This paper describes the cryo-electron microscopy methodology, which is used to obtain high quality microscopic images of macromolecules in their near-native state. The method yields images suitable for further computerized processing using the single particle approach, devised to generate the 3D reconstruction of a macromolecule.
Cryo-electron microscopy (cryoEM) entails flash-freezing a thin layer of sample on a support, and then visualizing the sample in its frozen hydrated state by transmission electron microscopy (TEM). This can be achieved with very low quantity of protein and in the buffer of choice, without the use of any stain, which is very useful to determine structure-function correlations of macromolecules. When combined with single-particle image processing, the technique has found widespread usefulness for 3D structural determination of purified macromolecules.
The protocol presented here explains how to perform cryoEM and examines the causes of most commonly encountered problems for rational troubleshooting; following all these steps should lead to acquisition of high quality cryoEM images. The technique requires access to the electron microscope instrument and to a vitrification device. Knowledge of the 3D reconstruction concepts and software is also needed for computerized image processing. Importantly, high quality results depend on finding the right purification conditions leading to a uniform population of structurally intact macromolecules.
The ability of cryoEM to visualize macromolecules combined with the versatility of single particle image processing has proven very successful for structural determination of large proteins and macromolecular machines in their near-native state, identification of their multiple components by 3D difference mapping, and creation of pseudo-atomic structures by docking of x-ray structures. The relentless development of cryoEM instrumentation and image processing techniques for the last 30 years has resulted in the possibility to generate de novo 3D reconstructions at atomic resolution level.
Het doel van cryoEM is om elektronen microscopische beelden van macromoleculen te verkrijgen in hun moedertaal gehydrateerde toestand. Op grond van het inbedden van het macromolecuul in verglaasde water, kan een bevroren gehydrateerde monster rechtstreeks worden ingevoerd en gevisualiseerd in de TEM-instrument. Verglazing, bereikt door flits bevriezen (10.000 o C / sec), bevriest het monster zonder water kristallisatie en zorgt ervoor dat de moleculaire herschikkingen tijdens bevriezing te verwaarlozen is. De overmaat elektron verstrooiing van het monster ten opzichte van de omringende buffer heeft een kleine maar voldoende contrast om het macromolecuul te zien in afwezigheid van vlek 1. Geautomatiseerde beeldverwerking kan vervolgens worden gebruikt om het macromolecuul 3D structuur opnieuw. Grote macromoleculen in de ~ 500 kDa- meerdere MDa gamma zijn ideaal monsters voor cryoEM (goed voor meer dan 80% van de Electron Microscopy Data Bank (EMDB) inschrijvingen); Deze omvatten eiwitten, eiwitcomplexen, eiwit-nucleïnezuur complexes en membraaneiwitten ingebed in een bilaag. Deze macromoleculen zijn minder waarschijnlijk te kristalliseren (minder dan 2% instroom in het VOB database) Dit is echter wel zo dat kleinere stukken opgelost door x-ray kristallografie of NMR worden gedokt in de 3D omhulling door cryoEM. Anderzijds, enkele grootste structuren opgelost cryoEM identificeerbaar zijn binnen het volledige cel door dunne-sectie TEM 2. Zo cryoEM effectief overbrugt de grootte en resolutie kloof tussen subcellulaire en atomaire structuren.
CryoEM weerspiegelt beter natieve structuur het macromolecuul is dan de meer klassieke methode van negatieve kleuring (NS), waarbij het macromolecuul is uitgedroogd en omgeven door een laag van heavy metal vlek waarbij een sterk contrast 'negatieve' imago 3 de regio vlek uitsluiting creëert. In beide gevallen levert de elektronenbundel 2D projectiebeelden van de macromoleculen, genaamd deeltjes, waarbij de sHAPE afhankelijk van de oriëntatie van het macromolecuul ten opzichte van de elektronenbundel. Veel deeltjes, tenminste ~ 1000 en zonder bovengrens kan worden geanalyseerd op de computer "deeltje analyse" (SPA) software om de signaal-ruisverhouding (SNR) hoewel middeling vergroten en ruimtelijke oriëntatie parameters van het deeltje vinden die nodig zijn om het macromolecuul's 3D-structuur door terug projectie 4-7 recreëren. NS, met hogere SNR wordt gebruikt om voorafgaande monster karakterisering en een de novo 3D reconstructie te genereren; zijn resolutie zelden meer dan 20 A, die wordt opgelegd door de uitdroging en de grootte van het zware metaal graan. In het algemeen, voor cryoEM 3D structurele vastberadenheid, een lage resolutie 3D-reconstructie wordt eerst verkregen van NS en dan cryoEM wordt gebruikt voor het verfijnen van deze lage resolutie aanvankelijke plan om verder te studeren het macromolecuul in zijn inheemse gehydrateerde toestand, om de interne structuur te zien, en om de resolutie te verhogen. Geente dat als de NS-model werd vervormd (de meest voorkomende voorbeeld is het afvlakken als gevolg van uitdroging 8) en de cryoEM deeltjes hadden lage SNR, daarna de vervorming kon dragen in de cryoEM model (het model-vooringenomenheid artefact, die gebruikelijk is in lage SNR datasets 9). Structurele vervorming zou resulteren in een mismatch tussen de NS en cryoEM ruwe deeltjes en tussen de ruwe cryoEM deeltjes en bijbehorende projecties van het 3D-model loodrecht op de afvlakking richting. Model vertekening kunnen oplossen door zich als de 3D-model ondergaat opeenvolgende verfijning cycli. Indien deze niet voorkomen, die zou worden gedetecteerd als een gebrek aan overeenstemming tussen ruwe cryoEM deeltjes en corresponderende projecties van het 3D-model, dan een de novo model wordt opgebouwd uit de cryoEM gegevens. Een goede aanpak kan zijn om de hoekige reconstructie algoritme 10, waarin verscheidene mogelijke 3D-volumes kunnen leveren gebruiken, en gebruik vervolgens de NS 3D-model om de best mogelijke cryoEM model te selecterendie verder worden verfijnd 11. Een nog betere strategie is om de SNR van de cryoEM dataset te verhogen (zie specifieke paragraaf in de discussie).
De biochemische kwaliteit van het gezuiverde macromolecuul heeft een uiterst invloed op het eindresultaat. Het macromolecuul, gezuiverd uit weefsel of expressie in heterologe systemen moet een hoge graad van zuiverheid hebben en structureel intact. Het moet niet te vormen aggregaten en mag ook niet van elkaar te scheiden. Om een bepaalde conformatie te definiëren, moet de voorbereiding voorwaarden een uniforme conformationele toestand te bevorderen. Om complexen studie, het optimaal dat de Kd in het nM, anders fixeermiddelen zijn met succes gebruikt om lagere affiniteit interacties 12,13 stabiliseren.
Onverwerkte cryoEM beelden opleveren waardevolle informatie over de afmetingen, grote lijnen, aggregatietoestand / multimerisatie-, homogeniteit en interne structuur van de macromolecule. Niettemin is de potentiaal van de techniek enorm verbeterd met beeldverwerking. Een 3D-structuur onthult algemene architectuur van het macromolecuul, 3D plaats van liganden en subeenheden, conformationele veranderingen, en maakt docking van atoomstructuren bepaald door x-ray kristallografie of NMR. De hoeveelheid gegevens van een 3D reconstructie toe stapsgewijs als de resolutie verhoogd: algemeen 15-20 resolutie is eenduidige docking atomaire structuren op 9-10 Å alfa-helices zichtbaar staafjes, 5 A is het mogelijk te onderscheiden beta sheets en een resolutie van 3,5 A en beter is het mogelijk om een atomaire model 14 bouwen.
De mogelijkheid om informatieve afbeeldingen en een 3D reconstructie met SPA van betrekkelijk kleine hoeveelheden van het monster te cryoEM een aantrekkelijke techniek te verkrijgen, zoals 3-5 ul van ten minste 0,05 mg / ml is voldoende om een TEM rooster bereiden. De minimale instrumentale eisenvoor cryoEM zijn een zelfgemaakte of commerciële cryo-zuiger, een elektronenmicroscoop met ultra hoog vacuüm, beeldopname media en een lage dosis kit, een cryo-houder met haar gemaal, een gloedlossing apparaat, en een verdamper. Niet-essentiële maar verder gewenst functies op de TEM zijn CCD-camera (aanwezig in alle moderne TEM) of een directe elektron detector, veldemissie pistool (FEG), energie filtering en high throughput dataverzameling software. Deze software in principe maakt het verzamelen tienduizenden deeltjes in één cryoEM zitting 15, maar het verhoogde opslagbehoeften en daarop toezicht nabewerking tijd moeten in aanmerking worden genomen. FEG gecombineerd met contrast transfer functie (CTF) correctie ten grondslag ligt aan de meeste 3D-reconstructies die resolutie voldoende om alfahelices visualiseren bereikt. Op dat moment, het niveau van de resolutie is ook sample-afhankelijk: het bereiken van 10 Å resolutie is minder vaak voor membraaneiwitten terwijl alshoge orde van symmetrie aanwezig is dan atomaire resolutie is meer haalbaar. De recente ontwikkeling van elektronenbundel detectoren atomaire resolutie ingeschakeld zelfs voor macromoleculen met lage (4x) of geen symmetrie, waarbij de kwaliteit van de cryoEM elektronendichtheid kaarten past de afgeleide van x-ray diffractie data 16,17.
Praktische voorbeelden ter illustratie van de mogelijkheden van de techniek worden hier gegeven voor vier belangrijke soorten macromoleculen waar cryoEM heeft een voortdurende chief rol in hun structurele vastberadenheid. (I) Met hun icosahedrale symmetrie die de dataset met 60-voudige en hun grote omvang die trouw en reproduceerbare uitlijning maakt verhoogt, hebben de structuren van verschillende icosahedrale virussen zijn opgelost tot bijna-atomaire resolutie door cryoEM gevolgd door SPA 18. We tonen een voorbeeld van een klasse van icosahedral virussen, het adeno-geassocieerde virussen (AAV), die bijna atomaire structuren cryoEM en cryoEM / x-ray hybrid methoden bestaan 19,20. (Ii) macromoleculen met helixstructuur zijn microtubules, filamenten en virussen. De herhalende eenheden langs de spiraalvormige as kan worden geanalyseerd door een complexere versie van SPA aangepast aan de spiraalvormige geometrie 21. In het voorbeeld tonen wij tabakmozaïekvirus (TMV), een RNA virus dat werd opgelost tot atomaire resolutie van cryoEM 22. (Iii) Large oplosbare eiwitten zijn uitvoerig bestudeerd. Onder deze, macromoleculen vormen symmetrische multimère cilinders vormen een terugkerend architectuur vaak opgelost op subnanometer resolutie 23,24. Hier laten we beelden van KLH, een ongewervelde zuurstofdrager, waar een hybride moleculair model is ontstaan uit cryoEM / x-ray kristallografie hybride methoden 25. (Iv) membraan eiwitten zijn een belangrijke klasse van eiwitten; zij vormen ongeveer 1/3 van de eiwitten gecodeerd door het humane genoom maar zijn moeilijk structureel karakteriseren vanwege complexiteit van de transmembrane domein stabilisatie 26, die minder dan 1,5% van de structuren opgelost door structurele techniek gecombineerd. De rol van cryoEM en 3D wederopbouw na structuurbepaling wordt toegelicht met de ryanodine receptor (RyR), een grote eukaryote intracellulair Ca2 + kanaal belang spieren en hersenen signalering. De hoogste resolutie cryoEM structuren tot nu toe, met 10 een resolutie, onthullen secundaire structuur 27.
TEM gevolgd door SPA heeft vele macromoleculaire 3D structuren bijgedragen bijna 2000 vermeldingen in de EMDB medio 2014 algemeen voor een bepaald macromolecuul, wordt een lage-resolutie 3D structuur eerst bepaald NS gegevens, eventueel gevolgd door een hoger- resolutie cryoEM 3D-structuur. Het hoge contrast van de moleculaire grenzen door NS, waarbij de eerste 3D reconstructie vergemakkelijkt wordt later verfijnd door cryoEM met zijn vermogen om de interne structuur van het macromolecuul kaart in de volledig gehydrateerde toestand, en de mogelijkheid om veel hogere resolutie te bereiken. Een ander voordeel van cryoEM is de eliminatie van uitdroging stress die kan leiden tot ineenstorting van het macromolecuul. Daarnaast bestaat de mogelijkheid om de koolstofdrager, hetgeen mogelijk zuiging effecten elimineert en toont de conformatie dat het macromolecuul aanneemt in oplossing laten. Cryo-negatieve kleuring, een combinatie van cryoEM en NS, levert hoog contrast in een volledig hydnominale exemplaar en kan ook leiden tot een 3D-reconstructie met behulp van SPA, maar het is minder vaak gebruikt, met minder dan 10 EMDB inzendingen, voor een deel omdat de vlek zelf kunnen interfereren met de integriteit van het macromolecuul 31. Twee andere TEM technieken bevorderlijk zijn voor 3D-reconstructie zijn 2D elektron kristallografie en elektronenmicroscopie tomografie. 2D elektron kristallografie is een vlak of buisvormig kristal; het kristal van elektronen diffractie wordt gebruikt voor 3D-reconstructie kan leiden tot atomaire resolutie 32. In tomografie verglaasd of traditioneel vaste monsters wordt een macromolecuul of subcellulaire component geroteerd in de TEM voor daaropvolgende tomografische reconstructie 33, met als voordeel dat unieke objecten te reconstrueren; maar op dit moment heeft deze techniek een resolutiegrens van 40 tot 20 A 34,35. Onder al deze moleculaire TEM technieken, heeft SPA van NS en cryoEM gegevens de meest geweestgebruikt. Het protocol hier afgebeelde is gewijd aan het verkrijgen van cryoEM beelden geschikt voor SPA-analyse; De meeste gebruikers van het protocol ook voor cryoEM 2D kristallen en tomografische monsters.
Een succesvolle cryoEM sessie hangt af van het gecombineerde succes van veel kritische stappen; belangrijke aspecten in gedachten te houden, verklaring van de meest cryoEM artefacten en hoe te voorkomen dat ze worden beschreven in de volgende paragrafen. Dit deel beschrijft ook richtlijnen verzamelen van gegevens om hoge kwaliteit 3D-reconstructies met behulp van de SPA-methode te verkrijgen.
Vermijd overgang naar ijs kristallijn. Een centraal aspect is dat het monster nodig om te verblijven in glasvocht staat vanaf het moment van cryo kelderen hele TEM observatie. Dus na dompelen van het monster in vloeibare ethaan alle volgende stappen worden uitgevoerd bij vloeibare stikstof (-196 ° C) of vloeibaar helium (-269 ° C) temperaturen. Verwarmen tot boven de -135 ° C transformeert glasvocht water inkristallijn water; dan macromoleculaire herschikkingen kunnen plaatsvinden en water kristallen domineren het beeld (figuur 3A); het monster moet worden weggegooid. Accidental monster warm-up zou kunnen gebeuren als cryo-kelderen, de overdracht van de bevroren rooster tussen containers (zelfs als beschermd door een gridbox), en / of cryo houder inbrengen in de TEM te langzaam zijn, of als de afhandeling pincet waren onvoldoende pre- gekoeld. Aanzienlijke onderdruk verslechtering van de TEM bij cryo-overdracht (de koude steekproef vallen warmere binnenkomende lucht) kan ook opwarmen het monster. Tenslotte over-bestraling van het monster kan ook leiden tot de overgang naar ijs kristallijn.
Minimaliseren ijs besmetting. Gezien de kleine steekproef volume (3-5 pi) toegepast op de TEM rooster, kon verdampen buffer componenten (zout, detergenten) te concentreren en dus van invloed op macromoleculaire integriteit, waaronder verlies van multimere staat. Een hoge relatieve vochtigheid (RV) micro-omgeving of kamer te omzeilens dit probleem. Als alternatief cryo-kelderen kan gedaan worden in een voldoende geventileerde milieu koude kamer. Na cryo storten RH moet zo laag mogelijk zijn om ijs verontreiniging of condensatie van luchtvochtigheid op de cryo-grid voorkomen als de cryo-grid zelf werkt als een koude val. Verontreiniging ijs bestaat uit deeltjes met een hoog contrast en geen onderbouw met een grootte variërend tussen ~ 5 nm en enkele microns die interfereren met of zelfs geheel te blokkeren het beeld. Vermijd tocht, praten / ademhaling naar de cryo-grid tijdens lucht overdracht en het verminderen van relatieve luchtvochtigheid. Open containers met vloeibare stikstof met gecondenseerde water (zichtbaar als witte zwevende deeltjes) moeten ook worden verwijderd.
Maximaliseren macromoleculaire oriëntaties / uitzicht. Voor monster-ondersteuning, een keuze worden gemaakt tussen echte holey rasters en dunne carbon dan holey roosters. Dit is afhankelijk van (i) de manier waarop het monster zich verspreidt over koolstof film versus de koolstof gaten, (ii) beschikbaar monster concentration, zoals kale gaten kan een concentratie 100x hoger dan koolstof ook voor soortgelijke deeltjesdichtheid op de afbeelding vereist (van ~ 0,02-2 uM), en (iii) hoe willekeurig de verdeling van macromolecuul oriëntaties. Merk op dat gloedlossing, waarvan de koolstof hydrofiele maakt, zal een belangrijk effect op alle drie aspecten hebben en dat dit monster-afhankelijk zal zijn. Wat betreft de oriëntatie van het macromolecuul, terwijl een terugkerende weergave wenselijk de initiële structuurbepaling door willekeurige conische reconstructie, willekeur van macromoleculaire standpunten is wenselijk wanneer het verfijnen van de 3D reconstructie hogere resoluties. In ons voorbeeld, RYR1 interageert met de koolstof met een favoriete 'viervoudig' view (figuur 2D) en vereist holey roosters voor willekeur van oriëntaties en hogere resolutie 36.
Maximaliseren SNR. De beste strategie om SNR te verhogen is om de achtergrond bronnen van ruis te verminderen. Overmatige consumptiedikte en (indien aanwezig) koolstof filmdikte dan nodig te ondersteunen en verankeren het eiwit extra ruis toe. Zo moet ijsdikte tot het noodzakelijke minimum worden beperkt door het beheersen deppen tijd, druk, RH, en filterpapier kwaliteit. Voor carbon ondersteuning wordt een dunne (~ 5 nm) carbon folie gelaagd over de dikkere essen carbon film: de dikke essen carbon biedt mechanische weerstand terwijl de sample wordt afgebeeld op de dunne-carbon bedekt gat. Anderzijds, op dat extreem dun ijs en / of koolstof kan leiden tot een gemakkelijk gebroken steun die kan uitmonden in een web (Figuur 3D). Om SNR maximaliseren, moet onnodige buffercomponenten vermijden. Voor membraaneiwitten, het wasmiddel neemt een belangrijke tol op contrast (zie figuur 2D, rechter paneel). Bovendien doordat oppervlaktespanning wijzigt het detergens de wijze waarop het monster zich op de drager. Sommige membraaneiwitten vereisen de aanwezigheid van lipide naast detergent, die verder vermindert het contrast. Om dit het monster overwonnen kan worden verdund in een buffer met lagere detergensconcentratie en zonder lipide net voor cryo-kelderen 37. Nieuwe alternatieve detergentia 16 en het gebruik van nanodisks 38 het transmembraandomein component stabiliseren blijken succesvolle benaderingswijzen voor beeldvorming membraaneiwitten door cryoEM zijn.
Streven naar hoge kwaliteit foto's en voor te bereiden op de CTF correctie. Vitrified exemplaren vereisen een hoge defocuswaarden om voldoende image (fase) te genereren contrast waar de CTF, de functie die intensiteit betrekking heeft op de frequentie, heeft verschillende nul overgangen, op welk punt is er geen informatie. Terwijl CTF correctie niet noodzakelijk voor lage resolutie 3D reconstructie, bij het streven naar een hogere resolutie, een juiste weergave van het 3D-object herstellen afbeeldingen met verschillende defoci kunnen worden opgehaald zodat computationele CTF correctie kan worden uitgevoerd.CTF vastberadenheid en correctie is opgenomen in de grote SPA softwarepakketten 4-7; details zijn elders 39 te vinden. Voor een optimale CTF correctie, maken gebruik van verschillende defoci. Een goede strategie is om te wisselen tussen de 3-4 defocuswaarden. De waarden zijn afhankelijk van de grootte van het macromolecuul (grotere afmetingen vereisen minder defocus), ijs / carbon dikte (dunnere monster minder defocus vereist) en de spanning (lagere spanning vereist minder defocus). Voor 200 kV, een goed uitgangspunt bereik van waarden is 2,5, 3, 3,5 en 4 micrometer defocus. De CTF manifesteert als afwisselende ringen van hoge en lage intensiteit (Thon ringen 40) in de reciproke ruimte representatie, het vermogensspectrum. Het vermogensspectrum Display zal het potentieel voor resolutie te onthullen; de frequentie van de breedste zichtbare Thon ring het dichtst a priori schatting van de haalbare resolutie. Het vermogensspectrum moet periodiek worden gecontroleerd, en astigmatische (niet-cirkelvormige) Thon ringen (Figuur 3C) moet worden gecorrigeerd met als doel stigmator. Thon ringen moet zichtbaar zijn in ieder geval tot de gewenste resolutie.
Een cryoEM dataset met dit protocol kan direct worden verwerkt door SPA om een 3D reconstructie te genereren. Zelfs met een ideaal monster wordt de kwaliteit van de 3D reconstructie afhankelijk van de prestaties en specificaties van de TEM apparatuur en de beeldverwerking. Met de voortdurende verbeteringen op deze beide fronten, en met een speciale vermelding voor de recent ontwikkelde directe elektron detectoren, de mogelijkheid om 3D-reconstructies te verkrijgen op atomaire resolutie constanter is dichterbij dan het ooit is geweest.
The authors have nothing to disclose.
We thank the kind donations of AAV5 sample by Mavis Agbandje-McKenna and Antonette Bennett, and of TMV sample by Ruben Diaz. This work is supported by American Heart Association grant 14GRNT19660003 and VCU startup funds to MS.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Ethane | Airgas | 371745 | 99.99% purity very important, impurities can lead to high-contrast contaminants on the grid. CAUTION: flammable |
Liquid nitrogen | Airgas | 27135 | 99% purity. CAUTION: handling liquid nitrogen in a cold room poses a serious asphyxia hazard since nitrogen displaces oxygen without any warning signs. |
Dumont no. 5 Antimagnetic tweezers | Ted Pella | 5326 | |
Mica sheets, 1 x 4 cm | Ted Pella | 54 | |
Graphite rods, presharpened size 1/8” dia x 2 ¼” long tip 0.039” dia neck type | Electron Microscopy Sciences | 70220-45 | |
350 ml cryo-dewars | Pope | 8600 | |
Cu 400 mesh holey grids Quantifoil | Quantifoil | Q10525 | |
Cu 400 mesh holey grids C-Flat | Protochips | CF-1.2/1.3-4C | |
Glow discharge device | Electron Microscopy Sciences | Model E7620 | |
Turbo pumping station | Gatan | Model 655 | |
Carbon evaporator | Denton Vaccum | Model 502B | |
Freeze plunger | FEI | Vitrobot Mark IV | |
Image Processing software CTFFIND3/CTFTILT | http://grigoriefflab.janelia.org/ctf | ||
Image Processing software EMAN | http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2 | ||
Image Processing software Spider | http://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html | ||
Image Processing software Freealign | http://grigoriefflab.janelia.org/frealign | ||
3D visualization software Chimera | http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ | ||
Native Keyhole Limpet Hemocyanin | Biosyn |