This paper describes the cryo-electron microscopy methodology, which is used to obtain high quality microscopic images of macromolecules in their near-native state. The method yields images suitable for further computerized processing using the single particle approach, devised to generate the 3D reconstruction of a macromolecule.
Cryo-electron microscopy (cryoEM) entails flash-freezing a thin layer of sample on a support, and then visualizing the sample in its frozen hydrated state by transmission electron microscopy (TEM). This can be achieved with very low quantity of protein and in the buffer of choice, without the use of any stain, which is very useful to determine structure-function correlations of macromolecules. When combined with single-particle image processing, the technique has found widespread usefulness for 3D structural determination of purified macromolecules.
The protocol presented here explains how to perform cryoEM and examines the causes of most commonly encountered problems for rational troubleshooting; following all these steps should lead to acquisition of high quality cryoEM images. The technique requires access to the electron microscope instrument and to a vitrification device. Knowledge of the 3D reconstruction concepts and software is also needed for computerized image processing. Importantly, high quality results depend on finding the right purification conditions leading to a uniform population of structurally intact macromolecules.
The ability of cryoEM to visualize macromolecules combined with the versatility of single particle image processing has proven very successful for structural determination of large proteins and macromolecular machines in their near-native state, identification of their multiple components by 3D difference mapping, and creation of pseudo-atomic structures by docking of x-ray structures. The relentless development of cryoEM instrumentation and image processing techniques for the last 30 years has resulted in the possibility to generate de novo 3D reconstructions at atomic resolution level.
cryoEM的目标是获得在其天然水合状态大分子的电子显微镜图像。凭借嵌入在玻璃化水的大分子,冷冻水合样品可以直接引入并可视化以TEM仪器。玻璃化,通过闪冻(10,000℃/秒)实现,冻结的样品没有水的结晶,并确保在冻结分子重排是微不足道的。样品的电子散射的相对于周围的缓冲区中的过量提供一种小但足够的对比度,看所述大分子在没有任何污点1。计算机化的图像处理可以被用来重建该大分子的三维结构。大分子的〜500 kDa-多丙二醛的范围是理想的样本cryoEM(代表电子显微镜数据库(EMDB)项的80%以上);这些包括蛋白质,蛋白质复合物,蛋白质 – 核酸Çomplexes,和膜蛋白包埋在双层中。这些大分子是不太可能被结晶(具有小于2%的条目在PDB数据库中),但它是通常的情况是通过x射线晶体学或NMR解决较小的部分可以停靠到由cryoEM创建的3D信封。另一方面,一些由cryoEM解决的最大的结构是由薄截面的TEM 2的全部细胞内识别。因此,有效地cryoEM桥接亚细胞和原子结构之间的尺寸和分辨率的差距。
CryoEM体现更好的大分子的比负染色的更经典方法(NS),其中所述大分子是脱水,由一层重金属染色包围由此染色排除区域产生强烈对比的“负”图像3天然结构。在这两种情况下的电子束产生的大分子的2D投影图像,称为颗粒,其中的SHAPE取决于所述大分子的取向相对于所述电子束。许多颗粒,至少〜1000,并与没有上限,可以在计算机与“单粒子分析”(SPA)软件进行分析,以增加信号到虽然平均信噪比(SNR),并找到粒子的空间取向参数需要重新创建大分子的三维结构由背面投影4-7。 NS,具有更高的SNR,则用于初步样品表征,并产生一个从头三维重建;其第很少超过20埃,这是由重的金属颗粒的脱水和大小强加的。在一般情况下,对于cryoEM三维结构测定,低分辨率3D重建,首先从NS获得然后cryoEM用于细化此低分辨率初始地图进一步研究大分子在其天然水合状态,看它的内部结构,并增加其分辨率。没有德,如果对NS模型被扭曲(最常见的例子是平坦化从脱水8所得)和cryoEM颗粒具有低信噪比,则该失真可以携带到cryoEM模型(模型偏压工件,这是常见的低信噪比数据集9)。结构扭曲会导致的NS和cryoEM原料颗粒之间的原始cryoEM颗粒和3D模型垂直于展平方向的相应凸块之间的不匹配。模型偏差可以自行解决的3D模型,经过连续的优化循环。如果是不发生,这将被检测为缺少来自3D模型生cryoEM颗粒和相应的突起之间的对应关系,然后从头模型应从cryoEM数据构成。一个好的方法可能是使用的角度重构算法10,其可产生几种可能的3D体积,然后用生理盐水三维模型选择最佳的cryoEM模型这将进一步完善11。一个更好的策略是增加的cryoEM数据集的信噪比(参见讨论专用部分)。
纯化大分子的生化质量有最终结果的最大影响。大分子,从组织纯化的,或表达异源系统中,需要具有纯度高,并在结构上不动。它既不应该形成聚集也不应该分解。定义一个特定的构象,制备条件应促进均匀的构象状态。为了研究复合物,它是最佳的那其k个D在nM范围,否则固定剂已被成功地用于稳定低亲和力相互作用12,13。
未处理cryoEM图像上产生的尺寸的有价值的信息,一般轮廓,聚集/多聚化,均匀性的状态,并且macromolecu的内部结构勒。然而该技术的潜力是大大增强了图像处理。的三维结构揭示该大分子的总体架构,配体和亚单位,构象变化的三维位置,并使得能够通过X射线晶体学或NMR测定的原子结构的对接。一个三维重建的信息量逐步增加的分辨率提高:一般15-20一项决议,允许原子结构的明确对接,在9-10α-螺旋如棒可见,在5可以看出β片层,并以3.5埃,更好的分辨率有可能建立的原子模型14。
的可能性,以获得翔实的图片,并使用SPA从相对少量的样品做出cryoEM一个有吸引力的技术,三维重建,3-5微升至少为0.05毫克/毫升就足够准备一份TEM网格。最低要求的工具对于cryoEM是自制或商业冷冻柱塞,具有超高真空,图像记录介质和低剂量的试剂盒,一个低温保持器与它的泵站,辉光放电装置和蒸发器的电子显微镜。在TEM非必要但进一步需要的特征是CCD照相机(存在于所有的现代电信设备制造商)或直接电子检测器,场发射枪(FEG),能量过滤和高吞吐量数据收集软件。这个软件在原则使得能够收集颗粒的数以万计在单个cryoEM会话15,但是增加了数据存储需求和随后的监督后处理时间需要的要加以考虑。 FEG结合对比度传递函数(CTF)修正影响那些达到的分辨率足以显现α-螺旋大多数3D重建。在这一点上,分辨率的高低也是样品依赖性:膜蛋白达到10的分辨率是不常见的,而如果对称高阶的存在,那么原子分辨率更可以实现的。直接电子检测器的最近发展已使原子分辨率即使对于大分子低(4次)或不对称,其中,从X射线衍射数据16,17,这些衍生的cryoEM电子密度图的质量相匹配。
提供说明了该技术的能力的实际例子在这里的四个重要类型的大分子,其中cryoEM在其结构决定一个持续主要作用。 (一)在他们的二十面体对称,增加了60倍,其大尺寸允许忠实的 和可重复的定位数据集,几个二十面体病毒的结构已经解决了由cryoEM近原子分辨率其次SPA 18。我们展示了一类的二十面体病毒,腺相关病毒(自动增值服务)的一个例子,对于其通过cryoEM和由cryoEM / X射线HY近原子结构布里德方法存在19,20。 (ⅱ)大分子与螺旋结构包括微管,微丝和病毒。其重复单元沿着螺旋轴可以由更复杂的版本的SPA适于将螺旋几何形状21进行分析。在这个例子中,我们表明烟草花叶病毒(TMV),已被解决,以原子级分辨率由cryoEM 22的RNA病毒。 (三)大的可溶性蛋白被充分研究。其中,大分子形成对称多聚缸构成经常性的架构往往在解决亚纳米分辨率23,24。这里,我们表明,KLH,无脊椎动物氧载体,其中混合的分子模型,从cryoEM / X射线晶体混合方法25中创建的图像。 (ⅳ)膜蛋白是蛋白质的一类重要的;它们构成的约1/3由人类基因组编码的蛋白质的,但它们难以表征结构由于与TR相关的复杂性ansmembrane域稳定26,构成由任何结构相结合的技术解决了这个结构的小于1.5%。 cryoEM及三维重建在其结构测定的作用例举与兰尼碱受体(RyR的),一个大的真核细胞内Ca 2+通道在肌肉收缩和脑的信号非常重要。最高分辨率cryoEM结构到今天为止,有10的分辨率,显示二级结构27。
TEM接着SPA贡献许多大分子的三维结构,即将在EMDB 2000项由2014年中期一般来说,对于给定的大分子,低分辨率3D结构首先从NS数据,其可以随后是higher-确定分辨率cryoEM 3D结构。通过生理盐水,这有利于所述第一三维重建所提供的分子边界的高对比度,随后精制cryoEM,它能够与大分子的内部结构映射在其完全水合状态,并达到更高的分辨率的可能性。 cryoEM的另一个优点是消除脱水应力可能导致大分子的崩溃。此外,还有以省略碳载体,从而消除可能的表面吸收效果,并表明大分子采用在溶液中的构象的可能性。冷冻阴性染色,cryoEM和NS的组合,能提供高对比度的全附件hyd额定试样和也可导致三维重建使用SPA的,但它已不常用的,具有小于10 EMDB条目,这部分是因为污渍本身可与大分子31的完整性干扰。有利于三维重建两个TEM技术是二维电子晶体学和电子断层扫描。 2D电子晶体需要一个平面或管状晶体;晶体的电子衍射用于三维重建可能导致原子分辨率32。在玻璃化的或传统的固定标本的电子断层扫描,大分子或亚细胞组分的透射电镜用于后续断层重建33内旋转,与优点,即单数的对象可以被重建;然而,目前该技术的分辨率极限范围从40至20埃34,35。在所有这些分子TEM技术,对NS和cryoEM数据SPA一直是最广泛的使用。这里说明该协议是专门为获得适合SPA分析cryoEM图像;然而大多数的协议也适用于2D的cryoEM晶体和断层样品。
一个成功的cryoEM会议取决于很多关键步骤合并成功;重要的方面要记住,共同cryoEM文物的解释,以及如何避免它们将在下面的段落描述。本节还介绍了数据收集的指导方针,以获得使用SPA方法高品质的3D重建。
避免过渡到结晶冰。一个主要方面是,样品需要保持在玻璃态从冷冻切入整个TEM观察的时刻。由此切入试样中的液体乙烷后在液氮(-196℃)或液态氦(-269℃)的温度进行的所有后续步骤。升温至高于-135℃的玻璃转化水以结晶水;那么大分子重组可能发生和水结晶称霸图像( 图3A);样品应被丢弃。偶然样品预热可能发生,如果冷冻切入,冷冻的网格的容器(即使由gridbox保护),和/或低温保持器插入之间传递到TEM太慢,或者如果处理镊子是不充分的预冷却。在低温时转移的TEM显著真空恶化(冷样品陷阱温暖进气)也可以热身的样本。最后,在辐照的样本也可能导致过渡到结晶冰。
最大限度地减少冰的污染 。由于小样本量(3-5微升)应用到TEM网格,蒸发量可以集中缓冲液成分(盐,洗涤剂),从而影响大分子的完整性,包括多聚态损耗。较高的相对湿度(RH)的微环境或室内规避s此问题。或者冷冻飞泻可以在通风良好的环境冷室来完成。冷冻切入RH后应尽可能地低,以防止冰的污染,或在低温网格环境湿度的冷凝,作为冷冻格本身作为一个冷阱。冰污染由具有高对比度和尺寸范围之间〜5纳米和几微米该干扰甚至完全阻挡图像没有子颗粒。避免空气气流,谈论/对呼吸的空气传输过程中的冷冻格,并降低环境湿度。开液氮容器冷凝水(如白色悬浮颗粒可见)也应被丢弃。
最大限度地提高大分子取向/意见。对于样品的支持,要作出一个选择是真正的多孔格栅和薄碳在多孔网格之间。这取决于(ⅰ)如何将样品遍及碳膜相对于碳的孔,(ⅱ)提供样品concentration,裸孔可以要求的浓度100X比碳载体更高的图像上的类似粒子密度(从〜0.02〜2微米),以及(iii)是如何随机大分子取向的分布。需要注意的是辉光放电,这使得碳的亲水性,将在所有三个方面的重要作用,而这将是样品依赖性。对于大分子的取向,而经常视图是理想的初始结构确定由随机圆锥形重建,炼三维重建到更高的分辨率时的大分子次随机性是可取的。在我们的例子中,RYR1交互与喜爱的“四倍”视图( 图2D)的碳,需要多孔网格方向的随机性和更高的分辨率36。
最大限度地提高SNR。提高SNR最好的策略是减少噪音的背景来源。过多的冰厚度和(如果存在的话)的碳薄膜的厚度超出所需要的,以支持并嵌入该蛋白质将增加额外的噪声。因此冰厚度应通过控制杂交时间,压力,相对湿度,和滤纸质量被减少到最低限度的必要。对于碳载体,薄(〜5nm)的碳膜层叠在较厚的多孔碳膜:厚多孔碳提供机械阻力而样品被成像在薄碳覆盖的孔。另一方面,请注意,非常薄的冰和/或碳可以导致容易破损支撑,可以变成一个网络( 图3D)。为了最大化信噪比,应避免任何不必要的缓冲组件。对于膜蛋白,该洗涤剂呈现对比显著收费( 见图2D,右图)。除了通过减少表面张力的洗涤剂可改变样品散布在载体上的方法。一些膜蛋白需要脂质除了存在下DETergent,这进一步降低了对比度。为了克服这个样本可以之前冷冻暴跌37稀释在缓冲区中低浓度的洗衣粉,没有脂肪。新的替代洗涤剂16并利用纳米盘38,以稳定的跨膜域成分似乎是成功的方法用于成像膜蛋白由cryoEM。
争取高质量的图像和用于CTF校正做准备。上釉标本要求高的散焦值,以产生足够的图像(相位)的对比,其中CTF,即涉及强度与频率的函数,有几个零过渡,在该点没有信息。而CTF校正是没有必要的低分辨率3D重建,旨在为更高的分辨率时,来恢复3D对象的精确表示,具有不同defoci图像需要被收集使得计算CTF校正可以做到的。CTF确定和修正包括在主要的SPA软件包4-7;细节可以在其他地方找到39。为了获得最佳的CTF校正,使用范围defoci的。一个好的策略是交替之间3-4散焦值。的值依赖于该大分子(较大尺寸需要更少的散焦)的大小,冰/碳的厚度(更薄样品需要更少的散焦),并且电压(下限电压需要更少的散焦)。 200千伏,价值观的良好开端范围是2.5,3,3.5和4微米的散焦。周大福表现为交替的高,低强度的戒指(戒指吞40)在倒数空间表示,功率谱。显示所述功率谱将揭示为分辨率的潜力;最宽的可见吞环的频率是接近的可达到的分辨率的先验估计。功率谱应定期检查,并且像散(非圆形)吞环( 图3C)应与目标象散予以纠正。吞戒指应该是可见至少到所需的分辨率。
使用此协议获得的数据集cryoEM可以直接通过SPA,以产生一个三维重建处理。即使有一个理想的样品中,3D重建的质量将取决于性能和TEM设备的规格,并在图像处理。随着不断改进,在这两个方面,并特别提到了最近开发的直接电子探测器的可能性,以获得三维重建在原子分辨率更一致更接近比以往任何时候。
The authors have nothing to disclose.
We thank the kind donations of AAV5 sample by Mavis Agbandje-McKenna and Antonette Bennett, and of TMV sample by Ruben Diaz. This work is supported by American Heart Association grant 14GRNT19660003 and VCU startup funds to MS.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Ethane | Airgas | 371745 | 99.99% purity very important, impurities can lead to high-contrast contaminants on the grid. CAUTION: flammable |
Liquid nitrogen | Airgas | 27135 | 99% purity. CAUTION: handling liquid nitrogen in a cold room poses a serious asphyxia hazard since nitrogen displaces oxygen without any warning signs. |
Dumont no. 5 Antimagnetic tweezers | Ted Pella | 5326 | |
Mica sheets, 1 x 4 cm | Ted Pella | 54 | |
Graphite rods, presharpened size 1/8” dia x 2 ¼” long tip 0.039” dia neck type | Electron Microscopy Sciences | 70220-45 | |
350 ml cryo-dewars | Pope | 8600 | |
Cu 400 mesh holey grids Quantifoil | Quantifoil | Q10525 | |
Cu 400 mesh holey grids C-Flat | Protochips | CF-1.2/1.3-4C | |
Glow discharge device | Electron Microscopy Sciences | Model E7620 | |
Turbo pumping station | Gatan | Model 655 | |
Carbon evaporator | Denton Vaccum | Model 502B | |
Freeze plunger | FEI | Vitrobot Mark IV | |
Image Processing software CTFFIND3/CTFTILT | http://grigoriefflab.janelia.org/ctf | ||
Image Processing software EMAN | http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2 | ||
Image Processing software Spider | http://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html | ||
Image Processing software Freealign | http://grigoriefflab.janelia.org/frealign | ||
3D visualization software Chimera | http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ | ||
Native Keyhole Limpet Hemocyanin | Biosyn |