Protokollene beskriver to in vitro utviklingstoksisitetstestsystemer (UKK og UKN1) basert på humane embryonale stamceller og transkriptom studier. De testsystemer forutsi menneskelig utviklingstoksisitet farer, og kan bidra til å redusere dyrestudier, kostnader og den tiden som kreves for kjemisk sikkerhetstesting.
Effektive protokoller for å skille menneskelige pluripotente stamceller til ulike vev i kombinasjon med -omics teknologier åpnet nye horisonter for in vitro toksisitet testing av potensielle narkotika. Å gi et solid vitenskapelig grunnlag for slike analyser, vil det være viktig å få kvantitativ informasjon om tidsforløpet av utvikling og på de underliggende reguleringsmekanismer av systembiologi tilnærminger. To analyser er derfor innstilt her for disse kravene. I UKK testsystemet, er humane embryonale stamceller (hESC) (eller andre pluripotente celler) igjen å spontant skille i 14 dager i embryoide legemer, for å tillate generering av celler av alle tre bakterie lag. Dette systemet sammenfatter viktige trinn i tidlig human embryoutvikling, og det kan forutsi human-spesifikke tidlig embryotoksisitet / teratogenisitet, hvis cellene er utsatt for kjemikalier under differensiering. Den UKN1 testsystemet er basert på hESC differensiere til en population av neuroectodermal stamfar (NEP) celler for 6 dager. Dette systemet sammenfatter tidlig neural utvikling og spår tidlig utviklings neurotoxicity og epigenetiske endringer utløst av kjemikalier. Begge systemene, i kombinasjon med transcriptome microarray undersøkelser, er egnet til å identifisere toksisitet biomarkører. Dessuten kan de anvendes i kombinasjon for å generere inngangsdata for systemer biologi analyse. Disse testsystemer har fordeler i forhold til tradisjonelle toksikologiske studier som krever store mengder av dyr. Test systemer kan bidra til en reduksjon av kostnadene for legemiddelutvikling og kjemisk sikkerhetsvurdering. Deres kombinasjon belyser spesielt på forbindelser som kan påvirke neurodevelopment spesifikt.
Muligheten av humane embryonale stamceller (hESC) for å skille ut ulike typer celler åpnet opp en ny æra av in vitro toksisitet testing 1, sykdom modellering og regenerativ medisin 2. Stamcellene er utstyrt med kapasitet til å kopiere seg selv, for å holde deres pluripotent tilstand, og for å skille ut spesialiserte celler 3,4. Egenskapene til hESC (evne til å differensiere til alle viktige celletyper) er også funnet i andre humane pluripotente stamceller, som menneskeskapte pluripotente stamceller (hiPSC) eller celler som genereres av kjerneoverføring 5. For eksempel har mange forskjellige hESC linjer blitt differensiert i nevroner 6, nyreceller 7, neural crest cellene 8 kardiomyocytter 9-12, eller hepatocytter som celler 13,14. Videre kan hESC spontant differensiere i celler av alle tre bakterie lag 15-18 i embryoid organer (EBS) 19,20. Early embryoutvikling er regulert av differensial uttrykk for ulike gener knyttet til de ulike bakterie lag som har blitt fanget på mRNA nivå ved transcriptomics bruker mikromatriseteknologi 15. Dette arbeidet resulterte i etableringen av organspesifikke toksikologiske modeller basert på hESC / hiPSC og transcriptomics analyse (for oversikt se 21,22). Disse modellene har fordeler fremfor den tradisjonelle bruken av forsøksdyr i toksikologiske studier, som prekliniske studier med forsøksdyr er ikke alltid logisk for menneskelig sikkerhet. Stoffet indusert toksisitet oppstått hos pasienter er ofte relatert til metabolske eller signalprosesser som skiller mellom mennesker og forsøksdyr. Arten Forskjellen har forhindret pålitelig deteksjon av tidlig utviklingstoksisitet hos mennesker, og for eksempel medikamenter som thalidomid 23,24 og 25,26 dietylstilbestrol ble trukket tilbake fra markedet på grunn av teratogenisitet. Thalidomide har ikke vist noen utviklingstoksisitet i rotter eller mus. Miljø kjemikalier som metylkvikksølv 27 resulterte i prenatal utviklingstoksisitet når det gjelder nervesystemet i en rekke arter, men humane manifestasjoner har vært vanskelig å modellere i dyr. For å løse problemet med artsspesifisitet problemer, forskere som arbeider under ulike prosjekter basert på stamceller som ReProTect, ESNATS, DETECTIVE etc. er engasjert i utvikling av ulike modeller for embryotoksisitet, nevrotoksisitet, kardiotoksisitet, levertoksisitet og nefrotoksisitet ved hjelp av menneskegiftstoffer som mistenkes å påvirke mennesker. Under det europeiske konsortiet prosjektet "Embryonic Stem cellebasert Novel Alternative Testing Strategies (ESNATS)« Det er etablert fem testsystemer. En test system såkalt UKK (U niversitäts k linikum K OLN) test system delvis fanger tidlig menneskelig embryoutvikling. I denne system humane embryonale H9 celler er differensiert i tre bakterie lag (ektoderm, endoderm og mesoderm) 15 og bakterie lag spesifikke signaturer har blitt fanget av transcriptomics profil med Affymetrix microarray plattform. Ulike utviklingsgiftstoffer som thalidomid 28, valproinsyre, metylkvikksølv 16,17, eller cytosinarabinosid 15 har blitt testet i dette systemet, og toxicant bestemt gen signaturer er oppnådd. I en andre test-system, det såkalte UKN1 (U niversity av K onsta n z) testsystem 1, er H9-celler differensieres til neuroectodermal progenitorceller (NEP) i 6 dager. Dette er dokumentert av høy ekspresjon av nevrale genmarkører som Pax6 og OTX2. Under differensiering i 6 dager, har NEP celler vært utsatt for utviklings nevro-miljøgifter som VPA, metylkvikksølv. Giftstoff-spesifikke de-regulert transcriptomics profiler har vært obtainert som godt ved hjelp av Affymetrix microarray plattform 16,29.
Den nye visjonen for toksikologi av det 21. århundre ser for seg at testsystemer ikke bare gi fenotypiske beskrivelser som histopatologi in vivo, eller transkriptom endringer på slutten av langsiktige toxicant inkuberingene. Det foreslår heller at analysene gir mekanistisk informasjon 3, og at denne informasjonen kan tilordnes til såkalte uønskede utfall trasé (AOP) som gir en vitenskapelig begrunnelse for skadelige effekter 30. Å gi slik informasjon, testsystemer anvendes må være høyt kvalitetskontrollert 31, som for eksempel dokumentert av robuste standarddriftsprosedyrer. Videre tidsavhengige endringer må kartlegges med høy oppløsning. Dette krever testsystemer med synkroniserte endringer 32. De UKN1 og UKK testsystemer som er beskrevet her har blitt optimalisert for disse kravene.
Tradisjonelle tilnærminger til toksikologisk testing bære omfattende dyreforsøk dermed gjøre testing kostbart og tidkrevende. Dessuten, på grunn av den artsforskjellene de prekliniske dyresikkerhetsstudier er ikke alltid er gyldig for å forutsi giftvirkninger av potensielle legemidler som er relevant for mennesker. Selv om ikke-menneskelige primater er mest forutsigbare, fortsatt sterk etisk og socioeconomical krav raskt øke ved moderne samfunn for å utvikle følsom og robust in vitro test Sy…
The authors have nothing to disclose.
We thank M. Kapitza, Margit Henry, Tamara Rotshteyn, Susan Rohani and Cornelia Böttinger for excellent technical support. This work was supported by grants from the German Research Foundation (RTG 1331) and the German Ministry for Research (BMBF).
DMEM/F-12 | Life Technologies | 11320082 | Dulbecco's Modified Eagle Medium:Nutrient Mixture F-12 |
KOSR | Life Technologies | 10828028 | Knockout Serum Replacement |
GlutaMAX | Life Technologies | 35050061 | GlutaMAX supplement |
NEAA | Life Technologies | 11140050 | MEM Nonessential Amino Acids Solution |
DPBS | Life Technologies | 14190-0144 | Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, without calcium, without magnesium |
mTeSR medium | Stemcell Technologies | 5850 | |
Pluronic F-127 | Sigma | P2443-250G | |
V bottom plate | VWR | 734-0483 | Plate,Microwell,V BTTM,96 Well,Sterile 1 * 50 ST |
Vbottom plate lid | VWR | 634-0011 | Lid, Microtitre plates, Cond. Ring 1 * 50 ST |
Pen/Strep | Life Technologies | 15140-122 | Penicillin- Streptomycin, Liquid |
Distilled Water | Life Technologies | 15230-089. | Sterile Distilled Water |
Human FGF-2 (bFGF) | Millipore | GF003AF-100UG | Fibroblast Growth Factor basic, human recombinant, animal-free |
Filter 0.22 μm | Millipore | SCGPU02RE | Stericup-GP, 0.22 μm, polyethersulfone, 250 ml, radio- sterilized |
StemPro EZPassageTM Disposablte | Invitrogen | 23181010 | |
BD MatrigelTM, hESC qualified Matrix | Stemcell Technologies | 354277 | 5 ml vial |
DMSO | Sigma | D-2650 | |
RNAlater Stabilization Solution | Life Technologies | AM7020 | It stabilizes and protect the RNA integrity in unfrozen samples. |
70 μm Cell Strainer | Becton Dickinson | 352350 | Cell strainer with 70 μm Nylon mesh |
35 μm Lid cell strainer, 5 ml tube | Becton Dickinson | 352235 | 5 ml polystyrene round bottom test tube, with a cell strainer cap (35 μm) |
50 ml sterile Polypropylene tube | Greiner Bio-One | 227261 | 50 ml Polypropylene tube with conical bottom, Sterile |
T75 flask | Greiner Bio-One | 658175 | CELLSTAR Filter Cap Cell Culture 75 cm2 Flasks |
TRIzol | Life Technologies | 10296010 | |
96 well optical bottom plates | Thermo Scientific | 165305 | |
CellTiter-Blue | Promega | G8081 | |
Accutase | PAA | L11-007 | |
Apotransferin | Sigma-Aldrich | T-2036 | |
Dispase | Worthington Biochemicals | LS002104 | |
Dorsomorphin | Tocris Bioscience | 3093 | |
EDTA | Roth | 8043.2 | |
FBS | PAA | A15-101 | |
FGF-2 | R&D Systems | 233-FB | |
Gelatine | Sigma-Aldrich | G1890-100G | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-100G | |
GlutaMAX | Gibco Invitrogen | 35050-038 | |
HEPES | Gibco Invitrogen | 15630-056 | |
Insulin | Sigma-Aldrich | I-6634 | |
Knockout DMEM | Gibco Invitrogen | 10829-018 | |
Matrigel | BD Biosciences | 354234 | |
Noggin | R&D Systems | 719-NG | |
PBS | Biochrom AG | L1825 | |
Progesteron | Sigma-Aldrich | P7556 | |
Putrescine | Sigma-Aldrich | P-5780 | |
ROCK inhibitor Y-27632 | Tocris Biosciences | 1254 | |
SB431542 | Tocris Biosciences | 1614 | |
SDS | Bio-Rad | 161-0416 | |
Selenium | Sigma-Aldrich | S-5261 | |
β-Mercaptoethanol | Gibco Invitrogen | 31350-010 | |
List of Kits | |||
RNeasy Mini Kit (250) | QIAGEN | 74106 | |
GeneChip Hybridization, Wash, and Stain Kit | Affymetrix | 900721, 22, 23 | This kit provides all reagents required for hybridization wash and staining of microarrays. |
Rnase-Free DNase Set | QIAGEN | 79254 | |
List of equipment. | |||
Inverted microscope | Olympus | IX71 | |
Genechip Hybridisation Oven – 645 | Affymetrix | ||
Genechip Fluidics Station-450 | Affymetrix | ||
Affymetrix Gene-Chip Scanner-3000-7 G | Affymetrix | ||
Spectramax M5 | Molecular Devices | ||
List of softwares | |||
Prism 4 | |||
Affymetrix GCOS | |||
Partek Genomic Suite 6.25 | |||
Online tools for Functional annotation DAVID Onto-tools Intelligent Systems and Bioinformatics Laboratory |