Protokollerne beskriver to in vitro udviklingsmæssige toksicitet testsystemer (UKK og UKN1) baseret på humane embryonale stamceller og transkriptom studier. Testsystemet forudser human udviklingsmæssige fare toksicitet, og kan bidrage til at reducere dyreforsøg, omkostninger og den tid, der kræves til kemisk sikkerhed test.
Effektive protokoller til at differentiere humane pluripotente stamceller til forskellige væv i kombination med genomenbaserede teknologier åbnet nye horisonter til test in vitro toksicitet potentielle lægemidler. At skabe et solidt videnskabeligt grundlag for sådanne analyser, vil det være vigtigt at få kvantitative oplysninger om tidsforløbet for udvikling og om de underliggende reguleringsmekanismer ved systembiologiske metoder. To analyser er derfor blevet tunet her for disse krav. I UKK testsystem, er humane embryonale stamceller (hESC) (eller andre pluripotente celler) overladt til spontant at differentiere i 14 dage i embryoide organer til at tillade generering af celler fra alle tre kim lag. Dette system rekapitulerer vigtige trin af tidlig human embryonisk udvikling, og det kan forudsige humanspecifikke tidlig embryonal / teratogenicitet, hvis cellerne udsættes for kemikalier under differentiering. Den UKN1 testsystem er baseret på embryonale differentiere til en population af neuroektodermal progenitor (NEP) celler i 6 dage. Dette system rekapitulerer tidlig neural udvikling og forudser tidlig udviklingsneurotoksicitet og epigenetiske ændringer udløst af kemikalier. Begge systemer, i kombination med transkriptom microarray studier, er egnede til at identificere toksicitet biomarkører. Endvidere kan de anvendes i kombination til at generere input data for systemer biologi analyse. Disse testsystemer har fordele i forhold til de traditionelle toksikologiske undersøgelser kræver store mængder af dyr. De testsystemer kan bidrage til en reduktion af omkostningerne til lægemiddeludvikling og evaluering kemikaliesikkerhedsvurdering. Deres kombination belyser især på forbindelser, der kan påvirke nervesystemets udvikling specifikt.
Evnen af humane embryonale stamceller (hESC) til at differentiere til forskellige typer af celler åbnet en ny æra af test in vitro toksicitet 1, sygdom modellering og regenerativ medicin 2. Stamcellerne er udstyret med evnen til at kopiere sig selv, for at holde deres pluripotente tilstand og til at differentiere til specialiserede celler 3,4. Egenskaberne af embryonale (kapacitet til at differentiere til alle større celletyper) findes også i andre humane pluripotente stamceller, såsom humane inducerede pluripotente stamceller (hiPSC) eller celler frembragt ved kernetransplantation 5. For eksempel har mange forskellige hESC linjer blevet differentieret til neuroner 6, nyreceller 7, neurale kamceller 8, cardiomyocytter 9-12 eller hepatocytter lignende celler 13,14. Desuden kan embryonale spontant differentiere til celler af alle tre kim lag 15-18 i embryoide legemer (EBS) 19,20. EArly fosterudvikling er reguleret af differentiel ekspression af forskellige gener relateret til de forskellige kim lag, der er blevet fanget på mRNA niveau ved transcriptomics hjælp microarray-teknologi 15. Disse bestræbelser har resulteret i etableringen af orgel særlige toksikologiske modeller baseret på embryonale / hiPSC og transcriptomics analyse (til gennemgang se 21,22). Disse modeller har fordele i forhold til traditionelle brug af forsøgsdyr til toksikologiske undersøgelser, som prækliniske studier anvender forsøgsdyr ikke altid kan forudsige menneskelig sikkerhed. Narkotika inducerede toksiciteter forekommer i patienter er ofte relateret til metaboliske eller signaleringsprocesser, der adskiller sig mellem mennesker og forsøgsdyr. Arten Forskellen har forhindret pålidelig tidlig påvisning af afkommet hos mennesker, og for eksempel lægemidler, såsom thalidomid 23,24 og diethylstilbestrol 25,26 blev trukket tilbage fra markedet på grund af teratogenicitet. ThaliDomide har ikke vist nogen udviklingstoksicitet hos rotter eller mus. Miljømæssige kemikalier såsom methylkviksølv 27 resulterede i prænatal udviklingstoksicitet i forhold til nervesystemet i forskellige arter, men menneskelige manifestationer have været svært at modellere i dyr. For at løse problemet med artsspecificitet spørgsmål, forskere, der arbejder under forskellige projekter baseret på stamceller som genbeskyt, ESNATS, kriminalassistent mv er engageret i udvikling af forskellige modeller for embryonale toksicitet, neurotoksicitet, kardiotoksicitet, hepatotoksicitet og nefrotoksicitet ved hjælp af humane giftstoffer mistænkes for at påvirker mennesker. Under det europæiske konsortium projektet "embryonale stamceller-baserede Novel Alternative Testing Strategies (ESNATS)" er blevet etableret fem testsystemer. Et testsystem den såkaldte UKK (U niversitäts k linikum K OLN) testsystem delvist fanger tidlig menneskelig fosterudvikling. I denne system humane embryonale H9 celler differentieres i tre kim lag (ectoderm, endoderm og mesoderm) 15 og kim lag specifikke underskrifter er blevet taget til fange af transcriptomics profil bruge Affymetrix microarray platform. Forskellige udviklingsmæssige giftstoffer som thalidomid 28, valproat, methyl kviksølv 16,17 eller cytosinarabinosid 15 er blevet testet i dette system, og der er opnået giftstof specifikt gen signaturer. I et andet testsystem, den såkaldte den UKN1 (U niversity K onsta n z) testsystem 1 er H9 celler differentieres til neuroectodermal stamceller (NEP) i 6 dage. Dette fremgår af høj ekspression af neurale genmarkører, såsom Pax6 og OTX2. Under differentiering i 6 dage, har NEP-celler været udsat for udviklingsmæssige neuro-giftstoffer, såsom VPA, methylkviksølv. Giftstof-specifikke deregulerede transcriptomics profiler har været obtained samt ved hjælp af Affymetrix microarray platform 16,29.
Den nye vision for toksikologi det 21. århundrede, forventes testsystemer ikke kun giver fænotypiske beskrivelser ligesom histopatologi in vivo, eller transkriptom ændringer i slutningen af langsigtede toksiske inkubationer. Det foreslår snarere, at analyser giver mekanistisk information 3, og at disse oplysninger kan kortlægges såkaldte negative udfald veje (AOP), der giver en videnskabelig begrundelse for farlige virkninger 30. At give sådanne oplysninger, testsystemet anvendte nødt til at være meget kvalitet kontrolleres 31, som for eksempel dokumenteret af robuste standard drift procedurer. Desuden skal kortlægges med høj opløsning tidsafhængig ændringer. Dette kræver testsystemer med synkroniserede ændringer 32. De UKN1 og UKK testsystemer beskrevet her er blevet optimeret til disse krav.
Traditionelle tilgange til toksikologisk testning involverer omfattende dyreforsøg dermed gøre test dyrt og tidskrævende. Som følge af de interspecies forskelle de prækliniske sikkerhedsundersøgelser undersøgelser er ikke altid gyldige til at forudsige toksikologiske effekter potentielle lægemidler er relevante for mennesker. Selv ikke-menneskelige primater er mest forudsigelige, stadig stærk etisk og socioeconomical krav hurtigt hæve ved moderne samfund for at udvikle følsomme og robust in vitro tes…
The authors have nothing to disclose.
We thank M. Kapitza, Margit Henry, Tamara Rotshteyn, Susan Rohani and Cornelia Böttinger for excellent technical support. This work was supported by grants from the German Research Foundation (RTG 1331) and the German Ministry for Research (BMBF).
DMEM/F-12 | Life Technologies | 11320082 | Dulbecco's Modified Eagle Medium:Nutrient Mixture F-12 |
KOSR | Life Technologies | 10828028 | Knockout Serum Replacement |
GlutaMAX | Life Technologies | 35050061 | GlutaMAX supplement |
NEAA | Life Technologies | 11140050 | MEM Nonessential Amino Acids Solution |
DPBS | Life Technologies | 14190-0144 | Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, without calcium, without magnesium |
mTeSR medium | Stemcell Technologies | 5850 | |
Pluronic F-127 | Sigma | P2443-250G | |
V bottom plate | VWR | 734-0483 | Plate,Microwell,V BTTM,96 Well,Sterile 1 * 50 ST |
Vbottom plate lid | VWR | 634-0011 | Lid, Microtitre plates, Cond. Ring 1 * 50 ST |
Pen/Strep | Life Technologies | 15140-122 | Penicillin- Streptomycin, Liquid |
Distilled Water | Life Technologies | 15230-089. | Sterile Distilled Water |
Human FGF-2 (bFGF) | Millipore | GF003AF-100UG | Fibroblast Growth Factor basic, human recombinant, animal-free |
Filter 0.22 μm | Millipore | SCGPU02RE | Stericup-GP, 0.22 μm, polyethersulfone, 250 ml, radio- sterilized |
StemPro EZPassageTM Disposablte | Invitrogen | 23181010 | |
BD MatrigelTM, hESC qualified Matrix | Stemcell Technologies | 354277 | 5 ml vial |
DMSO | Sigma | D-2650 | |
RNAlater Stabilization Solution | Life Technologies | AM7020 | It stabilizes and protect the RNA integrity in unfrozen samples. |
70 μm Cell Strainer | Becton Dickinson | 352350 | Cell strainer with 70 μm Nylon mesh |
35 μm Lid cell strainer, 5 ml tube | Becton Dickinson | 352235 | 5 ml polystyrene round bottom test tube, with a cell strainer cap (35 μm) |
50 ml sterile Polypropylene tube | Greiner Bio-One | 227261 | 50 ml Polypropylene tube with conical bottom, Sterile |
T75 flask | Greiner Bio-One | 658175 | CELLSTAR Filter Cap Cell Culture 75 cm2 Flasks |
TRIzol | Life Technologies | 10296010 | |
96 well optical bottom plates | Thermo Scientific | 165305 | |
CellTiter-Blue | Promega | G8081 | |
Accutase | PAA | L11-007 | |
Apotransferin | Sigma-Aldrich | T-2036 | |
Dispase | Worthington Biochemicals | LS002104 | |
Dorsomorphin | Tocris Bioscience | 3093 | |
EDTA | Roth | 8043.2 | |
FBS | PAA | A15-101 | |
FGF-2 | R&D Systems | 233-FB | |
Gelatine | Sigma-Aldrich | G1890-100G | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-100G | |
GlutaMAX | Gibco Invitrogen | 35050-038 | |
HEPES | Gibco Invitrogen | 15630-056 | |
Insulin | Sigma-Aldrich | I-6634 | |
Knockout DMEM | Gibco Invitrogen | 10829-018 | |
Matrigel | BD Biosciences | 354234 | |
Noggin | R&D Systems | 719-NG | |
PBS | Biochrom AG | L1825 | |
Progesteron | Sigma-Aldrich | P7556 | |
Putrescine | Sigma-Aldrich | P-5780 | |
ROCK inhibitor Y-27632 | Tocris Biosciences | 1254 | |
SB431542 | Tocris Biosciences | 1614 | |
SDS | Bio-Rad | 161-0416 | |
Selenium | Sigma-Aldrich | S-5261 | |
β-Mercaptoethanol | Gibco Invitrogen | 31350-010 | |
List of Kits | |||
RNeasy Mini Kit (250) | QIAGEN | 74106 | |
GeneChip Hybridization, Wash, and Stain Kit | Affymetrix | 900721, 22, 23 | This kit provides all reagents required for hybridization wash and staining of microarrays. |
Rnase-Free DNase Set | QIAGEN | 79254 | |
List of equipment. | |||
Inverted microscope | Olympus | IX71 | |
Genechip Hybridisation Oven – 645 | Affymetrix | ||
Genechip Fluidics Station-450 | Affymetrix | ||
Affymetrix Gene-Chip Scanner-3000-7 G | Affymetrix | ||
Spectramax M5 | Molecular Devices | ||
List of softwares | |||
Prism 4 | |||
Affymetrix GCOS | |||
Partek Genomic Suite 6.25 | |||
Online tools for Functional annotation DAVID Onto-tools Intelligent Systems and Bioinformatics Laboratory |