Summary
Protokollene beskriver to in vitro utviklingstoksisitetstestsystemer (UKK og UKN1) basert på humane embryonale stamceller og transkriptom studier. De testsystemer forutsi menneskelig utviklingstoksisitet farer, og kan bidra til å redusere dyrestudier, kostnader og den tiden som kreves for kjemisk sikkerhetstesting.
Abstract
Effektive protokoller for å skille menneskelige pluripotente stamceller til ulike vev i kombinasjon med -omics teknologier åpnet nye horisonter for in vitro toksisitet testing av potensielle narkotika. Å gi et solid vitenskapelig grunnlag for slike analyser, vil det være viktig å få kvantitativ informasjon om tidsforløpet av utvikling og på de underliggende reguleringsmekanismer av systembiologi tilnærminger. To analyser er derfor innstilt her for disse kravene. I UKK testsystemet, er humane embryonale stamceller (hESC) (eller andre pluripotente celler) igjen å spontant skille i 14 dager i embryoide legemer, for å tillate generering av celler av alle tre bakterie lag. Dette systemet sammenfatter viktige trinn i tidlig human embryoutvikling, og det kan forutsi human-spesifikke tidlig embryotoksisitet / teratogenisitet, hvis cellene er utsatt for kjemikalier under differensiering. Den UKN1 testsystemet er basert på hESC differensiere til en population av neuroectodermal stamfar (NEP) celler for 6 dager. Dette systemet sammenfatter tidlig neural utvikling og spår tidlig utviklings neurotoxicity og epigenetiske endringer utløst av kjemikalier. Begge systemene, i kombinasjon med transcriptome microarray undersøkelser, er egnet til å identifisere toksisitet biomarkører. Dessuten kan de anvendes i kombinasjon for å generere inngangsdata for systemer biologi analyse. Disse testsystemer har fordeler i forhold til tradisjonelle toksikologiske studier som krever store mengder av dyr. Test systemer kan bidra til en reduksjon av kostnadene for legemiddelutvikling og kjemisk sikkerhetsvurdering. Deres kombinasjon belyser spesielt på forbindelser som kan påvirke neurodevelopment spesifikt.
Introduction
Muligheten av humane embryonale stamceller (hESC) for å skille ut ulike typer celler åpnet opp en ny æra av in vitro toksisitet testing 1, sykdom modellering og regenerativ medisin 2. Stamcellene er utstyrt med kapasitet til å kopiere seg selv, for å holde deres pluripotent tilstand, og for å skille ut spesialiserte celler 3,4. Egenskapene til hESC (evne til å differensiere til alle viktige celletyper) er også funnet i andre humane pluripotente stamceller, som menneskeskapte pluripotente stamceller (hiPSC) eller celler som genereres av kjerneoverføring 5. For eksempel har mange forskjellige hESC linjer blitt differensiert i nevroner 6, nyreceller 7, neural crest cellene 8 kardiomyocytter 9-12, eller hepatocytter som celler 13,14. Videre kan hESC spontant differensiere i celler av alle tre bakterie lag 15-18 i embryoid organer (EBS) 19,20. Early embryoutvikling er regulert av differensial uttrykk for ulike gener knyttet til de ulike bakterie lag som har blitt fanget på mRNA nivå ved transcriptomics bruker mikromatriseteknologi 15. Dette arbeidet resulterte i etableringen av organspesifikke toksikologiske modeller basert på hESC / hiPSC og transcriptomics analyse (for oversikt se 21,22). Disse modellene har fordeler fremfor den tradisjonelle bruken av forsøksdyr i toksikologiske studier, som prekliniske studier med forsøksdyr er ikke alltid logisk for menneskelig sikkerhet. Stoffet indusert toksisitet oppstått hos pasienter er ofte relatert til metabolske eller signalprosesser som skiller mellom mennesker og forsøksdyr. Arten Forskjellen har forhindret pålitelig deteksjon av tidlig utviklingstoksisitet hos mennesker, og for eksempel medikamenter som thalidomid 23,24 og 25,26 dietylstilbestrol ble trukket tilbake fra markedet på grunn av teratogenisitet. Thalidomide har ikke vist noen utviklingstoksisitet i rotter eller mus. Miljø kjemikalier som metylkvikksølv 27 resulterte i prenatal utviklingstoksisitet når det gjelder nervesystemet i en rekke arter, men humane manifestasjoner har vært vanskelig å modellere i dyr. For å løse problemet med artsspesifisitet problemer, forskere som arbeider under ulike prosjekter basert på stamceller som ReProTect, ESNATS, DETECTIVE etc. er engasjert i utvikling av ulike modeller for embryotoksisitet, nevrotoksisitet, kardiotoksisitet, levertoksisitet og nefrotoksisitet ved hjelp av menneskegiftstoffer som mistenkes å påvirke mennesker. Under det europeiske konsortiet prosjektet "Embryonic Stem cellebasert Novel Alternative Testing Strategies (ESNATS)« Det er etablert fem testsystemer. En test system såkalt UKK (U niversitäts k linikum K OLN) test system delvis fanger tidlig menneskelig embryoutvikling. I denne system humane embryonale H9 celler er differensiert i tre bakterie lag (ektoderm, endoderm og mesoderm) 15 og bakterie lag spesifikke signaturer har blitt fanget av transcriptomics profil med Affymetrix microarray plattform. Ulike utviklingsgiftstoffer som thalidomid 28, valproinsyre, metylkvikksølv 16,17, eller cytosinarabinosid 15 har blitt testet i dette systemet, og toxicant bestemt gen signaturer er oppnådd. I en andre test-system, det såkalte UKN1 (U niversity av K onsta n z) testsystem 1, er H9-celler differensieres til neuroectodermal progenitorceller (NEP) i 6 dager. Dette er dokumentert av høy ekspresjon av nevrale genmarkører som Pax6 og OTX2. Under differensiering i 6 dager, har NEP celler vært utsatt for utviklings nevro-miljøgifter som VPA, metylkvikksølv. Giftstoff-spesifikke de-regulert transcriptomics profiler har vært obtainert som godt ved hjelp av Affymetrix microarray plattform 16,29.
Den nye visjonen for toksikologi av det 21. århundre ser for seg at testsystemer ikke bare gi fenotypiske beskrivelser som histopatologi in vivo, eller transkriptom endringer på slutten av langsiktige toxicant inkuberingene. Det foreslår heller at analysene gir mekanistisk informasjon 3, og at denne informasjonen kan tilordnes til såkalte uønskede utfall trasé (AOP) som gir en vitenskapelig begrunnelse for skadelige effekter 30. Å gi slik informasjon, testsystemer anvendes må være høyt kvalitetskontrollert 31, som for eksempel dokumentert av robuste standarddriftsprosedyrer. Videre tidsavhengige endringer må kartlegges med høy oppløsning. Dette krever testsystemer med synkroniserte endringer 32. De UKN1 og UKK testsystemer som er beskrevet her har blitt optimalisert for disse kravene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Følgende protokoll ble utført ved hjelp av menneskelig Embryonic Stem Cell linje (hESC) H9. Denne cellelinje ble rutinemessig dyrket på mitotisk inaktiverte mus embryonale fibroblaster (MEFs) i hESC kulturmedium supplementert med bFGF og deretter dyrket i stamcelle media på 6 cm petriplater belagt med basalmembran matriks, slik som matrigel, for å bli kvitt MEFs. H9-celler fra> 80% konfluente plater ble anvendt for ytterligere passasje. H9-celler dyrket i basalmembranmatrise plater ble anvendt for EBS formasjonen. Alle fremgangsmåter som er nevnt i det følgende protokoll er blitt utført ved hjelp av standardmetoder for aseptisk og god cellekultur praksis.
Del 1. UKK test System
1. Menneskelig Embryonic Stem Cell Dyrking
- Splitting og vedlikehold av H9 på feeder-celler
- Pipetter 2 ml 0,1% gelatin i hver 6 cm plate og inkuberes i 30 minutter i cellekultur incubator (37 ° C og 5% CO2). Aspirer gelatin løsning med steril Pasteur pipette.
- Tilsett 2 ml MEF medium inneholdende 0,1 x 10 6 MEF celler / ml i de to gelatin belagte plater og inkuber dem i cellekultur inkubator (37 ° C og 5% CO2) O / N.
- På neste dag, fjerne H9 celler hette fra flytende nitrogen lagringstank ved hjelp av pinsett og tine flasken i en 37 ° C vannbad ved hjelp av en lang tang.
- Fjern flasken fra vannbadet, det bad med 70% etanol, lufttørke i biosikkerhet skap i 15 til 30 sekunder og overføre cellene til 15 ml Falcon-rør.
- Legg 9 ml H9 kulturmedium langsomt på innerveggen og sentrifuger cellene ved 200 xg i 5 min.
- Aspirer supernatanten og re-suspendere cellene i 6 ml kulturmedium innehold ROCK-inhibitor (10 uM, Y27632) og forsiktig pipette for å blande. Aspirer MEF medium fra 6 cm plate og tilsett 3 ml cellesuspensjon i hver plate. Endre medium på day 3 og deretter annenhver dag. Subkultur> 80% sammenflytende plateceller med split ratio 1: 3.
Merk: Vanligvis i 5 til 7 dager plate blir sammenflytende. Matere benyttes er oppnådd fra CF1 mus embryo og inaktiveres ved eksponering for γ stråling.
- H9 celledyrking på basalmembran matrix belagte plater
- Tine stamcelle medium (5x) supplement ved RT og tilsett 100 ml til 400 ml basal medium i biosikkerhet skap.
- Tine basalmembran matrix på is. Legg foreslo volumet av basalmembran matrix (se sertifikat for analyse for hvert parti) i 24 ml kjølt DMEM / F-12 basal medium for tolv 6 cm plater. Bland ved å pipettere opp og ned.
- Tilsett 2 ml i hver 6 cm plate. Hold platen ved RT i 1 time. Fjern medium og tilsett 2 ml av stamcelle medium.
- Ta ut fire sammenflytende H9 plater på MEFs. Fjern de differensierte kolonier med en ml pipettespissen henhold stereo holdt i biosikkerhet skap.
- Aspirermediet og vask cellene med 4 ml PBS og tilsett 2 ml stamcelle medium i hver plate. Skjær udifferensierte kolonier med 26 G nål inn til 6-9 stykker hver.
- Forsiktig samle cellene i 50 ml Falcon-rør. Sentrifuger ved 200 xg i 5 min.
- Aspirer supernatanten og re-suspendere i 12 ml stamcelle medium. Telle klumper ved å sette 20 ul på glass lysbilde under mikroskopet og justere volumet for 150 klumper per ml. Tilsett 2 ml av suspensjonen i hver 6 cm plate.
- Flytt platene back-og-tilbake og side-til-side bevegelser for uniform klump distribusjon og ruge platene i cellekultur inkubator (37 ° C og 5% CO 2).
- Fjern de differensierte kolonier og gi middels endring hver alternative dag.
2. embryoid Bodies (EBS) Formation
Utføre alle prosedyren nevnt nedenfor som per aseptiske forholdsregler og i biosikkerhet kabinettet.
- Dag 0 & #8212; Plating av H9 celler på V bunnplater
- Forbered 5% blokk-kopolymer slik som Pluronic F 127 i PBS og filtrer gjennom vakuumdrevet filtreringssystem ved bruk av 0,22 pm sterilt filter.
- Coat V bunn 96-brønners plater med 40 ul av 5% blokk-kopolymer per brønn og inkuber ved romtemperatur i 45 min.
- Fjern de konfluent basalmembran matrix plater med H9 celler fra inkubator og fjerne differensierte kolonier med en ml pipettespissen henhold stereo i biosikkerhet skap.
- Aspirer medium og vaske cellene med 4 ml PBS. Tilsett 2 ml tilfeldig differensieringsmedium (H9 kulturmedium uten bFGF, RD medium) i hver plate. Bruk passasje verktøyet og kutte H9 cellekolonier i klumper av lik størrelse og form ved å observere henhold stereomikroskop i biosikkerhet skap og deretter forsiktig skrape med celleskrape.
- Samle klumper i 50 ml Falcon rør og sentrifuger ved 200 xg i 5 min. Aspirer supernatanten og re-suspendere cell i RD medium for å få 1000 klumper per ml.
- Aspirer blokk-kopolymeren fra V bunnplater. Hell klumper i sterile firkantet plate og med hjelp av multikanal pipette tilsett 100 ul av suspensjon til hver brønn av V bunnplaten.
- For kraften aggregering av klumper, sentrifuger V bunnplater ved 4 ° C i 4 minutter ved 400 x g. Inkuber platene i cellekulturinkubator (37 ° C og 5% CO2) i fire dager.
- Dag 4 - Innsamling av EBS
- Samle EBS i sterile firkantet plate fra V bunnplater som bruker multikanalspipette og brede boringen 200 mL tips.
- Samle EBS fra sterile firkantet plate i 15 ml falk rør med 10 ml sterilt serologisk pipette. Tillat EBS til takke med 2 min. Aspirer supernatanten og vaske EBS med 5 ml PBS.
- Tillat EBS til takke med 2 min og aspirer supernatanten. Re-suspen EBS i 5 ml RD medium.
- Pipetter ut 10 ml RD medium i 10 cmbakteriologiske plater. Overfør EBS i 10 cm bakteriologiske plater.
- Inkuber bakteriologiske platene på horisontale rister (frem- og tilbakebevegelse bevegelse 50 / min) holdt i cellekultur inkubator (37 ° C og 5% CO2) i nødvendig tidsrom. Gi medium endring (15 ml RD medium) hver annen dag.
Merk: Lett håndtering er nødvendig så lenge dyrking hESCs. Størrelsen på EBS varierer på dag 4. Velg enhetlig størrelse EBS (± 20%) ved å observere henhold stereo for videre forsøk. Omtrent 50% EBS dannet med denne metoden er av jevn størrelse. Overføringen av EBS på shaker resultater i uniform form.
3. Cvtotoksisitetsmålinq for IC 10 Fastsettelse
- Overføring av EBS på optiske bunnplater
- Tine 0,1% gelatin i vannbad ved 37 ° C i 15 min og belegge optiske bunnplater med 50 ul av 0,1% gelatin pr brønn ved hjelp av multikanal pipette. Inkuber platene ved romtemperatur i45 min. Etter inkubasjon aspirer gelatin fra optiske bunnplater.
- Ta ut EBS samlet på dag 4 i 10 cm bakteriologisk plate som inneholder RD medium.
- Hold optiske bunnplater i skrå posisjon i biosikkerhet skap. Transfer to ensartet størrelse på EBS i 100 ul medium RD per brønn i optisk bunn 96-brønners plate ved å observere henhold stereomikroskop. Hold 12. kolonnen tom.
- Inkuber platene i cellekulturinkubator (37 ° C og 5% CO2) i 24 timer.
- Drug eksponering fra dag 5 til dag 14
- Vei testforbindelsen, og gjør høyeste konsentrasjon på kjent oppløsningsmiddel.
- Utføre halv-logaritmisk fortynning av forsøksforbindelsen serievis til 8 fortynninger i løsningsmidlet som inneholder Falconrør nummerert med A til H, holde røret no. Jeg så bilen kontroll, tube no. J som negativ kontroll (RD medium) og røret nei. K som positive (70% etanol) kontroll.
- Tine RD-medium i vannbad ved 37° C i 15 min. Ta ut 5 ml RD medium hver i 11 sterile falk rør merket fra 1 til 11.
- Overføring 5 mL av løsning fra tube A til rør K i tube 1-11 henhold og virvle rørene. Ta ut den optiske bunnplaten fra inkubatoren og fjerne mediet forsiktig med bruk av multikanalspipette.
- Tilsett 200 ul av mediet fra røret nummer 1 til 11 i de respektive kolonner av den optiske bunnplaten. Gi medium / stoffet endring hver alternative dag.
Merk: For halv logaritmisk fortynninger ta 6,48 mL løsemiddel i syv rør merket fra 2 til 8. Fra høyeste konsentrasjonen tube no.1 overførings 3 ul til tube no.2, Vortex og serielt overføre 3 pl til neste rør. Hold tube nr.9 for kjøretøy kontroll og rør no.10 for negativ kontroll. Tube no.11 er 70% etanol.
- Dag 14: Resazurin eksponering og fluorescens måling
- Tine RD medium i vannbad ved 37 ° C i 15 min. Utføre alle prosedyre nevnte statn nedenfor i fravær av lys i biosikkerhet kabinettet.
- Ta 10 ml medium ST i 15 ml rør (A) og tilsett anbefalte volum av resazurin reagens og blandes ved pipettering. Ta ut den optiske bunnplaten fra inkubatoren og forsiktig fjerne all medium med multikanalspipette.
- Tilsett 100 ul medium fra røret A i hver brønn. Inkuber platen i cellekulturinkubator (37 ° C og 5% CO2) i 90 min.
- Mål fluorescens bruker spektrofotometer (560 Ex / 590 Em).
- IC 10 verdsettelser
- Importere verdiene i grafen pad prisme etter trekke de tomme verdier. Set x-aksen som en dose og y-aksen som en fluorescerende enheter.
- Normalisere verdier for å oppnå prosent på y-aksen og omforme verdiene (x-aksen som log skala). Beregn IC 50-verdien ved hjelp sigmoidal-doserespons (variabel helling) parameter. Beregne logge IC 10-verdier ved hjelp av følgendeligning:
F = 10 logEC 50 = logECF - (1 / hillslope) * log (F / (100-F))
Y = Bottom + (Topp-bunn) / (1 + 10 ^ ((LogEC 50 -X) * hillslope)) - Bestem IC 10 verdier som skal tas for videre studier.
4. Biomarker studie basert på Mikromatriser
- Dag 0 til dag 5:
- Embryoid kropp dannelse og overføring til 10 cm bakteriologiske plater - følg trinnene som er nevnt i punkt 2 for embryoid kroppen formasjon.
Merk: Bruk tre biologiske replikater for hver undersøkelse. Dele hver biologisk replikere i to deler - Medikamentell behandling ved IC 10 konsentrasjon og kontroll over kjøretøyet. Forbered legemiddelkonsentrasjonen 10.000 ganger over IC 10 konsentrasjonen i bilen og fra dette legge til 10 mL til 100 ml RD medium med H9 celleklumper i 50 ml Eppendorfrør bland godt og frø den på V bunnplater. Følg samme prosedyre for kjøretøy kontrollgruppen.
<li> For legemiddeleksponering på dag 5 til 14, samle EB's og overføre dem i 10 cm bakteriologiske plater på dag 4 i henhold til trinnene som er nevnt i punkt 2. Overfør platene på horisontal shaker (gjensidighets motion 50 / min) i cellekulturinkubator (37 ° C og 5% CO2) i 14 dager. Gi medium endre hver alternative dag. - Embryoid kropp dannelse og overføring til 10 cm bakteriologiske plater - følg trinnene som er nevnt i punkt 2 for embryoid kroppen formasjon.
- For prøvetaking, på dag 14, samle EBS fra 10 cm plater på 15 ml falk rør med sterilt serologisk pipette. Tillat EBS til takke med 2 min. Aspirer supernatanten og vaske EBS med 5 ml PBS. Tillat EBS til takke med 2 min og aspirer supernatanten. Re-suspen EBS i 1 ml RNAlater oppløsning eller TRIzol reagens, vortex og lagre prøven ved -80 ° C inntil videre behandling.
Merk: Utfør alle prosedyre i biosikkerhet kabinettet som per god laboratoriepraksis. Rotere platene i sirkelbevegelser rundt sentrum for å bringe alle EBS i sentrum, aspirer mediet fra rundt ved hjelp av sterile glass pasture pipette, tilsett 15 ml RD medium og deretter legge til 15 mL av stoffet / kjøretøy for respektive gruppe.
5. RNA Isolation og integritet Testing
- RNA Isolation:
De fleste av de trinnene som er nevnt nedenfor skal utføres for RNA-rensing ved hjelp RNeasy Mini Kit som per bruksanvisningen. Bruk alltid nuklease gratis rør, pipettespisser og vann. Mens han jobbet med TRIzol utføre alle prosedyre i kjemisk sikkerhetshette og vernebriller samt kjemiske vernehansker.- Tine prøvene på is. Hvis prøvene er lagret i RNAlater oppløsning, sentrifugere rørene ved 12.000 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Kast supernatanten og tilsett 1 ml TRIzol reagens.
- Triturer prøvene som bruker 24 G nål og 1 ml sprøyte. Omtrent 15 ganger utgnidning er tilstrekkelig for avbrudd av EBS, celleveggen og plasmamembraner.
- Tilsett 200 ul av kloroform i hver prøve. Vortex for å blande innholdet jevnt. Sentrifugerved 12.000 xg i 15 min ved 4 ° C. Fjern de RNeasy mini spin kolonner, 1,5 ml rør og merk dem riktig.
- Utlevering av væsken i 1,5 ml rør (mens samle supernatanten ikke forstyrrer den midterste eller nederste lag). Legg like stort volum av avkjølt 70% etanol. Bland innholdet ved forsiktig risting.
- Påfør 700 ul fra rørene til respektive minispinnkolonner og sentrifuger dem ved 12.000 xg i 20 sekunder ved romtemperatur. Utføre alle ytterligere skritt på RT.
- Kast filtratet og anvende resten av oppløsningen til de respektive kolonner og sentrifuger dem ved 12.000 xg i 20 sek. Kast filtratet.
- Påfør 350 mL av RW1-buffer til kolonnen og sentrifuger dem ved 12.000 xg i 20 sek. Kast filtratet og anvende 10 pl DNAse og 70 ul RDD buffer til kolonnen.
- Inkuber ved RT i 15 min. Påfør 350 mL av RW1-buffer til kolonnen og sentrifuger dem ved 12.000 xg i 20 sek. Kast filtratet. Påfør 500 mL avRPE vaskebuffer til kolonnen og sentrifuger dem ved 12.000 xg i 20 sek. Kast filtratet. Igjen Påfør 500 mL av RPE vaskebuffer til kolonnen og sentrifuger dem ved 12.000 xg i 2 min. Kast filtratet.
- Shift kolonnene til nye 2 ml samling rør og sentrifuger dem på 12.000 xg i 1 min. Overfør kolonnene til merket 1,5 ml samling rør og gjelder 22 mL av nuklease fritt vann. Sentrifuger rørene ved 12.000 xg i 1 min.
- Fjern samlingen røret og sette dem på is. Kvantifisere RNA ved hjelp av automatisert elektroforese system.
- RNA-konsentrasjonen, renhet og integritetstesting.
For RNA renhet og integritet teste bruk automatisert elektroforese system og respektive kit 33.
6. Mikromatrise Studier
- Utfør transkripsjonen profilering bruker kommersielt tilgjengelige menneske array-chips. For RNA target forberedelse, fragmentering, hybridisering 34 og rekkechip farging, vasking 35 bruke kommersielt tilgjengelige kits.
- Utfør rekke chip skanning og kvalitetskontroll ved hjelp av standard fluidics stasjonen, array-skannere og standard drifts programvare 36. Genekspresjonsanalyse importere filer generert fra skannere til standard kommersielt tilgjengelig programvare 37, utføre bakgrunnskorreksjon, samandrag og normalisering med Robust Multi-matrise Analysis (RMA).
- For å få oversikt over forskjellig uttrykt gener (DEG) 's utfører en måte ANOVA analyse. Fra denne listen filtrere ut genene basert på fold endring (± 2) og FDR-kontrollerte p-verdi (<0,05). Innhent Principal Component Analysis (PCA), Heat kart, etc. ved hjelp av denne programvaren.
Del 2. UKN 1 Test System
1. Vedlikehold av hESC
- Seeding av MEFs
- For differensiering bruke NSCB # 8534 (H9) cellelinje. Kultur cells på mus embryonale fibroblaster (MEFs) som mater celler. Coat T25-kolbe med 4 ml 0,1% gelatin, og inkuber i 30 min ved 37 ° C.
- Tine MEFs i 37 ° C vannbad og overføre cellene i forvarmet DMEM / 10% FBS.
- Spin 3,5 min med 500 x g, supernatanten fjernes og re-suspendere cellene for å oppnå en x 10 7 celler / ml. Plate MEFs 4 x 10 4 / cm 2 i T25 kolber på gelatin. Eventuelt bruke MEFs for de neste to dagene. Kvaliteten på MEF partier er en svært kritisk problem for hESC vedlikehold. Derfor er det lurt å belyse det beste selskapet og forberedelse metode for H9 celler. Vi bruker PMEF P3.
- Splitting og vedlikehold av H9
- Tilsett 1 ml forvarmet dispase per T25-kolbe H9 og inkuber 9 minutter ved 37 ° C.
- Tilsett 2 ml vaskemedium til dispase behandlede celler og pipette 5 ganger opp og ned med 5 ml pipette og overføre celleløsning i et Falcon-rør.
- Vask kolben med 9 ml vaskemediumog tilsett celler til de andre. Spin 3,5 min med 500 xg, fjern supernatanten og re-suspendere celler i 10 ml hESC medium.
- Spin 3,5 min med 500 xg, fjern supernatanten og re-suspendere cellene i 4 ml hESC medium. Tilsett 0,5 ml cellesuspensjon, og 4,5 ml hESC medium og plate i en ny (PBS vasket) T25-kolbe med MEFs. Endre hele hESC medium (5 ml) av kolben hver dag.
2. Differensiering av hESC mot neuroectodermal stamceller (NEP)
- Forbered hESC medium og KCM medium. Belegge en 10 cm skål med gelatin (0,1% i PBS) per T25-kolbe og inkuberes i 30 min ved 37 ° C. Fjern medium fra hESC og legger nok accutase til å dekke hele bunnen av kolben (1 ml pr T25-kolbe) og inkuberes 25 til 30 minutter ved 37 ° C.
- Forbered basalmembran matrix belagte plater under accutase inkubasjon. Legg kaldt DMEM / F12 til frossen basalmembran matrise pellet og løse det 01:20. Filtrer basalmembran matrix Solusjon gjennom en 40 mikrometer celle sil. Legg filtrerte oppløsningen til platen, hele bunnen for å bli dekket (1 ml per seks-brønns er nødvendig) og inkuberes i 2 timer ved RT.
- Etter inkubasjonsperioden fjernes basalmembran matriks supernatant og frø-celler på de belagte brønner. Etter accutase trinn (2.1) stopper reaksjonen ved tilsetning av 1,5 ml HES medium. Skrap celler fra kolben, tilsett 8 ml hESC medium og produsere en enkel celleløsning ved pipettering med 10 ml pipette grundig. Filtrer celler gjennom en 40 mikrometer celle sil.
- Spin celler 3 min med 500 xg, fjern supernatanten og re-suspendere celler i 10 ml hESC. Ringlegemer 3 min med 500 x g, supernatanten fjernes og re-suspendere celler i hESC inneholder ROCK inhibitor Y-27632 ved en sluttkonsentrasjon på 10 uM.
- Fjern supernatanten av gelatin belagt parabolen. Plate cellesuspensjonen på gelatin belagt rett til å fjerne MEFs og la i kuvøse for nøyaktig 1 time.
MERK: Under dette trinnet de MEFs vil settle på gelatin belagt plate, mens hESC ikke kan feste til gelatin. Derfor er dette avgjørende for å oppnå en matefritt differensiering. Det er et kritisk punkt som er for lange inkubasjonstider resulterer i hESC klumper og for kort inkubasjon i ineffektiv fjerning av MEFs. Etter 45 min inkubasjon platen bør undersøkes for allerede avgjort MEFs og hESC klumper. - Forsiktig Når MEFs er festet, vaske ikke-adherente celler (hESC) av etter inkubering med mediet allerede i platen. Dersom flere T25 ble brukt for å få flere celler, enkeltceller nå kan kombineres. Vask platen en gang med hESC medium.
- Spin-celler 3 min med 500 xg, fjern supernatanten og re-suspendere celler i ca. 4 ml KCM inneholdende 10 uM inhibitor ROCK Y-27632 og 10 ng / ml FGF-2.
- Cellene telles i et hemocytometer ved hjelp av trypanblått. Plate 18 x 10 3 celler / cm 2 på basalmembran matrix belagte plater i KCM inneholder 10 mm ROCK inhibitor Y-27632 og10 ng / ml FGF-2 (for seks godt bruke 1,5 ml pr brønn). Det er avgjørende å plate cellene i riktig tetthet for å skille dem lykkes i NEPs.
- Etter 24 timer, endres mediet til frisk KCM inneholdende 10 uM inhibitor ROCK Y-27632 og 10 ng / ml FGF-2. Etter ytterligere 24 timer, endre medium til frisk KCM inneholder 10 ng / ml FGF2.
- 72 timer etter utsåing av cellene, begynner differensiering av medium endring mot KSR medium. Dette tidspunktet refereres til som dagen for differensiering 0 (DoD0). Tilsetningen av teststoffer er nå mulig.
- På DoD1 og DoD2 mediet endres akkurat som på DoD0. Neste medium endringen er på DoD4 inneholder 25% N2-S og 75% KSR. På DoD6 differensieringen er stoppet og cellene blir høstet for analyse.
3. Chromatin Immunpresipitering (chip) av hESC og NEP
- Utarbeidelse av kjerner
- Legg 500 mL accutase til hver 6 brønn som skal analyseres og inkuberes i 25 til 30 min. Count celler i et Neubauer kammer ved hjelp av trypan blå.
- Resuspender celler i 1% formaldehyd i DMEM / F12 for crosslink. Legg Tris pH 7,5 til en sluttkonsentrasjon på 125 mm etter 10 minutter for å stanse kryssbindings.
- Spin-celler 3 min med 500 xg ved 4 ° C, supernatanten fjernes og re-suspendere celler i kald PBS.
- Spin-celler 3 min med 500 xg ved 4 ° C, supernatanten fjernes og re-suspendere celler i 1 ml buffer / L1 1 x 10 6 celler.
- Inkuber i 5 min på is. Spin 5 min med 800 xg ved 4 ° C, supernatanten fjernes og re-suspen kjerner i en L2- ml buffer / 2 x 10 6 celler.
- Ultralydbehandling og kvalitetskontroll
- Sonicate slik at DNA-fragmenter av 300-700 bp lengde genereres. Spinn 1 min med 10 000 xg ved 4 ° C. Overfør supernatanten til et nytt rør. Fragmentene må ha riktig størrelse, ellers immunoutfelling vil være ineffektiv, så vel som den fulgte qPCR.
- Fjern 50 pl end blanding med 50 ul L2-buffer for å kontrollere effektiviteten av sonication ved å kjøre en agarosegel.
- Omvendt tverrbinding av inkubering ved 65 ° C i 4 timer og 500 rpm. Belastningsprøver 1: 5 med Orange G lasting fargestoff på en 1,5% agarosegel og kjøre 45 min ved 110 V i 1x TBE buffer. Kontrollfragmentstørrelse (bør være mellom 300-700 bp).
- Kromatin Immunpresipitering
- Fortynn prøvene 1: 5 fortynning i buffer og en aliquot ml pr IP i silikoniserte rør.
- Fjern 5% (volum) fra fortynnet kromatin sample (trinn 3.3.1) og oppbevares ved 4 ° C som "input".
- Inkuber prøvene med antistoffer for ditt valg og med uspesifikke IgG O / N ved 4 ° C på en rotator.
- Tilsett 50 ul protein-A / G-Sepharose-kuler til hver prøve etter immunoutfelling. Inkuber prøvene 3 timer ved 4 ° C på en rotator. Spinn 1 min med 1500 xg ved 4 ° C og fjern supernatanten.
- Vask med en ml vaske perler. Spin 1 min med 1500 xg ved4 ° C og fjern supernatanten. Gjenta trinn g til h. Vask med 1 ml endelige vaskebuffer. Under vasketrinnene bør du ikke miste noen av perlene, fordi dette endrer mengden av eluatet direkte.
- Sentrifuger 1 min med 1500 x g ved 4 ° C, og fjerne supernatanten. Legg 125 ul elueringsbuffer og inkuberes 15 minutter med 65 ° C ved 1000 rpm på en ristemaskin.
- Spinn 1 min med 1500 xg og overføre supernatanten til et nytt rør Gjenta trinn k og l. Tilsett 200 ul elueringsbuffer til inngang (3.3.2). Legg Proteinase K og RNase til hver prøve og inkuber 30 minutter med 37 ° C ved 500 rpm på en ristemaskin, og deretter 4 timer til 65 ° C ved 500 rpm på en ristemaskin.
MERK: For DNA ekstraksjon bruk kommersielt tilgjengelig ChIP DNA Clean og konsentrator Kit 38.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Metylkvikksølv eksponering i UKK testsystem
Cytotoksisiteten Analysen ble utført med H9 EBS for å oppnå en IC-10-verdi (reduksjon av levedyktighet med 10%) for cytotoksisiteten av metyl-kvikksølv (figur 1). Vi har også utført en microarray basert (Affymetrix plattform) biomarkør studien. H9 EBS har vært utsatt for metylkvikksølv (0,25 og 1 mm) i 14 dager. På dag 14, har prøvene er samlet ved hjelp av TRIzol og RNA ble isolert. Transkripsjonen profilering ble utført ved hjelp av Human Genome U133 pluss 2,0 array-chips. Dataene er analysert med Partek Genomisk Suite TM 6.6. Først oversikt data ble innhentet av prinsipp Component Analysis (Figur 2A), generering av Venn-diagrammer (figur 2B) og bygging av varme kart (Figur 2C). Prinsippet komponentanalyse representerer den totale fordelingen av genekspresjon og det tydelig visualisert segregasjon av MeHg 1fiM fra kjøretøyet kontroll og MeHg 0,25 mikrometer grupper (PC # 25,2) (Figur 2A). En liste over differensielt-uttrykte gener (DEG) ble oppnådd etter statistisk behandling (enveis ANOVA) og filtrering av data ved hjelp av en fold endring cut-off på ± 2 og et mangfold-korrigert (Benjamini Hochberg-metoden) p-verdi <0,05 (tabell 1). Den 1fiM MeHg behandling resulterte i 276 degs og 0,25 mikrometer i 31 degs (figur 2B). Varmen kartet viste at MeHg 1fiM behandling hovedsakelig redusert genekspresjon (figur 2C). Informasjon om høy- est over genet ontologispråk betingelser ble oppnådd ved hjelp av DAVID bioinformatikk verktøyet. Tabell 2 viser de betydelig overrepresentert GO gen kategorier som inneholdt mer enn 5 gener. De nedregulert transkripsjonsfaktorer knyttet til nervesystemet utvikling ble identifisert. SEPP1, DDIT4, AK4, FRZB (hjerneutvikling), PITX (nucleus neural utvikling) og ErbB3, UGT8, apoB, APOA1 (nervesystemet utvikling) ble nedregulert på en doseavhengig måte for metylkvikksølv behandling (tabell 3).
UKN en testsystem
Dette differensiering protokollen bruker dual SMAD inhibiton 6 for å generere en ren populasjon av NEP innen seks dager etter differensiering. De resulterende celler som er karakterisert ved et opp-regulering av neurale forløperceller gener Pax6 og OTX2. Stamcellemarkører Oct4 og Nanog er nedregulert i løpet av differensiering mot NEP (figur 3A). På grunn av den svært synkron og homogen differensiering, er det også mulig å få informasjon om de histonmodifikasjonene under denne tidlige utviklingstrinn. Vi tilpasset protokollen for kromatin immuno-utfelling (chip) ved hjelp av cellene, enten ved begynnelsen av differensiering eller etter 6 dagersdifferensiering. En bryter av metylering steder på promoterregionene av Pax6 og OTX2 var tydelig fra disse studiene (figur 3B). De undersøkte metylering nettsider Histone 3 lysin 4 trimethylation (H3K4me3) og histon 3 lysin 27 trimethylation (H3K27me3) var svært dynamisk i løpet av differensiering. Også på proteinnivå en nedregulering av Oct4 kunne observeres (figur 4). Den oppregulering av Pax6 og neural stamcelle markør nestin ble observert ved immunofluorescens-mikroskopi på proteinnivå (figur 4). Cellepopulasjonen viste et homogent og rent differensiering etter seks dager med differensiering. Derfor kulturene lett kan brukes for analyse av RNA og protein. Systemet gir også mulighet til å teste stoffer og effekten de har på tidlig neural utvikling 16,29.
Figur 1. Cvtotoksisitetsmålinq (H9 differensiering) for MeHg. Analysen ble utført i henhold til protokollen for å definere IC 10 verdi for metylkvikksølv.
Figur 2. Representative analyser av differensial uttrykte gener som induseres av 0,25 uM og en MeHg etter påføring av UKK testsystem. De hESCs ble behandlet med 0,25 og 1 pM MeHg ifølge UKK testsystem. Analyse av differensial uttrykt transkripsjoner i 14-dagers differensierte EBS har blitt utført ved hjelp av Partek Genomisk Suite TM 6.6 software. (A) Principal Component Analysis (3-dimensjonale) av microarray data. (B) Venn diagram hentet fra microarray analyse av genuttrykk. Diagrammet viser antallgener modulert av MeHg behandling (endring> ± 2, p-verdi <0,05). (C) hierarkisk clustering av genuttrykk data (endring> ± 2, p-verdi <0,05). De høyt uttrykte gener i bilen kontrollgruppe er undertrykt av en mikrometer MeHg behandling. Den 1fiM MeHg behandling resulterte i 233 utskrifter med lavere uttrykk og 43 prober med høyere uttrykk som i forhold til kjøretøy kontrollgruppen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. genekspresjon og histon metylering mønster under differensiering fra hESC mot NEP. For alle forsøkene, hESC ble differensiert til neuroectodermal forløperceller (NEP). (A) Prøver ble tatt ved day 6 av differensiering, og transkripsjonsnivåer av markørgener av nevrale differensiering ble bestemt ved RT-qPCR. Data (genuttrykk i forhold til hESC) er gjennomsnitt ± SEM av fem forsøk. (B) Prøver for kromatin immunopresipitering (chip) var forberedt på dag 6 av differensiering. ChIP ble utført med antistoffer som er spesifikke for H3K4me3 eller H3K27me3 eller kontroll IgG. De berikelse faktorer av promotersekvenser er gitt som% inngang for H3K4me3 (grå) og H3K27me3 (svart). Data er midler ± SEM av tre uavhengige cellepreparater. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Protein uttrykk under differensiering fra hESC mot NEP. Cellene ble fiksert og farget for stamcelleforskningen markørOct4 (grønn) på dag 0 av differensiering (DoD0) og for NEP markører Pax6 (rød) og nestin (grønn) på dag 6 av differensiering (DoD6). Scale bar indikerer 50 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Tabell 1. Liste over differensielt uttrykte gener (> ± 2 ganger, p-verdi <0,05) av MeHg behandling versus kjøretøy kontroll i 14 dager gamle EBS. Klikk her for å vise denne tabellen.
Tabell 2. Liste over betydelig beriket og utvalgte GO kategorier (p-verdi <0,05,> 5 gener) med feilregulert transkript for MeHg versus kjøretøy kontroll i 14 dager gamle EBS.
| GO Term | Telle | P-verdi | Gener |
| Regulering av apoptose | 18 | 0,0068 | ARHGEF3, TBX3, ErbB3, MITF, BNIP3, CDH1, IGF2, IFI16, HGF, GCH1, AMIGO2, SERPINB9, KRT18, MSX1, ETS1, VEGFA, PERP, IGFBP3 |
| Regulering av Cell Proliferation | 17 | 0,0123 | RBP4, LYN, TBX3, ErbB3, MITF, IGF2, KDR, RERG, MSX1, ADM, ETS1, VEGFA, BNC1, ADAMTS1, FABP1, IGFBP3, FIGF |
| Blodkar Development | 12 | 0.0001 | Plat, ApoB, HAND1, TBX3, EPAS1, FOXF1, LEPR, VEGFA, COL3A1, LOX, FIGF, KDR |
| Skeletal System Development ng> | 12 | 0,0008 | RBP4, MSX1, LGALS3, TBX3, HOXB6, COL3A1, STC1, IGF2, POSTN, FRZB, IGFBP3, AHSG |
| Hjerte Development | 11 | 0.0001 | RBP4, ACTC1, MSX1, HAND1, TBX3, ADM, PKP2, ErbB3, GATA6, COL3A1, ADAMTS1 |
| Glukose metabolisme | 9 | 0,0003 | PDK1, RBP4, LDHA, PGM 5 avgis, PYGL, HK2, PFKP, IGF2, PGK1 |
| Lung Development | 7 | 0,0008 | RBP4, EPAS1, GATA6, FOXF1, VEGFA, LOX, KDR |
| Epitel Development | 7 | 0,0386 | F11R, FREM2, GATA6, FOXF1, VEGFA, DSP, KDR |
| Mesoderm Development | 5 | 0,0088 | HAND1, TBX3, FOXF1, VEGFA, SNAI2 |
| Begrep | Gene Symbol | Brett Change * | |
| 0,25 mikrometer MeHg vs VC | 1fiM MeHg vs VC | ||
| Brain Development | SEPP1 | -2,17 | -4,13 |
| DDIT4 | -1,20 | -3,11 | |
| AK4 | -1,41 | -3,08 | |
| FRZB | -1,29 | -2,19 | |
| Nevronale nucleus utvikling | PITX2 | -2,08 | -4,90 |
| Nervesystemet utvikling | ErbB3 | -1,86 | -2,89 |
| UGT8 | -1,67 | -2,14 | |
| ApoB | -3,59 | -5,72 | |
| APOA1 | 2,63 | -2,90 | |
| VEGFA | -1,28 | -3,06 | |
* P-verdi <0,05
Tabell 4. Sammensetning av kultur media.
| Sr. No. | Medium / Buffer navn | Sammensetning | |||
| Beløp | | ||||
| 1 | MEF Medium | DMEM høy glukose | |||
| FCS | 10% | ||||
| Penicillin | 100 enheter / ml | ||||
| Streptomycin | 100 pg / ml | ||||
| L-Glutamin | 2 mm | ||||
| 2 | H9 Kultur Medium | DMEM F12 | |||
| KOSR | 20% | ||||
| NEAA | 1% | ||||
| Glutamax | 1x | ||||
| β-merkaptoetanol | 0,1 mm | ||||
| Penicillin | 100 enheter / ml | ||||
| Streptomycin | 100 pg / ml | ||||
| bFGF | 4 ng / ml | 3 | RD Medium | H9 kulturmedium uten bFGF | |
| 4 | Vask Medium | DMEM / F12 | |||
| Knockout Serum REPLACEMENT | 20% | ||||
| 1x Glutamax | 1x | ||||
| MEM ikke-essensielle aminosyrer | |||||
| HEPES | 15 mm | ||||
| β-merkaptoetanol | 90 mikrometer | ||||
| 5 | KCM Medium | DMEM | |||
| FBS | 10% | ||||
| inkubert i 24 timer på MEFs | |||||
| 6 | Knockout Serum Erstatning (KSR) | ||||
| Knockout serum erstatning | 15% | ||||
| 1x Glutamax | |||||
| 1 x MEM ikke-essensielle aminosyrer | |||||
| β-merkaptoetanol | 15 um | ||||
| Noggin | 35 ng / ml | ||||
| Dorsomorphin | 600 nM | ||||
| SB431542 | 10 mikrometer | ||||
| 7 | N2-S | DMEM / F-12 | |||
| Apotransferin | 100 pg / ml | ||||
| Glukose | 1,55 mg / ml | ||||
| Putrescin | 10 mm | ||||
| Selen | 500 mikrometer | ||||
| Progesteron | 20 pM | ||||
| Glutamax | 200 mikrometer | ||||
| 25 ug / ml | |||||
| 8 | L1 Buffer | Tris pH 8 | 50 mm | ||
| EDTA | 2 mm | ||||
| NP-40 | 0,10% | ||||
| Glyserol | 10% | ||||
| 9 | L2-buffer | Tris pH 8 | 50 mm | ||
| EDTA | 10 mm | ||||
| SDS | 1% | ||||
| 10 | Elueringsbuffer | NaHCO3 | 100 mm | ||
| SDS | 1% | ||||
| 11 | Wash Buffer | Tris | 20 mm | ||
| EDTA | 2 mm | SDS | 0,10% | ||
| NP-40 | 0.50% | ||||
| NaCl | 150 mm | ||||
| 12 | Endelig Wash Buffer | Tris | 20 mm | ||
| EDTA | 2 mm | ||||
| SDS | 0,10% | ||||
| NP-40 | 0.50% | ||||
| NaCl | 500 mm | ||||
| 1. 3 | Stem Cell Medium | mTESAR TM basal medium | 400 ml | ||
| mTESAR TM supplement | 100 ml | ||||
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tradisjonelle tilnærminger til toksikologisk testing bære omfattende dyreforsøk dermed gjøre testing kostbart og tidkrevende. Dessuten, på grunn av den artsforskjellene de prekliniske dyresikkerhetsstudier er ikke alltid er gyldig for å forutsi giftvirkninger av potensielle legemidler som er relevant for mennesker. Selv om ikke-menneskelige primater er mest forutsigbare, fortsatt sterk etisk og socioeconomical krav raskt øke ved moderne samfunn for å utvikle følsom og robust in vitro test Systemet er relevant for menneskers sikkerhet.
Den unike evne hESCs til å differensiere til alle somatiske celletyper, og derfor rekapitulere in vivo humane utviklingsmessige prosesser i kombinasjon med sensitive toksikogenomikk tilnærminger har vært foreslått som et alternativ til de tradisjonelle metoder for medikament sikkerhetstesting 6,21. Under 'ESNATS' prosjektet 'UKK' test system er utviklet for å forutsiutviklings embryonale toksisitet basert på transcriptomics profilering. I dette systemet hESC er blitt differensiert i de embryoide legemer i 14 dager. Tiden kinetic transcriptomics profil innhentet viser høy uttrykk for differensiering markør spesifikke for de tre bakterie lag ektoderm, endoderm og mesoderm på dag 14 som delvis rekapitulere tidlig menneskelig embryoutvikling. Basert på disse resultatene, har kjent fosterskadelige stoffer blitt eksponert under differensiering i 14 dager og differensial uttrykt gen profil foreligger. Imponerende, gen signaturer i forbindelse med de teratogene effekter av thalidomid observert hos mennesker, kan bli spådd av dette testsystemet 28. De representative resultater for metylkvikksølv i UKK-systemet viser konsentrasjonsavhengig nedregulering av transkripsjonsfaktorer knyttet til nervesystemet utvikling. De andre utviklings Nevro-miljøgifter ble også testet i dette systemet og innsats går på å identifiserede vanligste Toxico-markører på tvers av forbindelsene på mRNA nivå og validere dem på proteinnivå. The UKK testprotokoll gitt her gir grunnleggende retningslinje for å gjennomføre forsøket med humane embryonale stamcelle H9 å identifisere transcriptomic signatur for skade utviklingen.
Den optimaliserte standard operasjon prosedyre (SOP) for differensiering av pluripotente stamceller i henhold til UKN1 protokollen tillater en robust og synkronisert differensiering av hESC til NEP. Allerede etter seks dager med differensiering er en homogen cellepopulasjon med høy Pax6 uttrykket nivåer generert. Cellene vokser i adherente kulturer, som tillater analyse av immunfarging. Immunocytokjemisk analyse med høy oppløsning og ved konfokal mikroskopi krever at cellene blir dyrket på tynne glassoverflater. Dette er mulig på disse kulturene hvis glasset er belagt optimalt, men det må nevnes at cellene vokser meget tett, i mer enn ett enkelt lagetter seks dager. Derfor er rutinemessig analyse av avstamning-spesifikke markører lettere utført av RT-qPCR, chip eller western blot. En stor fordel for biokjemisk analyse av kulturene er det høye utbyttet av celler som kan oppnås ved denne differensiering protokollen fra en liten utgangspopulasjon av hESC. En ulempe med denne protokollen er de høye kostnadene av de mellom kosttilskudd (f.eks Noggin) som kreves for å tvinge den homogene nevrale differensiering. En annen ulempe for noen anvendelser kan være at noen små molekyler (kinase-inhibitorer) må være til stede i dyrkningsmediet som en del av protokollen. Således kan enkelte signalveier ikke undersøkes toksikologisk, som endring av dyrkningsforholdene endrer også differensieringen 29.
Fordelen med testsystemet kombinasjonen er bedre forståelse av DNT. Mens UKK dekker et bredere spekter og negativ effekt på tidlig bakterie beleggdannelse kan undersøkes, UKN1 alleOWS å undersøke flere nevrale spesifikke mekanismer som epigenetikk. Selv om de to kultursystemer som er presentert her er vist å forutsi utviklings neurotoksisitet for noen modell toxicants 16, er det fortsatt et behov for høyere gjennomstrømning versjoner av protokollene som tillater screening av et stort antall mulige utviklings neurotoxicants. Videre er mer arbeid som kreves for å identifisere og validere vanlige markører for toksisitet på mRNA eller protein nivå, og å etablere dem som en del av preklinisk narkotika sikkerhet evaluering.
Mer enn 20 milliarder amerikanske dollar per år er investert av farmasøytisk industri for legemiddelforskning 39. Som et bevis på konseptet, har vi utviklet in vitro toksisitetstestsystemer basert på hESC og transcriptomics som kan være egnet til å forutsi menneske relevante giftvirkninger av potensielle legemiddel forbindelser i en kostnadseffektiv og mindre tidkrevende måte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F-12 | Life Technologies | 11320082 | Dulbecco's Modified Eagle Medium:Nutrient Mixture F-12 |
| KOSR | Life Technologies | 10828028 | Knockout Serum Replacement |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050061 | GlutaMAX supplement |
| NEAA | Life Technologies | 11140050 | MEM Nonessential Amino Acids Solution |
| DPBS | Life Technologies | 14190-0144 | Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, without calcium, without magnesium |
| mTeSR medium | Stemcell Technologies | 5850 | |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443-250G | |
| V bottom plate | VWR | 734-0483 | Plate,Microwell,V BTTM,96 Well,Sterile 1 * 50 ST |
| V bottom plate lid | VWR | 634-0011 | Lid, Microtitre plates, Cond. Ring 1 * 50 ST |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15140-122 | Penicillin-Streptomycin, Liquid |
| Distilled Water | Life Technologies | 15230-089. | Sterile Distilled Water |
| Human FGF-2 (bFGF) | Millipore | GF003AF-100UG | Fibroblast Growth Factor basic, human recombinant, animal-free |
| Filter 0.22 μm | Millipore | SCGPU02RE | Stericup-GP, 0.22 μm, polyethersulfone, 250 ml, radio-sterilized |
| StemPro EZPassageTM Disposablte | Invitrogen | 23181010 | |
| BD MatrigelTM, hESC qualified Matrix | Stemcell Technologies | 354277 | 5 ml vial |
| DMSO | Sigma | D-2650 | |
| RNAlater Stabilization Solution | Life Technologies | AM7020 | It stabilizes and protect the RNA integrity in unfrozen samples. |
| 70 μm Cell Strainer | Becton Dickinson | 352350 | Cell strainer with 70 μm Nylon mesh |
| 35 μm Lid cell strainer, 5 ml tube | Becton Dickinson | 352235 | 5 ml polystyrene round bottom test tube, with a cell strainer cap (35 μm) |
| 50 ml sterile Polypropylene tube | Greiner Bio-One | 227261 | 50 ml Polypropylene tube with conical bottom, Sterile |
| T75 flask | Greiner Bio-One | 658175 | CELLSTAR Filter Cap Cell Culture 75 cm2 Flasks |
| TRIzol | Life Technologies | 10296010 | |
| 96 well optical bottom plates | Thermo Scientific | 165305 | |
| CellTiter-Blue | Promega | G8081 | |
| Accutase | PAA | L11-007 | |
| Apotransferin | Sigma-Aldrich | T-2036 | |
| Dispase | Worthington Biochemicals | LS002104 | |
| Dorsomorphin | Tocris Bioscience | 3093 | |
| EDTA | Roth | 8043.2 | |
| FBS | PAA | A15-101 | |
| FGF-2 | R&D Systems | 233-FB | |
| Gelatine | Sigma-Aldrich | G1890-100G | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-100G | |
| GlutaMAX | Gibco Invitrogen | 35050-038 | |
| HEPES | Gibco Invitrogen | 15630-056 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I-6634 | |
| Knockout DMEM | Gibco Invitrogen | 10829-018 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | |
| Noggin | R&D Systems | 719-NG | |
| PBS | Biochrom AG | L1825 | |
| Progesteron | Sigma-Aldrich | P7556 | |
| Putrescine | Sigma-Aldrich | P-5780 | |
| ROCK inhibitor Y-27632 | Tocris Biosciences | 1254 | |
| SB431542 | Tocris Biosciences | 1614 | |
| SDS | Bio-Rad | 161-0416 | |
| Selenium | Sigma-Aldrich | S-5261 | |
| β-Mercaptoethanol | Gibco Invitrogen | 31350-010 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| List of Kits | |||
| RNeasy Mini Kit (250) | QIAGEN | 74106 | |
| GeneChip Hybridization, Wash, and Stain Kit | Affymetrix | 900721, 22, 23 | This kit provides all reagents required for hybridization wash and staining of microarrays. |
| Rnase-Free DNase Set | QIAGEN | 79254 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| List of equipment | |||
| Inverted microscope | Olympus | IX71 | |
| Genechip Hybridisation Oven - 645 | Affymetrix | ||
| Genechip Fluidics Station-450 | Affymetrix | ||
| Affymetrix Gene-Chip Scanner-3000-7 G | Affymetrix | ||
| Spectramax M5 | Molecular Devices | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| List of softwares | |||
| Prism 4 | |||
| Affymetrix GCOS | |||
| Partek Genomic Suite 6.25 | |||
| Online tools for Functional annotation DAVID Onto-tools Intelligent Systems and Bioinformatics Laboratory |
|||
References
- Liu, W. W., Deng, Y. G., Liu, Y., Gong, W. R., Deng, W. B. Stem Cell Models for Drug Discovery and Toxicology Studies. Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 27 (1), 17-27 (2013).
- Zuba-Surma, E. K., Jozkowicz, A., Dulak, J. Stem Cells in Pharmaceutical Biotechnology. Current Pharmaceutical Biotechnology. 12 (11), 1760-1773 (2011).
- Leist, M., Hartung, T., Nicotera, P. The dawning of a new age of toxicology. ALTEX. 25 (2), 103-114 (2008).
- Kuegler, P. B., et al. Markers of murine embryonic and neural stem cells, neurons and astrocytes: reference points for developmental neurotoxicity testing. ALTEX. 27 (1), 17-42 (2010).
- Yamada, M., et al. Human oocytes reprogram adult somatic nuclei of a type 1 diabetic to diploid pluripotent stem cells. Nature. , (2014).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
- Takasato, M., et al. Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney. Nature cell biology. 16 (1), 118-126 (2014).
- Zimmer, B., et al. Evaluation of Developmental Toxicants and Signaling Pathways in a Functional Test Based on the Migration of Human Neural Crest Cells. Environmental Health Perspectives. 120 (8), 1116-1122 (2012).
- Bosman, A., et al. Molecular and Functional Evidence of HCN4 and Caveolin-3 Interaction During Cardiomyocyte Differentiation from Human Embryonic Stem Cells. Stem Cells and Development. 22 (11), 1717-1727 (2013).
- Sartiani, L., et al. Developmental changes in cardiomyocytes differentiated from human embryonic stem cells: A molecular and electrophysiological approach. Stem Cells. 25 (5), 1136-1144 (2007).
- Xu, X. Q., et al. Chemically defined medium supporting cardiomyocyte differentiation of human embryonic stem cells. Differentiation. 76 (9), 958-970 (2008).
- Pal, R., Mamidi, M. K., Das, A. K., Bhonde, R. Comparative analysis of cardiomyocyte differentiation from human embryonic stem cells under 3-D and 2-D culture conditions. Journal of Bioscience and Bioengineering. 115 (2), 200-206 (2013).
- Subramanian, K., et al. Spheroid Culture for Enhanced Differentiation of Human Embryonic Stem Cells to Hepatocyte-Like Cells. Stem Cells and Development. 23 (2), 124-131 (2014).
- Sivertsson, L., Synnergren, J., Jensen, J., Bjorquist, P., Ingelman-Sundberg, M. Hepatic Differentiation and Maturation of Human Embryonic Stem Cells Cultured in a Perfused Three-Dimensional Bioreactor. Stem Cells and Development. 22 (4), 581-594 (2013).
- Jagtap, S., et al. Cytosine arabinoside induces ectoderm and inhibits mesoderm expression in human embryonic stem cells during multilineage differentiation. British Journal of Pharmacology. 162 (8), 1743-1756 (2011).
- Krug, A. K., et al. Human embryonic stem cell-derived test systems for developmental neurotoxicity: a transcriptomics approach. Archives of Toxicology. 87 (1), 123-143 (2013).
- Leist, M., et al. Test systems of developmental toxicity: state-of-the art and future perspectives. Archives of Toxicology. 87 (12), 2037-2042 (2013).
- Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers. Molecular medicine. 6 (2), 88-95 (2000).
- Khoo, M. L. M., et al. Growth and differentiation of embryoid bodies derived from human embryonic stem cells: Effect of glucose and basic fibroblast growth factor. Biology of Reproduction. 73 (6), 1147-1156 (2005).
- Son, M. Y., Kim, H. J., Kim, M. J., Cho, S. Physical Passaging of Embryoid Bodies Generated from Human Pluripotent Stem Cells. Plos One. 6 (5), (2011).
- Winkler, J., Sotiriadou, I., Chen, S., Hescheler, J., Sachinidis, A. The potential of embryonic stem cells combined with -omics technologies as model systems for toxicology. Current medicinal chemistry. 16 (36), 4814-4827 (2009).
- Gunaseeli, I., Doss, M. X., Antzelevitch, C., Hescheler, J., Sachinidis, A. Induced pluripotent stem cells as a model for accelerated patient- and disease-specific drug discovery. Current medicinal chemistry. 17 (8), 759-766 (2010).
- Miller, M. T., Stromland, K. Teratogen update: Thalidomide: A review, with a focus on ocular findings and new potential uses. Teratology. 60 (5), 306-321 (1999).
- Newman, C. G. H. Teratogen Update - Clinical Aspects of Thalidomide Embryopathy - A Continuing Preoccupation. Teratology. 32 (1), 133-144 (1985).
- Stern, L. In vivo assessment of the teratogenic potential of drugs in humans. Obstetrics and gynecology. 58 (5 Suppl), 3S-8S (1981).
- Lynch, H. T., Reich, J. W. Diethylstilbestrol, Genetics, Teratogenesis, and Tumor Spectrum in Humans. Medical Hypotheses. 16 (3), 315-332 (1985).
- Satoh, H. Behavioral teratology of mercury and its compounds. Tohoku Journal of Experimental Medicine. 201 (1), 1-9 (2003).
- Meganathan, K., et al. Identification of Thalidomide-Specific Transcriptomics and Proteomics Signatures during Differentiation of Human Embryonic Stem Cells. Plos One. 7 (8), (2012).
- Balmer, N. V., et al. Epigenetic changes and disturbed neural development in a human embryonic stem cell-based model relating to the fetal valproate syndrome. Human Molecular Genetics. 21 (18), 4104-4114 (2012).
- Smirnova, L., Hogberg, H. T., Leist, M., Hartung, T. Developmental neurotoxicity - Challenges in the 21st Century and In Vitro Opportunities. ALTEX. 31 (2), 129-156 (2014).
- Leist, M., Efremova, L., Karreman, C. Food for thought ... considerations and guidelines for basic test method descriptions in toxicology. ALTEX. 27 (4), 309-317 (2010).
- Zimmer, B., et al. Coordinated waves of gene expression during neuronal differentiation of embryonic stem cells as basis for novel approaches to developmental neurotoxicity testing. Cell Death and Differentiation. 18 (3), 383-395 (2011).
- Experion RNA StdSens Analysis Kit for RNA analysis by Electrophoresis. , Available from: http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/10000976B%20%20RNA%20STDSENS%20MANUAL.PDF (2014).
- Affymetix GeneChip 3 IVT Express Kit for Target RNA preparation, Fragmentation and hybridization. , Available from: http://microarray.csc.mrc.ac.uk/downloads/3'%20IVT%20Express%20Manual.pdf (2014).
- Affymetrix GeneChip Hybridization, Wash and Stain Kit. , Available from: http://www.affymetrix.com/catalog/131467/AFFY/Hybridization,-Wash,-and-Stain-Kit#1_1 (2014).
- Affymetrix GeneChip Operating Software. , Available from: http://www.affymetrix.com/estore/partners_programs/programs/developer/gcos_sdk/gcos_sdk_overview.affx#1_1 (2014).
- Partek Genomics Suite. , Available from: http://www.partek.com/pgs (2014).
- ChIP DNA Clean and Concentrator. , Available from: http://www.zymoresearch.com/dna/dna-clean-up/pcr-dna-clean-up-concentration/chip-dna-clean-concentrator (2014).
- Kraljevic, S., Stambrook, P. J., Pavelic, K. Accelerating drug discovery. EMBO Reports. 5 (9), 837-842 (2004).
