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Developmental Biology

基于发育毒性测定化学品安全筛选和系统生物学数据生成人类多能干细胞

Published: June 17, 2015 doi: 10.3791/52333
Automatic Translation
*1, *2, 1, 1, 1, 3, 3, 4, 2, 1, *2, *1
1Center of Physiology and Pathophysiology, Institute of Neurophysiology, University of Cologne, 2Department of Biology, University of Konstanz, 3Department of Statistics, Technical University of Dortmund, 4Leibniz Research Centre for Working Environment and Human Factors, Technical University of Dortmund
* These authors contributed equally

Summary

该协议描述了基于人胚胎干细胞和转录研究2 在体外发育毒性试验系统（UKK和UKN1）。测试系统预测人类发育毒性危险，并可能有助于减少动物研究中，成本和所需的化学安全测试的时间。

Abstract

高效的协议来区分人多能干细胞，以组合各种组织与组学技术开辟了新的视野为潜在药物的体外毒性测试。为了提供这种试验坚实的科学基础，这将是非常重要的获得发展的时间进程和底层的监管机制，系统生物学方法的定量信息。两个实验都因此被调整为在这里这些要求。在UKK测试系统中，人胚胎干细胞（hESC细胞）（或其它多能细胞）都留给自发分化为胚状体14天，以允许产生所有三个胚层的细胞。该系统概括的人类早期胚胎发育的关键步骤，并且它可以预测人特异性早期胚胎毒性/致畸性，如果细胞分化过程中暴露于化学品。所述UKN1测试系统是基于人类胚胎干细胞分化为一个populat神经外胚层祖离子（NEP）细胞6天。该系统概括早期神经发育，并预测早期发育神经毒性和化学品引发的表观遗传变化。两个系统，在与转录微阵列研究结合，适合于识别的毒性的生物标志物。此外，它们也可以组合使用以产生用于系统生物学分析的输入数据。这些测试系统具有比传统的毒理学研究需要大量的动物的优点。该测试系统可能有助于减少药物开发和化学安全性评价的费用。他们的组合揭示尤其是对可能影响具体化合物的神​​经发育光。

Introduction

人类胚胎干细胞（hESC细胞）的分化成各种细胞的能力打开了体外毒性试验1中 ，疾病建模和再生医学2的新时代。干细胞被赋予的能力，自我复制，以保持其多能状态，并分化成特定细胞3,4。的人类胚胎干细胞的特性（容量来区分所有主要的细胞类型），也发现在其它人多能干细胞，如人类诱导多能干细胞（hiPSC）或通过核移植5产生的细胞。例如，许多不同的hESC细胞系已分化为神经元6，肾细胞7，神经嵴细胞8，心肌9-12，或肝细胞样细胞13,14。此外，人类胚胎干细胞可自发地分化成胚状体（EB）19,20所有三种胚层15-18的细胞。 Ë阿尔利胚胎发育是通过与已捕获在mRNA水平通过使用微阵列技术15转录的不同胚层的多种基因的差异表达调控。这些努力使建立基于人类胚胎干细胞/ hiPSC和转录组分析（综述见21,22）器官特异性毒性模型。这些车型有优势的传统使用实验动物的毒理学研究，如使用实验动物并不总是预测人类安全的临床前研究。在患者中遇到的药物诱导的毒性往往与人类和实验动物之间是不同的代谢或信号传导过程。的物种差异防止了可靠的早期检测发育毒性在人类，例如药物如沙利度胺23,24和己烯雌酚25,26从市场上撤回由于致畸。塔利domide并没有表现出在大鼠或小鼠任何发育毒性。环境化学品如甲基汞27导致相对于神经系统中的各种物种产前发育毒性，但人的表现已经很难在动物模型。为了解决种属特异性问题的问题，科学家们根据不同的项目工作的基础上的干细胞一样重新保护，ESNATS，侦探等所从事的不同型号的发展胚胎毒性，神经毒性，心脏毒性，肝毒性和肾毒性涉嫌使用对人体有毒物质影响人类。根据欧洲联盟项目的胚胎干细胞为基础的新型替代测试策略（ESNATS）“五个测试系统已经建立。一个测试系统的所谓UKK（UniversitätsķlinikumķOLN）测试系统部分捕捉人类早期胚胎发育。在这个System人类胚胎H9细胞分化中15和胚层特定的签名已被抓获转录使用Affymetrix芯片平台简介三个胚层（外胚层，内胚层和中胚层）。像沙利度胺28，丙戊酸，甲基汞16,17，或阿糖胞苷15各个发育毒物在该系统已经过测试，并且具体毒物基因签名已被获得。在第二测试系统，即所谓的UKN1（U。高校ķonsta N个Z的）测试系统1中，H9细胞分化到神经外胚层祖细胞（NEP）6天。这是通过高表达的神经基因标记如PAX6和OTX2证实。在分化6天，NEP细胞已经暴露于发育神经毒物如丙戊酸钠，甲基汞。毒物特异性解除管制的转录概况已obtai通过使用Affymetrix芯片平台定义16,29以及。

对于21 世纪的毒理学的新远景设想，测试系统不仅产生的表型的描述，如组织病理学体内 ，或转录变化在长期毒物孵化结束。它，而表明试验提供机械信息3，而该信息可以被映射到所谓的不利后果的途径（AOP），提供了一个科学原理为危险影响30。为了提供这种信息，应用的测试系统必须高度控制质量31，作为例如通过稳健标准操作程序记载。此外，依赖于时间的变化需要被映射为高的分辨率。这就要求测试系统同步变化32。这里所描述的UKN1和UKK测试系统进行了优化这些需求。

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Protocol

使用人胚胎干细胞系（人类胚胎干细胞）H9进行以下协议。此细胞系常规地在有丝分裂失活的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）在人类胚胎干细胞的培养基补充有bFGF和然后培养干细胞培养基上6厘米涂有基底膜基质如基质胶，培养皿除掉的MEF的培养。从> 80％汇合板的H9细胞用于进一步的通道。 H9细胞对基底膜基质平板上培养被用于EB的形成。在以下协议中提及的所有程序使用标准方法进行无菌和良好的细胞培养的做法已经完成。

第1部分UKK测试系统

1.人类胚胎干细胞培养

  1. 分裂和维护H9的饲养细胞上
    1. 加入2毫升0.1N％明胶到每个6厘米板孵育在细胞培养incub 30分钟员（37℃和5％的CO 2）。吸明胶溶液用无菌巴斯德吸管。
    2. 加入2毫升含有0.1×10 6 MEF细胞/ ml的MEF培养基成两个明胶包被的板并孵育它们在细胞培养孵育箱（37℃，5％CO 2）的O / N。
    3. 次日，取出从所述液氮贮罐的H9细胞小瓶使用镊子和使用长镊子解冻小瓶在37℃水浴中。
    4. 从水浴，浴用70％的乙醇，空气干燥除去小瓶中的生物安全柜15至30秒，将细胞转移至15ml falcon管。
    5. 添加9毫升H9培养基慢慢在内壁和离心将细胞在200×g离心5分钟。
    6. 吸出上清液并重新悬浮的细胞在含ROCK抑制剂6毫升培养基（10μM，Y27632），轻轻移液管混合。从6厘米板吸MEF中，加3毫升细胞悬液每块板。更改D中的培养基唉3，然后每隔一天。亚文化> 80％汇合板细胞分流比1：3。
      注意：通常在5至7天板变得汇合。用馈线是从小鼠CF1胚胎获得，并通过暴露灭活γ辐射。
  2. 在基底膜基质涂层板H9细胞培养
    1. 解冻干细胞培养基（5次）补充在RT和生物安全柜加入100 ml分解成400 ml基础培养基。
    2. 在冰上解冻基底膜基质。添加基底膜基质的建议量（参照分析证书每批）24毫升冷冻的DMEM / F-12培养基十二6厘米板。吹打向上和向下混合。
    3. 加入2毫升每6厘米板。保持所述板在RT 1小时。除去培养基并加入2ml的干细胞培养基中培养。
    4. 就拿出来的MEF 4汇合H9板。取出1毫升枪头分化殖民地体视显微镜下，在保持生物安全柜。
    5. 吸气该介质和洗涤细胞用4ml PBS中并加入2ml干在各平板的细胞培养基。切＆G针头未分化的殖民地，以每6至9个。
    6. 轻轻收集细胞在50毫升猎鹰管。离心，在200×g离心5分钟。
    7. 吸出上清液并重新悬浮于12ml干细胞培养基。通过将在显微镜下对载玻片20微升计数的团块，并调整为每毫升150团块的体积。加入2毫升悬浮液中在每个6厘米板。
    8. 移动板背面的往复和侧到另一侧的运动为均匀丛分布和孵化在细胞培养孵育箱（37℃，5％CO 2）的板。
    9. 取出分化殖民地，并给换液每隔一天。

2.胚状体（EBS）的形成

执行以下按无菌操作和生物安全柜中提到的所有程序。

  1. 0天＆＃8212; H9细胞的上的v底板镀
    1. 制备5％的嵌段共聚物，例如聚醚F 127在PBS中，并通过用0.22微米的无菌过滤器真空驱动过滤系统进行过滤。
    2. 外套V底96孔板用40微升每孔的5％的嵌段共聚物和在室温下孵育45分钟。
    3. 从孵化器中取出汇合基底膜基质板的H9细胞和生物安全柜中取出体视显微镜下，用1毫升枪头分化的殖民地。
    4. 吸出培养基，并用4毫升的PBS洗涤细胞。加入2ml随机分化培养基（H9培养基没有bFGF和RD介质）在每块板。使用通道工具并切成均匀大小和形状的团块的H9细胞集落通过在生物安全柜下立体显微镜观察，然后用细胞刮棒轻轻刮去。
    5. 收集在50ml falcon管中，并离心该团块在200×g离心5分钟。吸出上清液并重新悬浮大公l在RD中得到每毫升1000团块。
    6. 吸从V底板的嵌段共聚物。倒团块在无菌方形板和多道移液器的帮助下加入100微升悬浮到了V底板各孔。
    7. 为团块的力聚集，离心机在V底平板在4℃以400×g下4分钟。孵育板在细胞培养孵育箱（37℃，5％的CO 2）四天。
  2. 4日 - 收集的EB
    1. 收集在无菌方形板使用多道移液器和大口径200微升技巧V底板EBS的。
    2. 用10ml无菌血清吸管收集无菌方形板胚在15毫升猎鹰管。允许胚沉降2分钟。吸出上清液并用5毫升的PBS洗涤的EB。
    3. 允许的EB沉降2分钟，吸出上清液。重悬在5毫升RD中胚。
    4. 于10cm吸取取10 ml RD媒体细菌学板。转移于10cm细菌学板EBS的。
    5. 孵育细菌板在水平摇动器（往复运动50 /分钟）保持在细胞培养孵育箱（37℃，5％的CO 2）所需的时间段。给换液（15毫升RD介质）每隔一天。
      注：温和的处理是必需的，而人类胚胎干细胞培养。 EBS的大小在4天通过不同体视显微镜下观察作进一步的实验选择大小均匀的EB（±20％）。用这种方法形成的约50％的EB大小均匀的。胚对振动筛的结果一致的形状转移。

3.细胞毒性测定的IC 10测定

  1. 胚的光学底板转移
    1. 解冻0.1％明胶在水浴中于37℃下进行15分钟，并涂覆光学底板用50μl0.1％明胶的每使用多道移液器良好。孵育所述板在室温45分钟。培养结束后吸光从底板明胶。
    2. 取出于10cm细菌学板含RD中收集的第4天胚。
    3. 请在生物安全柜倾斜位置光学底板。转让的EB在光学底96孔板每孔100μl的RD介质由下立体显微镜观察两台同类尺寸。保持12 个列空。
    4. 孵育板在细胞培养孵育箱（37℃，5％CO 2）24小时。
  2. 从第5天的药物暴露14天
    1. 称量测试化合物，并最高浓度在已知的溶剂。
    2. 执行半对数稀释的测试化合物的连续直到8稀释在溶剂中含有编号与A至H falcon管，保持管没有。我作为车辆控制，管没有。 Ĵ为阴性对照（RD介质）和管没有。 K作为阳性（70％乙醇）的控制。
    3. 解冻在水浴在RD培养基中于37°下进行15分钟。取出标有从1到11月11日无菌猎鹰管各5毫升RD媒介。
    4. 将5微升的解决方案，从管A至管K的要管1到11分别与涡管。取出光盘底板的孵化器，并小心地使用多通道吸管取出介质。
    5. 从管1号加入200μl的媒体11到光底板的各列。给中/药物改变每隔一天。
      注意：对于半对数稀释采取6.48微升溶剂7管2标记，以8.从最高浓度管一号转移3微升至2号管，涡旋并连续3微升转移到下一个管。保持管9号车辆控制和管的10号阴性对照。管11号是70％的乙醇。
  3. 第14天：刃天青曝光和荧光测定
    1. 在水浴解冻RD培养基中于37℃下进行15分钟。执行所有程序mentio下面ñ在生物安全柜没有光线。
    2. 取10毫升RD培养基在15ml管（A）中，并添加刃天青试剂的推荐量和通过移液混合。取出光盘底板从孵化器中，小心地取出用多道移液器的所有媒体。
    3. 加入100微升介质从A管，每孔。孵育板在细胞培养孵育箱（37℃，5％CO 2）90分钟。
    4. 衡量使用荧光分光光度计（560 例 / 590 EM）。
  4. IC 10值确定
    1. 减去空白值后，导入图形垫棱镜值。集X轴作为一个剂量和y轴作为荧光单位。
    2. 归一化值，以获得关于y轴的百分比和变换的值（x轴为对数标度）。通过使用S形剂量反应（可变斜率）参数计算的IC 50值。计算使用以下日志IC 10值公式：
      F = 10 logEC 50 = logECF - （1 /坡面）*日志（F /（100-F））
      Y =底+（顶-底）/（1 + 10 ^（（LogEC 50 -X）*坡面））
    3. 要采取确定IC 10值继续深造。

基于微阵列生物标志物4.研究

  1. 0天至第5天：
    1. 胚体形成和转移到10厘米细菌板 - 按照2点为胚状体形成中提到的步骤。
      注意：使用三次生物学重复每个研究。将每个生物复制到两部分组成-在IC 10浓度和车辆控制药物治疗。准备药物浓度10,000倍以上的IC 10浓度的车辆，并从该加10微升与H9的细胞团块100毫升RD培养基在50毫升离心管中拌匀种子它的v底板。按照同样的步骤进行车辆控制组。
    2. <利>对于在第5天的药物暴露14，收集EB's和第4天他们转移于10cm细菌学板为每在点中提到的步骤2.将在水平摇动器（往复运动50 /分钟）中的板细胞培养孵育箱（37℃，5％CO 2）14天。给换液每隔一天。
  2. 对于样品的采集，第14天，收集10 CM平板的胚在15毫升猎鹰管，用无菌血清吸管。允许胚沉降2分钟。吸出上清液并用5毫升的PBS洗涤的EB。允许的EB沉降2分钟，吸出上清液。在1ml的RNAlater溶液或TRIzol试剂，涡旋重悬的EB和样品储存在-80℃直到进一步处理。
    注：在生物安全柜执行所有程序按照优良实验室规范。旋转打圈板围绕中心，从以无菌玻璃pastu帮助周围的把所有的EB的中心，吸出培养基再吸，加15毫升RD中，然后加入15微升的药物/车辆的各组。

5. RNA分离和完整性测试

  1. RNA分离：
    大部分下面提到的步骤将被用于使用RNeasy Mini试剂盒按照说明书RNA纯化进行。始终使用不含核酸酶的试管，枪头和水。虽然有工作的TRIzol开展化学安全罩的所有程序，并戴防护眼镜以及化学防护手套。
    1. 解冻样品在冰上。如果样本被存储在RNAlater中的溶液，离心管在12000×g离心5分钟，在4℃。弃上清，加入1 ml TRIzol试剂。
    2. 磨碎使用24克针和1ml注射器的样品。约15倍研磨足以胚，细胞壁和细胞膜的破坏。
    3. 加入200微升的氯仿每个样品中。涡旋均匀混合的内容。离心分离机在12000×g离心15分钟，在4℃。卸下RNeasy小型离心柱，1.5 mL管和正确标注它们。
    4. 收集在1.5ml管中的上清液（在收集上清液不打扰的中间或底层）。加冷冻的70％乙醇的等体积。通过轻轻摇动混合内容。
    5. 应用从管700μl到各自微型离心柱和离心它们在12000×g离心20秒，在室温。在完成所有RT的进一步措施。
    6. 弃去滤液，并应用剩余溶液到各自的列和离心它们在12000×g离心20秒。弃去滤液。
    7. 应用350微升RW1缓冲到列和离心它们在12000×g离心20秒。弃去滤液，并应用10微升DNA酶和70微升RDD缓冲到柱上。
    8. 在室温下孵育15分钟。应用350微升RW1缓冲到列和离心它们在12000×g离心20秒。弃去滤液。应用500微升RPE洗涤缓冲液对柱和离心机它们在12000×g离心20秒。弃去滤液。再次应用500微升的RPE洗涤缓冲液对柱和离心机它们在12000×g离心2分钟。弃去滤液。
    9. 转向列到新的2 ml收集管和离心它们在12000×g离心1分钟。转移列标记好的1.5 ml收集管，并应用22微升的核酸自由水。离心管在12000×g离心1分钟。
    10. 取下收集管，并把它们在冰上。使用自动电泳系统RNA定量。
  2. RNA的浓度，纯度和完整性测试。
    对于RNA的纯度和完整性测试采用自动化电泳系统和相应的试剂盒33。

6.芯片研究

  1. 使用商业可用的人力阵列芯片进行转录谱。对于RNA目标的准备，破碎，杂交34和阵列芯片染色，水洗35使用市售的试剂盒。
  2. 通过使用标准的流控站，阵列扫描仪和标准操作软件进行36阵列芯片扫描和质量控制检查。用于基因表达分析导入从扫描仪产生的标准商业可用的软件37中的文件，用稳健多阵列分析（RMA）进行背景校正，总结和正常化。
  3. 用于获得的差异表达的基因的列表（DEG的）执行一个单向ANOVA分析。从该列表中过滤出基于倍数变化（±2）和FDR受控的p值（<0.05）的基因。获得使用该软件的主成分分析（PCA），热图等 。

第2部分。UKN 1测试系统

人类胚胎干细胞的维护1.

  1. 的MEF播种
    1. 对于差异化使用NSCB＃8534（H9）细胞系。文化CELLS对小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）作为饲养细胞。涂层的T25烧瓶用4ml 0.1％的明胶和温育30分钟，在37℃。
    2. 在37℃水浴中解冻的MEF和转移细胞进入预温热的DMEM / 10％FBS中。
    3. 自旋3.5分钟用500×g离心，除去上清液并重新悬浮细胞，以获得1×10 7个细胞/ ml。板的MEF 4×10 4个/ cm 2的在明胶T25烧瓶。或者，使用该MEF在接下来的两天。 MEF批次的质量是人类胚胎干细胞维持一个非常关键的问题。因此，应阐明的最佳公司及其制备方法对H9细胞。我们使用PMEF P3。
  2. 分裂和维护的H9
    1. 加入1毫升预热的分散酶每T25培养瓶中的H9和孵育在37℃下9分钟。
    2. 加入2ml洗涤介质来分散酶处理的细胞和吸管了5次，下用5毫升吸管和转移的细胞解决了猎鹰管。
    3. 洗烧瓶用9ml洗涤介质并添加细胞的其他人。旋转3.5分钟，500 XG，除去上清液，重新悬浮细胞在10毫升人类胚胎干细胞培养基。
    4. 旋转3.5分钟，500 XG，除去上清液，重新悬浮细胞在4毫升人类胚胎干细胞培养基。加入0.5 mL细胞悬液和4.5毫升人类胚胎干细胞中，板新（PBS洗涤）T25烧瓶的MEF。每天改变烧瓶的整个人类胚胎干细胞培养基（5ml）中。

人类胚胎干细胞的分化2.对神经外胚叶祖细胞（NEP）

  1. 人类胚胎干细胞准备中，KCM中。涂布一层10cm皿，每T25烧瓶明胶（在PBS中0.1％）并孵育30分钟，在37℃。从人类胚胎干细胞中除去培养基，并添加足够的Accutase覆盖烧瓶的整个底部（每T25培养瓶中1ml）中并孵育25至30分钟，在37℃。
  2. 在孵化的Accutase准备基底膜基质涂层板。加冷DMEM / F12冷冻基底膜基质颗粒和解决它1:20。过滤基底膜基质SOLU灰通过40微米的细胞滤网。添加过滤的溶液直接制版，整个底部有被覆盖（每6孔1ml是必需的），孵育2小时，在室温。
  3. 后潜伏期除去基底膜基质的上清液和种子细胞对包被的孔。之后的Accutase步骤（2.1）停止加入为1.5ml HES媒体的反应。从烧瓶中刮去细胞，加8毫升人类胚胎干细胞中，产生吹打单细胞溶液10毫升吸管彻底。通过40微米的细胞滤网过滤细胞。
  4. 自旋细胞3分钟，500×g离心，除去上清液，并在10毫升的hESC的重新悬浮细胞。再次3分钟，500×g离心自旋细胞，除去上清液并重新悬浮含有ROCK抑制剂Y-27632以10μM的终浓度的细胞在人类胚胎干细胞。
  5. 删除明胶涂层盘的上清液。在明胶涂层盘板的细胞悬液，除去该MEF和孵化器留下了整整1小时。
    注意：在此步骤期间的MEF将settle到明胶涂层板，而胚胎干细胞无法连接到明胶。因此，这是至关重要的，以获得无饲养分化。这是一个关键的一步，因为过长孵化导致人类胚胎干细胞团块和过短的潜伏期去除效率低下的MEF。孵育45分钟后，板，要追究已经解决的MEF和胚胎干细胞团块。
  6. 一旦该MEF附上，轻轻洗掉非贴壁细胞（hESC细胞）关闭孵育已经在板中的介质后。如果几个T25被用来得到更多的细胞，单细胞现在可以结合起来。人类胚胎干细胞有一次中等洗涤板。
  7. 自旋细胞3分钟，500×g离心，除去上清液并重新悬浮含有10μM的ROCK抑制剂Y-27632和10ng / ml的FGF-2的细胞中约4毫升KCM。
  8. 使用计数台盼蓝细胞血球。板18×10 3细胞/ cm 2的基底膜基质中的KCM涂层板含有10μM的ROCK抑制剂Y-27632和10毫微克/毫升的FGF-2（6井使用每孔1.5毫升）。关键的是要培养板上的细胞中的权利密度成功分化成的NEP。
  9. 24小时后，改变培养基含有10μM的ROCK抑制剂Y-27632和10ng / ml的FGF-2的新鲜KCM。后进一步24小时，改变培养基，以含有10纳克/ ml的FGF2新鲜KCM。
  10. 在播种后的细胞72小时，分化开始迈向KSR中中的变化。这个时间点被称为分化0（DoD0）的一天。在加入测试物质，现在是可能的。
  11. 上DOD1和DOD2将培养基更换完全相同上DoD0。下一介质的变化是在DoD4含有25％N 2 S和75％KSR。在DoD6分化停止，收集细胞进行分析。

人类胚胎干细胞和NEP 3.染色质免疫沉淀（ChIP）

  1. 核的制备
    1. 加入500μl的Accutase到每个6孔应进行分析，并孵育25至30分钟。腠NT细胞在纽鲍尔室使用台盼蓝。
    2. 悬浮细胞在DMEM / F12中用于交联的1％甲醛。添加的Tris pH为7.5至125毫摩尔的最终浓度10分钟后停止交联。
    3. 自旋细胞3分钟，500×g离心在4℃下，除去上清液，并在冷的PBS重悬细胞。
    4. 自旋细胞3分钟，500×g离心在4℃下，除去上清液并重新悬浮细胞在1ml L1-缓冲/ 1×10 6个细胞。
    5. 孵育5分钟在冰上。自旋5分钟，800×g离心在4℃下，除去上清液并重新悬浮晶核在1ml L2-缓冲/ 2×10 6个细胞。
  2. 超声和​​质量控制
    1. 超声处理使产生300-700 bp的长度的DNA片段。自旋1分钟10,000 XG在4℃。上清转移到新管中。片段需要有正确的大小，否则免疫沉淀将是低效率的，以及随后的qPCR。
    2. 删除50微升的ð混合物用50μl的L2缓冲器通过运行在琼脂糖凝胶来检查超声处理的效率。
    3. 反向在65℃下交联温育4小时，500转。负载样品1：5与在1.5％琼脂糖凝胶橙G样染料和在1×TBE缓冲液中运行在110伏45分钟。控制碎片大小（应该是300-700之间BP）。
  3. 染色质免疫沉淀
    1. 稀释试样1：5的稀释缓冲液和等分每个IP1毫升在硅化试管中。
    2. 在4℃去除染色质稀释样品（步骤3.3.1）和存储5％（体积）为“输入”。
    3. 样品孵育与您所选择的IgG非特异性O / N，并与旋转器上的抗体在4℃。
    4. 免疫沉淀后添加50μl的蛋白A / G琼脂糖珠到各样品中。孵育样品3小时，在4℃下在旋转器上。自旋1分钟，1500 XG在4°C和上清。
    5. 用1毫升洗涤珠洗。自旋1分钟，1500 XG在4°C和上清。重复步骤g到h。用1毫升最终洗涤液清洗。在洗涤步骤，你应该不会丢失任何的珠子，因为这直接改变洗脱液的量。
    6. 离心机1分钟，1500 XG在4°C和上清。加入125微升洗脱缓冲液和孵化15分钟，65℃，1000转的摇床。
    7. 自旋1分钟，1500×g离心并转移上清液至新的试管中，重复步骤k和l。加入200μl洗脱缓冲输入（3.3.2）。添加蛋白酶K和RNase向每个样品孵育30分钟，37℃以500rpm摇动器上，之后4小时与65℃在500rpm的摇床上。
      注：对于DNA提取使用市售的ChIP DNA和清洁套装选矿厂38。

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Representative Results

在UKK测试系统甲基汞暴露

与H9的EB进行的细胞毒性测定，得到的IC 10值（10％减少活力的）甲基汞的细胞毒性（ 图1）。我们还进行了微阵列基础（Affymetrix公司的平台）的生物标志物研究。的H9的EB已暴露于甲基汞（0.25和1μM）14天。在第14天，将样品已收集使用Trizol和分离RNA。使用人类基因组U133加2.0阵列芯片进行转录谱。的数据进行了分析以将Partek基因组套件TM 6.6。通过主成分分析（ 图2A），代文氏图（ 图2B）和建设热图（ 图2C）获得的第一数据概述。在主成分分析表示基因表达的总体分布，它清晰可见segreg通货膨胀甲基汞1微米的车辆控制和甲基汞0.25μM组（PC＃25.2）（ 图2A）的。后获得的差异表达基因的列表（DEG）统计处理（单向ANOVA），并使用一个倍数变化截止的±2和多个校正（的Benjamini-的Hochberg方法）p值的数据的滤波<0.05（ 表1）。在1μM的甲基汞处理导致276 DEGS和0.25微米的31度的视角（ 图2B）。热图显示，甲基汞1μM的治疗主要是减少基因表达（ 图2C）。上任职人数过多的基因本体论术语的信息是通过使用DAVID生物信息学工具获得。 表2表示显著过多的GO基因类别包含多于5个基因。相关的神经系统发育的下调转录因子进行鉴定。SEPP1，DDIT4，AK4，FRZB（脑发育），PITX（神经核开发）和ERBB3，UGT8，APOB，APOA1（ ​​神经系统的发育）被下调的甲基汞治疗（ 表3），呈剂量依赖性。

UKN 1测试系统

这种分化协议使用双SMAD inhibiton 6到六天内分化产生NEP的纯人口。将得到的细胞的特征在于上调神经前体基因PAX6和OTX2的。的干细胞标志物OCT4和Nanog朝向NEP（ 图3A）的分化过程中被下调。由于高度同步和同质分化，但也可以在开发的早期阶段，以取得该组蛋白修饰信息。我们适于该协议用于使用细胞或者在分化的开始或后6天的染色质免疫沉淀（芯片）分化。上PAX6和OTX2的启动子区域的甲基化位点的开关是从这些研究中（ 图3B）明显。被调查的甲基化位点组蛋白赖氨酸3 4三甲基化（H3K4me3的）和组蛋白赖氨酸3三甲基27（H3K27me3）是分化过程中高度动态的。还蛋白水平的Oct4的向下调节，可以观察到（ 图4）。上调的Pax6和神经干细胞标记物巢蛋白 ，观察由蛋白水平免疫荧光显微镜（ 图4）。该细胞群表现出六天后分化的均匀和纯分化。因此，培养物可容易地用于RNA和蛋白质分析。该系统还提供了进行试验的物质和早期神经发育16,29他们有效果的可能性。

“图1”SRC 图1.细胞毒性测定（H9分化）为甲基汞。该法已经执行按协议定义的IC 10值的甲基汞。

图2
应用的UKK测试系统后引起的0.25和1微米的甲基汞差异表达的基因图2.代表分析的人类胚胎干细胞分别以0.25和1微米甲基汞根据UKK测试系统进行处理。差分的分析表示在14天的分化的EB转录已使用将Partek基因组套件TM 6.6软件进行。 （ 一 ）微阵列数据的主成分分析（3-Dimenional）。从基因表达的微阵列分析（B）的维恩图获得。该图显示的数量基因的甲基汞处理（倍数变化>±2，P <0.05）调制。 （C）的基因表达数据的分层聚类（折叠变化>±2，P <0.05）。高度表达的基因载体对照组由1微米的甲基汞处理压抑。 1μM甲基汞治疗导致233成绩单与低表达和43探头高表达的比较车辆的控制组。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3
人类胚胎干细胞从分化走向NEP在图3的基因表达和组蛋白甲基化模式。对于所有的实验，人类胚胎干细胞分化成神经外胚层前体细胞（NEP）。 （ 一 ）取样在d唉6分化和转录水平神经分化的标记基因通过RT-qPCR的确定。数据（相对于人类胚胎干细胞的基因表达）的平均值±5试验SEM。 （B）的样品的染色质免疫沉淀在分化的第6天，制备。沉淀物与特异于的H3K4me3或H3K27me3或对照IgG抗体进行的。启动子序列的富集因子给定为％输入H3K4me3的（灰色）和H3K27me3（黑色）。数据是平均值±3个独立的细胞制剂的SEM。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4
从人类胚胎干细胞分化朝NEP。期间图4的蛋白表达细胞固定并染色的干细胞标记Oct4的（绿色）在分化（DoD0）第0天和NEP的标记物的Pax6（红色）和巢蛋白 （绿色），在分化的第6天（DoD6）。比例尺为50微米。 请点击此处查看该图的放大版本。

表1
表1.差异表达基因的列表（>±2倍，P <0.05）甲基汞处理与14日龄胚车辆控制的。 请点击这里查看此表。

表2.显著丰富和选择GO类别列表（p值<0.05，> 5个基因）与陈德良失调脚本甲基汞对14日龄胚车辆控制。

GO期限 算 P值为 基因
细胞凋亡的调控 18 0.0068 ARHGEF3，TBX3，ERBB3，MITF，BNIP3，CDH1，IGF2，IFI16，HGF，GCH1，AMIGO2，SERPINB9，KRT18，MSX1，ETS1，VEGFA，PERP，IGFBP3
细胞增殖调控 17 0.0123 RBP4，LYN，TBX3，ERBB3，MITF，IGF2，KDR，RERG，MSX1，ADM，ETS1，VEGFA，BNC1，ADAMTS1，FABP1，IGFBP3，FIGF
血管开发 12 0.0001 PLAT，APOB，HAND1，TBX3，EPAS1，FOXF1，LEPR，VEGFA，COL3A1，液氧，FIGF，KDR
骨骼系统开发 NG> 12 0.0008 RBP4，MSX1，LGALS3，TBX3，HOXB6，COL3A1，STC1，IGF2，POSTN，FRZB，IGFBP3，AHSG
心脏发育 11 0.0001 RBP4，ACTC1，MSX1，HAND1，TBX3，ADM，PKP2，ERBB3，GATA6，COL3A1，ADAMTS1
葡萄糖代谢过程 9 0.0003 PDK1，RBP4，LDHA，PGM5，PYGL，HK2，PFKP，IGF2，PGK1
肺发育 7 0.0008 RBP4，EPAS1，GATA6，FOXF1，VEGFA，液氧，KDR
上皮发展 7 0.0386 F11R，FREM2，GATA6，FOXF1，VEGFA，DSP，KDR
中胚层发展 五 0.0088 HAND1，TBX3，FOXF1，VEGFA，SNAI2
lways“> 表3.列出显著下调14日龄胚相关的发育神经系统与甲基汞治疗转录。

术语 基因符号 倍数变化*
0.25μM甲基汞VS VC 1μM甲基汞VS VC
脑发育 SEPP1 -2.17 -4.13
DDIT4 -1.20 -3.11
AK4 -1.41 -3.08
FRZB -1.29 -2.19
神经核开发 PITX2 -2.08 -4.90
神经系统发育 ERBB3 -1.86 -2.89
UGT8 -1.67 -2.14
载脂蛋白B -3.59 -5.72
APOA1 2.63 -2.90
VEGFA -1.28 -3.06

* P <0.05

表4.组成的培养基。

<TD>胰岛素
老号 中/缓冲器名称 组成
量
1 MEF培养基 DMEM高糖
FCS 10％
青霉素 100单位/毫升
链霉素 100微克/毫升
L-谷氨酰胺 2毫米
2 H9培养基 DMEM F12
KOSR 20％
NEAA 1％
Glutamax的 1X
β巯基乙醇 0.1毫米
青霉素 100单位/毫升
链霉素 100微克/毫升
bFGF的 4纳克/毫升 3 RD中 没有bFGF的H9培养基
4 洗涤介质 的DMEM / F12
淘汰赛血清Replacment 20％
1X含有GlutaMAX 1X
MEM非必需氨基酸
HEPES 15毫米
β巯基乙醇 90μM
五 KCM中 DMEM
FBS 10％
培养24小时在MEF中
6 淘汰赛血清
更换（KSR）
淘汰赛血清替代品 15％
1X含有GlutaMAX
1×MEM非必需氨基酸
β巯基乙醇 15微米
头蛋白 35纳克/毫升
Dorsomorphin 600纳米
SB431542 10μM
7 N2-S DMEM / F-12
Apotransferin 100微克/毫升
葡萄糖 1.55毫克/毫升
腐胺 10毫
硒 500μM
孕激素 20μM
含有GlutaMAX 200μM
25微克/毫升
8 L1缓存 三pH值8 50毫米
EDTA 2毫米
NP-40的 0.10％
甘油 10％
9 L2缓存 三pH值8 50毫米
EDTA 10毫
SDS 1％
10 洗脱缓冲液 碳酸氢钠 100毫米
SDS 1％
11 洗涤液 三 20毫米
EDTA 2毫米 SDS 0.10％
NP-40的 0.50％
氯化钠 150毫米
12 最后的洗涤液 三 20毫米
EDTA 2毫米
SDS 0.10％
NP-40的 0.50％
氯化钠 500毫米
13 干细胞培养基 mTESAR TM培养基 400毫升
mTESAR TM补充百毫升

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Discussion

传统方法毒理试验涉及广泛的动物研究中从而使测试昂贵和费时。此外，由于种间差异的临床前动物安全性研究并不总是有效的预测与人类有关的潜在药物毒性作用。虽然非人类灵长类动物是最可预测的，还是强烈的伦理和socioeconomical需求正在迅速被现代社会提高发展中国家在体外试验敏感和强大 有关人类的安全系统。

人类胚胎干细胞的独特能力分化成所有的体细胞类型，因此已被提出作为一种替代药物安全性测试6,21的传统方法扼要重述在与敏感毒理办法的组合在人体内发育过程。根据“ESNATS'工程'UKK”测试系统已经发展预测基于转录分析发育胚胎毒性。在这个系统中的hESC已分化中的胚状体14天。所获得的时间动力学转录剖面显示高表达特定于三种胚层外胚层，内胚层和中胚层在第14天它部分地概括人类早期胚胎发育分化标记的。基于这些结果，已知致畸药物已分化过程中暴露14天，差异表达的基因信息已经获得。令人印象深刻的，沙利度胺在人体内观察到的致畸作用有关的基因特征，可以通过这个测试系统28预测。甲基汞代表结果相关的神经系统发育的转录因子的UKK系统显示浓度依赖性下调。在其它发育神经毒物也在该系统中测试和努力正在进行，以确定共同toxico刻度横跨化合物在mRNA水平和验证它们在蛋白质水平。这里提供的UKK测试协议给出基本方针进行的实验与人类胚胎干细胞H9识别转录签名发育有毒物。

优化的标准操作程序（SOP），用于根据所述UKN1协议多能干细胞的分化使人类胚胎干细胞的一个强大的和同步的分化的NEP。已经六天后分化，同质细胞群体具有较高的PAX6表达水平产生。细胞生长贴壁培养，这让通过免疫分析。免疫细胞化学分析，具有高分辨率和通过共聚焦显微镜需要细胞生长于薄玻璃表面。这是可能的，这些培养物如果玻璃被最佳涂覆，但它需要一提的是，细胞生长非常密集，在一个以上的单层六天后。因此，更容易被RT-qPCR的，芯片或免疫印迹进行的谱系特异性标志物常规分析。对于文化的生化分析的一大优点是产量高，可以通过这种分化协议，来自人类胚胎干细胞的一个小群体开始实现细胞。此协议的一个缺点是，迫使同质神经分化所需的介质补充剂（ 例如，头蛋白）成本高。另一个缺点对于某些应用可能是一些小分子（激酶抑制剂）必须存在于培养基中作为协议的一部分。因此，某些信号通路不能毒理学研究，作为培养条件的变化也改变了分化29。

测试系统相结合的优点是更好的理解DNT的。而UKK涵盖了早期胚层形成一个更广泛和不良反应可以进行调查，UKN1所有OWS开始调查神经的具体机制，如表观遗传学。虽然这里介绍的两种培养系统已显示出预测的发育神经毒性为几个模型毒物16，仍然有必要的，使大量的潜在发育神经毒物筛选协议更高的吞吐量的版本。此外，更多的工作是必需的，以确定和验证毒性的共同标记的mRNA或蛋白质水平，并建立它们作为临床前药物安全性评价的一部分。

每年超过20十亿这笔美元时由制药业的药物发现39的投资。作为概念证明，我们已开发了基于人类胚胎干细胞和转录体外毒性测试系统可适合于预测潜在的药物化合物的具有成本效益的和不太费时方式人体相关毒性的效果。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM/F-12 Life Technologies 11320082 Dulbecco's Modified Eagle Medium:Nutrient Mixture F-12
KOSR Life Technologies 10828028 Knockout Serum Replacement
GlutaMAX Life Technologies 35050061 GlutaMAX supplement
NEAA Life Technologies 11140050 MEM Nonessential Amino Acids Solution
DPBS Life Technologies 14190-0144 Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, without calcium, without magnesium
mTeSR medium Stemcell Technologies 5850
Pluronic F-127 Sigma P2443-250G
V bottom plate VWR 734-0483 Plate,Microwell,V BTTM,96 Well,Sterile 1 * 50 ST
V bottom plate lid VWR 634-0011 Lid, Microtitre plates, Cond. Ring 1 * 50 ST
Pen/Strep Life Technologies 15140-122 Penicillin-Streptomycin, Liquid
Distilled Water Life Technologies 15230-089. Sterile Distilled Water
Human FGF-2 (bFGF) Millipore GF003AF-100UG Fibroblast Growth Factor basic, human recombinant, animal-free
Filter 0.22 μm Millipore SCGPU02RE Stericup-GP, 0.22 μm, polyethersulfone, 250 ml, radio-sterilized
StemPro EZPassageTM Disposablte Invitrogen 23181010
BD MatrigelTM, hESC qualified Matrix Stemcell Technologies 354277 5 ml vial
DMSO Sigma D-2650
RNAlater Stabilization Solution Life Technologies AM7020 It stabilizes and protect the RNA integrity in unfrozen samples.
70 μm Cell Strainer Becton Dickinson 352350 Cell strainer with 70 μm Nylon mesh
35 μm Lid cell strainer, 5 ml tube Becton Dickinson 352235 5 ml polystyrene round bottom test tube, with a cell strainer cap (35 μm)
50 ml sterile Polypropylene tube Greiner Bio-One 227261 50 ml Polypropylene tube with conical bottom, Sterile
T75 flask Greiner Bio-One 658175 CELLSTAR Filter Cap Cell Culture 75 cm2 Flasks
TRIzol Life Technologies 10296010
96 well optical bottom plates Thermo Scientific 165305
CellTiter-Blue Promega G8081
Accutase PAA L11-007
Apotransferin Sigma-Aldrich T-2036
Dispase Worthington Biochemicals LS002104
Dorsomorphin Tocris Bioscience 3093
EDTA Roth 8043.2
FBS PAA A15-101
FGF-2 R&D Systems 233-FB
Gelatine Sigma-Aldrich G1890-100G
Glucose Sigma-Aldrich G7021-100G
GlutaMAX Gibco Invitrogen 35050-038
HEPES Gibco Invitrogen 15630-056
Insulin Sigma-Aldrich I-6634
Knockout DMEM Gibco Invitrogen 10829-018
Matrigel BD Biosciences 354234
Noggin R&D Systems 719-NG
PBS Biochrom AG L1825
Progesteron Sigma-Aldrich P7556
Putrescine Sigma-Aldrich P-5780
ROCK inhibitor Y-27632 Tocris Biosciences 1254
SB431542 Tocris Biosciences 1614
SDS Bio-Rad 161-0416
Selenium Sigma-Aldrich S-5261
β-Mercaptoethanol Gibco Invitrogen 31350-010
Name Company Catalog Number Comments
List of Kits
RNeasy Mini Kit (250) QIAGEN 74106
GeneChip Hybridization, Wash, and Stain Kit Affymetrix 900721, 22, 23 This kit provides all reagents required for hybridization wash and staining of microarrays.
Rnase-Free DNase Set QIAGEN 79254
Name Company Catalog Number Comments
List of equipment
Inverted microscope Olympus IX71
Genechip Hybridisation Oven - 645 Affymetrix
Genechip Fluidics Station-450 Affymetrix
Affymetrix Gene-Chip Scanner-3000-7 G Affymetrix
Spectramax M5 Molecular Devices
 
 
 
Name Company Catalog Number Comments
List of softwares
Prism 4
Affymetrix GCOS
Partek Genomic Suite 6.25
Online tools for Functional annotation
DAVID
Onto-tools Intelligent Systems and Bioinformatics Laboratory

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References

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Tags

发育生物学，第100，人类胚胎干细胞，发育毒性，神经毒性，神经外胚层祖细胞，免疫沉淀，分化，细胞毒性，embryopathy，胚状体
基于发育毒性测定化学品安全筛选和系统生物学数据生成人类多能干细胞
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Shinde, V., Klima, S., Sureshkumar,… More

Shinde, V., Klima, S., Sureshkumar, P. S., Meganathan, K., Jagtap, S., Rempel, E., Rahnenführer, J., Hengstler, J. G., Waldmann, T., Hescheler, J., Leist, M., Sachinidis, A. Human Pluripotent Stem Cell Based Developmental Toxicity Assays for Chemical Safety Screening and Systems Biology Data Generation. J. Vis. Exp. (100), e52333, doi:10.3791/52333 (2015).

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