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Developmental Biology

रासायनिक सुरक्षा स्क्रीनिंग और सिस्टम्स बायोलॉजी डेटा पीढ़ी के लिए विकासात्मक विषाक्तता Assays के आधार पर मानव स्टेम सेल

doi: 10.3791/52333 Published: June 17, 2015
* These authors contributed equally

Summary

प्रोटोकॉल मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं और transcriptome अध्ययन के आधार पर दो इन विट्रो विकासात्मक विषाक्तता परीक्षण प्रणाली (UKK और UKN1) का वर्णन है। परीक्षा प्रणाली मानव विकास की विषाक्तता के लिए खतरा भविष्यवाणी है, और जानवरों के अध्ययन, लागत और रासायनिक सुरक्षा के परीक्षण के लिए आवश्यक समय को कम करने के लिए योगदान कर सकते हैं।

Abstract

-omics प्रौद्योगिकियों संभावित दवाओं की इन विट्रो विषाक्तता परीक्षण के लिए नए क्षितिज खोल के साथ कुशल प्रोटोकॉल संयोजन में विभिन्न ऊतकों को मानव स्टेम कोशिकाओं को अलग करने के लिए। ऐसे assays के लिए एक ठोस वैज्ञानिक आधार प्रदान करने के लिए, यह विकास के समय के पाठ्यक्रम पर और प्रणालियों जीव विज्ञान के दृष्टिकोण से अंतर्निहित नियामक तंत्र पर मात्रात्मक जानकारी हासिल करने के लिए महत्वपूर्ण होगा। दो assays के इसलिए इन आवश्यकताओं के लिए यहाँ देखते हैं। UKK परीक्षा प्रणाली में, मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (hESC) (या अन्य pluripotent कोशिकाओं) अनायास तीनों जनन परतों की कोशिकाओं की पीढ़ी अनुमति देने के लिए, embryoid निकायों में 14 दिनों के लिए अंतर करने के लिए छोड़ दिया जाता है। इस प्रणाली के शुरू में मानव भ्रूण के विकास की महत्वपूर्ण कदम स्मरण दिलाता है, और कोशिकाओं भेदभाव के दौरान रसायनों के संपर्क में हैं, अगर यह मानव विशिष्ट जल्दी भ्रूण विषाक्तता / teratogenicity भविष्यवाणी कर सकते हैं। UKN1 परीक्षा प्रणाली एक populat को फर्क hESC पर आधारित हैneuroectodermal पूर्वज के आयन (एनईपी) 6 दिनों के लिए कोशिकाओं। इस प्रणाली के शुरू तंत्रिका विकास का स्मरण दिलाता है और जल्दी विकास न्यूरोटॉक्सिटी और रसायनों से चालू होने epigenetic परिवर्तन भविष्यवाणी की है। दोनों प्रणालियों, transcriptome माइक्रोएरे अध्ययन के साथ संयोजन में, विषाक्तता बायोमार्कर की पहचान करने के लिए उपयुक्त हैं। इसके अलावा, वे सिस्टम जीव विज्ञान के विश्लेषण के लिए इनपुट डेटा उत्पन्न करने के लिए संयोजन में इस्तेमाल किया जा सकता है। ये परीक्षण प्रणाली जानवरों की बड़ी मात्रा की आवश्यकता होती है पारंपरिक विषाक्तता अध्ययन से अधिक लाभ है। परीक्षा प्रणाली दवा के विकास और रासायनिक सुरक्षा मूल्यांकन के लिए लागत में कमी करने के लिए योगदान कर सकते हैं। उनका संयोजन विशेष रूप से विशेष रूप से की भविष्यवाणी को प्रभावित कर सकते हैं कि यौगिकों पर प्रकाश डालता है।

Introduction

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विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं में अंतर करने के लिए मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (hESC) की क्षमता के लिए इन विट्रो विषाक्तता परीक्षण 1, रोग मॉडलिंग और पुनर्योजी चिकित्सा 2 के एक नए युग खोला। स्टेम कोशिकाओं को स्वयं को दोहराने की क्षमता, उनके pluripotent राज्य रखने के लिए, और विशेष कोशिकाओं 3,4 में अंतर करने के साथ संपन्न होते हैं। hESC के गुणों को भी इस तरह के मानव प्रेरित स्टेम सेल (hiPSC) या परमाणु हस्तांतरण 5 द्वारा उत्पन्न कोशिकाओं के रूप में अन्य मानव स्टेम सेल, में पाए जाते हैं (क्षमता के सभी प्रमुख प्रकार की कोशिकाओं को अलग करने के लिए)। उदाहरण के लिए, कई अलग अलग hESC लाइनों कोशिकाओं 13,14 तरह न्यूरॉन्स 6, गुर्दे की कोशिकाओं 7, तंत्रिका शिखा कोशिकाओं 8, cardiomyocytes 9-12, या hepatocytes में विभक्त किया गया है। इसके अलावा, hESC अनायास embryoid निकायों (ईबीएस) 19,20 में तीनों जनन परतें 15-18 की कोशिकाओं में अंतर कर सकते हैं। एआर्ली भ्रूण के विकास के माइक्रोएरे प्रौद्योगिकी का उपयोग करते हुए 15 transcriptomics द्वारा mRNA के स्तर पर कब्जा कर लिया गया है, जो अलग जनन स्तर से संबंधित विभिन्न जीनों के अंतर अभिव्यक्ति के द्वारा नियंत्रित किया जाता है। इन प्रयासों hESC / hiPSC और transcriptomics विश्लेषण (समीक्षा के लिए 21,22 देखें) पर आधारित अंग विशिष्ट विषाक्तता के मॉडल की स्थापना में हुई। इन मॉडलों को प्रयोगशाला पशुओं हमेशा मानव सुरक्षा की भविष्यवाणी नहीं कर रहे हैं का उपयोग कर पूर्व नैदानिक ​​अध्ययन के रूप में विषाक्तता अध्ययन के लिए प्रयोगशाला पशुओं के पारंपरिक उपयोग से अधिक लाभ है। रोगियों का सामना करना पड़ा प्रेरित दवा विषाक्तता अक्सर मानव और प्रायोगिक पशुओं के बीच अलग है कि चयापचय या सिगनल प्रक्रियाओं से संबंधित हैं। प्रजातियों का अंतर मनुष्यों में विकासात्मक विषाक्तता के विश्वसनीय जल्दी पता लगाने को रोका गया है, और इस तरह के thalidomide के 23,24 और diethylstilbestrol 25,26 के रूप में उदाहरण के लिए दवाओं की वजह से teratogenicity को बाजार से वापस ले लिया गया। थालीdomide चूहों या चूहों में किसी भी विकासात्मक विषाक्तता नहीं दिखाया गया है। ऐसे मिथाइल पारा 27 के रूप में पर्यावरण रसायन विभिन्न प्रजातियों में तंत्रिका तंत्र के लिए सम्मान के साथ जन्म के पूर्व विकासात्मक विषाक्तता में हुई है, लेकिन मानव अभिव्यक्तियों जानवरों में मॉडल के लिए मुश्किल हो गया है। प्रजातियों विशिष्टता मुद्दों की समस्या का समाधान करने के लिए, विभिन्न परियोजनाओं के तहत काम कर रहे वैज्ञानिकों आदि को संदिग्ध मानव विषैले पदार्थ का उपयोग कर भ्रूण विषाक्तता, न्यूरोटॉक्सिटी, cardiotoxicity, हेपटोटोक्सिसिटी और nephrotoxicity के लिए विभिन्न मॉडलों के विकास में लगे हुए हैं ReProTect, ESNATS, जासूस की तरह स्टेम कोशिकाओं पर आधारित मनुष्य प्रभावित करते हैं। यूरोपीय संघ परियोजना 'भ्रूणीय स्टेम सेल आधारित उपन्यास वैकल्पिक परीक्षण रणनीतियाँ (ESNATS)' के तहत पांच परीक्षा प्रणाली स्थापित की गई हैं। एक परीक्षा प्रणाली तथाकथित UKK (यू niversitäts कश्मीर linikum कश्मीर OLN) परीक्षा प्रणाली आंशिक रूप से जल्दी मानव भ्रूण के विकास को दर्शाता है। इस एस मेंystem मानव भ्रूण H9 कोशिकाओं तीन रोगाणु परतों (बाहरी झिल्ली, अन्तर्जनस्तर और mesoderm) 15 और रोगाणु परत विशिष्ट हस्ताक्षरों Affymetrix माइक्रोएरे मंच का उपयोग प्रोफ़ाइल transcriptomics द्वारा कब्जा कर लिया गया है करने के लिए में भेदभाव कर रहे हैं। Thalidomide के 28, वैल्प्रोइक एसिड, मिथाइल पारा 16,17, या साइटोसिन arabinoside 15 की तरह विभिन्न विकासात्मक विषैले पदार्थ इस प्रणाली में परीक्षण किया गया है, और विषैला विशिष्ट जीन हस्ताक्षरों प्राप्त किया गया है। एक दूसरे परीक्षा प्रणाली में है, इसलिए परीक्षा प्रणाली 1 UKN1 (कश्मीर onsta एन जेड यू niversity) कहा जाता है, H9 कोशिकाओं 6 दिनों के लिए neuroectodermal पूर्वज कोशिकाओं (एनईपी) को भेदभाव कर रहे हैं। यह एक ऐसी Pax6 और OTX2 के रूप में तंत्रिका जीन मार्कर की उच्च अभिव्यक्ति इसका सबूत है। भेदभाव के दौरान 6 दिनों के लिए, एनईपी कोशिकाओं VPA, मिथाइल पारा के रूप में विकास न्यूरो विषैले पदार्थ को उजागर किया गया है। विषैला-विशिष्ट डे-विनियमित transcriptomics प्रोफाइल के obtai किया गया हैAffymetrix माइक्रोएरे मंच 16,29 का उपयोग करके के रूप में अच्छी तरह से नेड।

21 वीं सदी के विष विज्ञान के लिए नई दृष्टि परीक्षण प्रणाली लंबी अवधि विषैला incubations के अंत में vivo में ऊतकविकृतिविज्ञानी, या transcriptome परिवर्तन की तरह प्ररूपी विवरण उपज ऐसा नहीं कि सिर्फ परिकल्पना की गई है। बल्कि यह assays के यंत्रवत जानकारी 3 प्रदान करते हैं, और कहा कि इस जानकारी को तथाकथित करने के लिए मैप किया जा सकता है पता चलता है कि प्रतिकूल परिणाम रास्ते (एओपी) खतरनाक प्रभाव 30 के लिए एक वैज्ञानिक तर्क है कि प्रदान की। इस तरह की जानकारी उपलब्ध कराने के लिए आवेदन किया परीक्षण प्रणाली उच्च गुणवत्ता मजबूत मानक संचालन प्रक्रियाओं द्वारा प्रलेखित उदाहरण के लिए, के रूप में 31 से नियंत्रित किया जाना है। इसके अलावा, समय पर निर्भर परिवर्तन उच्च संकल्प के साथ मैप किए जाने की जरूरत है। इस सिंक्रनाइज़ परिवर्तन 32 के साथ परीक्षण प्रणाली की आवश्यकता है। यहाँ वर्णित UKN1 और UKK परीक्षण प्रणाली इन आवश्यकताओं के लिए अनुकूलित किया गया है।

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Protocol

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निम्नलिखित प्रोटोकॉल मानव भ्रूण स्टेम सेल लाइन (hESC) H9 उपयोग किया गया था। यह सेल लाइन नियमित hESC संस्कृति मीडिया में mitotically निष्क्रिय माउस भ्रूणीय (MEFs) fibroblasts bFGF के साथ पूरक और MEFs से छुटकारा पाने के लिए, इस तरह के Matrigel के रूप में तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के साथ लेपित 6 सेमी पेट्री प्लेटों पर स्टेम सेल मीडिया में तो सुसंस्कृत पर सुसंस्कृत था। > 80% मिला हुआ प्लेटों से H9 कोशिकाओं आगे पारित होने के लिए इस्तेमाल किया गया। तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स प्लेटों पर सुसंस्कृत H9 कोशिकाओं ईबीएस गठन के लिए इस्तेमाल किया गया। निम्नलिखित प्रोटोकॉल में उल्लिखित सभी प्रक्रियाओं सड़न रोकनेवाला और अच्छा सेल संस्कृति प्रथाओं के लिए मानक तरीकों का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया है।

भाग 1. UKK परीक्षा प्रणाली

1. मानव भ्रूण स्टेम सेल संवर्धन

  1. बंटवारे और फीडर कोशिकाओं पर H9 के रखरखाव
    1. प्रत्येक 6 सेमी की थाली में पिपेट 2 मिलीलीटर 0.1% जिलेटिन और सेल संस्कृति incub में 30 मिनट के लिए सेतेator (37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2)। बाँझ पाश्चर विंदुक के साथ महाप्राण जिलेटिन समाधान।
    2. दो जिलेटिन लेपित प्लेटों में 0.1 एक्स 10 6 MEF कोशिकाओं / एमएल युक्त 2 मिलीलीटर MEF मध्यम जोड़ें और सेल कल्चर इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2) हे / एन में उन्हें सेते हैं।
    3. अगले दिन, संदंश का उपयोग H9 कोशिकाओं तरल नाइट्रोजन भंडारण टैंक से शीशी निकालें और लंबे समय संदंश का उपयोग कर एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में शीशी पिघलना।
    4. 15 से 30 सेकंड के लिए जैव सुरक्षा कैबिनेट में पानी से स्नान, 70% इथेनॉल के साथ स्नान यह शुष्क हवा से शीशी निकालें और 15 एमएल फाल्कन ट्यूब कोशिकाओं हस्तांतरण।
    5. 5 मिनट के लिए 200 XG पर कोशिकाओं को धीरे धीरे भीतरी दीवार पर H9 संस्कृति के माध्यम से 9 मिलीलीटर जोड़ें और अपकेंद्रित्र।
    6. महाप्राण सतह पर तैरनेवाला और रॉक अवरोध करनेवाला युक्त 6 मिलीलीटर मध्यम संस्कृति में कोशिकाओं (10 माइक्रोन, Y27632) और मिश्रण करने के लिए धीरे पिपेट फिर से निलंबित। महाप्राण MEF 6 सेमी की थाली से मध्यम और प्रत्येक थाली में 3 एमएल सेल निलंबन जोड़ें। विकास पर मध्यम बदलें3 और उसके बाद हर दूसरे दिन प्र। विभाजन के अनुपात के साथ उपसंकृति> 80% मिला हुआ थाली कोशिकाओं 1: 3।
      नोट: आमतौर पर 5 से 7 दिनों में थाली मिला हुआ हो जाता है। इस्तेमाल किया भक्षण CF1 चूहों भ्रूण से प्राप्त की है और विकिरण γ के लिए जोखिम द्वारा निष्क्रिय कर रहे हैं।
  2. तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स लेपित प्लेटों पर H9 सेल संवर्धन
    1. पिघलना स्टेम सेल मध्यम (5x) आरटी पर पूरक और जैव सुरक्षा कैबिनेट में 100 मिलीलीटर मिलीलीटर 400 में बेसल मध्यम जोड़ने।
    2. बर्फ पर पिघलना तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स। तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स का सुझाव दिया मात्रा में जोड़ें बारह 6 सेमी प्लेटों के लिए DMEM / F-12 बेसल मध्यम ठंडा 24 मिलीलीटर में (प्रत्येक बैच के लिए विश्लेषण के प्रमाण पत्र को देखें)। ऊपर और नीचे pipetting द्वारा मिक्स।
    3. प्रत्येक 6 सेमी की थाली में 2 मिलीलीटर जोड़ें। 1 घंटे के लिए आरटी पर थाली रखें। मध्यम निकालें और स्टेम सेल के माध्यम से 2 मिलीलीटर जोड़ें।
    4. MEFs पर चार मिला हुआ H9 प्लेटें बाहर ले जाओ। जैव सुरक्षा कैबिनेट में रखा stereomicroscope के तहत 1 मिलीलीटर विंदुक टिप के साथ भेदभाव कालोनियों निकालें।
    5. महाप्राणमध्यम और 4 मिलीलीटर पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धोने और प्रत्येक थाली में सेल के माध्यम स्टेम मिली 2 जोड़ें। 6 से 9 टुकड़े प्रत्येक के लिए 26 जी सुई के साथ समान कालोनियों काटें।
    6. धीरे 50 मिलीलीटर बाज़ ट्यूब में कोशिकाओं को इकट्ठा। 5 मिनट के लिए 200 XG पर अपकेंद्रित्र।
    7. सतह पर तैरनेवाला Aspirate और सेल के माध्यम स्टेम ml 12 में फिर से निलंबित। माइक्रोस्कोप के तहत कांच की स्लाइड पर 20 μl डाल द्वारा गुच्छों की गणना और मिलीग्राम प्रति 150 clumps के लिए मात्रा समायोजित करें। प्रत्येक 6 सेमी की थाली में निलंबन के 2 मिलीलीटर जोड़ें।
    8. वर्दी पेड़ों का झुरमुट वितरण के लिए पीछे और आगे और पक्ष की ओर गतियों प्लेटें ले जाएँ और सेल कल्चर इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2) में प्लेटें सेते हैं।
    9. विभेदित कालोनियों निकालें और मध्यम परिवर्तन हर दूसरे दिन दे।

2. embryoid निकायों (ईबीएस) संरचना

सड़न रोकनेवाला सावधानियों के अनुसार और जैव सुरक्षा कैबिनेट में नीचे दिए गए सभी प्रक्रिया करते हैं।

  1. 0 दिवस & #8212; वी नीचे प्लेटों पर H9 कोशिकाओं के चढ़ाना
    1. ऐसे पीबीएस में Pluronic एफ 127 के रूप में 5% ब्लॉक copolymer को तैयार है और 0.22 बाँझ फिल्टर का उपयोग कर निर्वात संचालित छानने का काम प्रणाली के माध्यम से फिल्टर।
    2. अच्छी तरह से 5% प्रति ब्लॉक copolymer के 40 μl के साथ 96 अच्छी तरह से प्लेट नीचे और 45 मिनट के लिए आरटी पर सेते कोट वी।
    3. इनक्यूबेटर से H9 कोशिकाओं के साथ मिला हुआ तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स प्लेटें निकालें और जैव सुरक्षा कैबिनेट में stereomicroscope के तहत 1 मिलीलीटर विंदुक टिप के साथ भेदभाव कालोनियों को हटा दें।
    4. मध्यम Aspirate और 4 मिलीलीटर पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें। प्रत्येक थाली में (bFGF, आरडी मध्यम बिना H9 संस्कृति के माध्यम से) 2 मिलीलीटर यादृच्छिक भेदभाव मध्यम जोड़ें। बीतने के उपकरण का उपयोग करें और जैव सुरक्षा कैबिनेट में stereomicroscope के तहत देख कर एक समान आकार और आकार के clumps में H9 सेल कालोनियों में कटौती और फिर धीरे सेल खुरचनी के साथ परिमार्जन।
    5. 5 मिनट के लिए 200 XG पर 50 एमएल फाल्कन ट्यूब और अपकेंद्रित्र में clumps को ले लीजिए। सतह पर तैरनेवाला Aspirate और सेल फिर से निलंबितआरडी माध्यम में एल मिलीलीटर प्रति 1,000 clumps को पाने के लिए।
    6. वी नीचे प्लेटों से ब्लॉक copolymer aspirate। बाँझ वर्ग की थाली में गुच्छों डालो और मल्टीचैनल पिपेट की मदद से वी नीचे प्लेट की हर अच्छी तरह से करने के लिए निलंबन के 100 μl जोड़ें।
    7. गुच्छों के बल एकत्रीकरण के लिए, सेंट्रीफ्यूज 400 x जी पर 4 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर वी नीचे प्लेटों। चार दिनों के लिए सेल कल्चर इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2) में प्लेटें सेते हैं।
  2. दिन 4 - ईबीएस के संग्रह
    1. मल्टीचैनल पिपेट और विस्तृत बोर 200 μl युक्तियों का उपयोग वी नीचे प्लेटों से बाँझ वर्ग की थाली में ईबीएस लीजिए।
    2. 10 मिलीलीटर बाँझ सीरम वैज्ञानिक विंदुक के साथ 15 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूब में बाँझ वर्ग की थाली से ईबीएस लीजिए। ईबीएस 2 मिनट के लिए व्यवस्थित करने के लिए अनुमति दें। सतह पर तैरनेवाला Aspirate और 5 मिलीलीटर पीबीएस के साथ ईबीएस धो लें।
    3. ईबीएस 2 मिनट के लिए व्यवस्थित और सतह पर तैरनेवाला महाप्राण करने की अनुमति दें। 5 मिलीलीटर आरडी माध्यम में ईबीएस फिर से निलंबित।
    4. 10 सेमी में बाहर पिपेट 10 मिलीलीटर आरडी मध्यमजीवाणु प्लेटें। 10 सेमी जीवाणु प्लेटों में ईबीएस स्थानांतरण।
    5. (50 / मिनट विनिमय गति) सेल कल्चर इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2) के लिए आवश्यक समय अवधि के लिए में रखा क्षैतिज प्रकार के बरतन पर जीवाणु प्लेटें सेते हैं। मध्यम परिवर्तन (15 मिलीलीटर आरडी माध्यम) हर दूसरे दिन दे दो।
      नोट: कोमल से निपटने के लिए आवश्यक है hESCs संवर्धन करते हुए। ईबीएस के आकार के आगे के प्रयोग के लिए stereomicroscope के तहत देख कर एक समान आकार ईबीएस (± 20%) का चयन दिन 4 पर बदलता रहता है। इस विधि के साथ का गठन लगभग 50% ईबीएस आकार में एक समान होते हैं। वर्दी आकार में एक प्रकार के बरतन परिणामों पर ईबीएस के हस्तांतरण।

3. cytotoxicity परख आईसी 10 निर्धारण के लिए

  1. ऑप्टिकल नीचे प्लेटों पर ईबीएस का स्थानांतरण
    1. अच्छी तरह से मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग प्रति 0.1% जिलेटिन की 50 μl के साथ 15 मिनट और कोट ऑप्टिकल नीचे प्लेटों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में 0.1% जिलेटिन गला लें। के लिए आरटी पर प्लेटें सेते45 मिनट। ऊष्मायन के बाद ऑप्टिकल नीचे प्लेटों से जिलेटिन aspirate।
    2. आरडी मध्यम युक्त 10 सेमी जीवाणु थाली में 4 दिन पर एकत्र ईबीएस बाहर ले जाओ।
    3. जैव सुरक्षा कैबिनेट में slanted स्थिति में ऑप्टिकल नीचे प्लेटों रखें। स्थानांतरण stereomicroscope के तहत देख द्वारा ऑप्टिकल नीचे 96 अच्छी तरह से थाली में अच्छी तरह से प्रति 100 μl आरडी माध्यम में ईबीएस के दो समान आकार। खाली 12 वें स्तंभ रखें।
    4. 24 घंटे के लिए सेल कल्चर इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2) में प्लेटें सेते हैं।
  2. 14 दिन के लिए दिन में 5 से दवा जोखिम
    1. परीक्षण परिसर वजन और ज्ञात विलायक में सर्वोच्च एकाग्रता बनाने के।
    2. कोई ट्यूब रखें, क्रमानुसार एच करने के लिए एक साथ गिने फाल्कन ट्यूबों युक्त विलायक में 8 dilutions तक परीक्षण परिसर के आधे-लघुगणक कमजोर पड़ने प्रदर्शन करते हैं। मैं वाहन पर नियंत्रण, ट्यूब नहीं के रूप में। जम्मू कोई नकारात्मक नियंत्रण (आरडी मध्यम) और ट्यूब के रूप में। (70% इथेनॉल) नियंत्रण के रूप में सकारात्मक कश्मीर।
    3. 37 में नहाने के पानी में आरडी मध्यम पिघलना15 मिनट के लिए सी °। 1-11 लेबल वाले 11 बाँझ फाल्कन ट्यूबों में 5 मिलीलीटर आरडी मध्यम प्रत्येक बाहर ले जाओ।
    4. स्थानांतरण 5 क्रमश: 11 से 1 ट्यूब में ट्यूब कश्मीर के लिए ट्यूब एक से समाधान के μl और ट्यूबों भंवर। इनक्यूबेटर से ऑप्टिकल नीचे की थाली से बाहर ले लो और ध्यान मल्टीचैनल पिपेट के उपयोग के साथ मीडिया को हटा दें।
    5. ऑप्टिकल नीचे की थाली के संबंधित कॉलम में 11 से ट्यूब संख्या 1 से मीडिया के 200 μl जोड़ें। मध्यम / दवा परिवर्तन हर दूसरे दिन दे दो।
      नोट: आधा-लघुगणक dilutions के क्रमानुसार ट्यूब नं .2, भंवर और करने के लिए सर्वोच्च एकाग्रता ट्यूब नंबर 1 स्थानांतरण 3 μl से 8. करने के लिए 2 से लेबल 7 ट्यूबों में विलायक 6.48 μl लेने के अगले ट्यूब करने के लिए 3 μl हस्तांतरण के लिए। नकारात्मक नियंत्रण के लिए वाहन पर नियंत्रण और ट्यूब No.10 के लिए ट्यूब No.9 रखें। ट्यूब No.11 70% इथेनॉल है।
  3. 14 दिन: Resazurin जोखिम और प्रतिदीप्ति माप
    1. 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में गल आरडी मध्यम। सभी प्रक्रिया mentio सम्पन्नएन नीचे जैव सुरक्षा कैबिनेट में प्रकाश के अभाव में।
    2. 15 मिलीलीटर ट्यूब (ए) में 10 मिलीलीटर आरडी मध्यम लो और resazurin अभिकर्मक की सिफारिश की मात्रा जोड़ने और pipetting द्वारा मिश्रण। इनक्यूबेटर से ऑप्टिकल नीचे की थाली से बाहर ले लो और ध्यान मल्टीचैनल विंदुक के साथ सभी मध्यम हटा दें।
    3. प्रत्येक कुएं में ट्यूब एक से मध्यम के 100 μl जोड़ें। 90 मिनट के लिए सेल कल्चर इनक्यूबेटर में प्लेट (37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2) सेते हैं।
    4. प्रतिदीप्ति का उपयोग स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (560 EX / 590 एम) को मापने।
  4. आईसी 10 मूल्य दृढ़ संकल्प
    1. खाली मूल्यों को घटाने के बाद ग्राफ पैड चश्मे में मूल्यों को आयात करें। एक प्रतिदीप्ति इकाइयों के रूप में एक खुराक और y अक्ष के रूप में सेट एक्स-अक्ष।
    2. वाई अक्ष पर प्रतिशत प्राप्त करने और मूल्यों (प्रवेश पैमाने के रूप में एक्स अक्ष) को बदलने के लिए मूल्यों को मानक के अनुसार। Sigmoidal खुराक प्रतिक्रिया (चर ढलान) पैरामीटर का उपयोग करके आईसी 50 मूल्य की गणना करें। निम्नलिखित का उपयोग करके आईसी 10 मूल्यों के लिए लॉग इन गणनासमीकरण:
      एफ = 10 logEC 50 = logECF - (1 / HillSlope) * प्रवेश (एफ / (100-एफ))
      वाई = निचला + (ऊपर से नीचे) / (1 ​​+ 10 ^ ((LogEC 50 एक्स) * HillSlope))
    3. निर्धारित बनाने के लिए आईसी 10 मूल्यों आगे की पढ़ाई के लिए ले जाया जाएगा।

4. biomarker अध्ययन प्रोटीन के आधार पर

  1. 5 दिन के लिए दिवस 0:
    1. Embryoid शरीर गठन और हस्तांतरण करने के लिए 10 सेमी जीवाणु प्लेटें - embryoid शरीर गठन के लिए बिंदु 2 में वर्णित चरणों का पालन करें।
      नोट: प्रत्येक अध्ययन के लिए तीन जैविक प्रतिकृति का प्रयोग करें। आईसी 10 एकाग्रता और वाहन नियंत्रण में दवा उपचार - प्रत्येक जैविक दो भागों में दोहराने फूट डालो। वाहन में दवा एकाग्रता आईसी 10 एकाग्रता से ऊपर 10,000 गुना तैयार है और यह 50 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब में H9 सेल clumps के साथ 100 मिलीलीटर आरडी मध्यम करने के लिए 10 μl जोड़ने से मिश्रण अच्छी तरह से और वी नीचे प्लेटों पर बीज। वाहन नियंत्रण समूह के लिए उसी प्रक्रिया का पालन करें।
  2. <से 14 दिन 5 पर दवा प्रदर्शन के लिए li> EB's इकट्ठा करने और बिंदु में वर्णित चरणों के रूप में प्रति दिन 4 पर 10 सेमी में जीवाणु प्लेटों उन्हें स्थानांतरण क्षैतिज प्रकार के बरतन (विनिमय गति 50 / मिनट) में पर प्लेटें 2. स्थानांतरण सेल कल्चर इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2) 14 दिनों के लिए। मध्यम परिवर्तन हर दूसरे दिन दे दो।
  3. नमूना संग्रह के लिए, दिन 14, बाँझ सीरम वैज्ञानिक विंदुक के साथ 15 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूब में 10 सेमी प्लेटों से ईबीएस इकट्ठा। ईबीएस 2 मिनट के लिए व्यवस्थित करने के लिए अनुमति दें। सतह पर तैरनेवाला Aspirate और 5 मिलीलीटर पीबीएस के साथ ईबीएस धो लें। ईबीएस 2 मिनट के लिए व्यवस्थित और सतह पर तैरनेवाला महाप्राण करने की अनुमति दें। 1 मिलीलीटर RNAlater समाधान या TRIzol अभिकर्मक, भंवर में ईबीएस पुनः निलंबित और आगे की प्रक्रिया तक -80 डिग्री सेल्सियस पर नमूना दुकान।
    नोट: अच्छा प्रयोगशाला प्रथाओं के अनुसार जैव सुरक्षा कैबिनेट में सभी प्रक्रिया को पूरा करें। बाँझ कांच pastu की मदद से आसपास से मध्यम, केंद्र में सभी ईबीएस लाने महाप्राण करने के लिए केंद्र के चारों ओर परिपत्र गति में प्लेटें घुमाएँपिपेट पुनः, 15 मिलीलीटर आरडी मध्यम जोड़ने और फिर संबंधित समूह के लिए दवा / वाहन के 15 μl जोड़ें।

5. शाही सेना अलगाव और वफ़ादारी परीक्षण

  1. शाही सेना अलगाव:
    नीचे उल्लेख किया कदमों से ज्यादातर निर्देश पुस्तिका के अनुसार RNeasy मिनी किट का उपयोग कर शाही सेना शुद्धि के लिए किया जा करने के लिए कर रहे हैं। हमेशा nuclease मुफ्त ट्यूबों, पिपेट सुझाव और पानी का उपयोग करें। TRIzol के साथ काम करते हुए रासायनिक सुरक्षा हुड में सभी प्रक्रिया से बाहर ले जाने और सुरक्षात्मक चश्मे के साथ ही रासायनिक सुरक्षात्मक दस्ताने पहनते हैं।
    1. बर्फ पर नमूने गला लें। नमूने RNAlater समाधान में जमा हो जाती है, तो 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 12,000 XG पर ट्यूब अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 1 मिलीलीटर TRIzol अभिकर्मक जोड़ें।
    2. 24 जी सुई और 1 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग कर नमूने Triturate। लगभग 15 बार विचूर्णन ईबीएस, सेल की दीवार और प्लाज्मा झिल्ली के विघटन के लिए पर्याप्त है।
    3. प्रत्येक नमूने में क्लोरोफॉर्म के 200 μl जोड़ें। भंवर समान रूप से सामग्री मिश्रण करने के लिए। अपकेंद्रित्र4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 12,000 XG पर। RNeasy मिनी स्पिन स्तंभ, 1.5 मिलीलीटर ट्यूब निकालें और उन्हें ठीक से लेबल।
    4. (सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा करने मध्यम या नीचे की परत को परेशान नहीं करते हैं) 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला लीजिए। ठंडा 70% इथेनॉल के बराबर मात्रा में शामिल करें। कोमल झटकों से सामग्री मिलाएं।
    5. संबंधित मिनी स्पिन स्तंभों के लिए ट्यूब से 700 μl लागू करें और आरटी पर 20 सेकंड के लिए 12,000 XG पर उन्हें अपकेंद्रित्र। आरटी पर आगे की सभी चरणों को पूरा करें।
    6. छानना त्यागें और संबंधित कॉलम के शेष समाधान को लागू करने और 20 सेकंड के लिए 12,000 XG पर उन्हें अपकेंद्रित्र। छानना त्यागें।
    7. स्तंभ के लिए RW1 बफर के 350 μl लागू करें और 20 सेकंड के लिए 12,000 XG पर उन्हें अपकेंद्रित्र। छानना त्यागें और स्तंभ के लिए 10 DNase के μl और 70 μl RDD बफर लागू होते हैं।
    8. 15 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं। स्तंभ के लिए RW1 बफर के 350 μl लागू करें और 20 सेकंड के लिए 12,000 XG पर उन्हें अपकेंद्रित्र। छानना त्यागें। के 500 μl लागू करेंRPE के स्तंभ के लिए बफर और 20 सेकंड के लिए 12,000 XG पर अपकेंद्रित्र उन्हें धो लें। छानना त्यागें। फिर स्तंभ के लिए RPE धोने बफर के 500 μl लागू करें और 2 मिनट के लिए 12,000 XG पर उन्हें अपकेंद्रित्र। छानना त्यागें।
    9. नई 2 मिलीलीटर संग्रह ट्यूबों के लिए कॉलम पारी और 1 मिनट के लिए 12,000 XG पर उन्हें अपकेंद्रित्र। लेबल वाले 1.5 मिलीलीटर संग्रह ट्यूब के लिए कॉलम स्थानांतरण और nuclease मुफ्त पानी के 22 μl लागू होते हैं। 1 मिनट के लिए 12,000 XG पर ट्यूब अपकेंद्रित्र।
    10. संग्रह ट्यूब निकालें और बर्फ पर डाल दिया। शाही सेना स्वचालित वैद्युतकणसंचलन प्रणाली का उपयोग यों।
  2. शाही सेना एकाग्रता, पवित्रता और अखंडता का परीक्षण।
    शाही सेना पवित्रता और अखंडता के लिए उपयोग स्वचालित वैद्युतकणसंचलन प्रणाली और संबंधित किट 33 का परीक्षण।

6. माइक्रोएरे स्टडीज

  1. वाणिज्यिक उपलब्ध मानव सरणी चिप्स का उपयोग कर ट्रांसक्रिप्शनल रूपरेखा प्रदर्शन करते हैं। शाही सेना लक्ष्य तैयारी, विखंडन, संकरण 34 और सरणी के लिएचिप धुंधला, वाशिंग 35 उपयोग वाणिज्यिक उपलब्ध किट।
  2. मानक fluidics स्टेशन, सरणी स्कैनर और मानक संचालन सॉफ्टवेअर 36 का उपयोग करके सरणी चिप स्कैनिंग और गुणवत्ता नियंत्रण की जांच को पूरा करें। जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए मानक उपलब्ध वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर करने के लिए 37 स्कैनर से उत्पन्न फ़ाइलें आयात, मजबूत बहु सरणी विश्लेषण (आरएमए) के साथ पृष्ठभूमि सुधार, संक्षिप्तीकरण और सामान्य प्रदर्शन करते हैं।
  3. विभिन्न व्यक्त जीनों की सूची प्राप्त करने के लिए (डिग्री) की एक तरह से एनोवा विश्लेषण करते हैं। इस सूची से गुना परिवर्तन (± 2) और एफडीआर नियंत्रित पी मूल्य (<0.05) के आधार पर जीन बाहर फिल्टर। इस सॉफ्टवेयर का उपयोग आदि प्रमुख घटक विश्लेषण (पीसीए), गर्मी का नक्शा, प्राप्त करते हैं।

भाग 2. UKN 1 टेस्ट सिस्टम

HESC 1. रखरखाव

  1. MEFs की सीडिंग
    1. भेदभाव के लिए NSCB # 8534 (H9) सेल लाइन का उपयोग करें। संस्कृति सीईफीडर कोशिकाओं के रूप में माउस भ्रूणीय (MEFs) fibroblasts पर LLS। 0.1% जिलेटिन के 4 मिलीलीटर और साथ कोट T25 कुप्पी 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सेते हैं।
    2. 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में गल MEFs और पूर्व गर्म DMEM / 10% FBS के में कोशिकाओं को हस्तांतरण।
    3. , 500 XG के साथ 3.5 मिनट स्पिन सतह पर तैरनेवाला हटाने और 1 10 x 7 कोशिकाओं / एमएल प्राप्त करने के लिए कोशिकाओं से निलंबित कर रहे हैं। जिलेटिन पर T25 बोतल में 4 एक्स 10 4/2 सेमी प्लेट MEFs। वैकल्पिक रूप से, अगले दो दिनों के लिए MEFs का उपयोग करें। MEF बैचों की गुणवत्ता hESC रखरखाव के लिए एक बहुत महत्वपूर्ण मुद्दा है। इसलिए यह H9 कोशिकाओं के लिए सबसे अच्छी कंपनी है और तैयारी विधि को स्पष्ट करने की सलाह दी जाती है। हम PMEF पी 3 का उपयोग करें।
  2. बंटवारे और H9 के रखरखाव
    1. T25 कुप्पी H9 प्रति 1 एमएल पूर्व गर्म dispase जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 9 मिनट सेते हैं।
    2. 2 मिलीलीटर इलाज कोशिकाओं और pipet 5 बार और एक बाज़ ट्यूब 5 मिलीलीटर pipet और स्थानांतरण सेल समाधान के साथ नीचे dispase करने के लिए मध्यम धोने जोड़ें।
    3. 9 मिलीलीटर मध्यम धोने के साथ कुप्पी धो लेंऔर दूसरों के लिए कोशिकाओं को जोड़ने। , 500 XG के साथ 3.5 मिनट स्पिन सतह पर तैरनेवाला हटाने और 10 मिलीलीटर hESC मध्यम में कोशिकाओं को फिर से निलंबित।
    4. , 500 XG के साथ 3.5 मिनट स्पिन सतह पर तैरनेवाला हटाने और 4 मिलीलीटर hESC मध्यम में कोशिकाओं को फिर से निलंबित। MEFs के साथ एक नया (पीबीएस धोया) T25 फ्लास्क में 0.5 मिलीलीटर सेल निलंबन और 4.5 मिलीलीटर hESC मध्यम और प्लेट जोड़ें। हर दिन कुप्पी की पूरी hESC मध्यम (5 एमएल) बदलें।

Neuroectodermal पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं की ओर hESC 2. भेदभाव (एनईपी)

  1. HESC मध्यम और KCM मध्यम तैयार करें। कोट एक 10 सेमी T25 फ्लास्क प्रति जिलेटिन (पीबीएस में 0.1%) के साथ पकवान और 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सेते हैं। HESC से मध्यम निकालें और कुप्पी के पूरे नीचे (T25 फ्लास्क प्रति 1 मिलीलीटर) को कवर किया और 37 डिग्री सेल्सियस पर 25 मिनट से 30 सेते करने के लिए पर्याप्त Accutase जोड़ें।
  2. Accutase ऊष्मायन के दौरान तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स लेपित प्लेटें तैयार करें। जमे हुए तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स गोली ठंड DMEM / F12 जोड़ें और यह 1:20 हल करने के लिए। फ़िल्टर तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स समाधानएक 40 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से tion। थाली करने के लिए फ़िल्टर किया समाधान जोड़ें, पूरे नीचे कवर (6 अच्छी तरह से प्रति 1 मिलीलीटर की आवश्यकता होती है) और आरटी पर 2 घंटे के लिए सेते हो गया है।
  3. ऊष्मायन अवधि के बाद लेपित कुओं पर तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स सतह पर तैरनेवाला और बीज कोशिकाओं को हटा दें। Accutase कदम (2.1) के बाद 1.5 एमएल HES मध्यम के अलावा द्वारा प्रतिक्रिया बंद करो। , कुप्पी से कोशिकाओं परिमार्जन 8 मिलीलीटर hESC मध्यम जोड़ने और अच्छी तरह से 10 मिलीलीटर pipet के साथ pipetting द्वारा एक एकल कोशिका समाधान का उत्पादन। एक 40 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से फिल्टर कोशिकाओं।
  4. स्पिन कोशिकाओं 500 XG के साथ 3 मिनट, सतह पर तैरनेवाला हटाने और hESC के 10 एमएल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित। स्पिन कोशिकाओं को फिर से 3 मिनट XG 500 के साथ सतह पर तैरनेवाला निकालें और रॉक अवरोध करनेवाला वाई 27,632 10 माइक्रोन का एक अंतिम एकाग्रता में युक्त hESC में कोशिकाओं से निलंबित कर रहे हैं।
  5. जिलेटिन लेपित पकवान की सतह पर तैरनेवाला निकालें। जिलेटिन लेपित पकवान पर प्लेट सेल निलंबन MEFs हटाने के लिए और वास्तव में 1 घंटे के लिए इनक्यूबेटर में छोड़ने के लिए।
    नोट: इस चरण के दौरान MEFs होगा ओंettle hESC जिलेटिन को संलग्न नहीं कर सकते हैं, जबकि जिलेटिन लेपित थाली पर। इसलिए यह एक फीडर से मुक्त भेदभाव प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है। यह MEFs का अकुशल हटाने में एक के रूप में महत्वपूर्ण कदम hESC clumps में भी लंबे समय से ऊष्मायन परिणाम और भी कम ऊष्मायन है। ऊष्मायन के 45 मिनट के बाद थाली पहले से ही तय हो चुका MEFs और hESC clumps के लिए जांच की जानी चाहिए।
  6. MEFs संलग्न किया है, धीरे थाली में पहले से ही मध्यम के साथ ऊष्मायन के बाद बंद गैर पक्षपाती कोशिकाओं (hESC) धो लें। कई T25 अधिक कोशिकाओं को पाने के लिए इस्तेमाल किया गया है, एकल कक्षों अब जोड़ा जा सकता है। HESC मध्यम के साथ एक बार थाली धो लें।
  7. स्पिन कोशिकाओं 500 XG के साथ 3 मिनट, सतह पर तैरनेवाला हटाने और / एमएल FGF-2 10 माइक्रोन रॉक अवरोध करनेवाला वाई 27,632 और 10 एनजी युक्त लगभग 4 मिलीलीटर KCM में कोशिकाओं को फिर से निलंबित।
  8. Trypan नीले रंग का उपयोग कर एक hemocytometer में कोशिकाओं की गणना। युक्त KCM में प्लेटें लेपित तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स पर प्लेट 18 एक्स 10 3 कोशिकाओं / 2 सेमी 10 माइक्रोन रॉक अवरोध करनेवाला वाई 27,632 और10 एनजी / एमएल FGF -2 (6 अच्छी तरह से अच्छी तरह से प्रति 1.5 मिलीलीटर उपयोग के लिए)। यह NEPs में उन्हें सफलतापूर्वक अलग करने के लिए सही घनत्व में कोशिकाओं थाली करने के लिए महत्वपूर्ण है।
  9. 24 घंटे के बाद, 10 माइक्रोन रॉक अवरोध करनेवाला वाई 27,632 और 10 एनजी / एमएल FGF-2 युक्त ताजा KCM करने के लिए मध्यम बदल जाते हैं। आगे 24 घंटे के बाद, 10 एनजी / एमएल FGF2 युक्त ताजा KCM करने के लिए मध्यम बदल जाते हैं।
  10. कोशिकाओं को बोने के बाद 72 घंटा, भेदभाव एस आर मध्यम ओर मध्यम परिवर्तन से शुरू होता है। इस समय बिंदु भेदभाव 0 (DoD0) के दिन के रूप में जाना जाता है। परीक्षण पदार्थों के अलावा अब संभव है।
  11. DoD1 और DoD2 पर मध्यम बिल्कुल DoD0 पर के रूप में बदल जाता है। अगला मध्यम परिवर्तन DoD4 25% एन 2-एस और 75% एस आर युक्त पर है। DoD6 में भेदभाव बंद कर दिया है और कोशिकाओं के विश्लेषण के लिए काटा जाता है।

HESC और एनईपी 3. chromatin immunoprecipitation (चिप)

  1. नाभिक की तैयारी
    1. विश्लेषण किया है और 25 से 30 मिनट के लिए सेते किया जाना चाहिए जो प्रत्येक 6 अच्छी तरह से करने के लिए Accutase 500 μl जोड़ें। CouTrypan नीले रंग का उपयोग कर एक Neubauer कक्ष में NT कोशिकाओं।
    2. Crosslink के लिए DMEM / F12 में 1% formaldehyde में Resuspend कोशिकाओं। Crosslink बंद करने के लिए 10 मिनट के बाद 125 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता के लिए Tris 7.5 पीएच जोड़ें।
    3. स्पिन कोशिकाओं 4 डिग्री सेल्सियस पर 500 XG के साथ 3 मिनट, सतह पर तैरनेवाला हटाने और ठंड पीबीएस में कोशिकाओं को फिर से निलंबित।
    4. स्पिन कोशिकाओं 4 डिग्री सेल्सियस पर 500 XG के साथ 3 मिनट / 1 एक्स 10 6 कोशिकाओं बफर L1- 1 मिलीलीटर में कोशिकाओं, सतह पर तैरनेवाला हटाने और फिर से निलंबित।
    5. बर्फ पर 5 मिनट के लिए सेते हैं। स्पिन 4 डिग्री सेल्सियस पर 800 XG के साथ 5 मिनट, सतह पर तैरनेवाला हटाने और / 2 x 10 6 कोशिकाओं बफर L2- 1 मिलीलीटर में नाभिक से निलंबित कर रहे हैं।
  2. Sonication और गुणवत्ता नियंत्रण
    1. 300-700 बीपी लंबाई की है कि डीएनए टुकड़े उत्पन्न कर रहे हैं ताकि sonicate। 4 डिग्री सेल्सियस पर 10,000 XG साथ 1 मिनट स्पिन। एक नया ट्यूब स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला। टुकड़े अन्यथा immunoprecipitation के अकुशल के रूप में अच्छी तरह से पालन किया qPCR के लिए किया जाएगा, सही आकार की आवश्यकता है।
    2. 50 μl एक निकालें50 μl एल 2 बफर के साथ डी मिश्रण एक agarose जेल चलाकर sonication के दक्षता की जांच करने के लिए।
    3. 4 घंटा और 500 आरपीएम के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन से crosslink उल्टा। लोड नमूने 1: 1.5% agarose जेल पर ऑरेंज जी लोड हो रहा है डाई के साथ 5 और 1x TBE बफर में 110 वी पर 45 मिनट चला। नियंत्रण टुकड़ा आकार (300-700 बीपी के बीच होना चाहिए)।
  3. Chromatin immunoprecipitation
    1. नमूने 1 पतला: 5 कमजोर पड़ने बफर और विभाज्य में आईपी प्रति 1 मिलीलीटर siliconized ट्यूबों में।
    2. 'इनपुट' के रूप में 4 डिग्री सेल्सियस पर पतला क्रोमेटिन नमूना (कदम 3.3.1) और दुकान से 5% (मात्रा) निकालें।
    3. एक रोटेटर पर 4 डिग्री सेल्सियस पर unspecific आईजीजी हे / एन अपनी पसंद की और साथ एंटीबॉडी के साथ नमूने सेते हैं।
    4. Immunoprecipitation के बाद प्रत्येक नमूने के 50 μl प्रोटीन-ए / जी Sepharose मोती जोड़ें। एक रोटेटर पर 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूने 3 घंटा सेते हैं। 4 डिग्री सेल्सियस पर 1,500 XG साथ 1 मिनट स्पिन और सतह पर तैरनेवाला हटा दें।
    5. 1 मिलीलीटर धोने के मोतियों के साथ धोएं। स्पिन 1 मिनट 1,500 XG पर साथ4 डिग्री सेल्सियस और सतह पर तैरनेवाला हटा दें। एच करने के लिए कदम दोहराएँ छ। 1 मिलीलीटर अंतिम धोने बफर के साथ धोएं। इस सीधे eluate की राशि को बदल देता है, क्योंकि धोने कदम के दौरान आप, मोती के किसी भी खोना नहीं चाहिए।
    6. अपकेंद्रित्र 1 से 4 डिग्री सेल्सियस पर 1,500 XG साथ न्यूनतम और सतह पर तैरनेवाला हटा दें। 125 μl क्षालन बफर जोड़ें और एक प्रकार के बरतन पर 1000 rpm पर 65 डिग्री सेल्सियस के साथ 15 मिनट सेते हैं।
    7. 1,500 XG साथ 1 मिनट स्पिन और एक नया ट्यूब चरण को दोहराएँ कश्मीर और एल स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला। इनपुट (3.3.2) के लिए 200 μl क्षालन बफर जोड़ें। प्रत्येक नमूने के लिए proteinase कश्मीर और RNase जोड़ें और एक प्रकार के बरतन पर 500 rpm पर 37 डिग्री सेल्सियस के साथ 30 मिनट सेते हैं और बाद में 4 घंटा एक प्रकार के बरतन पर 500 rpm पर 65 डिग्री सेल्सियस के साथ।
      नोट: डीएनए निष्कर्षण उपयोग वाणिज्यिक उपलब्ध चिप डीएनए स्वच्छ और concentrator किट 38 के लिए।

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Representative Results

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UKK परीक्षा प्रणाली में मिथाइल पारा जोखिम

cytotoxicity परख एक आईसी 10 मूल्य मिथाइल पारा के cytotoxicity के लिए (10% की व्यवहार्यता की कमी) (चित्रा 1) प्राप्त करने के लिए H9 ईबीएस के साथ प्रदर्शन किया गया था। हम यह भी एक माइक्रोएरे आधारित (Affymetrix मंच) बायोमार्कर अध्ययन प्रदर्शन किया। H9 ईबीएस 14 दिनों के लिए मिथाइल पारा (0.25 और 1 माइक्रोन) को उजागर किया गया है। 14 दिन पर, नमूने TRIzol का उपयोग कर एकत्र किया गया है और शाही सेना पृथक किया गया। Transcriptional रूपरेखा मानव जीनोम U133 प्लस 2.0 सरणी चिप्स का उपयोग कर प्रदर्शन किया था। डेटा Partek जीनोमिक सुइट टीएम 6.6 के साथ विश्लेषण किया गया है। पहली डेटा सिंहावलोकन सिद्धांत घटक विश्लेषण (2A चित्रा), वेन आरेख की पीढ़ी (चित्रा 2 बी) और गर्मी के निर्माण के नक्शे (चित्रा -2) से प्राप्त हुई थी। सिद्धांत घटक विश्लेषण जीन की अभिव्यक्ति के समग्र वितरण का प्रतिनिधित्व करता है और यह स्पष्ट रूप से segreg visualizedवाहन नियंत्रण से MeHg 1 माइक्रोन और MeHg (# 25.2 पीसी) 0.25 माइक्रोन समूहों (2A चित्रा) की समझना। विभिन्न व्यक्त जीन की एक सूची (डिग्री) के बाद प्राप्त हुई थी सांख्यिकीय उपचार (एक तरह से एनोवा) और ± 2 के एक गुना परिवर्तन कट ऑफ और बहुलता को सही (Benjamini-Hochberg विधि) पी मूल्य का उपयोग कर डेटा का छानने <0.05 (1 टेबल)। 1 माइक्रोन MeHg उपचार 276 DEGS और 31 DEGS (चित्रा 2B) में 0.25 माइक्रोन में हुई। गर्मी के नक्शे MeHg 1 माइक्रोन उपचार मुख्य रूप से जीन अभिव्यक्ति (चित्रा -2) को कम कर दिखाया। Overrepresented जीन आंटलजी शर्तों पर सूचना डेविड जैव सूचना विज्ञान उपकरण का उपयोग करके प्राप्त किया गया था। तालिका 2 से अधिक 5 जीन निहित है कि काफी overrepresented जाओ जीन श्रेणियों का प्रतिनिधित्व करता है। तंत्रिका तंत्र के विकास से संबंधित नीचे विनियमित प्रतिलेखन कारक की पहचान की गई। SEPP1, DDIT4, AK4, FRZB (मस्तिष्क विकास), पीआईटेक्सास (तंत्रिका नाभिक विकास) और ERBB3, UGT8, ApoB, APOA1 (तंत्रिका तंत्र के विकास) मिथाइल पारा उपचार (3 टेबल) के लिए एक खुराक निर्भर तरीके से नीचे विनियमित किया गया।

UKN 1 परीक्षा प्रणाली

इस भेदभाव प्रोटोकॉल भेदभाव के छह दिनों के भीतर एनईपी के शुद्ध आबादी उत्पन्न करने के लिए दोहरी Smad inhibiton 6 का उपयोग करता है। परिणामी कोशिकाओं तंत्रिका अग्रदूत जीन Pax6 और OTX2 की एक अप-नियमन की विशेषता है। स्टेम सेल मार्कर OCT4 और Nanog नीचे एनईपी (चित्रा 3) की दिशा में भेदभाव के दौरान विनियमित रहे हैं। कारण अत्यधिक तुल्यकालिक और समरूप भेदभाव करने के लिए, यह विकास के इस प्रारंभिक चरण के दौरान हिस्टोन संशोधनों के बारे में जानकारी प्राप्त करने के लिए भी संभव है। हम भेदभाव की शुरुआत में या के 6 दिन बाद या तो कोशिकाओं का उपयोग इम्युनो वर्षा (चिप) क्रोमेटिन के लिए प्रोटोकॉल अनुकूलितभेदभाव। Pax6 और OTX2 के प्रमोटर क्षेत्रों पर मिथाइलेशन साइटों की एक स्विच इन अध्ययनों (3B चित्रा) से स्पष्ट हो गया था। जांच की मिथाइलेशन साइटों 3 लाइसिन 4 trimethylation (H3K4me3) और हिस्टोन 3 लाइसिन 27 trimethylation (H3K27me3) भेदभाव के दौरान अत्यधिक गतिशील थे हिस्टोन। इसके अलावा प्रोटीन स्तर पर Oct4 के नीचे विनियमन (चित्रा 4) मनाया जा सकता है। Pax6 की अप-विनियमन और तंत्रिका स्टेम सेल मार्कर nestin प्रोटीन स्तर पर immunofluorescence माइक्रोस्कोपी (चित्रा 4) से मनाया गया। सेल की आबादी भेदभाव के छह दिन बाद एक सजातीय और शुद्ध भेदभाव दिखाया। इसलिए संस्कृतियों आसानी से शाही सेना और प्रोटीन का विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस प्रणाली को भी पदार्थ और जल्दी तंत्रिका विकास 16,29 पर वे हैं प्रभाव का परीक्षण करने के लिए संभावना प्रदान करता है।

चित्रा MeHg के लिए 1. cytotoxicity परख (H9 भेदभाव)। परख मिथाइल पारा के लिए आईसी 10 मूल्य को परिभाषित करने के लिए प्रोटोकॉल के अनुसार प्रदर्शन किया गया है।

चित्र 2
UKK परीक्षा प्रणाली के आवेदन के बाद 0.25 और 1 माइक्रोन MeHg द्वारा प्रेरित अंतर व्यक्त जीनों की चित्रा 2. प्रतिनिधि विश्लेषण। HESCs UKK परीक्षा प्रणाली के अनुसार 0.25 और 1 माइक्रोन MeHg के साथ इलाज किया गया। अंतर का विश्लेषण 14 दिन विभेदित ईबीएस में टेप Partek जीनोमिक सुइट टीएम 6.6 सॉफ्टवेयर का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया है व्यक्त की है। (ए) माइक्रोएरे डेटा के प्रमुख घटक विश्लेषण (3-Dimenional)। (बी) वेन आरेख जीन अभिव्यक्ति के माइक्रोएरे विश्लेषण से प्राप्त की। आरेख की संख्या से पता चलता हैMeHg उपचार (गुना परिवर्तन> ± 2, पृ मूल्य <0.05) द्वारा संग्राहक जीनों। (सी) डाटा जीन की अभिव्यक्ति की श्रेणीबद्ध क्लस्टरिंग (बदलें गुना> ± 2, पृ मूल्य <0.05)। वाहन नियंत्रण समूह में अत्यधिक व्यक्त जीनों 1 माइक्रोन MeHg उपचार से दमित कर रहे हैं। । वाहन नियंत्रण समूह की तुलना के रूप में 1 माइक्रोन MeHg उपचार कम अभिव्यक्ति के साथ 233 टेप और उच्च अभिव्यक्ति के साथ 43 जांच में हुई इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
एनईपी के प्रति hESC से भेदभाव के दौरान चित्रा 3. जीन अभिव्यक्ति और हिस्टोन मिथाइलेशन पैटर्न। सभी प्रयोगों के लिए, hESC neuroectodermal अग्रदूत कोशिकाओं (एनईपी) को भेदभाव कर रहे थे। (ए) के नमूने डी पर ले जाया गयातंत्रिका भेदभाव के मार्कर जीन की प्र भेदभाव के 6, और प्रतिलेख के स्तर आर टी-qPCR के द्वारा निर्धारित किया गया है। डाटा (hESC के सापेक्ष जीन की अभिव्यक्ति) 5 प्रयोगों के SEM ± साधन हैं। Chromatin immunoprecipitation (चिप) के लिए (बी) नमूने भेदभाव के 6 दिन में तैयार किया गया था। चिप H3K4me3 या H3K27me3 या नियंत्रण आईजीजी के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ प्रदर्शन किया गया था। प्रमोटर दृश्यों के संवर्धन कारकों H3K4me3 (ग्रे) और H3K27me3 (काला) के लिए% निवेश के रूप में दिया जाता है। डाटा 3 स्वतंत्र सेल की तैयारी के SEM ± साधन हैं। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
की ओर एनईपी। HESC से भेदभाव के दौरान चित्रा 4. प्रोटीन अभिव्यक्ति कोशिकाओं तय की और स्टेम सेल मार्कर के लिए दाग रहे थेभेदभाव (DoD0) के दिन 0 पर और भेदभाव के दिन 6 (DoD6) में एनईपी मार्करों Pax6 (लाल) और nestin (हरा) के लिए Oct4 (हरा)। स्केल बार 50 माइक्रोन इंगित करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका एक
विभिन्न व्यक्त जीनों की तालिका 1. सूची (> ± 2 गुना, पी मूल्य <0.05) 14 दिन पुरानी ईबीएस में वाहन नियंत्रण बनाम MeHg उपचार की। इस तालिका देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Dysregulated ट्रॅन के साथ काफी समृद्ध और चयनित विभाग की तालिका 2 सूची (P मूल्य 0.05 <,> 5 जीन)14 दिन पुरानी ईबीएस में वाहन नियंत्रण बनाम MeHg के लिए स्क्रिप्ट।

जाओ टर्म गिनती पी मूल्य जीन
Apoptosis के विनियमन 18 0.0068 ARHGEF3, TBX3, ERBB3, MITF, BNIP3, CDH1, IGF2, IFI16, HGF, GCH1, AMIGO2, SERPINB9, KRT18, MSX1, ETS1, VEGFA, perp, IGFBP3
सेल प्रसार का नियमन 17 0.0123 RBP4, Lyn, TBX3, ERBB3, MITF, IGF2, KDR, RERG, MSX1, एडीएम, ETS1, VEGFA, BNC1, ADAMTS1, FABP1, IGFBP3, FIGF
Vasculature विकास 12 0.0001 बेनी, ApoB, HAND1, TBX3, EPAS1, FOXF1, LEPR, VEGFA, COL3A1, Lox, FIGF, KDR
कंकाल प्रणाली विकास एनजी> 12 0.0008 RBP4, MSX1, LGALS3, TBX3, HOXB6, COL3A1, STC1, IGF2, POSTN, FRZB, IGFBP3, AHSG
हार्ट विकास 1 1 0.0001 RBP4, ACTC1, MSX1, HAND1, TBX3, एडीएम, PKP2, ERBB3, GATA6, COL3A1, ADAMTS1
ग्लूकोज चयापचय की प्रक्रिया 9 0.0003 PDK1, RBP4, LDHA, PGM5, PYGL, HK2, PFKP, IGF2, PGK1
फेफड़ों के विकास 7 0.0008 RBP4, EPAS1, GATA6, FOXF1, VEGFA, Lox, KDR
उपकला विकास 7 0.0386 F11R, FREM2, GATA6, FOXF1, VEGFA, डीएसपी, KDR
Mesoderm विकास 5 0.0088 HAND1, TBX3, FOXF1, VEGFA, SNAI2
"lways> तालिका 3. सूची में काफी नीचे विनियमित 14 दिन पुरानी ईबीएस में MeHg उपचार के साथ विकास संबंधी तंत्रिका तंत्र से संबंधित टेप।

अवधि जीन प्रतीक दुगुना परिवर्तन *
कुलपति बनाम 0.25 माइक्रोन MeHg कुलपति बनाम 1 माइक्रोन MeHg
मस्तिष्क में वृद्धि SEPP1 -2.17 -4.13
DDIT4 -1.20 -3.11
AK4 -1.41 -3.08
FRZB -1.29 -2.19
Neuronal नाभिक विकास PITX2 -2.08 -4.90
तंत्रिका तंत्र के विकास ERBB3 -1.86 -2.89
UGT8 -1.67 -2.14
ApoB -3.59 -5.72
APOA1 2.63 -2.90
VEGFA -1.28 -3.06

* पी मूल्य 0.05 <

संस्कृति मीडिया के पटल 4. रचना।

<टीडी> इंसुलिन
क्रमांक. मध्यम / बफर नाम रचना
मात्रा
1 MEF मध्यम DMEM उच्च ग्लूकोज
एफसीएस 10%
पेनिसिलिन 100 यूनिट / मिलीलीटर
स्ट्रेप्टोमाइसिन 100 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर
एल Glutamine 2 मिमी
2 H9 संस्कृति मध्यम DMEM के लिए F12
KOSR 20%
NEAA 1%
Glutamax 1x
β-mercaptoethanol 0.1 मिमी
पेनिसिलिन 100 यूनिट / मिलीलीटर
स्ट्रेप्टोमाइसिन 100 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर
bFGF 4 एनजी / एमएल 3 आरडी मध्यम BFGF के बिना H9 संस्कृति के माध्यम से
4 धो मध्यम DMEM / F12
नॉकआउट सीरम replacment 20%
1x GlutaMAX 1x
सदस्य गैर आवश्यक अमीनो एसिड
HEPES 15 मिमी
β-mercaptoethanol 90 माइक्रोन
5 KCM मध्यम DMEM
एफ बी एस 10%
MEFs पर 24 घंटे के लिए incubated
6 नॉकआउट सीरम
रिप्लेसमेंट (एस आर)
नॉकआउट सीरम रिप्लेसमेंट 15%
1x GlutaMAX
1x सदस्य गैर आवश्यक अमीनो एसिड
β-mercaptoethanol 15 माइक्रोन
नोगिन 35 एनजी / एमएल
Dorsomorphin 600 एनएम
SB431542 10 माइक्रोन
7 एन 2-एस DMEM / F-12
Apotransferin 100 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर
ग्लूकोज़ 1.55 मिलीग्राम / एमएल
प्यूटर्साइन 10 मिमी
सेलेनियम 500 माइक्रोन
Progesteron 20 माइक्रोन
GlutaMAX 200 माइक्रोन
25 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर
8 एल 1 बफर Tris 8 पीएच 50 मिमी
EDTA 2 मिमी
एनपी-40 0.10%
ग्लिसरॉल 10%
9 एल 2 बफर Tris 8 पीएच 50 मिमी
EDTA 10 मिमी
एसडीएस 1%
10 Elution बफर 3 NaHCO 100 मिमी
एसडीएस 1%
1 1 धो बफर Tris 20 मिमी
EDTA 2 मिमी एसडीएस 0.10%
एनपी-40 0.50%
NaCl 150 मिमी
12 अंतिम धोने बफर Tris 20 मिमी
EDTA 2 मिमी
एसडीएस 0.10%
एनपी-40 0.50%
NaCl 500 मिमी
13 सेल के माध्यम स्टेम mTESAR टीएम बेसल मध्यम 400 मिलीलीटर
mTESAR टीएम के पूरक 100 मिलीलीटर

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Discussion

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विषाक्तता परीक्षण करने के लिए परंपरागत दृष्टिकोण इस प्रकार के परीक्षण महंगा है और समय लेने वाली बनाने व्यापक जानवरों के अध्ययन शामिल है। इसके अलावा, interspecies मतभेद के कारण पूर्व नैदानिक ​​पशु सुरक्षा अध्ययन मनुष्यों के लिए प्रासंगिक संभावित दवाओं की विषाक्तता प्रभाव की भविष्यवाणी करने के लिए हमेशा मान्य नहीं हैं। गैर मानव प्राइमेट, सबसे उम्मीद के मुताबिक, अभी भी नैतिक रूप से मजबूत हैं और socioeconomical मांगों को तेजी से इन विट्रो परीक्षा में संवेदनशील और मजबूत विकास के लिए आधुनिक समाजों द्वारा की परवरिश कर रहे हैं मानव सुरक्षा के लिए प्रासंगिक प्रणाली।

hESCs के अद्वितीय क्षमता इसलिए दवा सुरक्षा का परीक्षण 6,21 के लिए पारंपरिक तरीकों के लिए एक विकल्प के रूप में प्रस्तावित किया गया है संवेदनशील toxicogenomics दृष्टिकोण के साथ संयोजन में vivo में मानव विकास की प्रक्रिया recapitulating, सभी दैहिक प्रकार की कोशिकाओं में अंतर करने के लिए। 'ESNATS' परियोजना के तहत 'UKK' परीक्षा प्रणाली की भविष्यवाणी करने के लिए विकसित किया गया हैtranscriptomics रूपरेखा के आधार पर विकास भ्रूण विषाक्तता। इस प्रणाली में hESC 14 दिनों के लिए embryoid निकायों में भेदभाव किया गया है। प्राप्त समय गतिज transcriptomics प्रोफाइल आंशिक रूप से जल्दी मानव भ्रूण के विकास पुनरावृत्ति जो दिन में 14 पर तीन जनन स्तर बाहरी झिल्ली, अन्तर्जनस्तर और mesoderm के लिए विशिष्ट भेदभाव मार्कर की उच्च अभिव्यक्ति से पता चलता है। इन परिणामों के आधार पर जाना जाता टेराटोजेनिक दवाओं 14 दिनों के लिए भेदभाव के दौरान उजागर किया गया है और अंतर व्यक्त जीन प्रोफाइल प्राप्त किया गया है। प्रभावशाली, मनुष्यों में मनाया thalidomide के टेराटोजेनिक प्रभाव के साथ जुड़े जीन हस्ताक्षर, इस प्रणाली का परीक्षण 28 से अनुमान लगाया जा सकता है। तंत्रिका तंत्र के विकास से संबंधित प्रतिलेखन कारक के UKK प्रणाली शो एकाग्रता पर निर्भर नीचे नियमन में मिथाइल पारा के लिए प्रतिनिधि का परिणाम है। अन्य विकासात्मक न्यूरो विषैले पदार्थ भी इस प्रणाली में परीक्षण किया गया और प्रयासों की पहचान करने के लिए जा रहे हैंmRNA के स्तर पर यौगिकों भर में आम toxico-मार्करों और प्रोटीन के स्तर पर उन्हें मान्य। यहाँ प्रदान UKK परीक्षण प्रोटोकॉल विकासात्मक विषैला के लिए transcriptomic हस्ताक्षर की पहचान करने के लिए मानव भ्रूण स्टेम सेल H9 के साथ प्रयोग के संचालन के लिए बुनियादी दिशानिर्देश देता है।

UKN1 प्रोटोकॉल के अनुसार स्टेम कोशिकाओं के भेदभाव के लिए अनुकूलित मानक संचालन प्रक्रिया (एसओपी) एनईपी के लिए hESC की एक मजबूत और सिंक्रनाइज़ भेदभाव की अनुमति देता है। पहले से ही भेदभाव के छह दिन बाद, उच्च Pax6 अभिव्यक्ति के स्तर के साथ एक सजातीय सेल की आबादी उत्पन्न होता है। कोशिकाओं immunostaining के द्वारा विश्लेषण की अनुमति जो पक्षपाती संस्कृतियों में बड़े होते हैं। उच्च संकल्प के साथ और confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा Immunocytochemical विश्लेषण कोशिकाओं पतली गिलास सतहों पर हो रहे हैं कि आवश्यकता है। कांच बेहतर लेपित है, तो यह इन संस्कृतियों के लिए संभव है, लेकिन यह कोशिकाओं को एक से अधिक परत में, बहुत घना हो जाना उल्लेखनीय है कि करने की जरूरत हैछह दिनों के बाद। इसलिए, वंश विशेष मार्कर की दिनचर्या विश्लेषण और अधिक आसानी से आर टी-qPCR, चिप या पश्चिमी धब्बा द्वारा किया जाता है। संस्कृतियों के जैव रासायनिक विश्लेषण के लिए एक बड़ा लाभ यह है कि hESC के एक छोटे से प्रारंभिक आबादी से इस भेदभाव प्रोटोकॉल के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है जो कोशिकाओं की उच्च उपज है। इस प्रोटोकॉल में से एक दोष सजातीय तंत्रिका भेदभाव के लिए मजबूर करने के लिए आवश्यक मध्यम आपूर्ति करता है (उदाहरण के लिए, नोगिन) की उच्च लागत है। कुछ अनुप्रयोगों के लिए एक और दोष कुछ छोटे अणुओं (काइनेज अवरोधकों) प्रोटोकॉल के हिस्से के रूप में संस्कृति के माध्यम में उपस्थित रहने की जरूरत है कि हो सकता है। संस्कृति की स्थिति के परिवर्तन भी भेदभाव 29 में परिवर्तन के रूप में इस प्रकार, कुछ संकेत रास्ते, toxicologically की जांच नहीं की जा सकती।

परीक्षा प्रणाली संयोजन का लाभ DNT की बेहतर समझ है। UKK जल्दी रोगाणु परत गठन पर एक व्यापक रेंज और प्रतिकूल प्रभाव को शामिल किया गया जबकि सभी, UKN1 की जांच की जा सकती हैOWS ऐसे epigenetics रूप में और अधिक तंत्रिका-विशिष्ट तंत्र की जांच करने के लिए। कुछ मॉडल 16 विषैले पदार्थ के लिए यहाँ प्रस्तुत दो संस्कृति प्रणालियों के विकास न्यूरोटॉक्सिटी की भविष्यवाणी करने के लिए दिखाया गया है, संभावित विकास neurotoxicants की एक बड़ी संख्या की स्क्रीनिंग की अनुमति है कि प्रोटोकॉल के उच्च throughput संस्करणों के लिए एक की जरूरत अभी भी वहाँ है। इसके अलावा, अधिक काम की पहचान और mRNA या प्रोटीन के स्तर पर विषाक्तता के आम मार्कर के लिए मान्य है, और पूर्व नैदानिक ​​दवा सुरक्षा मूल्यांकन के एक भाग के रूप में उन्हें स्थापित करने के लिए आवश्यक है।

प्रति वर्ष से अधिक $ 20000000000 दवाओं की खोज 39 के लिए दवा उद्योगों से निवेश कर रहे हैं। अवधारणा के एक सबूत के रूप में, हम एक लागत प्रभावी और कम समय लेने वाली ढंग से संभावित दवा यौगिकों के मानव प्रासंगिक विषाक्तता प्रभाव की भविष्यवाणी करने के लिए उपयुक्त हो सकता है कि hESC और transcriptomics के आधार पर इन विट्रो विषाक्तता परीक्षण प्रणाली में विकसित किया है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM/F-12 Life Technologies 11320082 Dulbecco's Modified Eagle Medium:Nutrient Mixture F-12
KOSR Life Technologies 10828028 Knockout Serum Replacement
GlutaMAX Life Technologies 35050061 GlutaMAX supplement
NEAA Life Technologies 11140050 MEM Nonessential Amino Acids Solution
DPBS Life Technologies 14190-0144 Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, without calcium, without magnesium
mTeSR medium Stemcell Technologies 5850
Pluronic F-127 Sigma P2443-250G
V bottom plate VWR 734-0483 Plate,Microwell,V BTTM,96 Well,Sterile 1 * 50 ST
V bottom plate lid VWR 634-0011 Lid, Microtitre plates, Cond. Ring 1 * 50 ST
Pen/Strep Life Technologies 15140-122 Penicillin-Streptomycin, Liquid
Distilled Water Life Technologies 15230-089. Sterile Distilled Water
Human FGF-2 (bFGF) Millipore GF003AF-100UG Fibroblast Growth Factor basic, human recombinant, animal-free
Filter 0.22 μm Millipore SCGPU02RE Stericup-GP, 0.22 μm, polyethersulfone, 250 ml, radio-sterilized
StemPro EZPassageTM Disposablte Invitrogen 23181010
BD MatrigelTM, hESC qualified Matrix Stemcell Technologies 354277 5 ml vial
DMSO Sigma D-2650
RNAlater Stabilization Solution Life Technologies AM7020 It stabilizes and protect the RNA integrity in unfrozen samples.
70 μm Cell Strainer Becton Dickinson 352350 Cell strainer with 70 μm Nylon mesh
35 μm Lid cell strainer, 5 ml tube Becton Dickinson 352235 5 ml polystyrene round bottom test tube, with a cell strainer cap (35 μm)
50 ml sterile Polypropylene tube Greiner Bio-One 227261 50 ml Polypropylene tube with conical bottom, Sterile
T75 flask Greiner Bio-One 658175 CELLSTAR Filter Cap Cell Culture 75 cm2 Flasks
TRIzol Life Technologies 10296010
96 well optical bottom plates Thermo Scientific 165305
CellTiter-Blue Promega G8081
Accutase PAA L11-007
Apotransferin Sigma-Aldrich T-2036
Dispase Worthington Biochemicals LS002104
Dorsomorphin Tocris Bioscience 3093
EDTA Roth 8043.2
FBS PAA A15-101
FGF-2 R&D Systems 233-FB
Gelatine Sigma-Aldrich G1890-100G
Glucose Sigma-Aldrich G7021-100G
GlutaMAX Gibco Invitrogen 35050-038
HEPES Gibco Invitrogen 15630-056
Insulin Sigma-Aldrich I-6634
Knockout DMEM Gibco Invitrogen 10829-018
Matrigel BD Biosciences 354234
Noggin R&D Systems 719-NG
PBS Biochrom AG L1825
Progesteron Sigma-Aldrich P7556
Putrescine Sigma-Aldrich P-5780
ROCK inhibitor Y-27632 Tocris Biosciences 1254
SB431542 Tocris Biosciences 1614
SDS Bio-Rad 161-0416
Selenium Sigma-Aldrich S-5261
β-Mercaptoethanol Gibco Invitrogen 31350-010
Name Company Catalog Number Comments
List of Kits
RNeasy Mini Kit (250) QIAGEN 74106
GeneChip Hybridization, Wash, and Stain Kit Affymetrix 900721, 22, 23 This kit provides all reagents required for hybridization wash and staining of microarrays.
Rnase-Free DNase Set QIAGEN 79254
Name Company Catalog Number Comments
List of equipment
Inverted microscope Olympus IX71
Genechip Hybridisation Oven - 645 Affymetrix
Genechip Fluidics Station-450 Affymetrix
Affymetrix Gene-Chip Scanner-3000-7 G Affymetrix
Spectramax M5 Molecular Devices
 
 
 
Name Company Catalog Number Comments
List of softwares
Prism 4
Affymetrix GCOS
Partek Genomic Suite 6.25
Online tools for Functional annotation
DAVID
Onto-tools Intelligent Systems and Bioinformatics Laboratory

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References

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Shinde, V., Klima, S., Sureshkumar, P. S., Meganathan, K., Jagtap, S., Rempel, E., Rahnenführer, J., Hengstler, J. G., Waldmann, T., Hescheler, J., Leist, M., Sachinidis, A. Human Pluripotent Stem Cell Based Developmental Toxicity Assays for Chemical Safety Screening and Systems Biology Data Generation. J. Vis. Exp. (100), e52333, doi:10.3791/52333 (2015).More

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