skjema. (Ii) Bilder av de spiralformede TMV vis stenger av 180 Å diameter og med variabel lengde, ofte mer enn 0,1 mikrometer, med en skruelinjeformet gjentakelse av 23 en synlig bådei NS og i cryoEM. Den 40 en sentral kanal er fylt med beis i NS-bilder og tom i cryoEM bilder. (Iii) Native KLH, en didecamer av 8 MDA, samler i karakteristiske fat 350 Å diameter og 400 en lengde. NS og cryoEM avsløre KLH er rektangulære sidevisninger og sirkelslutt på visninger. Begge teknikkene avslører seks striper vinkelrett på symmetriaksen og de jevnt fordelte morfologiske enheter innenfor hver tier. CryoEM avslører et tomt indre struktur. (Iv) Ryanodine reseptoren, en stor tetramerisk intracellulær kanal på 2,26 MDA, blir sett på som et kvadrat på 275 x 275 Å to. Intrikate overflate funksjoner som en sentral kors og en sentral depresjon manifest som flekken opphopning av NS, og som lavere densitet av cryoEM. Mens NS viser tilsvar kontrast i alle de fire testede prøver, eksponerer sammenligning av cryoEM paneler nedre SNR (kontrast) av RyR1 på grunn av tilstedeværelsen av vaskemiddel for å oppløse dette membranprotein.

Typiske eksempler på cryoEM gjenstander er vist for RyR1: krystallinsk is, is forurensning, astigmatisme, og web-lignende strukturer (figur 3). Årsaker og forebygging er nærmere beskrevet i diskusjonskapittelet.

SPA og 3D rekonstruksjon av frossen hydrert RyR1 avslører sin firedelte symmetrisk struktur, noe som gjenspeiler proteinets homotetrameric organisasjon (Figur 4A). Cytoplasmaområdet danner en firkantet prisme av 275 x 275 x 120 A 3 og inneholder flere reproduserbare globular domener som danner et stillas-lignende struktur. Transmembrandomenen danner et mindre konisk firkantet prisme med maksimum dimensjoner 115 x 115 x 60 A 3. Ved 10 Å oppløsning er det mulig å visualisere alfa-helikser (figur 4b). 3D forskjell kartlegging kan avsløre posisjonen viktige ligander, i dette tilfelle 3D-differansen kart over FKBP12, et 12 kD protein considered en underenhet av RyR1, legges oppå RyR1 (Figur 4C) 29. Endelig konformasjonsendringer tilveiebringe en dynamisk riss av makromolekylet. I dette tilfelle RyR1 tidligere stabilisert i enten lukket eller åpen betingelser viser en massetranslokasjon fra den lukkede til den åpne tilstand (figur 4D) 27.

Figur 1
Figur 1. Flytskjema for kryo elektronmikros teknikk. Diagrammet belyser hovedtrinnene i protokollen.

Figur 2
Figur 2. Sammenligning av NS og cryoEM for en rekke prøver. (A) AAV5, en icosahedral virus. (B) TMV, en spiralformet virus. Innfellinger viser spiral gjenta, av 23. Å. (C) Native KLH. (D) RyR1; representative synspunkter blir uthevet (f, firling utsikt og s, fra siden). Alle prøver blir avbildet under lave doseforhold og på samme forstørrelse på 50.000 som en under en akselererende spenning på 200 kV. Skala barer, 10 Nm. Alle NS prøvene er på karbon støtte, cryoEM prøvene A, C, D er på tynn karbon i løpet quantifoil, og cryoEM prøve B er direkte over quantifoil hull. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Galleri av bilder som viser vanlige cryoEM gjenstander på en RyR1 cryoEM prøven. (A) Crystal is. (B) Ice forurensning (piler). (C) Astigmatism. RyR1s i astigmatic bildet er knapt synlig. Den innfelt til høyre viser strøm SPECTrum av bildet med asymmetriske Thon ringer. Den innfelt til venstre viser strøm spekteret av en ikke-astigmatic bilde for referanse. (D) Web-lignende strukturer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4. CryoEM og 3D rekonstruksjon av ryanodine reseptoren. . (A) Isosurface representasjon (B) Forankrings av en krystallstruktur av RyR1 sin N-terminal 30 viser god overensstemmelse mellom atom-koordinater og cryoEM konvolutt; Pilene peker på to alfa-helikser som stikker ut fra strukturen. Pilhode angir et av de fire helikser som omgir pore av ionekanalen. De stiplede linjer angir grensene for membranen. (C) RyR1 og 3D losering av FKBP12 ligand (oransje farge). (D) konformasjonsendringer av RyR1 i går fra lukket (oransje) til åpen (svart mesh) konformasjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

TEM fulgt av SPA har bidratt mange makromolekylære 3D-strukturer, nærmer seg 2000 oppføringer i EMDB innen midten av 2014. Generelt for en gitt makromolekyl, er en lav-oppløsning 3D-struktur først bestemmes fra NS data, noe som kan bli etterfulgt av en med høyere oppløsning cryoEM 3D-struktur. Den høye kontrasten i de molekylære grensene gitt av NS, hvilket letter den første 3D-rekonstruksjon, er senere raffineres ved cryoEM med sin evne til å kartlegge den indre strukturen av makromolekylet i sin fullt hydrert tilstand, og muligheten til å oppnå mye høyere oppløsning. En annen fordel med cryoEM er eliminering av dehydrering stress som kan føre til kollaps av makromolekyl. I tillegg er det mulighet for å utelate karbonbærer, som eliminerer mulige overflate absorpsjonseffekter og viser konformasjonen at makromolekylet fatter i oppløsning. Cryo-negativ farging, en kombinasjon av cryoEM og NS, gir høy kontrast i en fullt hydvurdert prøven og kan også føre til 3D-rekonstruksjon ved bruk av SPA, men det har blitt mindre hyppig brukt, med mindre enn 10 EMDB oppføringer, delvis fordi den flekker i seg selv kan påvirke integriteten av makromolekylet 31. To andre TEM teknikker som bidrar til 3D rekonstruksjon er 2D elektron krystallografi og elektron tomografi. 2D elektron krystallografi krever en plan eller rørformet krystall; crystal elektrondiffraksjon brukes for 3D rekonstruksjon som potensielt kan føre til atom oppløsning 32. I elektron tomografi av glassert eller tradisjonelt faste prøver, er et makromolekyl eller sub-cellulær komponent roteres inne i TEM for påfølgende tomografisk rekonstruksjon 33, med den fordel at singulære gjenstander kan rekonstrueres; imidlertid i dag har denne teknikken en oppløsning grense mellom 40 og 20 A 34,35. Blant alle disse molekylære TEM teknikker, har SPA av NS og cryoEM data vært den mestanvendes. Protokollen illustrert her er dedikert til å skaffe cryoEM bilder som egner seg for SPA analyse; Likevel er de fleste av protokollen er også anvendelig til cryoEM av 2D krystaller og tomografiske prøver.

En vellykket cryoEM sesjon avhenger av det kombinerte suksess for mange kritiske trinn; viktige aspekter å huske på, forklaring av felles cryoEM artefakter og hvordan du kan unngå dem er beskrevet i følgende avsnitt. Denne delen beskriver også retningslinjer datainnsamling for å oppnå høykvalitets 3D rekonstruksjoner ved hjelp av SPA-metoden.

Unngå overgang til krystallinsk is. Et sentralt aspekt er at utvalget trenger å bo i glasslegemet tilstand fra det øyeblikk av cryo-stuper hele TEM observasjon. Dermed etter stuper prøven i flytende etan alle etterfølgende trinn utføres ved flytende nitrogen (-196 ° C) eller flytende helium (-269 ° C) temperaturer. Oppvarming til over -135 ° C forvandler glass vann itil krystallinsk vann; deretter makromolekylære omleiringer kan finne sted, og vann krystaller dominerer bildet (figur 3A); prøven skal kastes. Utilsiktet prøven oppvarming kan skje hvis cryo-nedsenking, overføring av den frosne nettet mellom beholderne (selv om det er beskyttet av et gridbox), og / eller cryo holderen innsetting i TEM er for langsom, eller hvis håndterings pinsett var tilstrekkelig pre- avkjølt. Betydelig vakuum forverring i TEM på cryo-overføring (de kalde prøve feller varmere innkommende luft) kan også varme opp prøven. Til slutt, over-bestråling av prøven kan også resultere i overgangen til krystallinsk is.

Minimer is forurensning. Gitt den lille prøvevolum (3-5 mL) brukes på TEM rutenettet, kan fordampning konsentrere bufferkomponenter (salt, vaskemidler) og dermed påvirke makromolekylært integritet inkludert tap av multimert tilstand. En høy relativ luftfuktighet (RH) mikromiljøet eller kammer omgås dette problemet. Alternativt cryo-plunging kan gjøres på en tilstrekkelig ventilert miljø kaldt rom. Etter cryo-stuper RH bør være så lavt som mulig for å hindre at is forurensning, eller kondensering av omgivelsesfuktighet på kryo-gitteret, som kryo-gitteret i seg selv fungerer som en kaldfelle. Ice forurensning består av partikler med høy kontrast og ingen understell med størrelser mellom ~ 5 nm og flere mikrometer som forstyrrer eller helt blokkerer bildet. Unngå luft trekk, snakker / puste mot cryo-grid under luftoverføring, og redusere relativ fuktighet i omgivelsene. Åpne flytende nitrogenbeholdere med kondensvann (synlig som hvite suspenderte partikler) bør også kastes.

Maksimere makromolekyl orienteringer / visninger. For prøven støtte, er et valg som skal gjøres mellom ekte holey nett og tynn karbon i løpet holey nett. Dette avhenger av (i) hvor prøven sprer seg over karbonfilm versus karbon hull, (ii) tilgjengelig prøve concentration, som bare hull kan kreve en konsentrasjon 100 ganger høyere enn karbon støtte for en lignende partikkeltetthet på bildet (fra ~ 0,02 til 2 uM), og (iii) hvor tilfeldig er fordelingen av makromolekylorienteringer. Legg merke til at glødeutladning, som gjør det karbonhydrofile, vil ha en viktig effekt på alle tre sider og at dette vil være prøven avhengig. Når det gjelder retningen på makromolekyl, mens en tilbakevendende syn er ønskelig for den første strukturbestemmelse av tilfeldig konisk gjenoppbygging, er tilfeldigheten av makromolekyl utsikt ønskelig når raffinering 3D rekonstruksjon til høyere oppløsninger. I vårt eksempel, samhandler RyR1 med karbon med en favoritt 'fordoblet' view (figur 2D) og krever holey nett for tilfeldigheten orienteringer og høyere oppløsning 36.

Maksimere SNR. Den beste strategien for å øke SNR er å redusere bakgrunnsstøykilder. Dreven istykkelse og (hvis det finnes) karbon filmtykkelse utover det som er nødvendig for å støtte og legge proteinet vil legge ekstra støy. Således istykkelsen bør reduseres til det nødvendige minimum ved å regulere trekk tid, trykk, RH, og filterpapirkvaliteten. For karbon-støtte, er en tynn (~ 5 nm) karbon film lagvis over tykkere holey karbon film: den tykke holey karbon gir mekanisk motstand mens prøven er avbildet over tynne karbon-dekket hullet. På den annen side, være oppmerksom på at ekstremt tynne is og / eller karbon, kan resultere i en lett ødelagt støtte som kan slå inn i en bane (figur 3D). Å maksimere SNR bør eventuelle unødvendige bufferkomponenter unngås. For membran proteiner, tar vaskemiddel en betydelig toll på kontrast (se figur 2D, høyre panel). I tillegg ved å redusere overflatespenningen endrer vaskemiddel måten prøven sprer seg på bæreren. Noen membranproteiner krever tilstedeværelse av lipid, i tillegg til DETergent, noe som ytterligere reduserer kontrasten. For å overvinne denne prøven kan fortynnes i en buffer med lavere konsentrasjon vaskemiddel og uten lipid like før cryo-stuper 37. Nye alternative vaskemidler 16 og bruken av nanodisks 38 for å stabilisere det transmembrane domene komponent synes å være vellykkede metoder for avbildning membranproteiner fra cryoEM.

Streve for bilder av høy kvalitet og forberede seg CTF korreksjon. Vitrified prøver krever høye defokus verdier for å generere tilstrekkelig bilde (fase) kontrast der CTF, funksjonen som gjelder intensitet til frekvensen, har flere null overganger, og da er det ingen informasjon. Mens CTF korreksjon er ikke nødvendig for lav oppløsning 3D rekonstruksjon, når som mål for høyere oppløsning, for å gjenopprette en nøyaktig gjengivelse av 3D-objektet, bilder med forskjellige defoci må hentes slik at beregnings CTF korreksjon kan gjøres.CTF besluttsomhet og korrigering er inkludert i de store SPA programvarepakker 4-7; detaljer kan finnes andre steder 39. For optimal CTF korreksjon, bruker en rekke defoci. En god strategi er å veksle blant 3-4 Defocus verdier. Verdiene avhenger av størrelsen av makromolekylet (større størrelser krever mindre uskarp), is / karbon tykkelse (tynnere prøven krever mindre uskarp), og den spenning (lavere spenning krever mindre uskarp). For 200 kV, er et godt utgangspunkt rekke verdier 2,5, 3, 3,5 og 4 mikrometer defokus. CTF manifesterer som alternerende ringer av høy og lav intensitet (Thon ringer 40) i den gjensidige plass representasjon, makt spektrum. Vise effektspekteret vil avdekke potensialet for oppløsning; frekvensen til den bredeste synlig Thon ringen er nærmest a priori estimat av den oppnåelige oppløsning. Effektspekteret bør sjekkes med jevne mellomrom, og astigmatic (ikke sirkulært) Thon ringer (figur 3C) bør korrigeres med målet stigmator. Thon ringene skal være synlig i det minste opp til den ønskede oppløsning.

En cryoEM datasett oppnådd ved anvendelse av denne protokollen kan være direkte prosessert av SPA for å generere en 3D-rekonstruksjon. Selv med en ideell prøven, vil kvaliteten på 3D-rekonstruksjon avhenge av ytelse og spesifikasjoner av TEM utstyr, og på bildebehandling. Med kontinuerlige forbedringer i begge disse fronter, og med spesiell omtale til de nyutviklede direkte elektron detektorer, muligheten innhente 3D rekonstruksjoner på atom oppløsning mer konsekvent er nærmere enn det noensinne har vært.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ethane Airgas 371745 99.99% purity very important, impurities can lead to high-contrast contaminants on the grid. CAUTION: flammable
Liquid nitrogen Airgas 27135 99% purity. CAUTION: handling liquid nitrogen in a cold room poses a serious asphyxia hazard since nitrogen displaces oxygen without any warning signs.
Dumont no. 5 Antimagnetic tweezers Ted Pella 5326
Mica sheets, 1 x 4 cm Ted Pella 54
Graphite rods, presharpened size 1/8” dia x 2 ¼” long tip 0.039” dia neck type Electron Microscopy Sciences 70220-45
350 ml cryo-dewars Pope 8600
Cu 400 mesh holey grids  Quantifoil Quantifoil Q10525
Cu 400 mesh holey grids C-Flat Protochips CF-1.2/1.3-4C
Glow discharge device Electron Microscopy Sciences Model E7620
Turbo pumping station Gatan Model 655
Carbon evaporator Denton Vaccum Model 502B
Freeze plunger FEI Vitrobot Mark IV
Transmission electron microscope 200 kV FEI Model Tecnai F20
CCD Camera 4k x 4k Gatan UltraScan 4000 UHS
Image Processing software CTFFIND3/CTFTILT http://grigoriefflab.janelia.org/ctf
Image Processing software EMAN http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2
Image Processing software Spider http://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html
Image Processing software Freealign  http://grigoriefflab.janelia.org/frealign
3D visualization software Chimera http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/
Native Keyhole Limpet Hemocyanin Biosyn

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Adrian, M., Dubochet, J., Lepault, J., McDowall, A. W. Cryo-electron microscopy of viruses. Nature. 308 (5954), 32-36 (1984).
  2. Franzini-Armstrong, C. RyRs: Their Disposition, Frequency, and Relationships with Other Proteins of Calcium Release Units. Curr Top Membr. 66C, 3-26 (2010).
  3. Booth, D. S., Avila-Sakar, A., Cheng, Y. Visualizing proteins and macromolecular complexes by negative stain EM: from grid preparation to image acquisition. J Vis Exp. (58), (2011).
  4. Shaikh, T. R., et al. SPIDER image processing for single-particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs. Nat Protoc. 3 (12), 1941-1974 (2008).
  5. Grigorieff, N. FREALIGN: high-resolution refinement of single particle structures. J Struct Biol. 157 (1), 117-125 (2007).
  6. Scheres, S. H. RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. J Struct Biol. 180 (3), 519-530 (2012).
  7. Ludtke, S. J. 3-D structures of macromolecules using single-particle analysis in EMAN. Methods Mol Biol. 673, 157-173 (2010).
  8. Radermacher, M., et al. Cryo-electron microscopy and three-dimensional reconstruction of the calcium release channel/ryanodine receptor from skeletal muscle. J Cell Biol. 127 (2), 411-423 (1994).
  9. Stewart, A., Grigorieff, N. Noise bias in the refinement of structures derived from single particles. Ultramicroscopy. 102, 67-84 (2004).
  10. Serysheva, I. I., et al. Electron cryomicroscopy and angular reconstitution used to visualize the skeletal muscle calcium release channel. Nat Struct Biol. 2, 18-24 (1995).
  11. Cheng, Y., et al. Single particle reconstructions of the transferrin-transferrin receptor complex obtained with different specimen preparation techniques. J Mol Biol. 355 (5), 1048-1065 (2006).
  12. Stark, H. GraFix: stabilization of fragile macromolecular complexes for single particle cryo-EM. Methods Enzymol. 481, 109-126 (2010).
  13. Wang, L., Lashuel, H. A., Walz, T., Colon, W. Murine apolipoprotein serum amyloid A in solution forms a hexamer containing a central channel. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (25), 15947-15952 (2002).
  14. Amunts, A., et al. Structure of the yeast mitochondrial large ribosomal subunit. Science. 343 (6178), 1485-1489 (2014).
  15. Suloway, C., et al. Automated molecular microscopy: the new Leginon system. J Struct Biol. 151 (1), 41-60 (2005).
  16. Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy. Nature. 504 (7478), 107-112 (2013).
  17. Bai, X. C., Fernandez, I. S., McMullan, G., Scheres, S. H. Ribosome structures to near-atomic resolution from thirty thousand cryo-EM particles. Elife. 2, e00461- (2013).
  18. Grigorieff, N., Harrison, S. C. Near-atomic resolution reconstructions of icosahedral viruses from electron cryo-microscopy. Curr Opin Struct Biol. 21, 265-273 (2011).
  19. Lerch, T. F., et al. Structure of AAV-DJ, a retargeted gene therapy vector: cryo-electron microscopy at 4.5 A resolution. Structure. 20 (8), 1310-1320 (2012).
  20. Govindasamy, L., et al. Structural insights into adeno-associated virus serotype 5. J Virol. 87 (20), 11187-11199 (2013).
  21. Egelman, E. H. A robust algorithm for the reconstruction of helical filaments using single-particle methods. Ultramicroscopy. 85 (4), 225-234 (2000).
  22. Ge, P., Zhou, Z. H. Hydrogen-bonding networks and RNA bases revealed by cryo electron microscopy suggest a triggering mechanism for calcium switches. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (23), 9637-9642 (2011).
  23. Clare, D. K., et al. ATP-triggered conformational changes delineate substrate-binding and -folding mechanics of the GroEL chaperonin. Cell. 149 (1), 113-123 (2012).
  24. Fonseca, P. C., He, J., Morris, E. P. Molecular model of the human 26S proteasome. Mol Cell. 46 (1), 54-66 (2012).
  25. Gatsogiannis, C., Markl, J. Keyhole limpet hemocyanin: 9-A CryoEM structure and molecular model of the KLH1 didecamer reveal the interfaces and intricate topology of the 160 functional units. J Mol Biol. 385 (3), 963-983 (2009).
  26. Torres, J., Stevens, T. J., Samso, M. Membrane proteins: the 'Wild West' of structural biology. Trends Biochem Sci. 28 (3), 137-144 (2003).
  27. Samso, M., Feng, W., Pessah, I. N., Allen, P. D. Coordinated Movement of Cytoplasmic and Transmembrane Domains of RyR1 upon Gating. PLoS Biology. 7 (4), 980-995 (2009).
  28. DiMattia, M., et al. purification, crystallization and preliminary X-ray structural studies of adeno-associated virus serotype 5. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 61 (Pt 10), 917-921 (2005).
  29. Samso, M., Shen, X., Allen, P. D. Structural characterization of the RyR1-FKBP12 interaction. J Mol Biol. 356 (4), 917-927 (2006).
  30. Lobo, P. A., Van Petegem, F. Crystal structures of the N-terminal domains of cardiac and skeletal muscle ryanodine receptors: insights into disease mutations. Structure. 17 (11), 1505-1514 (2009).
  31. De Carlo, S., Harris, J. R. Negative staining and cryo-negative staining of macromolecules and viruses for TEM. Micron. 42 (2), 117-131 (2011).
  32. Kuhlbrandt, W. Introduction to electron crystallography. Methods Mol Biol. 955, 1-16 (2013).
  33. Yahav, T., Maimon, T., Grossman, E., Dahan, I., Medalia, O. Cryo-electron tomography: gaining insight into cellular processes by structural approaches. Curr Opin Struct Biol. 21 (5), 670-677 (2011).
  34. Briggs, J. A. Structural biology in situ--the potential of subtomogram averaging. Curr Opin Struct Biol. 23 (2), 261-267 (2013).
  35. Harapin, J., Eibauer, M., Medalia, O. Structural analysis of supramolecular assemblies by cryo-electron tomography. Structure. 21 (9), 1522-1530 (2013).
  36. Samso, M., Wagenknecht, T., Allen, P. D. Internal structure and visualization of transmembrane domains of the RyR1 calcium release channel by cryo-EM. Nat Struct Mol Biol. 12 (6), 539-544 (2005).
  37. Sharma, M. R., et al. Cryoelectron microscopy and image analysis of the cardiac ryanodine receptor. J Biol Chem. 273 (29), 18429-18434 (1998).
  38. Denisov, I. G., Grinkova, Y. V., Lazarides, A. A., Sligar, S. G. Directed self-assembly of monodisperse phospholipid bilayer Nanodiscs with controlled size. J Am Chem Soc. 126 (11), 3477-3487 (2004).
  39. Zhu, J., Penczek, P. A., Schroder, R., Frank, J. Three-dimensional reconstruction with contrast transfer function correction from energy-filtered cryoelectron micrographs: procedure and application to the 70S Escherichia coli ribosome. J Struct Biol. 118 (3), 197-219 (1997).
  40. Thon, F. Phase contrast electron microscopy. , Academic Press. New York. (1971).

Tags

Strukturbiologi 3D elektronmikroskopi Cryo-elektronmikroskopi membran proteiner ryanodine reseptor enkelt partikkel bildebehandling transmisjonselektronmikroskopi
Gjøre og ikke gjøre av Cryo-elektronmikroskopi: En Primer på Prøvepreparering og High Quality datainnsamling for Macromolecular 3D Rekonstruksjon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cabra, V., Samsó, M. Do's and… More

Cabra, V., Samsó, M. Do's and Don'ts of Cryo-electron Microscopy: A Primer on Sample Preparation and High Quality Data Collection for Macromolecular 3D Reconstruction. J. Vis. Exp. (95), e52311, doi:10.3791/52311 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter