Introduction
알츠하이머 병 (AD), 파킨슨 병 (PD), 근 위축성 측삭 경화증 (ALS) 및 전염성 해면상 뇌증 (TSEs)를 포함한 많은 신경 변성 질환, 응집하기 쉬운 단백질과 연관되어 있고, 따라서 집합 적 단백질 미스 폴딩 장애 (즉 PMD라고도 ). 그들은 모두 인간과 동물 (1)에 감염 될 수 있다는 점에서 TSEs 또는 프리온 질병은 PMD를 독특한 클래스를 구성한다. 분자 수준에서, 프리온은 모집 및 병리학 적 β-시트 풍부한 PRP 사우스 캐롤라이나 형태 2,3에 단량체 α 나선이 풍부한 호스트 인코딩 세포 PRP (PRP C)를 변환하여 복제합니다. 자체 전파 단백질 응집체는 포유 동물의 프리온 4,5으로 중요한 특성을 공유 곰팡이에서 확인되었다. 또한 프리온은 포유류 세포 간에서 이동할 수 있으며 6,7 나이브 세포를 감염.
즉 PMD의 OTH 동안어 TSEs는 전염성이없는 것보다, 그들은 프리온 질환 8,9와 공통 병원성 원칙을 공유 할 수 있습니다. PMD를 각각에 연결된 단백질 구조 또는 기능에 관련되지는 않지만, 그들은 결정화와 같은 과정을 통해 모든 형태의 집계는 핵이라고 또는 중합 시드; 또한 단백질 씨는 수용성 이소 2,10,11 모집에 의해 성장한다. 자기 전파 효율이 함께 같은 분자 샤페론 같은 추가적인 요인 궁극적으로 세포 집합체 핵 시딩 단편화 및 12-15의 확산 속도를 결정하는 단백질의 고유 특성에 따라, 생체 내에서 변화한다. 따라서, 단백질 응집을 효율적으로 전파 할 수 있습니다 이러한 요인들 사이에서 좋은 균형이 존재해야한다. 일부 아밀로이드 응집체가 프리온의 특성을 항구, 따라서 모든 PMD가이 전염성이있는 이유도 설명 할 수 있습니다. 프리온은 '최고의 공연'O를 대표하는 것그들에게 PMD가 8, 13을 연구 할 수있는 강력한 도구를 만드는 자기 복제 단백질 집합체의 FA 다양한 스펙트럼.
흥미롭게도, 질병 관련 집계와 관련된 독성은 종종 비 셀 자율적 인 구성 요소 (16, 17)이있다. 이것은 그들이 단지 세포 유전자 전시에게 특정 표현형을 발현하는 것을 의미 엄격 셀 자율적 효과와는 달리, 해당 유전자를 발현하지 않는 인접 셀에 영향을 미치는 것을 의미한다. 이것은 강력하게 조직 - 특이 적 발현에 의해 증명 또는 신경 퇴행성 질환 18 ~ 26의 다양한 모델의 각 단백질의 노크했다. 다양한 메커니즘 점감 영양 공급, 신경 신호 불균형, 글루타메이트 흥분 독성 (excitotoxicity), 및 신경 염증 16,27,28 포함 PMD가이 비 - 자율적 인 세포 독성의 기초로 제안되어왔다. 또한, 질환 세포 간의 결합 된 응집체의 프리온 같은 운동 might이면 (29, 30)에 기여한다. 증가 증거는 프리온이 아닌 다른 단백질 흠이 특성은 여러 가지 PMD 30-36에서 관찰되는 병리의 확산을 설명 할 수있는 세포 간에서 송신 할 수 있음을 시사한다. 그러나, 아직 질환 단백질의 세포 내 이동 및 이웃 셀에 대한 독성 효과 사이의 명확한 인과 관계가 있는지를 판정해야한다. 따라서, 셀 간 전송 및 비 자율 세포 독성의 기초 세포질 통로의 더 나은 이해는 신규 치료법의 개발이 필요하고 필수적이다. 그러나, 후생 동물에 잘못 접힌 단백질의 세포 간 전송에 영향을 미칠 확산 및 세포 인자 프리온 등의 여러 측면이 아니라 생명체의 수준에서, 특히 이해되지 않습니다.
예쁜 꼬마 선충 선충은 잠재력을 제공하는 몇 가지 장점이 있습니다 프리온 같은 spreadi의 새로운면을 발견후생 동물 17 ng를. 이는 생체가 생체에서의 형광 태그로 단백질을 추적 가능 투명하다. 또한, 질병에 의해 영향을받는 많은 세포 및 생리 학적 과정은 인간에 웜으로부터, 그리고 C.된다 엘레 또한 유전자 조작 및 분자 생화학 적 분석 37 ~ 39의 다양한 의무입니다. 정확히 959 체세포는 여전히 근육, 신경 및 대장 등 여러 가지 별개의 조직 유형을 가지고 간단한 몸 계획을 가지고있는 성인 자웅 동체를 구성합니다.
C. 새로운 프리온 모델을 설정하려면 엘레, 우리는 벌레 4,40에는 알려진 내생 프리온 단백질이 없기 때문에 외생 적, 잘 특징 글루타민 / 아스파라긴 (Q / N) 세포질 효모 프리온 단백질 Sup35의이 풍부한 프리온 도메인 NM을 표현하기로 결정했습니다. 효모 프리온은 프리온 복제 41 ~ 44의 기본 메커니즘을 밝히는데 귀중한왔다. 또한, NM은 전나무이다포유 동물 세포 배양 물 45, 46에서 프리온의 전체 라이프 사이클 요점을 되풀이하는 것으로 나타났다 세포질 성 단백질 프리온 등. 마찬가지로, C로 표시 할 때 엘레, 미토콘드리아 무결성 및 외관의 중단을 포함하여 40. NM 집계가 깊은 독성 표현형와 관련이 효모 세포 프리온 생물학의 전시 주요 기능에 비해 후생 동물 세포에서의 전파에 대한 다양한 요구 사항에 매우 잘 채택 Sup35 프리온 도메인 세포 수준과 관련된 다양한 자식 작용 소체뿐만 아니라 배아와 유충 마비, 발달 지연과 유기체 레벨에 단백질 접힘 환경 교란 광범위. 놀랍게도, 프리온 도메인 유전자가 발현되지 않은 인접 조직에 영향을 미치는 세포 자율 및 비 자율 세포 독성을 나타낸다. 또한, 내부 및 셀간 프리온 도메인 소낭 수송 실시간 모니터링된다 <EM> 생체 (40).
여기에서 우리는 C.에서 프리온 등의 보급을 검사하는 방법에 대해 설명합니다 엘레. 우리는 시간 경과 형광 현미경을 이용하여 프리온 도메인을 함유 소포 인트라 및 세포 간 수송을 모니터링하는 방법을 설명 할 것이다. 우리는 조직 - 특이 폴딩 센서의 사용을 강조 편재 셀룰러 니스에 셀 자율 및 비 자율 셀에 미치는 효과를 평가하기 위하여, 응력 기자를 표현한다. 마지막으로, 우리는 프리온 - 유도 독성의 새로운 개질제를 식별하기 위해 최근에 수행 넓은 게놈 RNA 간섭 (RNAi의) 화면의 순서를 설명한다. 조합, 이러한 방법은 단백질의 세포 간 이동 및 그 이외의 세포 자율 독성에 관여하는 유전 적 경로를 떨어져 애타게하는 데 도움이 될 수 있습니다.
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Protocol
1. 모니터링 세포 횡단는 생체 시간 경과 영상으로 프리온 같은 단백질의 확산
참고 : C. 성장 표준 방법에 조심스럽게 재배 온도 (47)를 제어에 따라 elegans의 야생형 (WT) (N2)와 유전자 변형 라인.
- C.의 유전자 변형 라인을 생성 엘레 단량체 적색 형광 단백질 (MRFP) 태그 프리온 같은 단백질을 표현. 미세 주입 (48)를 사용하는 방법을 보여줍니다 비디오를 시청. 이러한 염색체 외 라인을 통합하는 방법에 대한 자세한 내용과 방법에 대해서는 49을 참조하십시오.
- 계란은 표준 방법 (50)에 따라 누워 또는 표백에 의해 동기화 인구를 준비합니다.
- 달걀 누워에 의해 동기화
- 전송 10-20 임신하는 접시에 성인들이 1 알을 낳는하자 - 2 시간. 접시에서 어른을 제거하고 자손이 원하는 나이까지 성장 할 수 있습니다.
<표백에 의한 리> 동기화 - 임신하는 성인의 동기화 인구를 수집 및 알칼리 차아 염소산 용액 (250 mM의 NaOH를 1 : H 2 O 상업 표백제의 4 (v / v)로 희석)로 표백. 2 O 7H, 22 mMKH 2 PO 4, 86 mMNaCl, 1 mMMgSO 4 ·가 7H 2 O, 1 dH보다 2 O를 추가 M9 버퍼 (47) (21 mMNa 2 HPO 4 · 회 (218 XG 분 1) 계란을 세척 L).
- 그들이 20 ° C에서 / 부드러운 교반 O와 M9 버퍼에 N을 부화 할 수 있습니다. 웜 개발 동기화 모집단을 떠나고, 음식 공급원의 부재하에 L1 단계에서 정지한다. OP50 E. 시드 신선한 선충 성장 미디어 (NGM) 접시에 L1s로 이동 대장균 박테리아와는 자손이 원하는 나이 47까지 발전 할 수 있습니다.
- 달걀 누워에 의해 동기화
- 두 마일 준비그들의 전체 길이에 걸쳐 배치 된 테이프와 라벨 croscope 슬라이드 스페이서로서 이용된다. 그들 사이의 제 3 현미경 슬라이드를 놓습니다.
- 깨끗한 슬라이드에 H 2 O 2 % 아가로 오스와 피펫 한 방울을 녹여.
- 한천 드롭의 상단에있는 세 개의 다른 슬라이드에 수직 네 번째 슬라이드를 놓습니다. 조심스럽게 라벨 테이프와 같은 두께로 패드를 평평를 누르십시오.
- 스페이서를 제거하고 부드럽게 떨어져 슬라이드를 당겨 전에 1 분 동안 말리면. 한천 패드는 그 중 하나에 충실합니다.
- 10 % AGA 준비(M9 버퍼) (51)을 설명하고 3 μL 나노 구체의 크기 표준 솔루션 웜 (폴리스티렌 비즈, 100 ㎚) 플러스 3 μL 마취제 (M9 버퍼에 4 밀리미터의 levamisole)를 추가로 패드를했다. 커버 슬립으로 가볍게 커버. 탈수를 방지하기 위해, VALAP (바셀린, 라놀린, 파라핀 왁스 같은 양의 혼합물)와 커버 슬립을 봉인.
주 : 결과 EM-CCD 카메라와 MetaMorph로부터 같은 현미경 자동화 및 이미지 분석 소프트웨어를 구비 한 스피닝 디스크 AF 공 촛점 현미경을 사용하여 획득하고 아래 구체적인 개요이지만, 다른 유사한 공 초점 영상 시스템도 사용될 수있다.
- 63X 또는 100X / 1.4NA 오일 목표를 사용하여 현미경 슬라이드 홀더에 웜을 포함하는 현미경 슬라이드를 놓습니다.
- 소프트웨어를 엽니 다. MRFP 이미징을위한 레이저 파워 및 필터를 조정합니다. 10 %의 전력 및 배출 필터> 600 nm에서 561 nm의 레이저를 사용합니다.
- "저장"탭에서 선택하거나 파일을 저장할 디렉토리 폴더를 만듭니다. 파일에 이름을 지정합니다.
- "파장 길이"탭에서 적절한 조명을 선택하고 노출과 이득을 조정합니다. 100 ~ 300 밀리 초 100과 300 사이의 카메라 이득 사이의 노출 "YokoQuad 레드"(또는 MRFP 이미징 동등한 조명 설정)을 사용하여, 각각의 샘플에 따라 (라이브 이미지를 사용하여 평가).
- "어 Timelapse"탭에서 "시점의 수"= 301, "시간"= 5 분 "시간 / 간격"= 1 초를 선택합니다.
- "AFC SET의 Z의 HOLD"와 "Z의 HOLD에 AFC 반환"유형 : "저널"탭을 선택 저널에서 &# 8220; 특수 "(2 회), 초기 점 :"시작 시간의 점 "과"시점의 끝 ". 이 옵션은 자동 초점 화상 장기간에 걸쳐 동일한 부분에 중요하다.
- 설정을 완료 한 후 "취득". 인터벌 동영상은 별도의 TIFF 파일로 세이프가 걸려있다.
- ImageJ에 주어진 시계열의 모든 .TIFF 파일을 엽니 다. "이미지"→ "스택"→ "스택에 이미지"로 이동합니다. 선택적으로, → "파일"의 영화를 내보내기 등, 크기, 줄을 추가, 밝기 및 대비를 조정 → "AVI ..." "다른 이름으로 저장"(예를 들어, 비디오 1과 2는 그림 1에 해당하는 참조).
2. 자율 및 비 세포 자치가 Proteostasis 및 독성에 미치는 영향 세포를 조사하기 위해 접는 센서 및 스트레스 기자 사용
- 접이식 센서 또는 스트레스 reporte을 같이 발현 형질 전환 라인을 생성함께 프리온 같은 단백질과 R. 십자가를 설정하거나 유전자 변형 라인을 생성하는 방법에 대한 방법에 대해서는, 48,49,52를 참조하십시오. C.의 목록은 표 1을 참조하십시오 사용할 수있는 엘레 균주.
- 형질 전환 동물의 동기 인구를 준비하고 (1.2 절) (50) 전술 한 바와 같이 원하는 세 때까지 성장합니다.
- 실체 현미경을 사용하여 접는 센서 또는 스트레스 기자의 각각의 표현형을 확인합니다.
- 폴딩 센서, 동기 후의 각 날 응집체 은닉 동물의 수를 결정 (예컨대,도 2e 및 F 참조).
- 스트레스 기자를 들어, 테스트 기자의 증가 형광 프리온 같은 단백질 결과의 동시 발현은 (예를 들어, 그림 3 참조)합니다.
C.에서 프리온에 의한 독성의 억제를위한 3 게놈 전체 화면 엘레
RNAi의 심사 프로토콜의 4 도식 표현 그림. 각 단계에 대한 자세한 설명 프로토콜 (3)을 참조하십시오.
- C.의 동기화 엘레 웜과의 RNAi 라이브러리의 중복
- RNAi의 화면의 경우, Ahringer의 RNAi 라이브러리 (또는 비달의 RNAi 라이브러리) 53, 54을 사용합니다. 10 % 글리세롤 보충 100 μl의 LB-A 미디어와 플레이트 (LB 50 ㎍ / ml의 암피실린)를 작성하여 96 웰 플레이트에 원래 384 웰 형식에서의 RNAi 라이브러리를 Rearray 및 96 핀 복제기를 사용하여 접종. -80 ° C에서 교반 및 저장 37 ° CO / N에서 성장.
- C. 유지 엘레 WT 20 ° C NGM에 플레이트에서 형질 전환 라인은 OP50 E. 시드 표준 방법 (47)에 따라 대장균 박테리아.
- 표백에 의해 프리온 도메인 형질 전환 및 WT (제어) 선충을 동기화 (1.2 절 참조).
- 웜이 표백되는 당일에, 50 ㎍ / ㎖의 앰피 실린이 보충 된 LB 매체를 준비한다. 분배하도록 자동 지급기 시약을 사용하여 (또는 수동 피펫)을 96 웰 플레이트의 각 웰에 LB-A 매체 65 μL.
- -80 ° C에서 96 웰 Ahringer의 RNAi 라이브러리 플레이트를 제거하고 종이 타월로 줄 지어 멸균 후드에 가져. 즉시 플레이트가 계속 동결하는 동안 판의 외부에 얼음에서 오염되지 않도록주의하면서, 거꾸로 접시를 들고하여 밀봉 테이프를 제거합니다. 판을 Reinvert하고 약 30 분 동안 해동 수 있습니다.
- 하나의 신선한 LB-A 플레이트에 다음 하나의 RNAi 라이브러리 플레이트에 한 멸균 96 핀 복제기를 찍어합니다. 각각의 판에 대한 신선한 무균 복제를 사용합니다. 접착 호일 테이프 모든 판을 밀봉 및 -80 ° C에 라이브러리 번호판을 반환합니다. 벌레는 표백제에 담가 세척 할 수있다,다시 사용할 수 있도록 멸균.
- 중복 된 RNAi의 플레이트가 37 ° C, 300 rpm으로 설정 인큐베이터에서 O / N을 성장하도록 허용합니다. HT115 E.을 사용하려면 대장균 컨트롤로 빈 벡터 (L4440)를 숨겨 박테리아, 문화 관에 별도로 성장하고 두 개의 96 웰 플레이트의 1/4에 멀티 채널 피펫 문화의 65 μl를 피펫.
- 박테리아 dsRNA를 생산 및 웜의 첨가 유도
- DDH 2 O.에 5 mM의 농도로 이소 프로필-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG)를 희석 분배하도록 멀티 헤드를 사용하여 자동화 된 워크 스테이션 (또는 수동 피펫)의 RNAi 박테리아와 제어 플레이트의 각 웰에 희석 IPTG 10 μL. 다시 봉인 및 인큐베이터에 접시를 배치합니다. 이를 37 ℃에서 3 시간 동안 흔들어 보자.
- 박테리아가 떨고있다 동안, 벌레를 준비합니다. 유리 현미경 슬라이드에 - (10 μL ~ 5) 작은 샘플을 잘 M9 / 웜 현탁액을 혼합하고, 피펫. 계산실체 현미경 벌레의 수와는 μL 당 벌레의 수를 계산한다.
- 0.20 ㎎ / ㎖ IPTG, 8.0 ㎍ / ㎖의 콜레스테롤 50 ㎍ / ml의 암피실린, 9.6 ㎍ / ㎖의 테트라 사이클린 0.0835 ㎍ / ml의 Fungizone을하며 : 무균 기술을 사용하여, 다음의 최종 농도로 보충 M9 (M9 +)의 용액을 제조 50 μL 당 15 벌레.
- 프리온 도메인 형질 전환 및 WT 웜에 대한 별도의 솔루션을합니다. 최종 (아래 참조)의 RNAi 복사 플레이트의 수에 의존 할 필요 M9 + 웜 용액의 부피, 플러스 ~ 자동 디스펜서가 사용되는 경우, 저장소 내에 남아 불감 부피의 30 ㎖.
- 박테리아 dsRNA를 생산의 3 시간 유도 한 후, 인큐베이터에서 접시를 타고 그들이 동물을 강조 열을 피하기 위해 RT (~ 30 분)으로 냉각 할 수 있습니다.
- 각각의 RNAi 판 웰과 빈 벡터 제어 플레이트의 일 50 μL + M9 프리온 유전자 도메인 웜 용액을 분주한다. 확인동물 저장조의 바닥으로 침강하는 경향이 각 공정 전에 웜 용액을 혼합하여주십시오.
- 제 2 제어 플레이트에 WT 웜을 분배. 포기를 할 수 있도록 봉인 판을 둡니다. 5 접시를 함께 젖은 종이 타월 및 알루미늄 호일로 포장 - 증발에서 액체 문화를 유지하기 위해, 4 스택. 4 일 동안 20 ° C에서 200 rpm으로 품어.
- 점수
참고 : 인큐베이터 4 일 후, 웜은 성인의 두 번째 날에하고 화면 준비가됩니다. 동물이 방해받지 래싱을 보장하기 위해 심사 전에 30 분 동안 비 흔들어 조건을 조정할 수 있습니다.- 제어 처리 프리온 도메인 형질 전환 동물에 비해 증가 탈곡 육안 모니터 화면 컴퓨터에 접속 된 콘 4M60 카메라를 사용.
- wrMTrck를 사용하여 확인하는 예비 히트 곡의 목록을 컴파일 (다음 절 참조).
예비 4. 확인화면 조회수
- 고체 접시에 운동성 분석
- 표준 방법 (47)에 따르면, 100 ㎍ / ㎖의 앰피 실린, 12.5 ㎍ / ㎖의 테트라 사이클린 및 1 mM의 IPTG로 보충 NGM와 접시를 준비합니다. 가능하다면, 모든 플레이트가 유선형 영상 획득 과정을 허용 할 미디어의 동일한 높이를 가질 보장 플레이트 주출 기계를 사용한다.
- 37 ° C, 250 rpm에서 ~ 1 ML의 LB + 50 ㎍ / ㎖의 앰피 실린, O / N의 다른 RNAi의 클론 성장.
- 다음날, 3 시간 동안 1 mM의 IPTG로하는 dsRNA의 발현을 유도한다. 얇은 층으로 확산 각각의 RNAi 세균성 클론의 150 μL와 접시를 시드. 어둠 속에서 실온에서 2 일간 건조 박테리아를 보자. RNAi의 클론 당 3 판을 준비합니다.
- 표준 방법 (50) (1.2 절 참조)에 따라 표백하여 웜 인구를 동기화하고, 알이 부화의 O / N M9 미디어를 할 수 있습니다.
- 웜 현탁액을 샘플 및 NEM의 양을 결정실체 현미경에서 μL 당 atodes. 30 L1 웜 -가 (25)가 포함되도록 그런 다음, 각 실험 플레이트에 M9 플러스 웜의 적절한 볼륨을 피펫. 벌레가 성년의 날 2에 도달 할 때까지 4 일 동안 20 ° C에서 선충 성장.
- ImageJ에 대한 wrMTrck 플러그인과 웜 운동의 정량 분석
참고 : 비디오는 하마 오카-R2 디지털 카메라 C10600-10B와 하마 마츠 간단한 PCI 이미징 소프트웨어의 10 배 배율로 실체 현미경을 사용하여 기록 하였다.- 카메라와 간단한 PCI 이미징 소프트웨어를 켭니다. 이미징 조건의 조정을 허용하기 위해 "라이브"를 클릭합니다.
- 다음 영상 조건을 설정 : 게인 = 0; 라이트 모드 = 높은; 속도 지수 = 1; 비닝 = 2. "자동 노출"다음 현미경 거울과 밝기 및 대비 다이얼을 이동, 조명 조건을 조정합니다.
참고 : 비디오는 overexp없이 높은 대비가 필요동물 밝은 배경으로 검은 모양을 나타나도록, osed. - "시간 스캔"을 클릭하고 폴더와 파일 이름을 선택합니다. 20 밀리 초에 "필드 지연"을 설정하고 30 초에 "시간에 정지". (대부분의 웜이 어디에) 기록하는 판의 영역을 선택하기 위하여 눌러 "라이브 리뷰". 보기 "시작"을 누릅니다 분야에서의 위치를 확인 빨리 무대에있는 플레이트에 3 ~ 4 번을 누릅니다.
- 동영상 촬영을 마친 후, 오른쪽 이미지를 클릭 .AVI에 .cxd 형식에서 동영상을 내보낼 "수출 몽타주 시퀀스"를 선택합니다.
- 운동성 비디오를 분석한다
- , ImageJ에 소프트웨어를 열고 "플러그인"탭으로 이동 한 다음 "wrmtrck을"과 "wrMTrck 배치"를 선택합니다. 모든 파일이 들어있는 디렉토리를 선택 분석합니다.
- Figur에 자세히 wrMTrck_Batch의 기본 입력 창에 입력 된 값을로드전자 5C. 각 매개 변수에 대한 설명은 플러그인을 동반 지침에서 찾아 볼 수있다. "OK"를 클릭하고 이동 분석을 실행 할 수 있습니다.
- 결과를 보좌 신부와 감지 된 모든 트랙이 실제 C.에서하는 것을 확인하기 위해 엘레 및 아티팩트 제거, 각각의 동영상에 대해 생성 .txt 파일들 각각을 열고 데이터 분석 소프트웨어 파일에 정보를 복사한다. 만든 "* _labels.zip"파일을 열고 수동으로 확인하고 거짓 웜 트랙을 제거하는 결과 "*의 _labels.tif"를 실행합니다.
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Representative Results
생체 시간 경과 영상에 의해 프리온 같은 단백질의 확산 세포 간 모니터링
형질 전환 C. 프리온 도메인을 발현 간스 라인 형상의 프리온 단백질, 예를 들면 세포 간 전송 및 비 자율 세포 독성의 특정 양상의 분석에 특히 적합하다. 수의 형광 추적 동물의 투명성은 삶의 모든 단계에서 생체 내에서 단백질을 태그. 이것의 활용, 세포 형광 현미경을 사용하여 조직에서 프리온 같은 단백질의 움직임이 가시화된다. 63X 또는 100X / 1.4NA 기름 목적은 기공 구조를 해결하는 것이 필요하다. 중요한 것은, 프리온 도메인이 아마도 산성 소포 (40) 내에서 형광 계속 표시하기 위해, MRFP 태그되어야한다. 종종 태그로 사용되는 노란색 형광 단백질 (YFP), 난그것은 낮은 pH 환경 40,55 급냉되기 때문에 적합 아니다. 혼자 RFP 태그 (그림 1A 및 B) 가용성을 유지하면서 긴장 AM815은 RFP-태그 R2E2 관 소포에 축적 (프리온 도메인 NM의 고도로 응집 경향이 독성 형태)을 표현한다. 생체 시간 경과 영상에 사용하면, 이러한 관 소포 내에서 셀 (40) (그림 1C 및 D, 비디오 1, 2) 비디오 【장소 링크 사이에 전송되는 것을 관찰 할 수있다 1, 2 여기].
접이식 센서와 스트레스 기자를 사용하면 proteostasis 및 독성 세포 자율과 비 세포 자치 미치는 영향을 조사하기 위해
프리온 종자 관련 단백질을 건너 세포 단백질 접힘 환경을 방해 할 수 있습니다. 이것은 적절한 접는 열차의 동시 발현을 통해 공개 될 수 있습니다RS. 접는 센서가 제대로 폴드 기능 proteostasis 네트워크에 의존하는 비 본질적인 준 단백질이다. 일부 예는 공지 된 반딧불 루시퍼 라제 및 온도에 민감한 (TS) 돌연변이 56-66 은닉 단백질이다. proteostasis의 중단은 골재의 육안 검사 또는 허용 온도에서 각각의 TS 돌연변이 표현형의 노출에 의해 검출 될 수 기자의 잘못된 폴딩 리드. 그들은 나이에 따라 집계 67-69을 전시하기 때문에 집계 (40 잔류 물)의 문턱에서 길이 폴리 글루타민 (polyQ)의 뻗어도 자주 사용된다. 통합 이전 발병 위험에 노출 된 접이식 환경을 보여준다. 여기, 우리는 C.로 표현하면 가용성 유지 프리온 변이 RΔ2-5 고용 엘레 몸 벽 근육 (BWM) 세포와 대장 (40) (그림 2A 및 C). BWM 세포에서 R2E2 동시 발현시, RΔ2-5 정말이에요단백질 접힘 환경에 R2E2의 셀 자치 효과를 드러내는 디일 집계 (그림 2B). proteostasis 미스 폴딩 및 조직 전반의 유도에 광범위한 효과 프리온 도메인 매우 응집하기 쉬운 형태를 발현하지 않는 별개의 조직에서 폴딩 센서의 식으로 평가 될 수있다. RΔ2-5가 소장 - 특이 적 프로모터 (VHA-6P)에서 표현 된 반면 R2E2는 BWM 세포 특이 적 프로모터 (묘-3P)에서 발현되었다. 장 RΔ2-5의 집계 R2E2가 아닌 셀 자율적 인 방식으로 (40) (그림 2D)에서 단백질 접힘 영향을 미친다는 것을 보여줍니다. 대신 응집체만을 고해상도로 검출 할 수 RΔ2-5를 사용하는 대신, polyQ44의 사용은 소장에서 발현 (Q44i)는 입체 (도 2e와 F)에서 저해상도 응집체의 시각화를 허용한다. 또한,이 애니의 정량화 할 수 있습니다LS 골재뿐만 아니라 골재의 수 정량.
프리온 도메인의 비 세포 자치 독성을 조사하기 위해, 우리는 이전에 전자 현미경으로 R2E2을 표현하지 않는 조직을 이웃 검사하고, 근육 세포에서 프리온 도메인의 표현 인접 조직에서 미토콘드리아의 무결성의 비 세포 자치 중단에 이르게 발견 장 40. 증가 된 활성 산소 종 (ROS) 생산 및 산화 스트레스의 결과 미토콘드리아 기능 장애. 산화성 스트레스 반응의 유도를 시각화하는 비 침습적 방법은 산화 스트레스 유도 성 리포터 (70)를 사용하는 것이다. 변형 CF1553는 산화 스트레스 유도 성 프로모터 SOD-3 (70)에서 녹색 형광 단백질 (GFP)을 표현한다. BWM 세포 프리온 R2E2 도메인을 발현하는 동물을 교차 할 때, 리포터 크게 (다양한 비 BWM 조직뿐 아니라 BWM 세포에서 상향 조절되었다
C.에서 프리온에 의한 독성의 억제를위한 게놈 와이드 스크린 엘레
프리온 도메인의 복잡한 독성 표현형 C. 표현 엘레 때문에 체외 프리온 모델 (71)에서 관찰되는 가장 뚜렷한 독성 부족 특히 흥미 롭다. 이 모델은 후생 동물의 프리온과 관련된 독성에 영향을 미칠 수있는 새로운 경로를 발견 할 수 있다는 것입니다. 이 문제를 해결하기 위해, 우리는 RNAi의이 고갈 된 경우, R2E2 형질 전환 동물의 운동성 결함을 개선하는 것, 유전자 검사를했다. WT 제어 처리 된 벌레는 포지티브 (CO)와 같이 사용될 수있다ntrol, 비록 대부분의 후보 유전자로 인해 변수의 RNAi 투과도 및 형질 전환 유전자의 높은 독성, 전체 이동 표현형 구조를 제공하지 않습니다. 동물 성년의 날이 첫 번째 애벌레 상태 L1에서의 RNAi와 함께 4 일 동안 처리 하였다. 그때까지, 치료 R2E2 동물의 대패는 우리가 운동성의 향상을 위해 선별되기 때문에 중요하다 WT 동물의 탈곡,보다 훨씬 느립니다. F1의 자손 (~ L1s) 존재하지만, P0 세대 구분하기가 용이합니다. 전용 P0 발생을 얻었된다. 이 초기 화면은 정량적 시각적 및 비이므로, 낮은 임계 프리온 발현 동물 탈곡 증가 듯 모든 세균의 RNAi 클론 정량적 크롤링 분석에서 재검사 하였다 즉, 예비 히트를 식별하는 데 사용 하였다. (4)를 설명 도표 화면 설정의 주요 단계. 팔콘 4M60 카메라의 고해상도 quar의 시각적 검사를 활성화화면이 더 효율적으로 완료 될 수 컴퓨터 화면이 시간에 플레이트의 운. 유용하지만, 이것은 필요하지 않다. 웜 탈곡 육안 검사는 저배율 (10X)에서 입체경을 사용하여 수행 될 수있다.
예비 스크린 히트 확인
높은 처리량 화면을 분석하는 게놈 넓은 효과를 보완 방법으로 정제 할 수 후보 유전자의 주요 목록을 얻을 수있는 방법으로 수행됩니다. 화면 결과의 유효성 검사는 RNAi의 당 하나의 실험 샘플 화면을 수행 발생할 수 있습니다 가능한 오탐 (false positive)을 제거하는 것이 필수적이다. R2E2 형질 전환 동물은 차 히트의 RNAi의 클론 공급과 운동의 정량적 판독으로, 성인의 두 번째 날에 NGM 판에 자신의 속도를 측정하고 독성을 감소 하였다. 우리는 개발 ImageJ에 대한 wrMTrck 플러그인을 사용 우리의정확하게 C.를 식별 실험실, 동영상에서 엘레과 그들의 움직임에 따라 이동합니다. wrMTrck 플러그인 및 자동화 된 분석 스크립트는 오픈 소스 및 사용 방법에 대한 자세한 설명과 함께, http://www.phage.dk/plugins/wrmtrck.html에서 공개적으로 사용할 수 있습니다. 다운로드 한 후 ImageJ에의 플러그인 폴더에 전체 wrMTrck 폴더를 복사합니다. 이 프로토콜은 시간에 비디오를 다수 분석 wrMTrck_Batch 바람직한 방법을 설명하지만, 영화에 의하여, 동영상에 대한 지시, 분석은 또한 플러그인 다운로드와 함께 사용할 수있다. WrMTrck_Batch 배경 공제와 바이너리 형식으로 원본 동영상 (그림 5A)를 변환하고 각 웜은 트랙을 할당됩니다. 처리 된 동영상의 각 나중에 수동으로 거짓으로 웜 (전자. g., 트랙 1 그림 5B)에서 확인 된 모든 아티팩트를 제거하기 위해, 중첩이 트랙과 함께 볼 수 있습니다. 배경 기술을 제거하는 한가지 효과적인 방법 (그림 5B에 화살표로 표시) ifacts 신중하게 식별 할 수있는 개체의 최소 및 최대 크기 (그림 5C)를 선택하는 것입니다. wrMTrck 플러그인이 상이한 출력들에서, 우리는 따라서 전위 차이를 정규화하여, 각 물체의 몸체의 길이로 나눈 각 트랙의 길이에 의해 표시되는 각 동물의 평균 속도를 측정한다 (BLPS) 파라미터 초당 몸체 길이를 사용 선충 (그림 5D)의 크기. 이 방법을 사용하여, 우리는 R2E2는 C. 표현의 운동성 표현형을 증가 프리온에 의한 독성 (SOPT) 35 진압을 확인 엘레 적어도 %, 133 % 및 빈 벡터 처리 웜 (그림 6)에 비해 256퍼센트까지. 이 SOPT 유전자는 마지막이 우리의 높은 처리량 검열 노력의 결과 안타를 확인 나타냅니다.
21fig1highres.jpg "/>
프리온 도메인 1. 그림 C의 세포와 조직 사이에 확산 기공을 교통 엘레. (A)는 (B). 몸 벽 근육에 RFP를 표현하는 선충 (BWM) 세포 (RFPm)의 공 촛점 Z - 스택을 붕괴 매우 독성 및 집계 경향 NM 변형, R2E2을 표현하는 선충의 공 초점 Z-스택 접음 , BWM 세포 (R2E2m). 화살표 관 소포를 표시, 화살표 집계를 나타냅니다. (C + D) 동물의 시간 경과 시리즈 표현 RFPm (C) 및 R2E2m (D). 화살표는 기공 운동의 영역을 나타냅니다. RFPm 주로 확산 염색을 나타낸다. RFPm이 소체에서 발견되는 경우에도,이 거의 움직. R2E2m는 내부와 세포 사이에 전송되는 다수의 소포에 지역화. 스케일 바 : 10 μm의. 첨부 된도 1 및도 2 동영상 [여기 비디오 1 및도 2에 도시 링크]도 1C 및 D에 대응각각.
그림 2. 접는 센서는 proteostasis에 프리온 도메인의 광범위한 효과를 알 수있다. R2E2m의 (A + B) 동시 발현은 RΔ2-5m 응집을 촉진합니다. BWM 세포에서 R2E2m와 공동 발현 (A) RΔ2-5m 제어 및 (B) RΔ2-5m의 공 초점 이미지. (C + D) 근육 R2E2m이 장 RΔ2-5i 응집을 촉진 표현. RΔ2-을 표현하는 제어 동물의 (C) 공 초점 이미지 장 세포에서 5I. (D) 장내 BWM 세포와 RΔ2-5i에 R2E2m을 표현하는 동물의 공 초점 이미지. 스케일 바 : 10 μm의 (E + F) R2E2m는 Q44i의 비 세포 자율 통합을 유도 (E) Q44i과 Q44i의 대표 형광 이미지, R2E2m 동물 사일 동기화 L1의 LAR을 전송 한 후..VAE 신선한 OP50 시드 NGM 플레이트 상. BWM 세포에서 R2E2의 발현은 장내 Q44i 집계의 이전 발병에 이르게. (%에서) 집계와 동물 (F) 정량 표시 일에 동기화 후. 오류 바 SD를 나타내는이 수치는 40에서 수정되었습니다.
그림 3. 잔디-3P :: GFP 전사 스트레스 기자 프리온 도메인이 산화 스트레스의 세포 자율적이고 비 셀 자율적 인 유도를 일으키는 것을 알 수있다. (A + B) 주제 형광 SOD-3P의 (동일한 노출 시간을 사용하여) 이미지 :: GFP 발현 대조군 (A) 및 SOD-3P :: GFP;. 성년의 일 2 R2E2m 동물 (B) (C) BWM 세포에서 R2E2의 발현은 기자의 유도 BWM 셀뿐만 아니라 리드뿐만 아니라, 부위 (II), 신경 척수 내 S (I) (III), 인두와 헤드 뉴런 (IV).
ImageJ에 대한 wrMTrck 플러그인과 웜의 움직임도 5 분석. (A) 시간에 여러 동물을 모니터링하는 적절한 배율 (~ 10X)를 이용하여 생성 된 입력 동영상의 예. (B) "* _labels.tif"파일 wrMTrck_Batch의 출력은 다음과 해석 결과의 수동 큐 레이션을 허용. 화살표는이 프로토콜에서 사용되는 파라미터를 도시. 인해 최소 및 최대 크기 매개 변수의 적절한 선택을 올바르게 분석에서 제외 된 객체를 나타내는 wrMTrck_Batch의 (C) 입력 창. 이러한 매개 변수는 개별 현미경 및 동영상 설정에 따라 조절 될 필요가있다. MoveMe를 발 (D)의 출력 결과BLPS 열이있는 (B)의 NT를 분석, 노란색으로 강조. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
프리온에 의한 독성 (SOPT)의 supressors 있습니다 RNAi의 클론으로 처리 그림 6. R2E2 웜 향상된 운동성을 보여줍니다. 운동성은 상대 BLPS로 표시되는 음성 대조군 (빈 벡터)에 비해. HTP 화면에서 식별 된 모든 통계적으로 유의 한 (학생 t 검정) RNAi의 클론있는 바와 같다. 
그림 5의 예로서 도시의 히트를 나타냅니다. 결과는 조건 당 17 <N <53 트랙, 영화 3 편에 있습니다. 오차 막대는 SEM을 나타냅니다. </ P>
표 1. C. 엘레 접는 센서와 스트레스 기자를 표현하는 균주.
| 스트레인 이름 | 유전자형 | 댓글 | 스트레인 소스 | ||||
| 접는 센서 | |||||||
| 유전자 | |||||||
| AM140 | UNC-54P :: polyQ35 :: YFP | 근육 별 polyQ35의 발현, 나이 따라 집계 | CGC 또는 모리모토 실험실 | ||||
| AM141 | UNC-54P :: polyQ40 :: YFP | polyQ40, AG의 근육 특이 적 발현전자 의존 집계 | CGC 또는 모리모토 실험실 | ||||
| AM801 | UNC-54P :: RΔ2-5 :: YFP | 핵 무능한 프리온 도메인의 근육 특이 적 발현 | 모리모토 실험실 | ||||
| OG412 | VHA-6P는 :: polyQ44는 YFP을 :: | 소장 특정 polyQ44의 발현, 나이 따라 집계 | CGC | ||||
| AM809 | VHA-6P :: RΔ2-5 :: GFP; 미오-2P :: mcherry | 핵 무능한 프리온 도메인의 소장 특정 식 | 모리모토 실험실 | ||||
| AM47 | F25B3.3p :: polyQ40 :: CFP | polyQ40의 신경 세포 특이 적 발현, 세포 유형 특정 집계 | 모리모토 실험실 | ||||
| AM982 | unc54p :: 루시 페라 :: YFP | WT 반딧불 루시 페라 제의 근육 특이 적 발현 | 모리모토 실험실 | 미오-3P :: 루시 페라 :: GFP; ROL-6 | WT 반딧불 루시 페라 제의 근육 특이 적 발현 | Behl 연구소 | |
| SNG-1P :: 루시 페라 :: GFP; ROL-6 | WT 반딧불 루시 페라 제의 근육 특이 적 발현 | Behl 연구소 | |||||
| FUH55 | unc54p :: FLUC :: EGFP; ROL-6 | WT 반딧불 루시 페라 제의 근육 특이 적 발현 | 있는 Hartl 연구소 | ||||
| FUH134 | unc54p :: FLUCSM :: EGFP; ROL-6 | R188Q 돌연변이 반딧불 루시 페라 제의 근육 특이 적 발현 | 있는 Hartl 연구소 | ||||
| FUH135 | unc54p :: FLUCDM :: EGFP; ROL-6 | R188Q + R261Q 이중 돌연변이 반딧불 루시 페라 제의 근육 특이 적 발현 | 있는 Hartl 연구소 | ||||
| FUH48 | F25B3.3p :: FLUC :: EGFP; ROL-6 | WT 반딧불 lucifera의 신경 세포 특이 적 발현그 자체 | 있는 Hartl 연구소 | ||||
| FUH136 | F25B3.3p :: FLUCSM :: EGFP; ROL-6 | R188Q 돌연변이 반딧불 루시 페라 제의 신경 세포 특이 적 발현 | 있는 Hartl 연구소 | ||||
| FUH137 | F25B3.3p :: FLUCDM :: EGFP; ROL-6 | R188Q + R261Q 이중 돌연변이 반딧불 루시 페라 제의 신경 세포 특이 적 발현 | 있는 Hartl 연구소 | ||||
| TS 돌연변이 | |||||||
| CB1402 | UNC-15 (e1402) I | Paramyosin (TS), 온도에 민감한 삼촌 - 마비,하자 | CGC | ||||
| CB1157 | UNC-54 (e1157) I | 미오신 (TS), 온도 감응 삼촌 | CGC | ||||
| CB1301 | UNC-54 (e1301) I | 미오신 (TS), 온도 감응 삼촌 | CGC | ||||
| CB286 | UNC-45 (e286) III | UNC-45 (TS), 온도에 민감한, 느린 이동 삼촌, EGL | CGC | ||||
| HE250 | UNC-52 (e669su250) II | Perlecan (TS), 온도에 민감한 삼촌, 뻣뻣한 마비 | CGC | ||||
| SD551 | 하자-60 (ga89를) IV | 라스 (TS)는 온도에 민감한 MUV, 인트는 LVA, OSM하자 | CGC | ||||
| CX51 | DYN-1 (ky51) X | Dynamin (TS), 온도에 민감한 삼촌 | CGC | ||||
| CW152 | 가스-1 (fc21) X | 가스 -1- (TS), 온도 감응 감도를 EtOH | CGC | ||||
| ZZ26 | UNC-63 (X26) I | 아세틸 콜린 수용체 (TS), 온도에 민감한 levamisole을 저항 | CGC | ||||
| 스트레스 기자 | |||||||
| CL2070 | HSP-16.2p :: GFP는 ROL-6 | 열 응력; UPR 사이토 | CGC | ||||
| TJ375 | HSP-16.2p :: GFP | 열 응력; UPR 사이토 | CGC | ||||
| TJ3000, TJ3001 | HSP-16.2p :: GFP; CBR-UNC-119 (+) | 열 응력; UPR 사이토 | CGC | ||||
| AM446 | hsp70p :: GFP, ROL-6 | 열 응력; UPR 사이토 | 모리모토 실험실 | ||||
| AM722 | hsp70p :: mcherry; 미오-2P :: CFP | 열 응력; UPR 사이토 | 모리모토 실험실 | ||||
| AM799 | hsp90p :: GFP | 열 응력; UPR 사이토 | 모리모토 실험실 | ||||
| OG497 | HSF-1P :: HSF-1 : GF피; CBR-UNC-119 (+) | 열 응력; UPR 사이토 | CGC | ||||
| CF1553 | 잔디-3P :: GFP, ROL-6 | 산화 스트레스 | CGC | ||||
| KN259 | 잔디-3P :: GFP, ROL-6 | 산화 스트레스 | CGC | ||||
| CL2166 | GST-4P :: GFP :: NLS | 산화 스트레스 | CGC | ||||
| LD1171 | GCS-1P :: GFP, ROL-6 | 산화 스트레스 | CGC | ||||
| LD1 | SKN-1P : SKN-1 :: GFP, ROL-6 | 산화 스트레스 | CGC | ||||
| IG274 | NLP-집 29p :: GFP | 삼투 스트레스 | CGC | ||||
| BC20309 | MTL-1P :: GFP | 금속 스트레스 | 베일리 연구소 | ||||
| BC20342 | MTL-2P :: GFP | 금속 STRESS | 베일리 연구소 | ||||
| BC20314 | ELT-2P :: GFP | 금속 스트레스 | 베일리 연구소 | ||||
| SJ4005 | HSP-4P :: GFP | UPR ER | CGC | ||||
| SJ4100 | HSP-6P :: GFP | UPR의 미토 | CGC | ||||
| SJ4058 | HSP-60P :: GFP | UPR의 미토 | CGC |
CGC : Caenorhabditis 엘레 유전학 센터; TS = 온도에 민감한; UPR = 펼쳐진 단백질 응답; 사이토는 세포질을 =; 미토는 미토콘드리아를 =; ER = 소포체.
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Discussion
여기에 설명 된 방법은 확산 예시 도와 같은 프리온 단백질의 조립 전지 자율 및 비 독성 세포 자율. 우리는 최근에 집계가 발생하기 쉬운 세포질 프리온 도메인이 자식 작용과 관련된 과정에 막 결합 소포로 흡수되는 것을 발견했다. 이러한 소체의 특정 서브 세트 내에서 세포 및 조직과 40 사이 프리온 도메인을 수송한다. 살아있는 동물에서의 움직임을 모니터링하는 키는 단백질 만 MRFP - 태그 단백질이 아마도 산성 소포에서 볼 수 있었기 때문에, MRFP 태그되어야한다는 것입니다. 동일한 방법을 사용하여, 우리는 현재와 같은 (ALS에 연결) 슈퍼 옥사이드 디스 뮤 타제 1 (SOD1), (PD에 연결) 알파 - 시누 클레인 또는 TAR의 DNA 결합 단백질과 같은 특정 질병 관련 단백질의 잠재적 인 프리온 같은 행동을 조사하고 있습니다 (ALS에 링크) (43) (TDP-43). 소포체 내의 세포 간 수송이 여러 다른 단백질에 의해 사용되는 것처럼 보이지만,이있을확산 허용 뉴 부가 경로.
잘 특징으로하는 접이식 센서의 사용은 환경에 C. 접이식 휴대 단백질에 미치는 영향을 모니터링하는 강력한 도구 엘레 63-66. 여기서 우리는 시각적으로 구별되는 동시에 조직의 폴딩 능력을 모니터링하는 조직 - 특이 적 발현 프로모터 하에서 형광의 연령 의존적 축적을 사용하는 방법에 태그가 부착 된 단백질 응집 경향이 보였다. 유기체 proteostasis 네트워크를 연구 할 수있는 다른 가능성은 내인성 TS 돌연변이 단백질의 사용을 포함한다. 이 준 안정 단백질은 허용 온도 (15 ° C)에서 정상적으로 작동하지만, misfold과 특성 돌연변이 표현형을 전시, 제한 온도 (25 ° C)에서 작동하지 될 것입니다. 응집하기 쉬운 단백질의 존재 또는 노화 동안 돌연변이 표현형도 63-66 허용 조건에서 노출되는 TS. 이들 TS 돌연변이 중 일부는 O로 표시되는세포 자율과 비 세포 자치 proteotoxic 효과를 테스트 할이 특히 유용하고, 조직 또는 전시 조직 특이 적 표현형의 하위 집합을 할수 있답니다. 예를 들어,의 TS 돌연변이가 LET-60, GTP 결합 RAS의 protooncogene 가족의 일원, 라스 (TS), 재하 표현하지만, 조직 특이 적 돌연변이가 63,66를 표현형을 보여줍니다. 이것을 사용하여 돌연변이에 TS, 셀룰러 proteostasis에 polyQ 확장의 효과는 셀 (63) 자율 것으로 나타났다. RAS (TS)의 유전 적 배경에 polyQ의 발현 단백질이 발현되는 조직에 특이적인 돌연변이 표현형을 밝혔다. 여러 돌연변이 표현형의 노출은 단백질이 아닌 세포 자율 proteotoxic 효과가 있음을 나타냅니다.
또한, 세포 스트레스 경로에 미치는 영향을 테스트하기 위해, C.에서 생체 형광 스트레스 기자의 큰 선택이있다 엘레 (72). 이들은 일반적으로 전사입니다열이나 산화 스트레스, 각각 72보고 등의 HSP-16.2p 나 SOD-3P로 스트레스 유도 성 프로모터에서 녹색 형광 단백질 (GFP)을 표현하는 등 기자,. 프리온 단백질과 같은 적합한 리포터 조합을 사용하여, 하나는 각각의 형질 전환 유전자를 발현하는 것 이외의 조직에서의 스트레스 반응의 유도 가능성을 모니터링 할 수있다. 한 가지주의해야 할 점은, 그러나, 이러한 스트레스 기자는 종종 주어진 경로 (관찰되지 않은)의 미묘한 상향 조절을 표시 할만큼 민감하지 않은 것입니다.
또한 비 세포 자치 독성에 영향을 미칠 확산 단백질에 영향을 미치는 유전자, 우리는 무너 뜨렸다 때, 운동 결함을 개선 할 유전자 스크리닝에 의해 시작 여부를 우리의 탐구에 검사합니다. 판독으로 수영 속도의 시각적 평가를 사용하여, 우리는 편안하게 분석 할 수 있었다 ~ 25 세션 당 판과 완성의 결과로, 일주일이 프로토콜의 두 라운드를 수행후 6 주 이내에 초기 화면. 고체 플레이트 웜 운동의 정량 분석에 의한 히트의 확인은, 3 회 반복 사용 wrMTrck은 추가 삼주에서 수행되었다. 주의 할 점은, 그러나, 판독 된 액상 배지에서 플레이트 대신 수영 크롤링하여 하나 수영 같이, 소정 후보 유전자를 잃을 수 있으며 크롤링 동일한 움직임없는 별개의 통로 (73)에 의해 영향을받을 수 있다는 것이다. 일부 후보 유전자 고체 플레이트상에서 확인 될 수없는 경우 즉, 그들은 수영 주어진 시간 내에 탈곡 주파수를 계수함으로써 정량화 될 수있는 액체 매질에서 다시 시험해야한다.
여기에 설명 선별 프로토콜은 크게 변동을 감소 된 액체 핸들링 워크 스테이션, 자동화 용도. 단점은 로봇의 저수지에 대한 유체의 과잉이 항상 가능하지 않을 수도있는, 필요한 것입니다. 이 검사 설정을 쉽게 C.에 다른 화면을 위해 적용 할 수 있습니다 엘레 <수행되도록 / EM>는 판독 out.This 화면과 그 사용 탈곡은 직접 와이드 스크린 디자인에 간단해야 게놈 같은 프리온 도메인의 확산 또는 비 세포 자율 독성에 영향을 미치는 유전자를 동정하기 위해 설계되지 않았다 적시에. 운동성 결함은 근육에서뿐만 아니라 신경 세포의 손상 및 다른 유전자의 결함 (53)의 수로부터 기인 할뿐만 아니라. 따라서,이 판독을 사용하여, 우리는 근육 고유의 독성뿐만 아니라 수정을 찾을 수 있습니다. 우리는 현재의 확산 및 비 세포 독성 자율 상기 한 방법을 사용하여 프리온 도메인에 미치는 영향에 대한 후보 유전자를 테스트한다. 이러한 실험은 결국 단백질 응집체의 확산 세포 횡단 직접 다른 조직 또는 세포 간 전송 및 비 세포 자치 독성 커플 해제 할 수있는 경우 관찰 된 독성에 연결되어 있는지 여부를 발표 할 예정이다.
종합적으로, 기술 된 방법은 PR 전위를 조사하는데 사용될 수있다C.를 사용하여 세포 및 유기체 수준에서 단백질의 이온과 같은 행동 엘레.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Nanosphere size standards 100 nm | ThermoScientific | 3100A | |
| Levamisole | Sigma | L-9756 | |
| IPTG | Sigma | 15502-10G | |
| Ahringer RNAi library | Source BioScience LifeSciences | http://www.lifesciences.sourcebioscience .com/clone-products/non-mammalian/c-elegans/c-elegans-rnai-library/ |
|
| Equipment | |||
| Sorvall Legend XTR Refrigerated Centrifuge, 120VAC | ThermoScientific | 75004521 | http://www.coleparmer.com/Product/Thermo_Scientific_Sorvall_Legend_ XTR_Refrigerated_Centrifuge_120 VAC/EW-17707-60 |
| 96 pin replicator | Scionomix | http://www.scinomix.com/all-products/96-pin-replicator/ | |
| HiGro high-capacity, incubating shaker | Digilab | http://www.digilabglobal.com/higro | |
| Multidrop Combi Reagent Dispenser | Titertrek | http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/titertek.htm | |
| Biomek FX AP96 Automated Workstation | Beckman Coulter | http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/biomek_multi.htm | |
| Innova44 shaker | New Brunswick | http://www.eppendorf.com/int///index.php?sitemap=2.3&pb=d78efbc05310ec 04&action=products&contentid=1& catalognode=83389 |
|
| M205 FA | Leica | http://www.leica-microsystems.com/de/produkte/stereomikroskope-makroskope/fluoreszenz/details/product/leica-m205-fa/ | |
| ORCA-R2 C10600-10BDigital CCD camera | Hamamatsu | http://www.hamamatsu.com/jp/en/community/life_science_camera/product/search/C10600-10B/index.html | |
| Spinning Disc AF Confocal Microscope | Leica | http://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/life-science-research/fluorescence-microscopes/details/product/leica-sd-af/ | |
| Falcon 4M60 camera | Teledyne Dalsa | http://www.teledynedalsa.com/imaging/products/cameras/area-scan/falcon/PT-41-04M60/ | |
| Software | |||
| MetaMorph Microscopy Automation & Image Analysis Software | Molecular Devices | http://www.moleculardevices.com/products/software/meta-imaging-series/metamorph.html | |
| Hamamatsu SimplePCI Image Analysis Software | Meyer Instruments | http://meyerinst.com/imaging-software/hamamatsu/index.htm | |
| ImageJ | NIH | http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html | |
| wrMTrck plugin for ImageJ | http://www.phage.dk/plugins/wrmtrck.html | ||
| C. elegans strains | |||
| N2 (WT) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | http://www.cgc.cbs.umn.edu/strain.php?id=10570 | |
| AM815 rmIs323[myo-3p::sup35(r2e2)::rfp] | Morimoto lab | available from our laboratory | |
| See table 1 for a source for folding sensor and stress reporter strains |
References
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- Jarrett, J. T., Lansbury, P. T. Seeding 'one-dimensional crystallization' of amyloid: a pathogenic mechanism in Alzheimer's disease and scrapie. Cell. 73 (6), 1055-1058 (1993).
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- Chien, P., Weissman, J. S., DePace, A. H. Emerging principles of conformation-based prion inheritance. Annu Rev Biochem. 73, 617-656 (2004).
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