Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

חוקר את החלבונים כמו פריון-הפצת ורעילות של שימוש במטזואניים דגם אורגניזם Published: January 8, 2015 doi: 10.3791/52321
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Molecular Biosciences, Rice Institute for Biomedical Research, Northwestern University

Introduction

מחלות רבות ניווניות, כוללים מחלת אלצהיימר, מחלת פרקינסון (PD) (AD), טרשת לרוחב amyotrophic (ALS), וencephalopathies transmissible spongiform (TSEs), המשויכות חלבוני צבירה מועדת ומכאן ידועות קולקטיבי חלבון misfolding הפרעות (PMDs ). TSEs או מחלות פריון מהוות מעמד ייחודי של PMDs בכך שהם יכולים להיות זיהומיות, באדם ובעלי החיים 1. ברמה המולקולרית, פריונים לשכפל על ידי גיוס והמרת PRP monomeric α-helix-עשיר בקידוד המארח הסלולרי (PRP C) לקונפורמציה PRP Sc β גיליון העשיר פתולוגי 2,3. אגרגטים חלבון עצמי הפצת גם זוהו בפטריות, אשר חולקות מאפיינים חשובים עם פריונים יונקים 4,5. בנוסף, פריונים יונקים מסוגלים לנוע מתא אל תא ולהדביק תאים נאיביים 6,7.

בעוד oth PMDsאה מ TSEs אינו מדבק, הם חולקים עיקרון פתוגניים משותף עם מחלות פריון 8,9. למרות שהחלבונים הקשורים לכל אחד מPMDs אינם קשורים במבנה או פונקציה, הם כל אגרגטים הטופס באמצעות תהליך התגבשות כמו שנקרא גרעיניים או זרע פילמור; יתר על כן זרעים חלבוניים לגדול על ידי גיוס isoforms המסיס 2,10,11. היעילות להפיץ עצמי משתנה in vivo, בהתאם למאפיינים הפנימיים של החלבון, אשר יחד עם גורמים סלולריים נוספים כגון מלווים מולקולריים סופו של דבר יקבעו את התעריפים של התגרענות כוללת, זריעה, פיצול והפצת 12-15. מכאן, שחייב להתקיים איזון עדין בין הגורמים הללו, המאפשר התפשטות יעילה של צבירת חלבון. זה עשוי גם להסביר מדוע רק חלק אגרגטים amyloidogenic נמל המאפיינים של פריון, ולכן לא כל PMDs הם מדבקים. נראים פריונים לייצג o 'מלמעלה מבצעים'ספקטרום רחב של fa אגרגטים חלבוניים המשכפלים את עוצמה, מה שהופך אותם כלי רב עוצמה כדי ללמוד PMDs 8,13.

מעניין לגלות שההרעלה כרוכה באגרגטים הקשורים למחלות לעתים קרובות יש מרכיב אוטונומי של תאים הלא 16,17. משמעות דבר היא כי הם משפיעים על תאים שכנים, שאינו מבטאים את הגן המתאים, בניגוד להשפעה אוטונומית תא בהחלט, מה שמרמז שרק תאים המבטאים את גן התערוכה פנוטיפ הספציפי. הדבר בא לידי הביטוי משכנע על ידי ביטוי רקמות ספציפיות או להפיל של החלבונים המתאימים במספר רב של דגמים של מחלות ניווניות 18-26. מנגנונים שונים הוצעו כבסיס לרעילות זו אינה תא אוטונומית בPMDs, כוללים אספקת חומרי מזון פחת, חוסר איזון באיתות עצבית, הפעלת יתר רעילה גלוטמט, וneuroinflammation 16,27,28. בנוסף, תנועה כמו פריון-אגרגטים צמודי מחלה בין תאי might לתרום להיבט זה 29,30. ראיות מצביעות על כך שהגדלת תכלילים חלבון אחרים מאשר פריונים יכולים לשדר מתא אל תא, שעשוי להסביר את מאפיין הפצה של פתולוגיה שנצפתה בPMDs רב 30-36. עם זאת, זה עדיין לא נקבע אם יש קשר סיבתי ברור בין תנועה בין תאית של חלבוני מחלה וההשפעה הרעילה על תאי שכנים. לכן, הבנה טובה יותר של המסלולים הסלולריים העומדים בבסיס שידור ורעילות אוטונומית שאינו תא תא אל התא היא הכרחית וחיונית לפיתוח תרופות חדשניות. עם זאת, היבטים רבים של פריון כמו גורמי הפצה וסלולריים המשפיעים על העברת תא אל התא של חלבוני misfolded בmetazoans אינם מובנה היטב, בפרט ברמת האורגניזם.

יש נמטודות elegans Caenorhabditis מספר יתרונות המספקים פוטנציאל ל לגלות היבטים חדשים של spreadi כמו פריון-ng בmetazoans 17. זה שקוף, המאפשר למעקב in vivo חלבונים של מתויגים fluorescently באורגניזם החי. יתר על כן, תהליכים תאיים ופיסיולוגיים רבים במחלה נשמרים מתולעים לאדם, ו- C. elegans הוא גם נוח למגוון רחב של מניפולציות גנטיות וניתוחים מולקולריים וביוכימיים 37-39. בדיוק 959 תאים סומטיים מרכיבים את אנדרוגינוס המבוגר עם תכנית גוף פשוט כי עדיין יש כמה סוגי רקמות שונים, כולל שרירים, תאי עצב ומעי.

לבסס מודל פריון חדש בג elegans, בחרנו להביע אקסוגני גלוטמין / -rich פריון NM תחום של חלבון פריון שמרי cytosolic Sup35 asparagine המאופיין היטב (Q / N), שכן אין חלבוני פריון אנדוגני ידועים בתולעים 4,40. פריונים שמרים כבר לא יסולא בפז בהבהרת מנגנונים בסיסיים של שכפול פריון 41-44. יתר על כן, NM הוא האשוחחלבון st cytosolic כמו פריון-שהוכח לשחזר את מחזור החיים המלא של פריון בתרבית תאי יונקים 45,46. כמו כן, כאשר באו לידי ביטוי בג elegans, תחום פריון Sup35 אימץ להפליא לדרישות השונות לריבוי בתאים מטזואניים בהשוואה לתאי שמרים ותכונות עיקריות הציגו ביולוגיה פריון צבירת 40. NM הייתה קשורה עם פנוטיפ רעיל עמוק, כוללים השיבוש של יושרה ומראה של המיטוכונדריה שלפוחית ​​שונות הקשורים autophagy ברמה התאית, כמו גם מעצר עוברי וזחל, עיכוב התפתחותי, והפרעה נרחבת של סביבת קיפול חלבונים ברמת האורגניזם. באופן מפתיע, תחום הפריון מציג רעילות אוטונומית תא תא אוטונומי ובלתי, המשפיע על רקמות השכנות, שבי transgene לא באו לידי ביטוי. יתר על כן, תחבורת לפוחי של תחום הפריון בתוך ובין התאים היא פיקוח בזמן אמת <em> In vivo 40.

כאן אנו מתארים כיצד לבחון הפצה כמו פריון-בג elegans. אנו נסביר כיצד לפקח על תחבורת התוך ובין תאית של שלפוחית ​​המכילה תחום הפריון באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הזמן לשגות. אנו להדגיש את השימוש בחיישני קיפול רקמות ספציפיות וכל מקום בגוף הביעו כתבי לחץ כדי לבדוק את השפעות תא אוטונומיות ובלתי תא אוטונומיות על כושר סלולארי. לבסוף, נתאר את ההליך של מסך הגנום ביצע לאחרונה רחב התערבות RNA (RNAi) לזהות מכפילי חדשים של רעילות עקב פריון. בשילוב, שיטות אלה יכולים לעזור ללהפריד מסלולים גנטיים מעורבים בתנועה בין תאית של חלבונים והרעילות האוטונומית מסוג התאים לא.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ניטור Transcellular הפצת של חלבונים כמו פריון-ידי in vivo זמן לשגות הדמיה

הערה: לגדול ג elegans wild-type (WT) (N2) וקווים מהונדסים על פי שיטות סטנדרטיים ולשלוט בזהירות את טמפרטורת טיפוח 47.

  1. צור קווים מהונדסים של ג elegans המבטא את החלבון כמו פריון-, מתויג עם חלבון monomeric אדום ניאון (mRFP). צפה בסרטון זה שמדגים כיצד להשתמש microinjection 48. לפרטים נוספים ושיטות המתארים כיצד לשלב קווי extrachromosomal אלה, ראו 49.
  2. הכן אוכלוסיות מסונכרנות על ידי הטלת ביצים או הלבנת פי שיטות סטנדרטי 50.
    1. סנכרון על ידי הטלת ביצים
      1. העברה 10 - 20 מבוגרים הרה להולדת על צלחת ולתת להם להטיל ביצים ל1-2 שעות. הסר מבוגרים מן הצלחת ולתת את הצאצאים לגדול עד הגיל הרצוי.
      2. <li> סנכרון על ידי הלבנה
      1. לאסוף אוכלוסייה מסונכרנת של מבוגרים הרה להולדת ולהלבין אותם בפתרון בסיסי היפוכלוריט (250 מ"מ NaOH ו -1: 4 v דילול (/ v) של אקונומיקה המסחרית בH 2 O). לשטוף את הביצים פעמיים (218 XG ל1 דק ') עם חיץ M9 47 (21 mMNa 2 HPO 4 · 7H 2 O, 22 mMKH 2 PO 4, 86 mMNaCl, 1 mMMgSO 4 · 7H 2 O, להוסיף DH 2 O עד 1 L).
      2. לאפשר להם לבקוע במאגר M9 עם O תסיסה עדין / N 20 ° C. פיתוח תולעת יעצור בשלב L1 בהיעדר מקור מזון, עוזב אוכלוסייה מסונכרנת. העבר את L1s על מדיה צלחות נמטודות טרי צמיחה (NGM) זורעים עם OP50 E. חיידקים וcoli לתת הצאצאים לפתח עד הגיל הרצוי 47.
  3. הכן רפידות 2% agarose (בH 2 O) בשקופית מיקרוסקופ כפי שתואר 50.
    1. הכן שני מילשקופיות croscope עם קלטת תיוג ממוקמת מעל כל אורכם כדי לשמש כמפרידים. מקום שקופית מיקרוסקופ שלישי ביניהם.
    2. לפזר agarose 2% בH 2 O וטיפה אחת פיפטה לשקופית נקייה.
    3. מקום שקופית רביעית בניצב לשלוש שקופיות אחרות על גבי הירידה אגר. לחץ בעדינות על אותו כדי לשטח את הכרית לאותו עובי כמו קלטת התיוג.
    4. תן לו להתייבש דקות 1 לפני הסרת מפרידי ומשייכתו בעדינות את השקופיות לגזרים. הכרית אגר תדבק אחד מהם.
  4. פיפטה ~ ההרדמה μl 10 (2 levamisole מ"מ במאגר M9) לכרית וההעברה ~ 10 בעלי חיים באמצעות בחירת חוט פלטינה. לכסות עם תלוש כיסוי (~ 22 x 22 מ"מ) ולקחת את התמונות בתוך שעה 1.
  5. לחלופין, לרכוש סרטים על פני תקופה ארוכה של זמן או לצמצם עוד יותר את האפשרות של כל תנועה של בעלי החיים, להשתמש בשילוב של הרדמה וחרוז קיבוע 51.
    1. הכן אגא 10%עלה רפידות (במאגר M9) כמתואר 51 ולהוסיף תולעים לפתרון סטנדרטים גודל nanosphere 3 μl (חרוזי פוליסטירן, 100 ננומטר) בתוספת 3 הרדמה μl (4 levamisole מ"מ במאגר M9). לכסות בעדינות עם להחליק את המכסה. כדי להימנע מהתייבשות, לאטום את תלוש לכסות עם VALAP (תערובת של כמויות שווה של זלין, לנולין, ושעוות פרפין).
  6. תמונה משותקת תולעים באמצעות מיקרוסקופ confocal.
    הערה: תוצאות שהושגו באמצעות דיסק מסתובב AF Confocal מיקרוסקופ מצויד במצלמת EM-CCD ותוכנה מיקרוסקופית אוטומציה וניתוח תמונה כגון MetaMorph ומתארות את הפרטים שלהלן, אך יכולות לשמש גם מערכות הדמיה confocal דומה אחרות.
    1. השתמש במטרת שמן 63X או 100X / 1.4NA ולמקם את שקופית מיקרוסקופ המכילה תולעים לתוך מחזיק שקופיות מיקרוסקופ.
    2. פתח את התוכנה. התאם כוח הלייזר ומסננים להדמית mRFP. השתמש בליזר 561 ננומטר ב 10% מסנן> 600 ננומטר כוח והפליטה.
    3. תחת הלשונית "שמירה" לבחור או ליצור את תיקיית הספרייה שבה צריכים להיות שמרו את הקבצים. להקצות שם לקובץ.
    4. תחת הלשונית "אורך הגל", בחר התאורה המתאימה ולהתאים את החשיפה ורווח. השתמש "YokoQuad אדום" (או הגדרת תאורה שווה ערך להדמית mRFP) עם חשיפה בין 100 ל 300 אלפיות שניים ורווח מצלמה בין 100 ל -300, תלוי במדגם הבודד (הוערך על ידי שימוש בתמונה החי).
    5. תחת הלשונית "ההילוך האיטי" בחר "מספר נקודות זמן" = 301, "משך" = 5 דקות ו" זמן / מרווח "sec = 1.
    6. תחת כתב העת "כתבי עת" הכרטיסייה בחר: "HOLD AFC SET Z" ו- "AFC חזור לHOLD Z", סוג: &# 8220; מיוחד "(פעמיים), נקודה ראשונית:" התחל זמן נקודה "ו-" End of נקודת זמן ". אפשרות פוקוס אוטומטי זה חשובה לתדמיתו הסעיף על פני תקופה ארוכה של זמן.
    7. כאשר ההתקנה נעשית, לחץ על "רכישה". הווידאו בהילוך האיטי הוא צפת כקבצי TIFF נפרדים.
    8. לפתוח את כל קבצי .tiff של סדרת זמן נתון בImageJ. עבור ל" תמונה "→" סטאקס "" תמונות לסטאקס "→. לחלופין, לשנות את הבהירות והניגודיות, להוסיף סרגל גודל, וכו 'לייצא את הסרט תחת "קובץ" → "שמירה בשם" → "AVI ..." (לדוגמא, ראה וידאו 1 ו -2 המתאימים לאיור 1).

2. שימוש חיישנים מתקפלים וכתבי מתח לחקר תא והתא אוטונומי ללא אוטונומי משפיע על פרוטוסטאזיס ורעילות

  1. צור קווים מהונדסים שcoexpress חיישן מתקפל או reporte מתחr יחד עם החלבון כמו הפריון. לשיטות על איך להקים צלבים או ליצור קווים מהונדסים, לראות 48,49,52. ראה בטבלת 1 רשימה של ג זני elegans, שניתן להשתמש.
  2. הכן אוכלוסיות מסונכרנות של בעלי חיים מהונדסים ולגדל אותם עד הגיל הרצוי כפי שתואר לעיל (סעיף 1.2) 50.
  3. שימוש סטראו, לבחון את הפנוטיפ בהתאמה של החיישן מתקפל או כתב מתח.
    1. לחיישן מתקפל, לקבוע את מספרם של בעלי החיים מחסה אגרגטים בכל יום לאחר הסנכרון (לדוגמא, ראה איור 2E וF).
    2. לכתב המתח, בדיקה אם Coexpression של תוצאות החלבון כמו פריון-בקרינה מוגברת של הכתב (לדוגמא, ראה איור 3).

מסך הגנום 3. לדיכוי רעילות עקב פריון בג elegans

איור 4
איור 4. ייצוג סכמטי של פרוטוקול הקרנת RNAi. ראה סעיף 3 לפרוטוקול תיאור מפורט של צעדים הבודדים.

  1. סנכרון של ג תולעי elegans ושכפול של ספריית RNAi
    1. עבור מסך RNAi, להשתמש בספריית Ahringer RNAi (או הספרייה וידאל RNAi) 53,54. Rearray ספריית RNAi מהפורמט המקורי גם 384 ל96 צלחות גם על ידי מילוי הצלחות עם תקשורת LB-מגבר 100 μl (50 מיקרוגרם / מיליליטר אמפיצילין בLB) בתוספת גליצרול 10% ולחסן באמצעות משכפל 96 פינים. לגדול ב 37 מעלות CO / N עם תסיסה ולאחסן ב -80 ° C.
    2. לשמור על ג elegans WT וקווים מהונדסים ב 20 ° C על NGM צלחות שנזרעו עם OP50 E. חיידקי coli על פי שיטות סטנדרטי 47.
    3. לסנכרן מהונדס תחום הפריון ונמטודות WT (שליטה) על ידי הלבנה (ראה סעיף 1.2).
    4. באותו היום שהתולעים מולבנים, להכין תקשורת LB בתוספת 50 מיקרוגרם / מיליליטר אמפיצילין. השתמש במתקן מגיב אוטומטי לוותר (או פיפטה באופן ידני) 65 μl של תקשורת LB-המגבר לבאר כל צלחת גם 96.
    5. הסר 96 גם צלחות ספריית Ahringer RNAi מ-80 ° C ולהביא אותם למכסה מנוע סטרילי המרופד במגבות נייר. מייד להסיר את חותם הקלטת על ידי לחיצה על הצלחת הפוכה ואילו צלחות עדיין מוקפאות, להיות זהיר, כדי למנוע זיהום מקרח בצד החיצוני של הצלחות. Reinvert הצלחות ולתת להם להפשיר במשך כ -30 דקות.
    6. טובלים משכפל 96 פינים סטרילי אחד לאחד צלחת ספריית RNAi, ולאחר מכן לתוך צלחת LB-מגבר אחד טרי. השתמש משכפל סטרילי טרי לכל צלחת. לאטום את כל הצלחות עם קלטת רדיד דבק ולהחזיר את צלחות ספרייה ל-80 ° C. יכולים להיות טבולים המשכפלים באקונומיקה, לשטוף,וautoclaved כדי לשמש שוב.
    7. לאפשר צלחות RNAi משוכפלות לגדול O / N בחממה מוגדרת 37 ° C ו -300 סל"ד. כדי להשתמש בHT115 E. coli חיידקי מחסה הווקטור הריק (L4440) כביקורת, לגדל אותו בנפרד בצינור תרבות ולאחר מכן פיפטה 65 μl של התרבות עם פיפטה רבה לרבע שתי 96 צלחות גם.
  2. אינדוקציה של ייצור dsRNA חיידקים ותוספת של תולעים
    1. לדלל איזופרופיל-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) לריכוז 5 מ"מ בDDH 2 O. השתמש בתחנת עבודה אוטומטית עם ראש רב-ערוצי לוותר (או pipet ידני) 10 μl של IPTG המדולל היטב בכל חיידקי RNAi וצלחות השליטה. יש לחתום מחדש ולמקם את הצלחות בחזרה לתוך החממה. תן להם ללחוץ על 3 שעות על 37 מעלות צלזיוס.
    2. בעוד חיידקים רועדים, להכין את התולעים. מערבבים את M9 / ההשעיה התולעת גם, ופיפטה מדגם קטן (~ 5 - 10 μl) לשקופית מיקרוסקופ זכוכית. רוזןמספר התולעים תחת סטראו ולחשב את מספר תולעים לכל μl.
    3. באמצעות טכניקה סטרילית, להכין פתרון של M9 תוספת (M9 +) עם הריכוזים הסופיים הבאים: 0.20 מ"ג / מיליליטר IPTG, 8.0 מיקרוגרם / כולסטרול מיליליטר, 50 מיקרוגרם / מיליליטר אמפיצילין, 9.6 מיקרוגרם / מיליליטר טטרציקלין, .0835 מיקרוגרם / מיליליטר Fungizone, ו 15 תולעים לכל 50 μl.
      1. הפוך את הפתרונות נפרדים למהונדס תחום פריון ותולעי WT. הנפח הסופי של פתרון תולעת M9 + הדרוש יהיו תלוי במספר צלחות RNAi המועתק (ראה להלן), בתוספת ~ 30 מיליליטר של נפח מת שיישאר במאגר, אם נעשה שימוש במתקן אוטומטי.
    4. לאחר האינדוקציה 3 שעות של ייצור dsRNA חיידקים, לקחת את הצלחות מהחממה ולתת להם להתקרר לRT (~ 30 דקות) כדי למנוע חום והדגיש את בעלי החיים.
    5. לוותר 50 μl פתרון תולעת מהונדס M9 + תחום פריון היטב בכל צלחות RNAi ואחת מצלחות בקרת וקטור הריקות. הפוךהקפד לערבב את פתרון התולעת לפני כל צעד כמו החיות נוטות משקעים התחתון של המאגר.
    6. לוותר תולעי WT לתוך צלחת השליטה השנייה. השאר את הצלחות החתומות כדי לאפשר אוורור. כדי לשמור על תרבות הנוזל מתאדה, מחסנית 4-5 צלחות ביחד ולעטוף במגבת לחה ונייר רדיד אלומיניום. לדגור על 200 סל"ד ב 20 מעלות צלזיוס למשך 4 ימים.
  3. ניקוד
    הערה: לאחר 4 ימים בחממה, התולעים יהיו ביום השני של בגרות ומוכנות למסך. תן לחיות להסתגל לתנאים שאינם רועדים למשך 30 דקות לפני ההקרנה על מנת להבטיח מתחבט באין מפריע.
    1. שימוש במצלמה פלקון 4M60 מחוברת למחשב עם צג, מסך חזותי לחבטה מוגברת בהשוואה לבעלי חיים מהונדסים תחום פריון שליטה טופלה.
    2. להרכיב רשימה של להיטים ראשוניים כדי לאשר באמצעות wrMTrck (ראה הסעיף הבא).

4. אישור ראשונילהיטי מסך

  1. assay תנועתיות על צלחות מוצקות
    1. להכין צלחות עם NGM בתוספת 100 מיקרוגרם / מיליליטר אמפיצילין, 12.5 מיקרוגרם / מיליליטר טטרציקלין וIPTG 1 מ"מ, על פי שיטות סטנדרטי 47. במידת האפשר, להשתמש במכונה לשפוך צלחת כדי להבטיח שכל הצלחות באותו גובה של תקשורת, שיאפשר לתהליך רכישת וידאו יעיל יותר.
    2. לגדול השיבוטים RNAi השונים ב~ 1 LB מיליליטר + 50 מיקרוגרם / מיליליטר אמפיצילין, O / N ב 37 ° C ו 250 סל"ד.
    3. למחרת, לגרום לביטוי של dsRNA עם IPTG 1 מ"מ לשעה 3. זרע הצלחות עם 150 μl של כל שיבוט חיידקי RNAi, התפשט לשכבה דקה. בואו חיידקים יבשים עבור 2 ימים בRT בחושך. הכן 3 צלחות לשיבוט RNAi.
    4. לסנכרן את אוכלוסיית התולעת על ידי הלבנת פי שיטות סטנדרטי 50 (ראה סעיף 1.2), ולתת לי O ביצים בוקעות / N בM9 תקשורת.
    5. לקחת דגימה של ההשעיה התולעת ולקבוע את סכום nematodes לμl בסטראו. לאחר מכן, פיפטה הנפח התקין של M9 בתוספת תולעים לכל צלחת ניסוי, כך שהוא מכיל 25 - 30 תולעי L1. לגדול נמטודות על 20 מעלות צלזיוס למשך 4 ימים עד התולעים להגיע ליום 2 בבגרות.
  2. ניתוח כמותי של תנועתיות תולעת עם תוסף wrMTrck לImageJ
    הערה: קטעי הווידאו נרשמו באמצעות stereomicroscope בהגדלה 10X במצלמה דיגיטלית C10600-10B Hamamatsu אורקה-R2 ותוכנת ההדמיה PCI Simple Hamamatsu.
    1. הפעל את המצלמה ותוכנת ההדמיה PCI Simple. לחץ על "חי" על מנת לאפשר להתאמה של תנאי ההדמיה.
    2. להגדיר את תנאי וידאו כדלקמן: רווח = 0; מצב אור = גבוה; מדד מהירות = 1; Binning = 2. לחץ על "Auto לחשוף" ולאחר מכן להתאים את תנאי התאורה, נע מראות מיקרוסקופ וחוגות בהירות והניגודיות.
      הערה: הווידאו צריכה להיות עם ניגודיות גבוהה מבלי להיות overexposed, כך שבעלי החיים מופיעים צורות שחורות כעל רקע בהיר.
    3. לחץ על "זמן סריקה" ולבחור תיקייה ושם קובץ. הגדר "שדה עיכוב" 20 אלפיות שניים ו" עצור בזמן "עד 30 שניות. לחץ על "סקירה חי" על מנת לבחור את האזור של הצלחת כדי להקליט (שבו רוב התולעים הם). הקש על הצלחת 3 או 4 פעמים על הבמה, במהירות לאשר את מעמדה בשדה הראייה ולחץ על "התחל".
    4. אחרי שהסרט מסתיים הקלטה, לחץ לחיצה ימנית על התמונה ולבחור "יצוא Montage רצף" לייצא את הסרט מפורמט .cxd לאבי.
  3. ניתוח קטעי וידאו תנועתיות
    1. פתח את תוכנת ImageJ, עבור לכרטיסיית "התוספים", ואז "wrmtrck" ובחר "אצווה wrMTrck". בחר את הספרייה המכילה את כל הקבצים להיות מנותח.
    2. בחלון הקלט העיקרי של wrMTrck_Batch, לטעון את ערכי הקלט כמפורט בfigurדואר 5C. ניתן למצוא הסבר לכל אחד מהפרמטרים בהוראות המלוות את התוסף. לחץ על "אישור" ולאפשר הפעלת ניתוח תנועה.
    3. לאצור את התוצאות ולאשר כי כל המסלולים זוהו הם מג בפועל elegans וחפצים לחסל, לפתוח כל אחד מקבצי txt שנוצרו עבור כל סרט ולהעתיק את המידע לקובץ תוכנת ניתוח נתונים. לפתוח את קבצי "* _labels.zip" נוצרו ולהפעיל את התוצאה "_labels.tif *" לבדוק באופן ידני ולחסל מסלולי תולעת שווא.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ניטור אינטר הפצה של חלבונים כמו פריון-ידי in vivo הדמיה הזמן לשגות

המהונדס C. קווי elegans להביע תחום הפריון הם גם מתאימים במיוחד לניתוח של היבטים מסוימים של חלבונים כמו פריון-, למשל, העברת תא אל התא ורעילות אוטונומית מסוג תאים לא. השקיפות של בעלי החיים מאפשר מעקב של fluorescently מתויגת חלבונים מתוך אורגניזם החי בכל שלב של חיים. מנצל את זה, תנועה של חלבונים כמו פריון-פני תאים ורקמות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הם דמיינו. מטרת שמן 63X או 100X / 1.4NA יש צורך לפתור את מבני לפוחי. חשוב לציין, תחום הפריון צריך להיות מתויג עם mRFP, כדי להישאר fluorescently גלויה בתוך שלפוחית ​​כנראה חומצי אלה 40. חלבון צהוב ניאון (YFP), המשמש לעתים קרובות כתג, iזה לא מתאים משום שהוא הרווה בסביבת pH נמוכה 40,55. זן AM815 מבטא מתויג RFP R2E2 (צורת צבירה מועדת ביותר והרעילה של תחום הפריון NM) המצטבר בשלפוחית ​​צינורי, ואילו תג RFP לבד נשאר מסיס (איור 1 א 'וב'). שימוש בזמן לשגות הדמיה vivo, זה יכול להיות שנצפה כי שלפוחית ​​צינורי אלה מועברות בתוך ובין תאי 40 (איור 1 ג 'ו-ד, 1 וידאו ו -2) [קישורי מקום לוידאו 1 ו -2 כאן].

באמצעות חיישנים מתקפלים וכתבי מתח לחקור תופעות תא אוטונומיות ובלתי תא אוטונומיות על פרוטוסטאזיס ורעילות

פריונים מסוגלים לחצות חלבונים הקשורים זרע ולשבש את סביבת קיפול חלבונים התאית. זה יכול להתגלות דרך Coexpression של הצר מתקפל מתאימיםrs. חיישנים מתקפלים הם חלבוני metastable שאינן חיוניים שתלוי ברשת פרוטוסטאזיס פונקציונלית להתקפל כראוי. כמה דוגמאות הן לוציפראז הגחלילית הידוע וחלבונים מחסה הטמפרטורה רגישה (TS) מוטציות 56-66. שיבוש פרוטוסטאזיס מוביל לmisfolding של הכתב, אשר יכול להיות מזוהה על ידי בדיקה ויזואלית של אגרגטים או על ידי חשיפה של פנוטיפ מוטנטי ts בהתאמה בטמפרטורות מתירנית. מתיחות של polyglutamine (polyQ) באורך על סף הצבירה (כ -40 שאריות) הם גם משמשים לעתים קרובות כי הם מפגינים צבירה תלוית גיל 67-69. מוקדם יותר תחילת הצבירה מגלה סביבה מתקפלת בסכנה. כאן, אנו מועסקים מוטציה פריון RΔ2-5 שנשאר מסיס כאשר באו לידי ביטוי בג קיר גוף שרירים elegans תאים (BWM) ומעי 40 (איור 2 א ו- C). על הביטוי בו זמנית עם R2E2 בתאי BWM, RΔ2-5 reaאגרגטים dily (איור 2), חושפים השפעה אוטונומית תא של R2E2 על סביבת קיפול חלבונים. ההשפעה הנרחבת על פרוטוסטאזיס ואינדוקציה של misfolding פני רקמות יכולה להיות מוערכת על ידי ביטוי של החיישן מתקפל ברקמות שונות שאינו מבטאות את הצורה מאוד צבירה מועדת של תחום הפריון. R2E2 בא לידי ביטוי תחת אמרגן תא BWM ספציפי (מיו-3P), ואילו RΔ2-5 בא לידי הביטוי תחת אמרגן מעי-ספציפי (VHA-6P). צבירה של RΔ2-5 מעיים מוכיחה כי R2E2 משפיע קיפול חלבונים באופן אוטונומי מסוג תאים לא 40 (איור 2 ד). במקום להשתמש RΔ2-5, שבו ניתן לאתר אגרגטים רק ברזולוציה גבוהה, השימוש בpolyQ44 הביע במעי (Q44i) מאפשר הדמיה של אגרגטים ברזולוציה נמוכה תחת סטראו (איור 2E וF). יתר על כן, זה מאפשר כימות של האנימהls עם אגרגטים, כמו גם כימות של מספר אגרגטים.

לחקור רעילות אוטונומית מסוג התאים לא של תחום הפריון, בדקנו בעבר השכן רקמות שאינם מבטאות R2E2 על ידי מיקרוסקופי אלקטרונים ומצאנו ביטוי זה של תחום הפריון בתאי שריר גורם לשיבוש שאינו תא אוטונומי של שלמות המיטוכונדריה ברקמות סמוכות, כגון כמעי 40. תוצאות תפקוד לקוי של המיטוכונדריה במינים חמצן תגובתי גדלו ייצור (ROS) וסטרס חמצונים. שיטה לא פולשנית ללדמיין אינדוקציה של תגובת לחץ חמצוני היא להשתמש סטרס חמצוני כתב מושרה 70. זן CF1553 מבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) תחת אמרגן מושרה סטרס חמצונים טפש-3 70. כאשר חצו לבעלי חיים המבטאים את תחום פריון R2E2 בתאי BWM, הכתב שהוגבר באופן משמעותי בתאי BWM כמו גם ברקמות שאינם BWM רבים ( טבלת 1 מספקת רשימה של ג elegans זנים להביע חיישני קיפול וכתבי מתח שיכול לשמש אנלוגיה.

מסך הגנום לדיכוי רעילות עקב פריון בג elegans

פנוטיפ הרעילות המורכב של תחום הפריון בא לידי ביטוי בג elegans הוא מעניין במיוחד בגלל חוסר הרעילות ניכרת נצפתה ברוב הדגמים בפריון מבחנה 71. מודל זה עשוי לחשוף נתיבים חדשים שיכול להשפיע על ההרעלה כרוכה בפריונים בmetazoans. כדי לטפל בזה, יש לנו הוקרן לגנים ש, כאשר יאזלו-RNAi, ישפרו את פגם תנועתיות של בעלי חיים מהונדסים R2E2. תולעי WT בקרה טופלה יכולים לשמש כשותף חיוביntrol, למרות שרוב גני המועמדים לא יספק הצלת פנוטיפ תנועה מלאה, בשל penetrance RNAi משתנה והרעילות הגבוהה של transgene. טופלו בעלי החיים במשך 4 ימים עם RNAi, מL1 מדינת הזחל הראשון ליום 2 בבגרות. באותו זמן, מתחבט של בעלי חיים שלא טופלו R2E2 הוא איטי יותר באופן משמעותי מהחבטות של בעלי החיים WT, וזה חשוב כי אנחנו בדיקות סקר לשיפור תנועתיות. צאצאי F1 יהיו נוכחים (~ L1s), אבל קל להבחין מדור P0. רק דור P0 הוא הבקיע. מסך ראשוני זה הוא חזותי ולא כמותי ולכן, סף נמוך שימש לזיהוי להיטים ראשוניים, כלומר שכל שיבוט RNAi חיידקים שנראו להגדיל את החבטות של בעלי חיים המבטאים-פריון היה הערכה מחדש בassay זחילה כמותי. איור 4 מתארים את שלבים עיקריים של מסך ההגדרה. הרזולוציה הגבוהה של המצלמה פלקון 4M60 אפשרה הקרנה חזותית של quarter של הצלחת בכל פעם על מסך מחשב, אשר אפשר המסך להסתיים בצורה יעילה יותר. בעוד מועיל, זה לא הכרחי. הבדיקה ויזואלית של חבטת תולעת יכולה גם להתבצע על ידי שימוש stereoscope בהגדלה נמוכה (10X).

אישור של להיטי מסך ראשוניים

מסכי תפוקה גבוהים מבוצעים כגישה המאפשרת אפקטים רחבים הגנום ניתוח לקבלת רשימה ראשונית של גני מועמדים שיכולים להיות מעודן בשיטות משלימות. אימות של תוצאות המסך לכן חיונית כדי למנוע תוצאות חיוביות שגויות אפשריות, שעלול להיגרם כתוצאה מביצוע מסך עם מדגם ניסיוני אחד בלבד לכל RNAi. בעלי חיים מהונדסים R2E2 הואכלו עם השיבוטים RNAi של להיטים ראשוניים ונמדדו המהירות שלהם על צלחות NGM ביום השני של בגרות, כקריאה לכימות של תנועתיות וירידה ברעילות. אנחנו השתמשנו בתוסף wrMTrck לImageJ, שפותח בנומעבדה, שמזהה במדויק ג elegans בקטעי וידאו ועוקב התנועה שלהם. תוסף wrMTrck והתסריטים לניתוח אוטומטי הם קוד פתוח וזמין לציבור בhttp://www.phage.dk/plugins/wrmtrck.html, יחד עם הוראות מפורטות כיצד להשתמש בו. לאחר ההורדה, להעתיק את כל תיקיית wrMTrck לתיקיית Plugins של ImageJ. פרוטוקול זה מתאר שיטת wrMTrck_Batch, העדיפה לניתוח מספר רב של קטעי וידאו בכל פעם, אבל הוראות לידני, סרט על ידי סרט, ניתוח זמינות גם עם הורדת התוסף. WrMTrck_Batch ממיר וידאו מקורי (איור 5 א ') לפורמט בינארי עם רקע חיסור וכל תולעת מוקצית מסלול. מאוחר יותר ניתן לצפות בכל קטעי הווידאו של עיבוד עם מסלולים אלה על גבי, על מנת לחסל באופן ידני כל חפצים שזוהו בטעות כתולעים (ה. g., מסלול 1 באיור 5). דרך יעילה אחת לחסל את אמנות רקע ifacts (מסומן בחץ באיור 5) הוא לבחור את המינימום וגודל מרבי של האובייקטים להיות מזוהה (איור 5 ג) בזהירות. מיציאות השונות של תוסף wrMTrck, אנו משתמשים באורכי הגוף לשנייה פרמטר (BLPS) המודד את המהירות הממוצעת של כל חיה, המיוצגים על ידי אורכו של כל מסלול מחולק באורך גופו של כל אובייקט, ובכך נרמול להבדלים אפשריים בגודל של נמטודות (איור 5D). באמצעות שיטה זו, זיהינו 35 מדכאי של רעילות עקב פריון (sopt) שהגדילו את פנוטיפ תנועתיות בR2E2 להביע ג elegans לפחות 133% ועד 256% בהשוואה לתולעים ריקים שטופל וקטור (איור 6). גני sopt אלה מייצגים הסופיים אישרו להיטים שנבעו ממאמצי הקרנת התפוקה הגבוהה שלנו.

21fig1highres.jpg "/>
איור 1. תחום הפריון מתפשט בין תאים ורקמות בג elegans בתחבורה לפוחי. () התמוטט Z- ערימות confocal של נמטודות להביע RFP בקיר גוף שרירים (BWM) תאים (RFPm). (ב) התמוטט Z- ערימות confocal של נמטודות מבטא את הגרסה הרעילה ביותר וצבירת NM נוטה, R2E2 , בתאי BWM (R2E2m). חצים מצביעים על שלפוחית ​​צינורי, ראש חץ סדרה (C + D) זמן לשגות של בעלי חיים המבטא RFPm (C) וR2E2m (ד ') מצביע על צבירה.. חצים מצביעים על תחומי תנועת לפוחי. RFPm מציג בעיקר צביעה מפוזרת. גם כאשר RFPm נמצא בשלפוחית, אלה בקושי זזים. R2E2m localizes למספר רב של שלפוחית ​​שמועברות בתוך ובין תאים. ברים בקנה מידה: 10 מיקרומטר. הוידאו המצורף 1 ו -2 [קישורי מקום לוידאו 1 ו -2 כאן] מתאים ל1C הדמויות וD,בהתאמה.

איור 2
איור 2. חיישנים מתקפלים לחשוף את ההשפעה הנרחבת של תחום הפריון בפרוטוסטאזיס. Coexpression (A + B) של R2E2m מקדם צבירת RΔ2-5m. תמונות Confocal השליטה RΔ2-5m () ו- (B) RΔ2-5m coexpressed עם R2E2m בתאי BWM. שריר (C + D) הביעו R2E2m מקדמת צבירת RΔ2-5i מעיים. (C) Confocal תמונה של חיה שליטה להביע RΔ2- 5i בתאי מעי. (ד ') תמונת Confocal של בעלי חיים המבטאים R2E2m בתאי BWM וRΔ2-5i במעי. ברים בקנה מידה: 10 מיקרומטר (E + F) R2E2m גורם צבירה אוטונומית מסוג תאים לא של Q44i (E) נציג תמונות ניאון של Q44i וQ44i; בעלי חיים R2E2m 4 ימים לאחר העברת lar L1 המסונכרן..vae לצלחות NGM OP50 הזרע טריים. הביטוי של R2E2 בתאי BWM מוביל להתפרצות מוקדמת של צבירת Q44i במעי. כימות (F) של בעלי חיים עם אגרגטים (ב%) בימים שצוינו לאחר סנכרון. ברים שגיאה מייצגים SD נתון זה שונה מ-40.

איור 3
כתב מתח תעתיק איור 3. טפש-3P :: GFP מגלה כי תחום הפריון גורם לאינדוקציה של תאים אוטונומיים ולא אוטונומית תא של סטרס חמצונים. (B +) נציג תמונות ניאון (תוך שימוש באותו זמן חשיפה) של SOD-3P :: בעלי חיים שליטה GFP להביע () וטפש-3P :: GFP;. בעלי החיים R2E2m (B) ביום 2 בבגרות (C) הביטוי של R2E2 בתאי BWM מוביל לאינדוקציה של הכתב לא רק בתא BWMs (I), אלא גם במעי (II), חוט עצב (III), תאי עצב לוע והראש (IV).

איור 5
איור 5. ניתוח של תנועת תולעת עם תוסף wrMTrck לImageJ. (א) דוגמא של סרט קלט שנוצר על ידי שימוש בהגדלה מתאימה (~ 10X) לעקוב אחר מספר בעלי חיים בכל פעם. (ב) קבצי "* _labels.tif" הוא פלט של wrMTrck_Batch ולאפשר לאוצרות ידניות של תוצאות ניתוח. חץ מצביע על אובייקט שלא נכלל בצורה נכונה מהניתוח בשל בחירה מתאימה של פרמטרים מינימום ומקסימום גודל. חלון קלט (C) של wrMTrck_Batch, מראה פרמטרים המשמשים לפרוטוקול זה. פרמטרים אלו צריכים להיות מותאמים על פי הגדרות מיקרוסקופ וסרט בודדות. (ד ') תוצאות פלט מmovemeניתוח NT של (B), עם עמודת BLPS מודגש בצהוב. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 1
6. תולעי R2E2 איור טופלו בשיבוטי RNAi שsupressors של מושרה פריון רעילות (sopt) מראים תנועתיות משופרת. תנועתיות מוצגת כBLPS יחסי בהשוואה לביקורת השלילית (וקטור ריק). מוצגים כל השיבוטים המשמעותיים מבחינה סטטיסטית (t-test סטודנט) RNAi המזוהה במסך HTP. כוכב שחור מייצג את הלהיט מוצג כדוגמא באיור 5. תוצאות מ -3 סרטים, עם 17 <n <53 מסלולים לכל מצב. ברים שגיאה מייצגים SEM. </ P>

טבלת 1. ג elegans זנים להביע חיישני קיפול וכתבי מתח.

שם זן גנוטיפ תגובות מקור מתח
חיישנים מתקפלים
transgenes
AM140 UNC-54p :: polyQ35 :: YFP שרירים ספציפי ביטוי של polyQ35, צבירה תלויה גיל מעבדה CGC או Morimoto
AM141 UNC-54p :: polyQ40 :: YFP ביטוי שריר הספציפי של polyQ40, agצבירה תלויה דואר מעבדה CGC או Morimoto
AM801 UNC-54p :: RΔ2-5 :: YFP ביטוי שריר הספציפי של תחום פריון פסול נוקלאציה מעבדה Morimoto
OG412 VHA-6P :: polyQ44 :: YFP מעי ספציפי ביטוי של polyQ44, צבירה תלויה גיל CGC
AM809 VHA-6P :: GFP :: RΔ2-5; מיו-2p :: mCherry ביטוי מעי הספציפי של תחום פריון פסול נוקלאציה מעבדה Morimoto
AM47 F25B3.3p :: polyQ40 :: CFP ביטוי נוירון הספציפי של polyQ40, צבירת סוג תא מסוימת מעבדה Morimoto
AM982 unc54p :: לוציפראז :: YFP ביטוי שריר הספציפי של הגחלילית בלוציפראז WT מעבדה Morimoto מיו-3P :: לוציפראז :: GFP; רול-6 ביטוי שריר הספציפי של הגחלילית בלוציפראז WT מעבדה Behl
SNG-1P :: לוציפראז :: GFP; רול-6 ביטוי שריר הספציפי של הגחלילית בלוציפראז WT מעבדה Behl
FUH55 unc54p :: FLUC :: egfp; רול-6 ביטוי שריר הספציפי של הגחלילית בלוציפראז WT מעבדה Hartl
FUH134 unc54p :: FLUCSM :: egfp; רול-6 ביטוי שריר הספציפי של הגחלילית בלוציפראז המוטציה R188Q מעבדה Hartl
FUH135 unc54p :: FLUCDM :: egfp; רול-6 ביטוי שריר הספציפי של הגחלילית בלוציפראז מוטציה כפולה R188Q + R261Q מעבדה Hartl
FUH48 F25B3.3p :: FLUC :: egfp; רול-6 ביטוי נוירון הספציפי של lucifera גחלילית WTse מעבדה Hartl
FUH136 F25B3.3p :: FLUCSM :: egfp; רול-6 ביטוי נוירון הספציפי של הגחלילית בלוציפראז המוטציה R188Q מעבדה Hartl
FUH137 F25B3.3p :: FLUCDM :: egfp; רול-6 ביטוי נוירון הספציפי של הגחלילית בלוציפראז מוטציה כפולה R188Q + R261Q מעבדה Hartl
מוטציות ts
CB1402 אני UNC-15 (e1402) Paramyosin (TS), טמפרטורה רגישה משותקת-דואה, בוא CGC
CB1157 אני UNC-54 (e1157) שרירן (TS), טמפרטורת דואה רגישה CGC
CB1301 אני UNC-54 (e1301) שרירן (TS), טמפרטורת דואה רגישה CGC
CB286 UNC-45 (e286) III UNC-45 (TS), טמפרטורה רגישה, UNC נע לאט, EGL CGC
HE250 UNC-52 (e669su250) II Perlecan (TS), UNC רגיש לטמפרטורה, שיתוק נוקשה CGC
SD551 בואו-60 (ga89) IV ראס (TS), Muv רגיש לטמפרטורה, Ste, בוא, Lva, OSM CGC
CX51 DYN-1 (ky51) X Dynamin (TS), טמפרטורת דואה רגישה CGC
CW152 גז-1 (fc21) X גז-1 (TS), רגישות EtOH רגישה לטמפרטורה CGC
ZZ26 אני UNC-63 (x26) קולטן האצטילכולין (TS), התנגדות levamisole רגישה לטמפרטורה CGC
כתבי מתח
CL2070 HSP-16.2p :: GFp; רול-6 לחץ תרמי; ציטומגלווירוס UPR CGC
TJ375 HSP-16.2p :: GFP לחץ תרמי; ציטומגלווירוס UPR CGC
TJ3000, TJ3001 HSP-16.2p :: GFP; CBR-UNC-119 (+) לחץ תרמי; ציטומגלווירוס UPR CGC
AM446 GFP :: hsp70p; הרול-6 לחץ תרמי; ציטומגלווירוס UPR מעבדה Morimoto
AM722 hsp70p :: mCherry; מיו-2p :: CFP לחץ תרמי; ציטומגלווירוס UPR מעבדה Morimoto
AM799 GFP :: hsp90p לחץ תרמי; ציטומגלווירוס UPR מעבדה Morimoto
OG497 HSF-1P :: HSF-1 :: GFp; CBR-UNC-119 (+) לחץ תרמי; ציטומגלווירוס UPR CGC
CF1553 טפש-3P :: GFP; רול-6 סטרס חמצונים CGC
KN259 טפש-3P :: GFP; רול-6 סטרס חמצונים CGC
CL2166 GST-4P :: GFP :: NLS סטרס חמצונים CGC
LD1171 GCS-1P :: GFP; רול-6 סטרס חמצונים CGC
LD1 SKN-1P :: SKN-1 GFP ::; רול-6 סטרס חמצונים CGC
IG274 NLP-29p :: GFP לחץ האוסמוטי CGC
BC20309 MTL-1P :: GFP מתח מתכת המעבדה ביילי
BC20342 MTL-2p :: GFP str מתכתESS המעבדה ביילי
BC20314 ELT-2p :: GFP מתח מתכת המעבדה ביילי
SJ4005 HSP-4P :: GFP UPR ER CGC
SJ4100 HSP-6P :: GFP מיטו UPR CGC
SJ4058 HSP-60p :: GFP מיטו UPR CGC

CGC: Caenorhabditis מרכז גנטיקה; ts = טמפרטורה רגישה; תגובה = חלבון מקופל UPR; ציטומגלווירוס = cytosolic; מיטו = המיטוכונדריה; ER = reticulum endoplasmic.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

השיטות שתוארו כאן לעזור כדי להמחיש מתפשטים ורעילות אוטונומית תא התא המורכב אוטונומית ולא של חלבונים כמו פריון. לאחרונה גילינו שתחום פריון cytosolic צבירה מועדת הוא נלקח לתוך שלפוחית ​​קרום הנכנס בתהליך autophagy קשור. תת-קבוצה מסוימת של שלפוחית ​​אלה משלוחי תחום הפריון בתוך ובין תאים ורקמות 40. המפתח כדי לפקח על התנועה שלהם בחי הוא שהחלבון צריך להיות מתויג עם mRFP, כי רק חלבונים מתויגים mRFP נראו בשלפוחית ​​כנראה חומצי אלה. שימוש באותה הגישה, אנחנו כרגע חוקרים את כמו פריון-התנהגות הפוטנציאל של חלבונים הקשורים למחלות מסוימים, כגון סופראוקסיד דיסמוטאז 1 (SOD1) (צמוד לALS), אלפא-סינוקלאין (הצמוד לPD) או חלבון קושר DNA TAR 43 (TDP-43) (צמודים לALS). למרות שתחבורה בין תאית זו בתוך שלפוחית ​​נראית לשימוש על ידי כמה חלבונים אחרים, שאולי ישמסלולי dditional המאפשרים הפצה.

השימוש בחיישנים מתקפלים מאופיינים היטב הוא כלי רב עוצמה כדי לפקח על השפעות על החלבון התאי מתקפל סביבה בג elegans 63-66. כאן יש לנו לראות כיצד להשתמש בהצטברות תלויה גיל מתויג fluorescently חלבוני צבירה נוטה הביע תחת יזמי רקמות ספציפיות כדי לפקח באופן חזותי את יכולת הקיפול של רקמות שונות בו זמנית. אפשרויות אחרות כדי ללמוד את רשת פרוטוסטאזיס האורגניזם כוללות שימוש בחלבוני מוטציה ts אנדוגני. חלבוני metastable אלה לתפקד באופן נורמלי בטמפרטורה מתירנית (15 ° C), אבל misfold והפכו nonfunctional בטמפרטורה המגבילה (25 ° C), מציגים פנוטיפ מוטנטי האופייני שלהם. בנוכחות חלבון נוטה צבירה או במהלך הזדקנות, ts פנוטיפ מוטנטי מקבל חשיפה גם בתנאים מתירנית 63-66. חלק ממוטציות ts אלה באים לידי ביטוי בonly משנה של רקמות או פנוטיפים רקמות ספציפיות תערוכה, מה שהופך שימושיים במיוחד אלה לבדיקת השפעות proteotoxic אוטונומיות תא אוטונומי ובלתי תא. לדוגמא, מוטציה ts של LET-60, חבר של משפחת protooncogene מחייב GTP RAS, ראס (TS), בא לידי ביטוי בכל מקום, אך מראה מוטציה רקמות ספציפיות פנוטיפים 63,66. באמצעות זה TS מוטציה, את ההשפעה של הרחבות polyQ על פרוטוסטאזיס הסלולרי הוצגה להיות תא אוטונומי 63. ביטוי של polyQ ברקע הגנטי של ראס (TS) חשף את פנוטיפ מוטנטי רק הספציפי לרקמה שבה החלבון בא לידי ביטוי. החשיפה של פנוטיפים מוטציה מרובים מצביעה על כך שחלבון יש השפעות proteotoxic אוטונומיות שאינו תא.

בנוסף, לבדיקת השפעות על מסלולי לחץ סלולריים, יש מבחר גדול של כתבי מתח ניאון in vivo בג elegans 72. אלה הם בדרך כלל שעתוקכתבי אל שמבטאים חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) תחת אמרגן מתח מושרה, כגון HSP-16.2p או טפש-3P, שדיווחו על לחץ תרמי או חמצוני, בהתאמה 72. באמצעות כתבים מתאימים בשילוב עם חלבונים כמו פריון-אפשר לפקח על אינדוקציה פוטנציאל של תגובות דחק ברקמות אחרות מזו שמבטאת את הגן המתאים. אזהרה אחת, עם זאת, היא שכתבי מתח אלה הם לעתים קרובות לא רגישים מספיק כדי לחשוף upregulation העדינה של מסלול נתון (תצפיות לא פורסמו).

במסע שלנו לבחון האם גנים המשפיעים על הרעילות האוטונומית שאינו התא להשפיע גם על חלבון מתפשט, אנחנו נכתבנו על ידי בדיקות סקר לאיתור גנים ה, כאשר הפילו, היה לשפר ליקויי תנועה. באמצעות הערכה חזותית של שיעורי שחייה כקריאה החוצה, היינו יכול בנוחות assay ~ 25 צלחות בכל הפעלה ולבצע שני סבבים של פרוטוקול זה בשבוע, וכתוצאה מכך להשלמהשל המסך הראשוני תוך 6 שבועות. האישור של הלהיטים, על ידי ניתוח כמותי של תנועת תולעת על צלחות מוצקות, בtriplicates, wrMTrck באמצעות בוצע ב3 שבועות נוספים. אזהרה אחת, עם זאת, היא שעל ידי שימוש בזחילה בצלחות במקום לשחות בתקשורת נוזלית כמו קריאה מתוך אחד עלול לאבד גני מועמדים מסוימים, שחייה וזחילה הן לא תנועות זהות ויכול להיות מושפעת ממסלולים שונים 73. לכן, אם לא ניתן לאשר כמה גני מועמדים על צלחות מוצקות, הם צריכים להיות מחדש נבדקו בתקשורת נוזלית, שבו חיה ניתן לכמת על ידי ספירת התדירות מתחבט בתוך זמן נתון.

פרוטוקול ההקרנה המתואר כאן משתמש אוטומטי תחנות עבודה טיפול נוזלית, אשר מקטינה מאוד שונות. החסרון הוא שעודף של נוזלים למאגר של הרובוטים נחוץ, אשר ייתכן שלא תמיד יהיה אפשרית. התקנת סינון זה ניתן להתאים בקלות למסכים אחרים בג elegans </ Em> שמתחבט שימוש כמסך-out.This קריאה לא תוכנן לזהות גנים המשפיעים באופן ישיר את הרעילות אוטונומית מסוג התאים לא מתפשטת או של תחום הפריון, כמו הגנום מסכי רחבים צריכים להיות פשוט בעיצוב, כך שיבוצע במועד. פגמי תנועתיות יכולים לנבוע לא רק משרירים, אלא גם מפני נזק עצבי וממספר הפגמים גנטיים אחרים 53. כך, באמצעות קריאה זו, אנו עלולים למצוא את מכפילי לא רק של הרעלת שרירים ספציפיים. אנחנו בודקים כרגע את הגנים המועמד להשפעותיהן על תחום פריון מתפשטים ורעילות אוטונומית מסוג התאים לא באמצעות השיטות שתוארו לעיל. ניסויים אלה סופו של דבר יגלו אם transcellular הפצה של אגרגטים חלבון קשור ישירות לרעילות נצפתה ברקמות אחרות, או אם שידור ורעילות האוטונומית של תאים הלא תא אל התא יכולים להיות כשהתיר.

יחדיו, ניתן להשתמש בשיטות שתוארו לבחון את יחסי הציבור הפוטנציאלייםכמו יון-התנהגות של חלבונים ברמה התאית והאורגניזם באמצעות C. elegans.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
Nanosphere size standards 100 nm ThermoScientific 3100A
Levamisole Sigma L-9756
IPTG Sigma 15502-10G
Ahringer RNAi library Source BioScience LifeSciences  http://www.lifesciences.sourcebioscience
.com/clone-products/non-mammalian/c-elegans/c-elegans-rnai-library/
Equipment
Sorvall Legend XTR Refrigerated Centrifuge, 120VAC ThermoScientific 75004521 http://www.coleparmer.com/Product/Thermo_Scientific_Sorvall_Legend_
XTR_Refrigerated_Centrifuge_120
VAC/EW-17707-60
96 pin replicator  Scionomix   http://www.scinomix.com/all-products/96-pin-replicator/
HiGro high-capacity, incubating shaker  Digilab http://www.digilabglobal.com/higro
Multidrop Combi Reagent Dispenser  Titertrek http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/titertek.htm
Biomek FX AP96 Automated Workstation  Beckman Coulter http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/biomek_multi.htm
Innova44 shaker New Brunswick http://www.eppendorf.com/int///index.php?sitemap=2.3&pb=d78efbc05310ec
04&action=products&contentid=1&
catalognode=83389
M205 FA  Leica http://www.leica-microsystems.com/de/produkte/stereomikroskope-makroskope/fluoreszenz/details/product/leica-m205-fa/
ORCA-R2 C10600-10BDigital CCD camera Hamamatsu http://www.hamamatsu.com/jp/en/community/life_science_camera/product/search/C10600-10B/index.html
Spinning Disc AF Confocal Microscope  Leica http://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/life-science-research/fluorescence-microscopes/details/product/leica-sd-af/
Falcon 4M60 camera  Teledyne Dalsa  http://www.teledynedalsa.com/imaging/products/cameras/area-scan/falcon/PT-41-04M60/
Software
MetaMorph Microscopy Automation & Image Analysis Software Molecular Devices http://www.moleculardevices.com/products/software/meta-imaging-series/metamorph.html
Hamamatsu SimplePCI Image Analysis Software Meyer Instruments http://meyerinst.com/imaging-software/hamamatsu/index.htm
ImageJ NIH http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html
wrMTrck plugin for ImageJ http://www.phage.dk/plugins/wrmtrck.html
C. elegans strains
N2 (WT) Caenorhabditis Genetics Center (CGC) http://www.cgc.cbs.umn.edu/strain.php?id=10570
AM815                                                    rmIs323[myo-3p::sup35(r2e2)::rfp] Morimoto lab available from our laboratory 
See table 1 for a source for folding sensor and stress reporter strains

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Prusiner, S. B. Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. Science. 216 (4542), 136-144 (1982).
  2. Jarrett, J. T., Lansbury, P. T. Seeding 'one-dimensional crystallization' of amyloid: a pathogenic mechanism in Alzheimer's disease and scrapie. Cell. 73 (6), 1055-1058 (1993).
  3. Caughey, B., Kocisko, D. A., Raymond, G. J., Lansbury, P. T. Aggregates of scrapie-associated prion protein induce the cell-free conversion of protease-sensitive prion protein to the protease-resistant state. Chem Biol. 2 (12), 807-817 (1995).
  4. Wickner, R. B. [URE3] as an altered URE2 protein: evidence for a prion analog in Saccharomyces cerevisiae. Science. 264 (5158), 566-569 (1994).
  5. Chien, P., Weissman, J. S., DePace, A. H. Emerging principles of conformation-based prion inheritance. Annu Rev Biochem. 73, 617-656 (2004).
  6. Kimberlin, R. H., Walker, C. A. Pathogenesis of mouse scrapie: patterns of agent replication in different parts of the CNS following intraperitoneal infection. J R Soc Med. 75 (8), 618-624 (1982).
  7. Beekes, M., McBride, P. A., Baldauf, E. Cerebral targeting indicates vagal spread of infection in hamsters fed with scrapie. J Gen Virol. 79 (3), 601-607 (1998).
  8. Jucker, M., Walker, L. C. Self-propagation of pathogenic protein aggregates in neurodegenerative diseases. Nature. 501 (7465), 45-51 (2013).
  9. Aguzzi, A. Cell biology: Beyond the prion principle. Nature. 459 (7249), 924-925 (2009).
  10. Scherzinger, E., et al. Self-assembly of polyglutamine-containing huntingtin fragments into amyloid-like fibrils: implications for Huntington's disease pathology. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (8), 4604-4609 (1999).
  11. Wood, S. J., et al. alpha-synuclein fibrillogenesis is nucleation-dependent. Implications for the pathogenesis of Parkinson's disease. J Biol Chem. 274 (28), 19509-19512 (1999).
  12. Wang, Y. Q., et al. Relationship between prion propensity and the rates of individual molecular steps of fibril assembly. J Biol Chem. 286 (14), 12101-12107 (2011).
  13. Cushman, M., Johnson, B. S., King, O. D., Gitler, A. D., Shorter, J. Prion-like disorders: blurring the divide between transmissibility and infectivity. J Cell Sci. 123 (8), 1191-1201 (2010).
  14. Tanaka, M., Collins, S. R., Toyama, B. H., Weissman, J. S. The physical basis of how prion conformations determine strain phenotypes. Nature. 442 (7102), 585-589 (2006).
  15. Winkler, J., Tyedmers, J., Bukau, B., Mogk, A. Chaperone networks in protein disaggregation and prion propagation. J Struct Biol. 179 (2), 152-160 (2012).
  16. Ilieva, H., Polymenidou, M., Cleveland, D. W. Non-cell autonomous toxicity in neurodegenerative disorders: ALS and beyond. J Cell Biol. 187 (6), 761-772 (2009).
  17. Nussbaum-Krammer, C. I., Morimoto, R. I. Caenorhabditis elegans as a model system for studying non-cell-autonomous mechanisms in protein-misfolding diseases. Dis Model Mech. 7 (1), 31-39 (2014).
  18. Lino, M. M., Schneider, C., Caroni, P. Accumulation of SOD1 mutants in postnatal motoneurons does not cause motoneuron pathology or motoneuron disease. J Neurosci. 22 (12), 4825-4832 (2002).
  19. Li, J. Y., et al. Lewy bodies in grafted neurons in subjects with Parkinson's disease suggest host-to-graft disease propagation. Nat Med. 14 (5), 501-503 (2008).
  20. Desplats, P., et al. Inclusion formation and neuronal cell death through neuron-to-neuron transmission of alpha-synuclein. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (31), 13010-13015 (2009).
  21. Clement, A. M., et al. Wild-type nonneuronal cells extend survival of SOD1 mutant motor neurons in ALS mice. Science. 302 (5642), 113-117 (2003).
  22. Gu, X., et al. Pathological cell-cell interactions elicited by a neuropathogenic form of mutant Huntingtin contribute to cortical pathogenesis in HD mice. Neuron. 46 (3), 433-444 (2005).
  23. Yamanaka, K., et al. Mutant SOD1 in cell types other than motor neurons and oligodendrocytes accelerates onset of disease in ALS mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (21), 7594-7599 (2008).
  24. Garden, G. A., et al. Polyglutamine-expanded ataxin-7 promotes non-cell-autonomous purkinje cell degeneration and displays proteolytic cleavage in ataxic transgenic mice. J Neurosci. 22 (12), 4897-4905 (2002).
  25. Raeber, A. J., et al. Astrocyte-specific expression of hamster prion protein (PrP) renders PrP knockout mice susceptible to hamster scrapie. EMBO J. 16 (20), 6057-6065 (1997).
  26. Yazawa, I., et al. Mouse model of multiple system atrophy alpha-synuclein expression in oligodendrocytes causes glial and neuronal degeneration. Neuron. 45 (6), 847-859 (2005).
  27. Lobsiger, C. S., Cleveland, D. W. Glial cells as intrinsic components of non-cell-autonomous neurodegenerative disease. Nat Neurosci. 10 (11), 1355-1360 (2007).
  28. Sambataro, F., Pennuto, M. Cell-autonomous and non-cell-autonomous toxicity in polyglutamine diseases. Prog Neurobiol. 97 (2), 152-172 (2012).
  29. Polymenidou, M., Cleveland, D. W. Prion-like spread of protein aggregates in neurodegeneration. J Exp Med. 209 (5), 889-893 (2012).
  30. Brundin, P., Melki, R., Kopito, R. Prion-like transmission of protein aggregates in neurodegenerative diseases. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (4), 301-307 (2010).
  31. Braak, H., Braak, E., Bohl, J. Staging of Alzheimer-related cortical destruction. Eur Neurol. 33 (6), 403-408 (1993).
  32. Meyer-Luehmann, M., et al. Exogenous induction of cerebral beta-amyloidogenesis is governed by agent and host. Science. 313 (5794), 1781-1784 (2006).
  33. Luk, K. C., et al. Pathological alpha-synuclein transmission initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice. Science. 338 (6109), 949-953 (2012).
  34. Clavaguera, F., et al. Transmission and spreading of tauopathy in transgenic mouse brain. Nat Cell Biol. 11 (7), 909-913 (2009).
  35. Nonaka, T., et al. Prion-like Properties of Pathological TDP-43 Aggregates from Diseased Brains. Cell Rep. 4 (1), 124-134 (2013).
  36. Lundmark, K., et al. Transmissibility of systemic amyloidosis by a prion-like mechanism. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (10), 6979-6984 (2002).
  37. Lai, C. H., Chou, C. Y., Ch'ang, L. Y., Liu, C. S., Lin, W. Identification of novel human genes evolutionarily conserved in Caenorhabditis elegans by comparative proteomics. Genome Res. 10 (5), 703-713 (2000).
  38. Xu, X., Kim, S. K. The early bird catches the worm: new technologies for the Caenorhabditis elegans toolkit. Nat Rev Genet. 12 (11), 793-801 (2011).
  39. Boulin, T., Hobert, O. From genes to function: the C. elegans genetic toolbox. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1 (1), 114-137 (2012).
  40. Nussbaum-Krammer, C. I., Park, K. W., Li, L., Melki, R., Morimoto, R. I. Spreading of a prion domain from cell-to-cell by vesicular transport in Caenorhabditis elegans. PLoS Genet. 9 (3), e1003351 (2013).
  41. Chernoff, Y. O., Lindquist, S. L., Ono, B., Inge-Vechtomov, S. G., Liebman, S. W. Role of the chaperone protein Hsp104 in propagation of the yeast prion-like factor [psi. Science. 268 (5212), 880-884 (1995).
  42. Liu, J. J., Lindquist, S. Oligopeptide-repeat expansions modulate 'protein-only' inheritance in yeast. Nature. 400 (6744), 573-576 (1999).
  43. Halfmann, R., et al. Prions are a common mechanism for phenotypic inheritance in wild yeasts. Nature. 482 (7385), 363-368 (2012).
  44. Tyedmers, J., Madariaga, M. L., Lindquist, S. Prion switching in response to environmental stress. PLoS Biol. 6 (11), e294 (2008).
  45. Krammer, C., et al. The yeast Sup35NM domain propagates as a prion in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (2), 462-467 (2009).
  46. Hofmann, J. P., et al. Cell-to-cell propagation of infectious cytosolic protein aggregates. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (15), 5951-5956 (2013).
  47. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
  48. Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection. J. Vis. Exp. (18), e833 (2008).
  49. Transformation and microinjection. WormBook. Evans, T. C. , (2006).
  50. Methods in cell biology. Wormbooks. Shaham, S. , (2006).
  51. Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. Long-term imaging of Caenorhabditis elegans using nanoparticle-mediated immobilization). PLoS One. 8 (1), e53419 (2013).
  52. Fay, D. Genetic mapping and manipulation: Chapter 1-Introduction and basics. WormBook. , (2006).
  53. Kamath, R. S., Ahringer, J. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods. 30 (4), 313-321 (2003).
  54. Rual, J. F., et al. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Res. 14 (10B), 2162-2168 (2004).
  55. Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
  56. Kern, A., Ackermann, B., Clement, A. M., Duerk, H., Behl, C. HSF1-controlled and age-associated chaperone capacity in neurons and muscle cells of C. elegans. PLoS One. 5 (1), e8568 (2010).
  57. Becker, J., Walter, W., Yan, W., Craig, E. A. Functional interaction of cytosolic hsp70 and a DnaJ-related protein, Ydj1p, in protein translocation in vivo. Mol Cell Biol. 16 (8), 4378-4386 (1996).
  58. Salvaterra, P. M., McCaman, R. E. Choline acetyltransferase and acetylcholine levels in Drosophila melanogaster: a study using two temperature-sensitive mutants. J Neurosci. 5 (4), 903-910 (1985).
  59. Goloubinoff, P., Mogk, A., Zvi, A. P., Tomoyasu, T., Bukau, B. Sequential mechanism of solubilization and refolding of stable protein aggregates by a bichaperone network. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (24), 13732-13737 (1999).
  60. Schroder, H., Langer, T., Hartl, F. U., Bukau, B. D. naK. DnaJ and GrpE form a cellular chaperone machinery capable of repairing heat-induced protein damage. EMBO J. 12 (11), 4137-4144 (1993).
  61. Rampelt, H., et al. Metazoan Hsp70 machines use Hsp110 to power protein disaggregation. EMBO J. 31 (21), 4221-4235 (2012).
  62. Gupta, R., et al. Firefly luciferase mutants as sensors of proteome stress. Nat Methods. 8 (10), 879-884 (2011).
  63. Gidalevitz, T., Ben-Zvi, A., Ho, K. H., Brignull, H. R., Morimoto, R. I. Progressive disruption of cellular protein folding in models of polyglutamine diseases. Science. 311 (5766), 1471-1474 (2006).
  64. Ben-Zvi, A., Miller, E. A., Morimoto, R. I. Collapse of proteostasis represents an early molecular event in Caenorhabditis elegans aging. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (35), 14914-14919 (2009).
  65. Karady, I., et al. Using Caenorhabditis elegans as a model system to study protein homeostasis in a multicellular organism. J Vis Exp. (82), e50840 (2013).
  66. Gidalevitz, T., Krupinski, T., Garcia, S., Morimoto, R. I. Destabilizing protein polymorphisms in the genetic background direct phenotypic expression of mutant SOD1 toxicity. PLoS Genet. 5 (3), e1000399 (2009).
  67. Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (16), 10417-10422 (2002).
  68. Brignull, H. R., Moore, F. E., Tang, S. J., Morimoto, R. I. Polyglutamine proteins at the pathogenic threshold display neuron-specific aggregation in a pan-neuronal Caenorhabditis elegans model. J Neurosci. 26 (29), 7597-7606 (2006).
  69. Mohri-Shiomi, A., Garsin, D. A. Insulin signaling and the heat shock response modulate protein homeostasis in the Caenorhabditis elegans intestine during infection. J Biol Chem. 283 (1), 194-201 (2008).
  70. Libina, N., Berman, J. R., Kenyon, C. Tissue-specific activities of C. elegans DAF-16 in the regulation of lifespan. Cell. 115 (4), 489-502 (2003).
  71. Schatzl, H. M., et al. A hypothalamic neuronal cell line persistently infected with scrapie prions exhibits apoptosis. J Virol. 71 (11), 8821-8831 (1997).
  72. Keith, S. A., Amrit, F. R., Ratnappan, R., Ghazi, A. The C. elegans healthspan and stress-resistance assay toolkit. Methods. , (2014).
  73. Pierce-Shimomura, J. T., et al. Genetic analysis of crawling and swimming locomotory patterns in C. elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (52), 20982-20987 (2008).

Tags

ביולוגיה תאית גיליון 95, מחלות ניווניות מחלות misfolding חלבון כמו-פריון הפצה שידור תא אל התא צבירת חלבון רעילות אוטונומית שאינו תא פרוטוסטאזיס
חוקר את החלבונים כמו פריון-הפצת ורעילות של שימוש במטזואניים דגם אורגניזם<em&gt; C. elegans</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M.… More

Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans. J. Vis. Exp. (95), e52321, doi:10.3791/52321 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter