Summary
Protokollerne beskriver to in vitro udviklingsmæssige toksicitet testsystemer (UKK og UKN1) baseret på humane embryonale stamceller og transkriptom studier. Testsystemet forudser human udviklingsmæssige fare toksicitet, og kan bidrage til at reducere dyreforsøg, omkostninger og den tid, der kræves til kemisk sikkerhed test.
Abstract
Effektive protokoller til at differentiere humane pluripotente stamceller til forskellige væv i kombination med genomenbaserede teknologier åbnet nye horisonter til test in vitro toksicitet potentielle lægemidler. At skabe et solidt videnskabeligt grundlag for sådanne analyser, vil det være vigtigt at få kvantitative oplysninger om tidsforløbet for udvikling og om de underliggende reguleringsmekanismer ved systembiologiske metoder. To analyser er derfor blevet tunet her for disse krav. I UKK testsystem, er humane embryonale stamceller (hESC) (eller andre pluripotente celler) overladt til spontant at differentiere i 14 dage i embryoide organer til at tillade generering af celler fra alle tre kim lag. Dette system rekapitulerer vigtige trin af tidlig human embryonisk udvikling, og det kan forudsige humanspecifikke tidlig embryonal / teratogenicitet, hvis cellerne udsættes for kemikalier under differentiering. Den UKN1 testsystem er baseret på embryonale differentiere til en population af neuroektodermal progenitor (NEP) celler i 6 dage. Dette system rekapitulerer tidlig neural udvikling og forudser tidlig udviklingsneurotoksicitet og epigenetiske ændringer udløst af kemikalier. Begge systemer, i kombination med transkriptom microarray studier, er egnede til at identificere toksicitet biomarkører. Endvidere kan de anvendes i kombination til at generere input data for systemer biologi analyse. Disse testsystemer har fordele i forhold til de traditionelle toksikologiske undersøgelser kræver store mængder af dyr. De testsystemer kan bidrage til en reduktion af omkostningerne til lægemiddeludvikling og evaluering kemikaliesikkerhedsvurdering. Deres kombination belyser især på forbindelser, der kan påvirke nervesystemets udvikling specifikt.
Introduction
Evnen af humane embryonale stamceller (hESC) til at differentiere til forskellige typer af celler åbnet en ny æra af test in vitro toksicitet 1, sygdom modellering og regenerativ medicin 2. Stamcellerne er udstyret med evnen til at kopiere sig selv, for at holde deres pluripotente tilstand og til at differentiere til specialiserede celler 3,4. Egenskaberne af embryonale (kapacitet til at differentiere til alle større celletyper) findes også i andre humane pluripotente stamceller, såsom humane inducerede pluripotente stamceller (hiPSC) eller celler frembragt ved kernetransplantation 5. For eksempel har mange forskellige hESC linjer blevet differentieret til neuroner 6, nyreceller 7, neurale kamceller 8, cardiomyocytter 9-12 eller hepatocytter lignende celler 13,14. Desuden kan embryonale spontant differentiere til celler af alle tre kim lag 15-18 i embryoide legemer (EBS) 19,20. EArly fosterudvikling er reguleret af differentiel ekspression af forskellige gener relateret til de forskellige kim lag, der er blevet fanget på mRNA niveau ved transcriptomics hjælp microarray-teknologi 15. Disse bestræbelser har resulteret i etableringen af orgel særlige toksikologiske modeller baseret på embryonale / hiPSC og transcriptomics analyse (til gennemgang se 21,22). Disse modeller har fordele i forhold til traditionelle brug af forsøgsdyr til toksikologiske undersøgelser, som prækliniske studier anvender forsøgsdyr ikke altid kan forudsige menneskelig sikkerhed. Narkotika inducerede toksiciteter forekommer i patienter er ofte relateret til metaboliske eller signaleringsprocesser, der adskiller sig mellem mennesker og forsøgsdyr. Arten Forskellen har forhindret pålidelig tidlig påvisning af afkommet hos mennesker, og for eksempel lægemidler, såsom thalidomid 23,24 og diethylstilbestrol 25,26 blev trukket tilbage fra markedet på grund af teratogenicitet. ThaliDomide har ikke vist nogen udviklingstoksicitet hos rotter eller mus. Miljømæssige kemikalier såsom methylkviksølv 27 resulterede i prænatal udviklingstoksicitet i forhold til nervesystemet i forskellige arter, men menneskelige manifestationer have været svært at modellere i dyr. For at løse problemet med artsspecificitet spørgsmål, forskere, der arbejder under forskellige projekter baseret på stamceller som genbeskyt, ESNATS, kriminalassistent mv er engageret i udvikling af forskellige modeller for embryonale toksicitet, neurotoksicitet, kardiotoksicitet, hepatotoksicitet og nefrotoksicitet ved hjælp af humane giftstoffer mistænkes for at påvirker mennesker. Under det europæiske konsortium projektet "embryonale stamceller-baserede Novel Alternative Testing Strategies (ESNATS)" er blevet etableret fem testsystemer. Et testsystem den såkaldte UKK (U niversitäts k linikum K OLN) testsystem delvist fanger tidlig menneskelig fosterudvikling. I denne system humane embryonale H9 celler differentieres i tre kim lag (ectoderm, endoderm og mesoderm) 15 og kim lag specifikke underskrifter er blevet taget til fange af transcriptomics profil bruge Affymetrix microarray platform. Forskellige udviklingsmæssige giftstoffer som thalidomid 28, valproat, methyl kviksølv 16,17 eller cytosinarabinosid 15 er blevet testet i dette system, og der er opnået giftstof specifikt gen signaturer. I et andet testsystem, den såkaldte den UKN1 (U niversity K onsta n z) testsystem 1 er H9 celler differentieres til neuroectodermal stamceller (NEP) i 6 dage. Dette fremgår af høj ekspression af neurale genmarkører, såsom Pax6 og OTX2. Under differentiering i 6 dage, har NEP-celler været udsat for udviklingsmæssige neuro-giftstoffer, såsom VPA, methylkviksølv. Giftstof-specifikke deregulerede transcriptomics profiler har været obtained samt ved hjælp af Affymetrix microarray platform 16,29.
Den nye vision for toksikologi det 21. århundrede, forventes testsystemer ikke kun giver fænotypiske beskrivelser ligesom histopatologi in vivo, eller transkriptom ændringer i slutningen af langsigtede toksiske inkubationer. Det foreslår snarere, at analyser giver mekanistisk information 3, og at disse oplysninger kan kortlægges såkaldte negative udfald veje (AOP), der giver en videnskabelig begrundelse for farlige virkninger 30. At give sådanne oplysninger, testsystemet anvendte nødt til at være meget kvalitet kontrolleres 31, som for eksempel dokumenteret af robuste standard drift procedurer. Desuden skal kortlægges med høj opløsning tidsafhængig ændringer. Dette kræver testsystemer med synkroniserede ændringer 32. De UKN1 og UKK testsystemer beskrevet her er blevet optimeret til disse krav.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Følgende protokol blev udført ved hjælp af humane embryonale stamceller line (embryonale) H9. Denne cellelinie var rutinemæssigt dyrket på mitotisk inaktiverede muse embryonale fibroblaster (MEF'er) i hESC kulturmedie suppleret med bFGF og derefter dyrket i stamceller medier på 6 cm Petri-plader overtrukket med basalmembran matrix, såsom matrigel, for at slippe af MEF. H9 celler fra> 80% sammenflydende plader blev anvendt til yderligere passage. H9-celler dyrket på basalmembranmatrix plader blev anvendt til EB'er formation. Alle procedurer nævnt i den følgende protokol er blevet udført under anvendelse af standardmetoder til aseptiske og god praksis cellekultur.
Del 1. UKK test System
1. humane embryonale stamceller Dyrkning
- Opdeling og vedligeholdelse af H9 på fødeceller
- Afpipetteres 2 ml 0,1% gelatine i hver 6 cm plade og inkuber i 30 min i cellekultur incubator (37 ° C og 5% CO2). Aspirer gelatineopløsning med steril Pasteur-pipette.
- Tilsæt 2 ml MEF medium indeholdende 0,1 x 10 6 MEF celler / ml i de to gelatineovertrukne plader og inkubere dem i cellekultur inkubator (37 ° C og 5% CO2) O / N.
- På næste dag, fjern H9-celler hætteglas fra den flydende nitrogen lagertank med pincet og tø hætteglasset i et 37 ° C vandbad under anvendelse lang pincet.
- Fjern hætteglasset fra vandbadet, bad den med 70% ethanol, lufttørre i biosikkerhed kabinet til 15 til 30 sek og overføre cellerne til 15 ml falcon rør.
- Tilsættes 9 ml H9 dyrkningsmedium langsomt på indervæggen og centrifugere cellerne ved 200 x g i 5 min.
- Aspirer supernatanten og resuspender cellerne i 6 ml dyrkningsmedium indeholdende ROCK inhibitor (10 uM, Y27632) og forsigtigt pipette for at blande. Aspirer MEF medium fra 6 cm plade, og der tilsættes 3 ml cellesuspension i hver plade. Skift mediet på day 3 og derefter hver anden dag. Subkultur> 80% sammenflydende plade celler med split-forhold 1: 3.
Bemærk: Normalt i 5 til 7 dage plade bliver sammenflydende. Foderautomater anvendte opnået fra CF1 mus embryo og inaktiveres ved udsættelse for γ-stråling.
- H9 celledyrkning på basalmembranmatrix overtrukne plader
- Tø stamcelle medium (5x) tillæg ved stuetemperatur, og tilsættes 100 ml i 400 ml basalmedium i biosikkerhed kabinet.
- Tø basalmembranmatrix på is. Tilføj foreslået volumen af basalmembran matrix (se certifikat for analyse for hvert parti) i 24 ml afkølet DMEM / F-12 basalmedium tolv 6 cm plader. Bland ved at pipettere op og ned.
- Tilsæt 2 ml i hver 6 cm plade. Holde pladen ved stuetemperatur i 1 time. Fjern mediet og tilsæt 2 ml stamceller medium.
- Tag fire sammenflydende H9 plader på MEF'er. Fjern de differentierede kolonier med 1 ml pipettespids under stereomikroskop holdes i biosikkerhed kabinet.
- Aspiratmediet og vask af cellerne med 4 ml PBS og der tilsættes 2 ml stamcelle medium i hver plade. Skær udifferentierede kolonier med 26 G nål på 6 til 9 stykker hver.
- Blidt opsamle cellerne i 50 ml Falcon-rør. Centrifuger ved 200 x g i 5 min.
- Aspirere supernatanten og resuspender i 12 ml stamcelle medium. Tæl klumper ved at sætte 20 pi på objektglas under mikroskop og justere lydstyrken for 150 klumper per ml. Tilsæt 2 ml suspension i hver 6 cm plade.
- Flytte pladerne back-og-tilbage og side-til-side bevægelser for ensartet klump distribution og inkuber pladerne i cellekultur inkubator (37 ° C og 5% CO2).
- Fjern de differentierede kolonier og give medium ændre hver anden dag.
2. embryoide organer (EB) Formation
Udføre alle procedure nævnt nedenfor som pr aseptiske forholdsregler og i biosikkerhed kabinet.
- Dag 0 & #8212; Udpladning af H9-celler på V bundplader
- Forbered 5% blokcopolymer, såsom Pluronic F 127 i PBS og filtreres gennem vakuum drevet filtreringssystem hjælp 0,22 um sterilt filter.
- Coat V bottom 96-brønds plader med 40 pi 5% blokcopolymer per brønd og inkuberes ved stuetemperatur i 45 minutter.
- Fjern sammenflydende basalmembranmatrix plader med H9 celler fra inkubatoren, og fjern de differentierede kolonier med 1 ml pipettespids under stereomikroskop i biosikkerhed kabinet.
- Aspirere mediet og vaskes cellerne med 4 ml PBS. Tilsæt 2 ml tilfældig differentiering medium (H9 dyrkningsmedium uden bFGF, RD medium) i hver plade. Brug passage værktøj og skær H9 cellekolonier i klumper af ensartet størrelse og form ved at observere under stereomikroskop i biosikkerhed kabinet og derefter forsigtigt skrabe med celleskraber.
- Indsamle klumper i 50 ml Falcon-rør og centrifugeres ved 200 xg i 5 min. Aspirere supernatanten og re-suspendere celli RD medium til at få 1.000 klumper per ml.
- Aspirere blokcopolymeren fra V bundplader. Hæld klumperne i steril firkantet plade og med hjælp af multikanalpipette tilsættes 100 pi af suspensionen til hver brønd i V bundplade.
- For den kraft aggregering af klumper, centrifuger V bundplader ved 4 ° C i 4 minutter ved 400 x g. Pladerne inkuberes i cellekultur inkubator (37 ° C og 5% CO2) i fire dage.
- Dag 4 - Indsamling af EB'er
- Saml EB'er i sterile firkantet plade fra V bundplader hjælp multikanalpipette og brede boring 200 tips ul.
- Saml EB'er fra sterile firkantet plade i 15 ml falcon rør med 10 ml sterilt serologisk pipette. Tillad EB'er til at nøjes med 2 min. Aspirere supernatanten og vask EBS med 5 ml PBS.
- Tillad EB'er til at nøjes med 2 min og aspirere supernatanten. Re-suspendere EB'er i 5 ml RD medium.
- Pipette ud 10 ml RD medium i 10 cmbakteriologiske plader. Overfør EB'er i 10 cm bakteriologiske plader.
- Inkubér bakteriologiske plader på vandret rysteapparat (frem- og tilbagegående bevægelse 50 / min) holdes i cellekultur inkubator (37 ° C og 5% CO2) i nødvendige tidsrum. Giv medium ændring (15 ml RD medium) hver anden dag.
Bemærk: Blid håndtering kræves, mens dyrkning hESCs. Størrelsen af EB'er varierer på dag 4. Vælg de ensartede størrelse EB'er (± 20%) ved at observere under stereomikroskop til yderligere forsøg. Ca. 50% EB'er dannet med denne fremgangsmåde er af ensartet størrelse. Overdragelsen af EB'er om shaker resulterer i ensartet form.
3. Cytotoksicitet Assay for IC 10 Bestemmelse
- Overførsel af EB'er om optiske bundplader
- Tø 0,1% gelatine i vandbad ved 37 ° C i 15 min og pels optiske bundplader med 50 pi 0,1% gelatine per brønd med multikanalpipette. Pladerne inkuberes ved stuetemperatur i45 min. Efter inkubering aspireres gelatinen fra optiske bundplader.
- Tag EBS indsamlet på dag 4 i 10 cm bakteriologisk plade indeholdende RD medium.
- Holde optiske bundplader i skrå position i biosikkerhed kabinet. Transfer to ensartet størrelse af EB'er i 100 pi RD medium per brønd i optisk bund 96 brønd plade ved at observere under stereomikroskop. Holde 12 th kolonne tom.
- Pladerne inkuberes i cellekultur inkubator (37 ° C og 5% CO2) i 24 timer.
- Drug eksponering fra dag 5 til dag 14
- Testforbindelsen veje og gøre højeste koncentration på kendt opløsningsmiddel.
- Udføre halv-logaritmisk fortynding af testforbindelsen serielt Til 8 fortyndinger i opløsningsmidlet indeholdende Falcon-rør nummereret med A til H, Hold røret no. I som vehikelkontrol, rør no. J som negativ kontrol (RD medium), og rør ikke. K som positiv (70% ethanol) kontrol.
- Optøs RD medium i vandbad ved 37° C i 15 min. Tag 5 ml RD medium hver i 11 sterile falk rør mærket 1-11.
- Overfør 5 pi løsning fra rør A til rør K i at røret 1 til 11 henholdsvis og vortex rørene. Tag den optiske bundplade fra inkubatoren, og fjern forsigtigt mediet med brug af multikanal pipette.
- Tilsæt 200 pi medier fra rør nummer 1 til 11 ind i de respektive kolonner af den optiske bundplade. Giv medium forandring / lægemiddel dagligt alternativ.
Bemærk: Ved halv-logaritmisk fortyndinger tager 6,48 pi opløsningsmidler i 7 rør mærket fra 2 til 8. Fra højeste koncentration rør no.1 transfer 3 pi til rør no.2, vortex og serielt overføre 3 pi til næste rør. Hold tuben nr.9 til styring køretøj og rør nr.10 for negativ kontrol. Tube no.11 er 70% ethanol.
- Dag 14: Resazurin eksponering og fluorescensmåling
- Tø RD medium i vandbad ved 37 ° C i 15 min. Udføre alle procedure mention nedenfor i fravær af lys i biosikkerhed kabinet.
- Tag 10 ml RD medium i 15 ml rør (A), og der tilsættes anbefalede volumen af resazurin reagens og blandes ved pipettering. Tag den optiske bundplade fra inkubatoren, og fjern forsigtigt al medium med multikanal pipette.
- Tilsættes 100 pi medium fra røret A i hver brønd. Inkubér pladen i cellekultur inkubator (37 ° C og 5% CO2) i 90 min.
- Måle fluorescens under anvendelse spektrofotometer (560 Ex / 590 Em).
- IC 10 værdien beslutsomhed
- Importer værdierne i grafen pad prisme efter fradrag af de tomme værdier. Sæt x-aksen som en dosis og y-aksen som en fluorescensenheder.
- Normalisere værdier for at opnå andel på y-aksen og omdanne værdierne (x-aksen som log skala). Beregne IC50-værdi ved anvendelse af S-formet dosis respons (variabel hældning) parameter. Beregne log IC 10 værdier ved hjælp af følgendeligning:
F = 10 logEC 50 = logECF - (1 / HillSlope) * log (F / (100-F))
Y = Bund + (Top-Bottom) / (1 + 10 ^ ((LogEC 50 X) * HillSlope)) - Bestem IC 10 værdier, der skal tages for yderligere undersøgelser.
4. Biomarkør Undersøgelse Baseret på Microarrays
- Dag 0 til dag 5:
- Embryoid krop dannelse og overførsel til 10 cm bakteriologiske plader - følge trinene nævnt i punkt 2 for embryoid krop formation.
Bemærk: Brug tre biologiske replikater for hver undersøgelse. Opdel hver biologiske replikere i to dele - Drug behandling på IC 10 koncentration og kontrol af køretøjerne. Forbered lægemiddelkoncentration 10.000 gange over IC 10 koncentrationen i køretøjet, og fra denne tilføjelse 10 pi til 100 ml RD medium med H9 celleklumper i 50 ml Eppendorf rør bland godt og frø det på V bundplader. Følg samme procedure for køretøj kontrolgruppe.
<li> For eksponering lægemiddel på dag 5 til 14, indsamle EB's og overføre dem i 10 cm bakteriologiske plader på dag 4 som pr de trin, der er nævnt i punkt 2. Overfør pladerne på horisontal ryster (gengældelse bevægelse 50 / min) i cellekultur inkubator (37 ° C og 5% CO2) i 14 dage. Giv medium ændre hver anden dag. - Embryoid krop dannelse og overførsel til 10 cm bakteriologiske plader - følge trinene nævnt i punkt 2 for embryoid krop formation.
- For prøvetagning, på dag 14, indsamle EB'er fra 10 cm plader i 15 ml falcon rør med steril serologisk pipette. Tillad EB'er til at nøjes med 2 min. Aspirere supernatanten og vask EBS med 5 ml PBS. Tillad EB'er til at nøjes med 2 min og aspirere supernatanten. Resuspender EB'er i 1 ml RNAlater opløsning eller TRIzol-reagens, vortex og opbevare prøven ved -80 ° C indtil yderligere bearbejdning.
Bemærk: Udfør alle procedure i biosikkerhed kabinet som pr god laboratoriepraksis. Rotere pladerne i cirkulær bevægelse omkring centret for at bringe alle EB'er i centrum, aspireres mediet fra omgivende ved hjælp af sterile glas pasture pipette, tilsættes 15 ml RD medium og derefter tilføje 15 ul lægemiddel / køretøj til respektive gruppe.
5. RNA Isolation og Integritet Testing
- RNA Isolation:
De fleste af de skridt, der er nævnt nedenfor, skal udføres for RNA oprensning ved anvendelse RNeasy Mini Kit som pr brugsanvisningen. Brug altid nukleasefrit rør, pipettespidser og vand. Mens du arbejder med TRIzol udføre alle procedure i kemikaliesikkerhedsrapporten hætte og slid beskyttelsesbriller samt kemiske beskyttelseshandsker.- Optø prøverne på is. Hvis prøver opbevares i RNAlater opløsning, centrifugeres rørene ved 12.000 xg i 5 min ved 4 ° C. Supernatanten fjernes, og der tilsættes 1 ml TRIzol reagens.
- Udriv prøver under anvendelse 24 G kanyle og 1 ml sprøjte. Ca. 15 gange findeling er tilstrækkelig til afbrydelse af EB'er, cellevæggen og plasma membraner.
- Tilsæt 200 pi af chloroform i hver prøve. Vortex at blande indholdet ensartet. Centrifugeved 12.000 xg i 15 minutter ved 4 ° C. Fjern RNeasy mini spin-søjler, 1,5 ml rør og mærke dem ordentligt.
- Saml supernatanten i 1,5 ml rør (samtidig med at indsamle supernatant ikke forstyrrer midten eller nederste lag). Tilføj tilsvarende volumen afkølet 70% ethanol. Bland indholdet ved forsigtig rystning.
- Påfør 700 pi fra rørene til respektive mini spin-søjler og centrifugere dem ved 12.000 xg i 20 sekunder ved stuetemperatur. Udføre alle yderligere skridt på RT.
- Filtratet Kassér og anvende resterende opløsning til de respektive kolonner og centrifugere dem ved 12.000 xg i 20 sek. Filtratet Kassér.
- Påfør 350 pi RW1 buffer til søjlen, og centrifugere dem ved 12.000 x g i 20 sek. Fjern filtratet og anvende 10 pi DNAse og 70 pi RDD puffer til søjlen.
- Inkuber ved stuetemperatur i 15 minutter. Påfør 350 pi RW1 buffer til søjlen, og centrifugere dem ved 12.000 x g i 20 sek. Filtratet Kassér. Påfør 500 piRPE vaskebuffer til søjlen og centrifugere dem ved 12.000 x g i 20 sek. Filtratet Kassér. Igen Påfør 500 pi RPE vaskebuffer til søjlen, og centrifugere dem ved 12.000 xg i 2 min. Filtratet Kassér.
- Skift kolonnerne til nye 2 ml rør indsamling og centrifugere dem ved 12.000 xg i 1 min. Overfør kolonnerne til mærket 1,5 ml opsamlingsrør og anvende 22 pi nuclease frit vand. Centrifuger rørene ved 12.000 x g i 1 min.
- Fjern indsamling røret og læg dem på is. Kvantificere RNA ved anvendelse automatiseret elektroforese system.
- RNA koncentration, renhed og integritet testning.
For RNA renhed og integritet testning brug automatiseret elektroforese-system og respektive kit 33.
6. Microarray Studies
- Udfør transkriptionel profilering ved hjælp af kommercielt tilgængelige menneskelige array-chips. Til fremstilling RNA-mål, fragmentering, hybridisering 34 og arraychip-farvning, vask 35 anvender kommercielt tilgængelige kits.
- Udføre vifte chip scanning og kvalitetskontrol ved hjælp af standard fluidik station, array-scannere og standardprocedurer software 36. For genekspressionsanalyse importere filer genereret fra scannere til standard kommercielle tilgængelige software 37, udføre baggrund korrektion, sammendrag og normalisering med Robust Multi-array analyse (RMA).
- Til opnåelse liste over differentielt udtrykte gener (DEG s) udfører en ANOVA-analyse. Fra denne liste bortfiltrere generne baseret på fold ændring (± 2) og FDR-kontrollerede p-værdi (<0,05). Anskaf Principal Component Analysis (PCA), Heat Kort osv ved hjælp af denne software.
Del 2. UKN 1 Test System
1. Vedligeholdelse af embryonale menneskelige stamceller
- Såning af MEF'er
- For differentieringen bruger NSCB # 8534 (H9) cellelinje. Kultur ceLLS på muse embryonale fibroblaster (MEF'er) som fødeceller. Coat T25 kolbe med 4 ml 0,1% gelatine og inkuberes i 30 minutter ved 37 ° C.
- Tø MEF'er i 37 ° C vandbad og overføre cellerne i forvarmet DMEM / 10% FBS.
- Spin 3,5 min med 500 x g, fjern supernatanten og resuspender cellerne til opnåelse af 1 x 10 7 celler / ml. Plate MEF'er 4 x 10 4 / cm2 i T25 beholdere om gelatine. Eventuelt bruge MEF'er for de næste to dage. Kvaliteten af MEF partier er et meget kritisk spørgsmål for embryonale vedligeholdelse. Derfor er det tilrådeligt at belyse den bedste virksomhed og fremstillingsmetode for H9-celler. Vi bruger PMEF P3.
- Opdeling og vedligeholdelse af H9
- Der tilsættes 1 ml foropvarmet dispase per T25 kolbe H9 og inkuberes 9 min ved 37 ° C.
- Tilsæt 2 ml vask medium til Dispase behandlede celler og pipette 5 gange op og ned med 5 ml pipette og overførsel celle løsning på en falk rør.
- Kolben skylles med 9 ml vaske mediumog tilføje celler til de andre. Spin 3,5 min med 500 xg, fjern supernatanten og re-suspendere cellerne i 10 ml hESC medium.
- Spin 3,5 min med 500 xg, fjern supernatanten og re-suspendere celler i 4 ml hESC medium. Tilsæt 0,5 ml cellesuspension og 4,5 ml hESC medium og pladen i en ny (PBS vaskes) T25 kolbe med MEF'er. Ændre hele hESC medium (5 ml) af kolben hver dag.
2. Differentiering af embryonale mod neuroectodermal progenitorceller (NEP)
- Forbered hESC medium og KCM medium. Coat en 10 cm skål med gelatine (0,1% i PBS) pr T25-kolbe og inkuberes i 30 minutter ved 37 ° C. Fjern mediet fra embryonale og tilføje nok Accutase at dække hele bunden af kolben (1 ml pr T25-kolbe), og der inkuberes 25 til 30 minutter ved 37 ° C.
- Forbered basalmembranmatrix coatede plader under Accutase inkubation. Tilføj kold DMEM / F12 til frosne basalmembran matrix pellet og løse det 1:20. Filter basalmembranmatrix Solution gennem et 40 um cellefilter. Tilføj filtrerede opløsning til plade, hele bunden skal dækkes (1 ml pr 6 brønde er påkrævet) og inkuberes i 2 timer ved stuetemperatur.
- Efter inkubationsperioden fjernes basalmembranmatrix supernatanten og frøceller på de coatede brønde. Efter Accutase trin (2,1) stoppe reaktionen ved tilsætning af 1,5 ml HES medium. Skrab celler fra kolben, tilsættes 8 ml hESC medium og producere en enkelt celle løsning ved pipettering med 10 ml pipette grundigt. Filter celler gennem en 40 um cellefilter.
- Spin celler 3 min med 500 xg, fjern supernatanten og re-suspendere celler i 10 ml embryonale. Spin celler igen 3 min med 500 x g, fjern supernatanten og resuspender cellerne i hESC indeholdende ROCK inhibitor Y-27632 ved en slutkoncentration på 10 uM.
- Fjern supernatanten af gelatine belagt skål. Plate cellesuspension på gelatine belagt fad til at fjerne de MEF'er og lade i inkubatoren for præcis 1 time.
BEMÆRK: Under dette trin af MEF vil settle på gelatine belagt plade, mens embryonale ikke kan knytte til gelatine. Derfor er dette er afgørende for at opnå en feeder-fri differentiering. Det er et afgørende skridt, da for lange inkubation resultater i hESC klumper og for kort inkubering i ineffektiv fjernelse af MEF'er. Efter 45 min inkubation pladen bør undersøges for allerede afviklet MEF'er og hESC klumper. - Når MEF'er har vedhæftet, forsigtigt vaske ikke-adhærente celler (hESC) fra efter inkubation med mediet allerede i pladen. Hvis flere T25 blev anvendt til at få flere celler, nu enkeltceller kan kombineres. Vask pladen en gang med embryonale medium.
- Spin celler 3 min med 500 xg, fjern supernatanten og re-suspendere cellerne i ca. 4 ml KCM indeholdende 10 uM ROCK inhibitor Y-27632 og 10 ng / ml FGF-2.
- Tæl celler i et hæmocytometer under anvendelse af Trypan blå. Plade 18 x 10 3 celler / cm2 på basalmembranmatrix overtrukne plader i KCM indeholdende 10 uM ROCK inhibitor Y-27632 og10 ng / ml FGF-2 (for 6 godt bruge 1,5 ml per brønd). Det er afgørende at pladen cellerne i den rigtige tæthed til at differentiere dem med succes i NEPS.
- Efter 24 timer, ændre medium til frisk KCM indeholder 10 pM ROCK inhibitor Y-27632 og 10 ng / ml FGF-2. Efter yderligere 24 timer, ændre medium til frisk KCM indeholder 10 ng / ml FGF2.
- 72 timer efter podning af cellerne, starter differentiering ved medium ændring hen imod KSR medium. Dette tidspunkt benævnes dagen for differentiering 0 (DoD0). Tilsætningen af teststoffer er muligt nu.
- På DoD1 og DoD2 mediet ændres præcis som på DoD0. Næste medium ændring er på DoD4 indeholdende 25% N2-S og 75% KSR. På DoD6 differentiering er stoppet, og cellerne høstes til analyse.
3. Chromatin Immunpræcipitation (chip) af embryonale menneskelige stamceller og NEP
- Fremstilling af kerner
- Tilføj 500 pi Accutase til hver 6 brønd, som skal analyseres, og der inkuberes i 25 til 30 min. Count celler i et Neubauer kammer ved hjælp Trypan blå.
- Resuspender cellerne i 1% formaldehyd i DMEM / F12 for tværbinding. Tilføj Tris pH 7,5 til en slutkoncentration på 125 mM efter 10 minutter for at stoppe tværbinding.
- Spin celler 3 min med 500 xg ved 4 ° C, fjern supernatanten og re-suspendere celler i koldt PBS.
- Spin celler 3 min med 500 x g ved 4 ° C, fjern supernatanten og resuspender celler i 1 ml L1 buffer / 1 x 10 6 celler.
- Der inkuberes i 5 minutter på is. Spin 5 min med 800 xg ved 4 ° C, fjern supernatanten og resuspender kerner i 1 ml L2- puffer / 2 x 10 6 celler.
- Ultralydbehandling og kvalitetskontrol
- Soniker således at DNA-fragmenter af 300-700 bp længde genereres. Spin 1 min med 10.000 xg ved 4 ° C. Overfør supernatanten til et nyt rør. Fragmenterne skal have den korrekte størrelse, ellers immunopræcipitation vil være ineffektiv samt fulgt qPCR.
- Fjern 50 pi end mix med 50 pi L2-buffer for at kontrollere effektiviteten af lydbehandling ved at køre en agarosegel.
- Reverse tværbinde ved inkubation ved 65 ° C i 4 timer og 500 rpm. Load prøver 1: 5 med Orange G loading dye på en 1,5% agarosegel og kørt 45 minutter ved 110 V i 1 x TBE-buffer. Kontrol fragmentstørrelse (bør være mellem 300-700 bp).
- Chromatin Immunfældning
- Fortynd prøver 1: 5 i fortyndingsbuffer og alikvot 1 ml pr IP i siliconiserede rør.
- Fjern 5% (volumen) fra fortyndet kromatin prøve (trin 3.3.1) og opbevares ved 4 ° C som "input".
- Inkuber prøver med antistoffer af dit valg og med uspecifik IgG O / N ved 4 ° C på en rotator.
- Tilføj 50 pi Protein-A / G sepharoseperler til hver prøve efter immunpræcipitering. Inkuber prøver 3 timer ved 4 ° C på en rotator. Spin 1 min med 1.500 xg ved 4 ° C og fjern supernatanten.
- Vask med 1 ml vask perler. Spin 1 min med 1.500 xg ved4 ° C og fjern supernatanten. Gentag trin g til h. Vask med 1 ml endelige vaskebuffer. Under vasketrinene bør du ikke miste nogen af perlerne, fordi det ændrer mængden af eluat direkte.
- Centrifuger 1 min med 1.500 xg ved 4 ° C og fjern supernatanten. Tilføj 125 pi elueringspuffer og inkuberes 15 min med 65 ° C ved 1.000 rpm på en ryster.
- Spin 1 min med 1.500 xg og overføre supernatanten til et nyt rør Gentag trin k og l. Der tilsættes 200 pi elueringspuffer til indgangen (3.3.2). Tilføj proteinase K og RNase til hver prøve og inkuberes 30 min med 37 ° C ved 500 rpm på et rysteapparat og derefter 4 timer med 65 ° C ved 500 rpm på en ryster.
BEMÆRK: DNA-ekstraktion brug kommercielt tilgængelig ChIP DNA Clean og Koncentrator Kit 38.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Methylkviksølv eksponering i UKK testsystem
Cytotoksicitetsassayet blev udført med H9 EB'er at opnå en IC 10-værdi (reduktionen af levedygtighed med 10%) for cytotoksiciteten af methyl-kviksølv (figur 1). Vi udførte også en mikroarray baseret (Affymetrix platform) biomarkør undersøgelse. H9 EB'er har været udsat for methyl-kviksølv (0,25 og 1 uM) i 14 dage. På dag 14, er blevet indsamlet prøver ved anvendelse af TRIzol og RNA blev isoleret. Transkriptionel profilering blev udført ved hjælp af Human Genome U133 plus 2,0 array-chips. Data er blevet analyseret med Partek Genomisk Suite TM 6.6. Første data oversigt blev opnået ved Princip Component Analysis (figur 2A), generering af Venn diagrammer (figur 2B) og konstruktion af varme kort (figur 2C). Princippet komponent analyse repræsenterer den overordnede fordeling af genekspression og det klart visualiseret segregation af MeHg 1 uM fra køretøjet kontrol og MeHg 0,25 uM grupper (PC # 25.2) (figur 2A). En liste over differentielt udtrykte gener (DEG) blev opnået efter statistisk behandling (envejs ANOVA) og filtrering af data ved hjælp af en fold ændring afskæring på ± 2 og en flerhed-korrigeret (Benjamini-Hochberg metode) p-værdi <0,05 (tabel 1). Den 1 uM MeHg behandling resulterede i 276 DEGS og 0,25 pM i 31 DEGS (figur 2B). Varmen kort viste, at MeHg 1 uM behandling hovedsagelig reduceret genekspression (figur 2C). Oplysninger om overrepræsenteret gen ontologi vilkår blev opnået ved hjælp af DAVID bioinformatik værktøjet. Tabel 2 viser de signifikant overrepræsenterede GO gen kategorier, der indeholdt mere end 5 gener. De ned-reguleret transkriptionsfaktorer relateret til nervesystemet udvikling blev identificeret. SEPP1, DDIT4, AK4, FRZB (hjernens udvikling), PITX (neural kerne udvikling) og ErbB3, UGT8, apoB, ApoA1 (nervesystem udvikling) blev nedreguleret i en dosisafhængig måde for methyl-kviksølv behandling (tabel 3).
UKN 1 testsystem
Denne differentiering protokollen bruger dobbelt SMAD hæmning 6 for at generere en ren population af NEP senest seks dage efter differentiering. De resulterende celler er karakteriseret ved en opregulering af den neurale precursorceller gener Pax6 og OTX2. De stamceller markører Oct4 og Nanog er nedreguleret under differentieringen i retning af NEP (figur 3A). På grund af den meget synkrone og homogen differentiering, er det også muligt at få oplysninger om de histon modifikationer i denne tidligt udviklingstrin. Vi tilpasset protokollen for chromatin immuno-udfældning (chip) under anvendelse af cellerne, enten ved begyndelsen af differentiering eller efter 6 dagesdifferentiering. Var tydeligt fra disse undersøgelser (figur 3B) En omskifter af methylering sites på promotorregioner af Pax6 og OTX2. De undersøgte methylering sites histon 3 lysin 4 trimethylation (H3K4me3) og histon 3 lysin 27 trimethylation (H3K27me3) var meget dynamisk i løbet af differentiering. Også på proteinniveauet en nedregulering af Oct4 kunne observeres (figur 4). Opreguleringen af Pax6 og neural stamcelle markør Nestin blev observeret ved immunfluorescensmikroskopi på proteinniveau (figur 4). Cellepopulationen viste en homogen og ren differentiering efter seks dages differentiering. Derfor let kan anvendes kulturerne til analyse af RNA og protein. Systemet giver også mulighed for at teste stoffer og den virkning, de har på tidlig neural udvikling 16,29.
Figur 1. Cytotoksicitet Assay (H9 differentiering) for MeHg. Analysen er udført som pr protokol til at definere IC 10 værdien for methyl-kviksølv.
Figur 2. Repræsentativ analyse af den differentierede udtrykte gener induceret ved 0,25 og 1 uM MeHg efter påføringen af UKK testsystem. De hESCs blev behandlet med 0,25 og 1 uM MeHg ifølge UKK testsystemet. Analyse af forskellen udtrykt transkripter med 14 dages differentierede EB'er er blevet udført under anvendelse af Partek Genomisk Suite TM 6.6 software. (A) Principal komponent analyse (3-Dimenional) i microarray data. (B) Venn-diagram opnået fra microarray analyse af genekspression. Diagrammet viser antallet afgener moduleret af MeHg behandling (fold ændring> ± 2, p-værdi <0,05). (C) Hierarkisk klyngedannelse af genekspression data (fold ændring> ± 2, p-værdi <0,05). De højt udtrykte gener i bilen kontrolgruppen er undertrykt af 1 uM MeHg behandling. Den 1 uM MeHg behandling resulterede i 233 udskrifter med lavere udtryk og 43 sonder med højere udtryk som sammenlignes med bilen kontrolgruppen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Genekspression og histon methyleringsmønster under differentiering fra embryonale mod NEP. Til alle eksperimenter blev embryonale differentieret til neuroectodermal prækursorceller (NEP). (A) Prøver blev taget ved day 6 af differentiering og transkriptniveauer af markørgener af neural differentiering blev bestemt ved RT-qPCR. Data (genekspression i forhold til embryonale) er middelværdier ± SEM af 5 eksperimenter. (B) Prøver til kromatin immunoprecipitation (chip) fremstillet på dag 6 i differentiering. Chippen blev udført med antistoffer specifikke for H3K4me3 eller H3K27me3 eller kontrol IgG. Faktorerne af promotorsekvenser berigelse er angivet som% input for H3K4me3 (grå) og H3K27me3 (sort). Data er middel ± SEM af 3 uafhængige cellepræparater. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Proteinekspression under differentiering fra embryonale retning af NEP. Celler blev fikseret og farvet for stamcellemarkørOct4 (grøn) på dag 0 af differentiering (DoD0) og for NEP markører Pax6 (rød) og Nestin (grøn) på dag 6 i differentiering (DoD6). Scale bar angiver 50 pm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Tabel 1. Liste over differentielt udtrykte gener (> ± 2 gange, p-værdi <0,05) i MeHg behandling versus køretøj kontrol i 14 dage gamle EB'er. Klik her for at se tabellen.
Tabel 2. Liste over betydeligt beriget og udvalgte GO kategorier (p-værdi <0,05,> 5 gener) med dysreguleret transcripts til MeHg versus køretøj kontrol i 14 dage gamle EB'er.
| GO Term | Tæl | P-værdi | Gener |
| Regulering af Apoptose | 18 | 0,0068 | ARHGEF3, TBX3, ErbB3, MITF, BNIP3, CDH1, IGF2, IFI16, HGF, GCH1, Amigo2, SERPINB9, KRT18, MSX1, ETS1, VEGFA, PERP, IGFBP3 |
| Regulering af Cell Proliferation | 17 | 0,0123 | RBP4, LYN, TBX3, ErbB3, MITF, IGF2, KDR-, RERG, MSX1 ADM, ETS1, VEGFA, BNC1, ADAMTS1, FABP1, IGFBP3, FIGF |
| Kar Udvikling | 12 | 0,0001 | PLAT, apoB, HAND1, TBX3, EPAS1, FOXF1, LEPR, VEGFA, COL3A1, LOX, FIGF, KDR |
| Skeletal System Udvikling ng> | 12 | 0,0008 | RBP4, MSX1, LGALS3, TBX3, HOXB6, COL3A1, STC1, IGF2, POSTN, FRZB, IGFBP3, AHSG |
| Hjerte Udvikling | 11 | 0,0001 | RBP4, ACTC1, MSX1, HAND1, TBX3 ADM, pKP2, ErbB3, GATA6, COL3A1, ADAMTS1 |
| Glukose metaboliske proces | 9 | 0,0003 | PDK1, RBP4, IdhA, PGM5, PYGL, HK2, PFKP, IGF2, PGK1 |
| Lunge Development | 7 | 0,0008 | RBP4, EPAS1, GATA6, FOXF1, VEGFA, LOX, KDR |
| Epitel Udvikling | 7 | 0,0386 | F11R, FREM2, GATA6, FOXF1, VEGFA, DSP, KDR |
| Mesoderm Udvikling | 5 | 0,0088 | HAND1, TBX3, FOXF1, VEGFA, SNAI2 |
| Term | Gene Symbol | Fold Change * | |
| 0.25 uM MeHg vs VC | 1 uM MeHg vs VC | ||
| Brain Development | SEPP1 | -2,17 | -4,13 |
| DDIT4 | -1,20 | -3,11 | |
| AK4 | -1,41 | -3,08 | |
| FRZB | -1,29 | -2,19 | |
| Neuronal kerne udvikling | PITX2 | -2,08 | -4,90 |
| Nervesystemet udvikling | ErbB3 | -1,86 | -2,89 |
| UGT8 | -1,67 | -2,14 | |
| ApoB | -3,59 | -5,72 | |
| ApoA1 | 2,63 | -2,90 | |
| VEGFA | -1,28 | -3,06 | |
* P-værdi <0,05
Tabel 4. Sammensætning af dyrkningsmediet.
| Sr. No. | Medium / Buffer navn | Sammensætning | |||
| Beløb | | ||||
| 1 | MEF Medium | DMEM Høj glukose | |||
| FCS | 10% | ||||
| Penicillin | 100 enheder / ml | ||||
| Streptomycin | 100 pg / ml | ||||
| L-Glutamin | 2 mM | ||||
| 2 | H9 Culture Medium | DMEM F12 | |||
| KOSR | 20% | ||||
| NEAA | 1% | ||||
| Glutamax | 1x | ||||
| β-mercaptoethanol | 0,1 mM | ||||
| Penicillin | 100 enheder / ml | ||||
| Streptomycin | 100 pg / ml | ||||
| bFGF | 4 ng / ml | 3 | RD Medium | H9 dyrkningsmedium uden bFGF | |
| 4 | Vaskemedium | DMEM / F12 | |||
| Knockout Serum Replacment | 20% | ||||
| 1x GlutaMAX | 1x | ||||
| MEM ikke-essentielle aminosyrer | |||||
| HEPES | 15 mM | ||||
| β-mercaptoethanol | 90 uM | ||||
| 5 | KCM Medium | DMEM | |||
| FBS | 10% | ||||
| inkuberes i 24 timer på MEF'er | |||||
| 6 | Knockout Serum Udskiftning (KSR) | ||||
| Knockout serum udskiftning | 15% | ||||
| 1x GlutaMAX | |||||
| 1x MEM ikke-essentielle aminosyrer | |||||
| β-mercaptoethanol | 15 um | ||||
| Noggin | 35 ng / ml | ||||
| Dorsomorphin | 600 nM | ||||
| SB431542 | 10 uM | ||||
| 7 | N2-S | DMEM / F-12 | |||
| Apotransferin | 100 pg / ml | ||||
| Glukose | 1,55 mg / ml | ||||
| Putrescin | 10 mM | ||||
| Selen | 500 uM | ||||
| Progesteron | 20 uM | ||||
| GlutaMAX | 200 uM | ||||
| 25 pg / ml | |||||
| 8 | L1 Buffer | Tris pH 8 | 50 mM | ||
| EDTA | 2 mM | ||||
| NP-40 | 0,10% | ||||
| Glycerol | 10% | ||||
| 9 | L2-buffer | Tris pH 8 | 50 mM | ||
| EDTA | 10 mM | ||||
| SDS | 1% | ||||
| 10 | Elution Buffer | NaHCO3 | 100 mM | ||
| SDS | 1% | ||||
| 11 | Wash Buffer | Tris | 20 mM | ||
| EDTA | 2 mM | SDS | 0,10% | ||
| NP-40 | 0,50% | ||||
| NaCl | 150 mM | ||||
| 12 | Endelig vaskebuffer | Tris | 20 mM | ||
| EDTA | 2 mM | ||||
| SDS | 0,10% | ||||
| NP-40 | 0,50% | ||||
| NaCl | 500 mM | ||||
| 13 | Stamcellemedium | mTESAR TM basalt medium | 400 ml | ||
| mTESAR TM supplement | 100 ml | ||||
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Traditionelle tilgange til toksikologisk testning involverer omfattende dyreforsøg dermed gøre test dyrt og tidskrævende. Som følge af de interspecies forskelle de prækliniske sikkerhedsundersøgelser undersøgelser er ikke altid gyldige til at forudsige toksikologiske effekter potentielle lægemidler er relevante for mennesker. Selv ikke-menneskelige primater er mest forudsigelige, stadig stærk etisk og socioeconomical krav hurtigt hæve ved moderne samfund for at udvikle følsomme og robust in vitro test Systemet er relevante for menneskers sikkerhed.
Den unikke evne til hESCs til at differentiere til alle somatiske celletyper, derfor den gentog in vivo humane udviklingsmæssige processer i kombination med følsomme toksikogenomik tilgange er blevet foreslået som et alternativ til de traditionelle metoder til lægemiddelsikkerhed test 6,21. Under de "ESNATS" projekt "UKK" testsystem er blevet udviklet til at forudsigeden udviklingsmæssige embryonale toksicitet baseret på transcriptomics profilering. I dette system hESC er blevet differentieret i de embryoide legemer i 14 dage. Den tid kinetiske transcriptomics profil opnået viser høj ekspression af differentieringsmarkør specifik for tre kim lag ektoderm, endoderm og mesoderm på dag 14, som delvist rekapitulere tidlig human embryonisk udvikling. Baseret på disse resultater, har kendt teratogene stoffer været udsat under differentiering i 14 dage og differentieret udtrykt gen profil er blevet opnået. Imponerende, gen signaturer forbundet med de teratogene virkninger af thalidomid observeret hos mennesker, kunne forudsiges ved dette testsystem 28. De repræsentative resultater for methyl-kviksølv i UKK systemet viser koncentrationsafhængig nedregulering af transkriptionsfaktorer relateret til nervesystemet udvikling. De andre udviklingsmæssige neuro-giftstoffer blev også testet i dette system, og indsatsen går på at identificerede fælles toksikologiske-markører tværs forbindelserne på mRNA-niveau og validere dem på proteinniveauet. Den UKK testprotokol forudsat her giver grundlæggende retningslinje for at gennemføre forsøget med embryonale stamceller H9 menneskeligt at identificere den transkriptom signatur for udviklingstoksisk.
Den optimerede standard operation procedure (SOP) for differentiering af pluripotente stamceller i henhold til UKN1 protokollen tillader en robust og synkroniseret differentiering af embryonale til NEP. Allerede efter seks dages differentiering, er en homogen cellepopulation med høj Pax6 ekspressionsniveauerne genereret. Cellerne vokser i adhærente kulturer, der tillader analyse ved immunfarvning. Immuncytokemisk analyse med høj opløsning og ved konfokal mikroskopi kræver, at cellerne dyrkes på tynde glasoverflader. Dette er muligt for disse kulturer, hvis glasset er belagt optimalt, men det skal nævnes, at cellerne vokser meget tæt, i mere end et enkelt lagefter seks dage. Derfor er rutinemæssig analyse af slægt-specifikke markører udføres lettere ved RT-qPCR, chip eller western blot. En stor fordel for den biokemiske analyse af kulturerne er højt udbytte af celler, som kan opnås ved denne differentiering protokol fra en lille start population af hESC. En ulempe ved denne protokol er den høje pris på de mellemstore kosttilskud (f.eks noggin), der kræves for at tvinge den homogene neural differentiering. En anden ulempe for nogle applikationer kan være, at nogle små molekyler (kinase inhibitorer) er nødt til at være til stede i dyrkningsmediet som en del af protokollen. Således kan visse signalveje ikke undersøges toksikologisk, som ændringen af dyrkningsbetingelserne ændrer også differentieringen 29.
Fordelen ved testsystemet kombination er den bedre forståelse af DNT. Hvorimod UKK dækker en bredere vifte og negativ virkning på tidlige kim lag dannelse kan undersøges, UKN1 alleOWS at undersøge flere neurale-specifikke mekanismer såsom epigenetik. Selv om de to dyrkningssystemer præsenteret her har vist sig at forudsige udviklingsneurotoksicitet for få model giftstoffer 16, er der stadig et behov for højere gennemløb versioner af de protokoller, der tillader screening af et stort antal potentielle udviklingsmæssige neurotoksiske stoffer. Desuden er mere arbejde, der kræves for at identificere og validere fælles markører for toksicitet ved mRNA eller protein-niveau, og at etablere dem som en del af præklinisk lægemiddelsikkerhed evaluering.
Mere end 20000 millioner dollars om året er investeret af de farmaceutiske industri for lægemiddelforskning 39. Som et bevis for koncept, har vi udviklet in vitro toksicitet testsystemer baseret på embryonale og transcriptomics, der kan være egnet til at forudsige de menneskelige relevante toksikologiske effekter potentielle drug forbindelser i en omkostningseffektiv og mindre tidskrævende måde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F-12 | Life Technologies | 11320082 | Dulbecco's Modified Eagle Medium:Nutrient Mixture F-12 |
| KOSR | Life Technologies | 10828028 | Knockout Serum Replacement |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050061 | GlutaMAX supplement |
| NEAA | Life Technologies | 11140050 | MEM Nonessential Amino Acids Solution |
| DPBS | Life Technologies | 14190-0144 | Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, without calcium, without magnesium |
| mTeSR medium | Stemcell Technologies | 5850 | |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443-250G | |
| V bottom plate | VWR | 734-0483 | Plate,Microwell,V BTTM,96 Well,Sterile 1 * 50 ST |
| V bottom plate lid | VWR | 634-0011 | Lid, Microtitre plates, Cond. Ring 1 * 50 ST |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15140-122 | Penicillin-Streptomycin, Liquid |
| Distilled Water | Life Technologies | 15230-089. | Sterile Distilled Water |
| Human FGF-2 (bFGF) | Millipore | GF003AF-100UG | Fibroblast Growth Factor basic, human recombinant, animal-free |
| Filter 0.22 μm | Millipore | SCGPU02RE | Stericup-GP, 0.22 μm, polyethersulfone, 250 ml, radio-sterilized |
| StemPro EZPassageTM Disposablte | Invitrogen | 23181010 | |
| BD MatrigelTM, hESC qualified Matrix | Stemcell Technologies | 354277 | 5 ml vial |
| DMSO | Sigma | D-2650 | |
| RNAlater Stabilization Solution | Life Technologies | AM7020 | It stabilizes and protect the RNA integrity in unfrozen samples. |
| 70 μm Cell Strainer | Becton Dickinson | 352350 | Cell strainer with 70 μm Nylon mesh |
| 35 μm Lid cell strainer, 5 ml tube | Becton Dickinson | 352235 | 5 ml polystyrene round bottom test tube, with a cell strainer cap (35 μm) |
| 50 ml sterile Polypropylene tube | Greiner Bio-One | 227261 | 50 ml Polypropylene tube with conical bottom, Sterile |
| T75 flask | Greiner Bio-One | 658175 | CELLSTAR Filter Cap Cell Culture 75 cm2 Flasks |
| TRIzol | Life Technologies | 10296010 | |
| 96 well optical bottom plates | Thermo Scientific | 165305 | |
| CellTiter-Blue | Promega | G8081 | |
| Accutase | PAA | L11-007 | |
| Apotransferin | Sigma-Aldrich | T-2036 | |
| Dispase | Worthington Biochemicals | LS002104 | |
| Dorsomorphin | Tocris Bioscience | 3093 | |
| EDTA | Roth | 8043.2 | |
| FBS | PAA | A15-101 | |
| FGF-2 | R&D Systems | 233-FB | |
| Gelatine | Sigma-Aldrich | G1890-100G | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-100G | |
| GlutaMAX | Gibco Invitrogen | 35050-038 | |
| HEPES | Gibco Invitrogen | 15630-056 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I-6634 | |
| Knockout DMEM | Gibco Invitrogen | 10829-018 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | |
| Noggin | R&D Systems | 719-NG | |
| PBS | Biochrom AG | L1825 | |
| Progesteron | Sigma-Aldrich | P7556 | |
| Putrescine | Sigma-Aldrich | P-5780 | |
| ROCK inhibitor Y-27632 | Tocris Biosciences | 1254 | |
| SB431542 | Tocris Biosciences | 1614 | |
| SDS | Bio-Rad | 161-0416 | |
| Selenium | Sigma-Aldrich | S-5261 | |
| β-Mercaptoethanol | Gibco Invitrogen | 31350-010 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| List of Kits | |||
| RNeasy Mini Kit (250) | QIAGEN | 74106 | |
| GeneChip Hybridization, Wash, and Stain Kit | Affymetrix | 900721, 22, 23 | This kit provides all reagents required for hybridization wash and staining of microarrays. |
| Rnase-Free DNase Set | QIAGEN | 79254 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| List of equipment | |||
| Inverted microscope | Olympus | IX71 | |
| Genechip Hybridisation Oven - 645 | Affymetrix | ||
| Genechip Fluidics Station-450 | Affymetrix | ||
| Affymetrix Gene-Chip Scanner-3000-7 G | Affymetrix | ||
| Spectramax M5 | Molecular Devices | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| List of softwares | |||
| Prism 4 | |||
| Affymetrix GCOS | |||
| Partek Genomic Suite 6.25 | |||
| Online tools for Functional annotation DAVID Onto-tools Intelligent Systems and Bioinformatics Laboratory |
|||
References
- Liu, W. W., Deng, Y. G., Liu, Y., Gong, W. R., Deng, W. B. Stem Cell Models for Drug Discovery and Toxicology Studies. Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 27 (1), 17-27 (2013).
- Zuba-Surma, E. K., Jozkowicz, A., Dulak, J. Stem Cells in Pharmaceutical Biotechnology. Current Pharmaceutical Biotechnology. 12 (11), 1760-1773 (2011).
- Leist, M., Hartung, T., Nicotera, P. The dawning of a new age of toxicology. ALTEX. 25 (2), 103-114 (2008).
- Kuegler, P. B., et al. Markers of murine embryonic and neural stem cells, neurons and astrocytes: reference points for developmental neurotoxicity testing. ALTEX. 27 (1), 17-42 (2010).
- Yamada, M., et al. Human oocytes reprogram adult somatic nuclei of a type 1 diabetic to diploid pluripotent stem cells. Nature. , (2014).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
- Takasato, M., et al. Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney. Nature cell biology. 16 (1), 118-126 (2014).
- Zimmer, B., et al. Evaluation of Developmental Toxicants and Signaling Pathways in a Functional Test Based on the Migration of Human Neural Crest Cells. Environmental Health Perspectives. 120 (8), 1116-1122 (2012).
- Bosman, A., et al. Molecular and Functional Evidence of HCN4 and Caveolin-3 Interaction During Cardiomyocyte Differentiation from Human Embryonic Stem Cells. Stem Cells and Development. 22 (11), 1717-1727 (2013).
- Sartiani, L., et al. Developmental changes in cardiomyocytes differentiated from human embryonic stem cells: A molecular and electrophysiological approach. Stem Cells. 25 (5), 1136-1144 (2007).
- Xu, X. Q., et al. Chemically defined medium supporting cardiomyocyte differentiation of human embryonic stem cells. Differentiation. 76 (9), 958-970 (2008).
- Pal, R., Mamidi, M. K., Das, A. K., Bhonde, R. Comparative analysis of cardiomyocyte differentiation from human embryonic stem cells under 3-D and 2-D culture conditions. Journal of Bioscience and Bioengineering. 115 (2), 200-206 (2013).
- Subramanian, K., et al. Spheroid Culture for Enhanced Differentiation of Human Embryonic Stem Cells to Hepatocyte-Like Cells. Stem Cells and Development. 23 (2), 124-131 (2014).
- Sivertsson, L., Synnergren, J., Jensen, J., Bjorquist, P., Ingelman-Sundberg, M. Hepatic Differentiation and Maturation of Human Embryonic Stem Cells Cultured in a Perfused Three-Dimensional Bioreactor. Stem Cells and Development. 22 (4), 581-594 (2013).
- Jagtap, S., et al. Cytosine arabinoside induces ectoderm and inhibits mesoderm expression in human embryonic stem cells during multilineage differentiation. British Journal of Pharmacology. 162 (8), 1743-1756 (2011).
- Krug, A. K., et al. Human embryonic stem cell-derived test systems for developmental neurotoxicity: a transcriptomics approach. Archives of Toxicology. 87 (1), 123-143 (2013).
- Leist, M., et al. Test systems of developmental toxicity: state-of-the art and future perspectives. Archives of Toxicology. 87 (12), 2037-2042 (2013).
- Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers. Molecular medicine. 6 (2), 88-95 (2000).
- Khoo, M. L. M., et al. Growth and differentiation of embryoid bodies derived from human embryonic stem cells: Effect of glucose and basic fibroblast growth factor. Biology of Reproduction. 73 (6), 1147-1156 (2005).
- Son, M. Y., Kim, H. J., Kim, M. J., Cho, S. Physical Passaging of Embryoid Bodies Generated from Human Pluripotent Stem Cells. Plos One. 6 (5), (2011).
- Winkler, J., Sotiriadou, I., Chen, S., Hescheler, J., Sachinidis, A. The potential of embryonic stem cells combined with -omics technologies as model systems for toxicology. Current medicinal chemistry. 16 (36), 4814-4827 (2009).
- Gunaseeli, I., Doss, M. X., Antzelevitch, C., Hescheler, J., Sachinidis, A. Induced pluripotent stem cells as a model for accelerated patient- and disease-specific drug discovery. Current medicinal chemistry. 17 (8), 759-766 (2010).
- Miller, M. T., Stromland, K. Teratogen update: Thalidomide: A review, with a focus on ocular findings and new potential uses. Teratology. 60 (5), 306-321 (1999).
- Newman, C. G. H. Teratogen Update - Clinical Aspects of Thalidomide Embryopathy - A Continuing Preoccupation. Teratology. 32 (1), 133-144 (1985).
- Stern, L. In vivo assessment of the teratogenic potential of drugs in humans. Obstetrics and gynecology. 58 (5 Suppl), 3S-8S (1981).
- Lynch, H. T., Reich, J. W. Diethylstilbestrol, Genetics, Teratogenesis, and Tumor Spectrum in Humans. Medical Hypotheses. 16 (3), 315-332 (1985).
- Satoh, H. Behavioral teratology of mercury and its compounds. Tohoku Journal of Experimental Medicine. 201 (1), 1-9 (2003).
- Meganathan, K., et al. Identification of Thalidomide-Specific Transcriptomics and Proteomics Signatures during Differentiation of Human Embryonic Stem Cells. Plos One. 7 (8), (2012).
- Balmer, N. V., et al. Epigenetic changes and disturbed neural development in a human embryonic stem cell-based model relating to the fetal valproate syndrome. Human Molecular Genetics. 21 (18), 4104-4114 (2012).
- Smirnova, L., Hogberg, H. T., Leist, M., Hartung, T. Developmental neurotoxicity - Challenges in the 21st Century and In Vitro Opportunities. ALTEX. 31 (2), 129-156 (2014).
- Leist, M., Efremova, L., Karreman, C. Food for thought ... considerations and guidelines for basic test method descriptions in toxicology. ALTEX. 27 (4), 309-317 (2010).
- Zimmer, B., et al. Coordinated waves of gene expression during neuronal differentiation of embryonic stem cells as basis for novel approaches to developmental neurotoxicity testing. Cell Death and Differentiation. 18 (3), 383-395 (2011).
- Experion RNA StdSens Analysis Kit for RNA analysis by Electrophoresis. , Available from: http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/10000976B%20%20RNA%20STDSENS%20MANUAL.PDF (2014).
- Affymetix GeneChip 3 IVT Express Kit for Target RNA preparation, Fragmentation and hybridization. , Available from: http://microarray.csc.mrc.ac.uk/downloads/3'%20IVT%20Express%20Manual.pdf (2014).
- Affymetrix GeneChip Hybridization, Wash and Stain Kit. , Available from: http://www.affymetrix.com/catalog/131467/AFFY/Hybridization,-Wash,-and-Stain-Kit#1_1 (2014).
- Affymetrix GeneChip Operating Software. , Available from: http://www.affymetrix.com/estore/partners_programs/programs/developer/gcos_sdk/gcos_sdk_overview.affx#1_1 (2014).
- Partek Genomics Suite. , Available from: http://www.partek.com/pgs (2014).
- ChIP DNA Clean and Concentrator. , Available from: http://www.zymoresearch.com/dna/dna-clean-up/pcr-dna-clean-up-concentration/chip-dna-clean-concentrator (2014).
- Kraljevic, S., Stambrook, P. J., Pavelic, K. Accelerating drug discovery. EMBO Reports. 5 (9), 837-842 (2004).
