Summary
Un intero test marcatura già cella con Burkholderia sartisoli RP037-Mche è stato sviluppato per rilevare frazioni di un contaminante organico (cioè, fluorene) disponibile per la degradazione batterica dopo trasporto attivo da miceli ponte pori pieni d'aria in un sistema modello insaturo acqua.
Introduction
Suolo è densamente popolato da una vasta gamma di microrganismi come batteri 1,2. Tuttavia, le condizioni in questo habitat sono impegnativi, soprattutto in termini di disponibilità di acqua 3. I batteri in modo permanente devono cercare le condizioni ottimali in ambienti eterogenei 4, ma l'assenza di film d'acqua continuo si traduce in mobilità limitata 5 ostacolando loro di diffondersi liberamente. Inoltre, i tassi di diffusione di soluti (ad esempio, nutrienti) sono abbassati in condizioni insaturi 6. Così, batteri e sostanze nutrienti sono spesso separati fisicamente e l'accessibilità dei nutrienti è limitato a 3. Di conseguenza, un vettore di trasporto per i composti chimici che non richiede un acqua-fase continua potrebbe contribuire a superare queste limitazioni. In realtà, molti microrganismi, come funghi e oomiceti hanno sviluppato una forma di crescita filamentosa che permette loro di crescere attraverso pori pieni d'aria e raggiungere in tal modo mobilizing anche fisica nutrienti 7 e 8 sostanze carboniose separato su lunghe distanze. Essi possono anche fungere da vettori di trasporto biologici che forniscono zuccheri e altre fonti di energia ai batteri 9. Assorbimento e trasporto in organismi miceliari è stato anche dimostrato di inquinanti organici idrofobici come gli idrocarburi policiclici aromatici (IPA) in Pythium ultimum 10 o nei funghi micorrizici arbuscolari 11. Dal PAH sono contaminanti solubili in acqua onnipresenti e scarsamente 12 nel suolo, trasporti miceli mediata potrebbe contribuire ad aumentare la biodisponibilità dei contaminanti per i potenziali degraders batteriche. Considerando che l'importo totale del trasporto inquinante può essere quantificato direttamente chimica significa 10, la biodisponibilità dei contaminanti trasportati da miceli a batteri degradanti e altri organismi non può essere valutata facilmente.
Il protocollo che segue presenta un metodo per valutare l'impatto di MyCelia sulla biodisponibilità contaminante degraders batteriche in modo diretto; permette la raccolta di informazioni sull'impatto spazio-temporale dei contaminanti sugli ecosistemi microbici. Descriviamo come impostare un elaborato sistema di microcosmo insaturo imitando interfacce aria-acqua nel suolo collegando una sorgente puntiforme PAH separati fisicamente con PAH-degradanti marcatura già batteri tramite vettori di trasporto miceliari. Poiché è escluso il trasporto aereo, l'effetto del trasporto miceliale basata sulla PAH biodisponibilità dei batteri può essere studiata in modo isolato. Più in dettaglio, tre anelli PAH fluorene, l'organismo miceliale Pythium ultimum e la marcatura già batterio Burkholderia sartisoli RP037-Mche 13 sono stati applicati nelle configurazioni microcosmo descritti. Il batterio B. sartisoli RP037-Mche è stato originariamente costruito per studiare flussi fenantrene alla cella 14 ed esprime migliorati proteina fluorescente verde (eGFP) per effetto del flusso di PAHla cella, mentre il rosso fluorescente mCherry è espressa costitutivamente. Informazioni dettagliate sulla costruzione giornalista è data da Tecon et al. 13 Nei test preliminari, il batterio non ha rivelato alcuna nuoto e solo molto lenta capacità sciamatura. Era in grado di migrare lentamente ife di Pythium ultimum quando applicato come una sospensione densa sopra il ife. Poiché i batteri sono stati incorporati in agarosio nella seguente protocollo, migrazione ife non si è verificato.
Utilizzando microscopio confocale a scansione laser (CLSM), i batteri marcatura già possono essere visualizzati direttamente in microcosmi ed espressione di eGFP possono essere quantificati in relazione alla quantità di cellule (proporzionale al segnale mCherry) con l'aiuto del ImageJ software. Questo permette di confrontare biodisponibilità qualitativamente in diversi scenari (cioè, superiore o inferiore). FLU è risultato essere biodisponibile dopo trasporto micelio di P. ultimum (cioè,era superiore a quello di un controllo negativo). Inoltre, il protocollo descrive come quantificare l'ammontare totale del trasporto miceli mediato tramite mezzi chimici e verificare la biodisponibilità dei contaminanti con fibre di vetro siliconato (fibre SPME) in microcosmi identici. I risultati con questa configurazione microcosmo sono stati pubblicati e discussi per la combinazione di P. ultimum, fluorene e B. sartisoli RP037-Mche 15. Qui, l'attenzione si concentra sulla descrizione metodo dettagliato e l'individuazione di potenziali insidie del protocollo di fornire questa conoscenza per i potenziali ulteriori applicazioni. Ulteriori applicazioni possono coinvolgere vari fungine, specie batteriche (ad esempio, da siti contaminati), e altri contaminanti (ad esempio, i pesticidi) o contaminante di alimentazione (ad esempio, i terreni di età).
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Protocol
1. Preparazione di piatti, Scivoli e incubazione Chambers
- Preparare il seguente materiale per ogni microcosmo: un grande plastico Petri fondo piatto (d = 10 cm), uno modificato (vedi punto 1.2) piccolo plastica Petri fondo piatto (d = 5 cm) con coperchi e un conteggio vetrino da camera con tre cavità.
- Prendete il numero desiderato di Petri parti inferiori piatto (d = 5 cm). Rimuovere parte della tesa con una sega per adattarsi esattamente una diapositiva (26 mm di bordo). Per sterilizzare il sistema, immergere Petri fondo piatto e coperchi in etanolo al 70% O / N e asciugare per almeno 2 ore in un armadio di flusso ai raggi UV. Conservare le piastre di Petri in un contenitore di plastica ermeticamente sigillato, che era stato anche esposto a luce UV per 2 h.
- Pulire il numero desiderato di diapositive con il 70% di etanolo e asciugare all'aria. Avvolgere diapositive in carta stagnola e metterli in un forno a muffola per 5 ore a 450 ° C per rimuovere eventuali contaminazioni. Preparare camere di incubazione di vetro con coperchi. Pulire con il 70% di etanolo e esporre le camere aperte a luce UV per almeno 2 ore in un armadio di flusso.
NOTA: grandi essiccatori (diametro circa 30 cm) con coperchi può essere utilizzato per questo scopo; ogni essiccatore può ospitare fino a dieci configurazioni microcosmo.
2. Preparazione di mezzi e culture
- Per eseguire 20 microcosmi paralleli, ottenere 100 ml di modifica medio triptone-lievito (MTY) 14, circa 150 ml di 21C minima media 16 (MM), 5 ml di minima agar (MMA, 0,5%, w / v), tre piastre di agar destrosio di patata (PDA, 1,5%, w / v) per P. ultimum, quattro piastre vuote, una piastra PDA contenente 2 mg L -1 cicloeximide, quattro piastre di agarosio (3%, w / v) contenente 0,3 g ml -1 carbone attivo e 40 mg di influenza in 2 porzioni mg.
- Preparare Mty contenente 50 mg L -1 di kanamicina (kanamicina è required a mantenere il eGFP giornalista plasmide) e MM contenente acetato di 10 mm per la coltivazione batterica. Utilizzare MM, senza acetato per preparare 0,5% MMA per l'immobilizzazione dei batteri nei microcosmi e versare piastre (ogni 20 ml) di 1,5% PDA per la coltivazione di Pythium ultimum e microcosmo configurazioni.
- Seminare alcuni ife di P. ultimum su tre piastre PDA freschi e incubare al buio a 25 ° C per circa 72 ore. Allora sì che le piastre sono ricoperte completamente di micelio fresco e soffice.
- Inizia due culture di B. sartisoli RP037-Mche in 50 ml di MTY da un stock di glicerolo. Incubare a 30 ° C con 230 giri movimento pallone rotante O / N.
- Densità cultura Misura ottica (OD) a 578 nm e centrifugare a 1000 xg per 10 minuti (per B. sartisoli RP037-Mche, l'OD atteso 578 è di circa 1,0 e le cellule sono in fase esponenziale). Gettare il surnatante e risospendere le cellulein una quantità appropriata di MM raggiungere un OD 578 di 0,4. Seminare 20 ml di MM contenenti 50 mg L -1 kanamicina con 400 ml di cellule risospese. Incubare a 30 ° C con 230 giri movimento pallone rotante O / N.
- Misura 578 OD della cultura in MM (per B. sartisoli RP037-Mche, l'OD atteso 578 è di circa 0,2 e le cellule sono in fase iniziale esponenziale). Cultura Centrifugare a 2.000 xg per 10 min e risospendere le cellule in una quantità appropriata di MM a raggiungere un diametro di 0,4. Mescolare 50 ml di sospensione cellulare con 500 ml di caldo, liquido MMA in 2 ml provette e conservare a 50 ° C fino utilizzo. Utilizzare 150 ml di cellule in MMA per ogni microcosmo.
- Versare in piastre di gel di agarosio contenente carbone attivo. Melt agarosio (3%; w / v) in acqua bidistillata. Mescolare accuratamente con carboni attivi (0,3 g ml -1) e versare la miscela in piastre di Petri di plastica(D = 10 cm).
3. Microcosmo di montaggio
NOTA:. L'impostazione microcosmo completo è illustrato schematicamente nella figura 1, fare riferimento alla Figura 1 per tutti i successivi singoli passi. Le seguenti operazioni descrivono la preparazione di un campione (SAM) con i vettori di trasporto miceliari e tre differenti configurazioni di controllo (CON AIR, CON NEG, CON POS). Una sintesi di tutte le diverse configurazioni si trovano nella tabella 1.
- Prendere numero desiderato di piastre di Petri e scivoli ed esporli ai raggi UV sotto un armadietto di flusso per 30 min.
- Posizionare la piccola scatola di Petri all'interno della grande e adattare la diapositiva attraverso la fessura della piccola scatola di Petri. Prendere un campione di sospensione cellulare caldo in MMA e aggiungere 150 ml nella cavità centrale di una diapositiva. Ripetere questa operazione fino a quando le cavità centrali di tutte le diapositive sonopieno di MMA. Attendere 5 min per il MMA solidificare.
- Utilizzare da 1 cm sonda di carotaggio a pugni le patch circolare da una piastra PDA vuoto. Collocare un cerotto ad una distanza di 2 mm accanto MMA all'interno del piccolo piatto Petri. Aggiungere questo per promuovere la crescita del micelio nella configurazione (PDA 3 nella figura 1).
- Tagliare patch curve PDA come barriere meccaniche. Utilizzare una parte inferiore piccola scatola di Petri pulita e sterile e premere in un piatto di PDA. Utilizzare una spatola per tagliare un altro anello più piccolo ad una distanza di 0,5 cm in agar che si traduce in un PDA-ring.
- Tagliare un pezzo, che si inserisce esattamente nella fessura del piccolo piatto Petri nella configurazione microcosmo e posizionarlo all'interno del gap superiore della diapositiva. Assicurarsi che la distanza tra il MMA e la barriera PDA circolare è circa 2 mm. Chiudere il coperchio della piccola scatola di Petri premendo delicatamente nella barriera PDA.
- Ripetere i punti 3.4 e 3.4.1 con un piatto PDA contenente 2 g L -1di cicloesimide.
NOTA: Questa è l'impostazione di controllo per il trasporto per via aerea (CON AIR) verso le cellule marcatura già, poiché miceli sono inibiti dal cicloeximide e non invadere MMA.
- Utilizzare da 1 cm sonda di carotaggio a pugni le patch circolari di un piatto PDA vuoto. Utilizzare un altro 0,5 centimetri sonda di carotaggio per tagliare la metà del primo patch. Posizionare la risultante piccola PDA-ring ad una distanza di 1 mm vicino alla barriera PDA (PDA 1 nella Figura 1).
- Aggiungere 2 mg di influenza nel foro di PDA 1. Utilizzare da 1 cm sonda di carotaggio per tagliare le patch circolari da lastre PDA ricoperte di P. ultimum e mettere un cerotto (PDA 2 in Figura 1) inferiore verso il basso sull'anello PDA in modo che il tappetino del micelio sia rivolta verso i cristalli influenza.
- Ripetere il passaggio precedente, senza l'aggiunta di cristalli di influenza.
NOTA: Questa è l'impostazione di controllo negativo (CON NEG) per determinare sfondofluorescenza delle cellule marcatura già.
- Ripetere il passaggio precedente, senza l'aggiunta di cristalli di influenza.
- Utilizzare da 1 cm sonda di carotaggio a pugni le patch circolari dal agar contenente carbone attivo. Mettere quattro patch in ogni configurazione microcosmo di diminuire ulteriormente la concentrazione FLU gassosa (Figura 1).
- Preparare un controllo positivo (CON POS). Aggiungere alcuni cristalli FLU a 200 ml di sospensione cellulare MMA e metterlo in una cavità di una sagoma vuota.
- Inserire un piatto Petri (d = 10 cm) con una certa polvere di carbone attivo sul fondo della camera di incubazione per minimizzare la concentrazione FLU gassosa nella camera. Inoltre, posizionare 04:56 50 ml bicchieri con acqua sterile sul fondo per mantenere alta umidità nella camera.
- Trasferire configurazioni microcosmo in camere di incubazione e incubare a 25 ° C per 96 ore. I campioni in modo casuale nelle diverse camere di crescita per escludere effetti di localizzazione.
NOTA: Questa volta ap incubazioneveli alla oomicete P. ultimum. Potrebbe essere diverso per altri organismi.
- Trasferire configurazioni microcosmo in camere di incubazione e incubare a 25 ° C per 96 ore. I campioni in modo casuale nelle diverse camere di crescita per escludere effetti di localizzazione.
4. Microscopia confocale a scansione laser
- Idealmente utilizzare un setup CLSM con il microscopio in posizione verticale.
NOTA: Può essere equipaggiato con i laser tradizionali offrendo ad esempio, 488, 561 e 633 linee di nm per l'eccitazione o con una sorgente laser sintonizzabile bianco. - Utilizzare le seguenti impostazioni per la raccolta di immagini: Eccitazione: 490 nm (eGFP) e 585 nm (mCherry) presso l'intensità del laser appropriata (eccitazione simultanea); gamme di emissione: da 500 a 550 nm (eGFP) e 605-650 nm (mCherry); obiettivo obiettivo: 63X NA 0.9 immersible acqua (a causa della sua lunga distanza di lavoro); passo per z-stack: 0.5 micron.
- Configurazione aperta microcosmo e usare un bisturi per rimuovere PDA 1, 2, 3 e la barriera PDA. Mettere un vetrino di vetro sulla parte superiore del MMA e premerlo delicatamente per rimuovere le bolle d'aria. Mount vetrino sul palco microscopio. Aggiungere una goccia d'acqua sopra thcopertura e di slittamento e utilizzare le impostazioni mCherry per trovare le cellule marcatura già nel campione.
- Prendi una rapida panoramica del campione e ottimizzare rapporto segnale-rumore con un bagliore-over-under tabella di ricerca per il rosso (mCherry) e verde (eGFP) del canale. Scegliete una posizione casuale sul campione da analizzare marcatura già fluorescenza.
NOTA: ife può mostrare autofluorescenza nel range di emissione di marcatura già (ad esempio, l'autofluorescenza verde) 17. Assicurarsi di selezionare le aree senza ife se questo è il caso. - Definire e registrare z-stack per ogni posizione nel verde (eGFP) e la (mCherry) canale rosso. Evitare sbiancamento del campione dalla lunga esposizione alla luce epifluorescenza o luce laser.
- Ripetere il passaggio precedente per dieci casuali, posizioni uniformemente distribuiti.
- Ripetere tutti i passi con le stesse impostazioni per tutti i campioni della pista di prova (SAM), CON AIR, CON NEG e CON POS. Analisi 5. Immagine
- Assicurarsi di installare il plugin logi_tool (http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/4.4.10/).
- Apri il file in ImageJ. Selezionare "canali Split" e vicino canale verde. Utilizzare la macro 'zona mCherry' fornito come file di codice aggiuntivo per quantificare area di fluorescenza rossa in z-stack. Regolare le impostazioni preferite nella macro (indicata in grassetto).
- L'uscita è una tabella con i pixel misurati sopra soglia (e la dimensione minima sopra definita) nello stack z.
NOTA: La somma di tutti i valori è il numero totale di pixel rossi (area) nello stack.
- L'uscita è una tabella con i pixel misurati sopra soglia (e la dimensione minima sopra definita) nello stack z.
- Apri il file in ImageJ. Selezionare "canali Split" e vicino canale rosso. Utilizzare la macro 216; eGFP int 'fornito come file di codice aggiuntivo per quantificare l'intensità di fluorescenza verde in pila z. Regolare le impostazioni preferite nella macro (indicata in grassetto).
- L'uscita è un tavolo con intensità media e l'area di tutti gli oggetti verdi sopra soglia (e soprattutto la dimensione minima definita) in z-stack. Per calcolare l'intensità totale di pixel verdi in pila, moltiplicare ciascuna intensità per la superficie corrispondente significa.
- Calcolare l'induzione relativo eGFP (eGFP rel):
(1)
NOTA: Poiché mCherry è espresso costitutivamente, il valore risultante di eGFP rel è una misura relativa per la quantità di eGFP espressa da una certa quantità di cellule. Si prega di fare riferimento anche alla Tabella 3 per ulteriori informazioni sul calcolo di eGFP rel. - Avvolgere 15 fiale ml in vetro, 1 ml GC fiale / MS e inserti in alluminio. Riempire evaporazione piatti con Na 2 SO 4; posizionare tutti in muffola per 5 ore a 450 ° C per rimuovere possibili contaminazioni. Conservare il Na 2 SO 4 all'interno di un essiccatore attivato.
- Tagliare PDMS fibre di vetro rivestito in 0,5 cm di lunghezza. Lavare fibre agitando quattro volte 2 ore in metanolo fresco. Ripetere il lavaggio passaggi altre quattro volte con acqua ultrapura e memorizzare fibre pure in acqua ultrapura in un flaconcino di vetro sigillato.
- Preparare 1,5 L di toluene / acetone (3: 1, v / v) contenente 10 mg L -1 fenantrene-d 10.
- Eseguire i passaggi 1, 2 e 3 del protocollo. Preparare microcosmi senza BIORcellule eporter per studiare il trasporto FLU (SAM (-) e CON AIR (-)) e con le cellule di marcatura già (SAM) per verificare il degrado FLU.
- Opzionali (senza celle marcatura già): Luogo tre PDMS rivestite in fibra di vetro (di solito utilizzati per esperimenti SPME) come artificiale e quantificabile lavandino contaminante all'interno MMA di SAM (-) utilizzando una pinza sottile.
- Rimuovere fibre di vetro con una pinza sottile e trasferire ognuno in un GC / MS flacone con inserto.
- Aggiungere 200 ml di toluene e scuotere verticalmente O / N e analizzare mediante GC / MS. Utilizzare le impostazioni di cui alla tabella 2.
- Trasferire MMA dalla cavità centrale in un flaconcino di vetro da 15 ml e aggiungere circa tre spatole di Na 2 SO 4. Mescolare bene con una spatola e aggiungere 10 ml di solvente. Vortex la miscela e agitare orizzontalmente O / N nel buio.
- Trasferire 1001; l di campione in GC / MS flacone con inserto. Aggiungere 10 ml di acenaftilene-D 08 (10 mg L -1) e analizzare tramite GC / MS con lo stesso programma, come descritto al punto 6.4.3.
NOTA: Per analizzare rosso (mCherry) e verde (eGFP) fluorescenza nelle z-stack registrati, tra le altre opzioni del software ImageJ free 18 (http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html) può essere utilizzato.
(1) NOTA: impostazioni Microcosmo possono anche essere utilizzati per eseguire la quantificazione chimica degli importi INFLUENZA traslocati con o senza un dissipatore contaminante abiotico.
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Representative Results
I risultati presentati qui sono già stati pubblicati in precedenza 15. Consultare l'articolo per la discussione dettagliata meccanicistica e ambientale.
Dopo la registrazione dell'immagine mediante CLSM, una sporgenza massima intensità può essere effettuato utilizzando il rispettivo software microscopio o ImageJ per ottenere una prima impressione visiva del campione ei controlli (Figura 2). Più tardi, i set di dati possono essere proiettati in modo diverso al fine di mostrare le caratteristiche significative di software specifici di visualizzazione. Il controllo positivo (CON POS) mostra induzione distinta eGFP (Figura 2A), mentre il controllo di bordo (CON AIR) presenta solo sfondo eGFP fluorescenza (Figura 2B). eGFP fluorescenza nel campione (SAM) sembra essere elevata rispetto a CON AIR, yet non così marcato come CON POS (Figura 2C). La fluorescenza mCherry è indipendente dalla degradazione degli IPA e quindi simile per tutti i campioni. Tuttavia, segnali leggermente elevata eGFP non vengono rilevate da questo metodo e successiva analisi dell'immagine è essenziale.
Per i microcosmi testati, ispezione visiva è stato integrato da analisi di immagine e calcolo dell'induzione eGFP relativa (cfr punto 5 e seguenti del protocollo; Figura 3). La fluorescenza verde per non-indotta B. sartisoli RP037-Mche è calcolata CON NEG. Nelle condizioni date, la relativa induzione eGFP è risultato rel eGFP = 0.53. Nessuna differenza significativa è stata rilevata tra CON NEG e CON AIR (rel eGFP = 0.54; p> 0.95) escludendo così qualsiasi trasporto FLU fase vapore verso le cellule marcatura già. Per CON POS, molto elevata induzione eGFP (eGFP rel = 53,7) è risultato che conferma la vitalità delle cellule in MMA dopo 96hr e rappresenta la massima induzione eGFP. In presenza di miceli e FLU (SAM), eGFP è stata indotta nelle cellule significativamente rispetto ai controlli negativi (rel eGFP = 1.15; p <0.001). Tuttavia, l'induzione eGFP è relativamente basso rispetto al controllo positivo (vedi tabella 3, punto 8).
Trasporto di FLU da miceli di P. ultimum nel setup microcosmo è stato quantificato chimicamente (cfr passaggio 6 e seguenti del protocollo, figura 4). In presenza di influenza e P. ultimum (SAM (-)), micelio transsituata a circa 25ng di FLU entro 96hr che equivale a un tasso di trasporto di 37.5pmold -1 cm -1. Controlli in assenza di miceli (CON AIR (-)) rivelato trasporto INFLUENZA gassoso nel MMA nell'intervallo solo 2NG entro 96hr, cioè, l'induzione della marcatura già dalla fase vapore concentrazioni potrebbe essere esclusa. Quando B.sartisoli RP037-Mche era presente (SAM), <1ng di FLU è stato rilevato nella patch MMA. Questo efficace degradazione batterica INFLUENZA verificato successivamente alla traslocazione miceli-mediata.
È possibile studiare l'influenza della degradazione batterica, cioè, di un lavandino FLU, di influenza traslocazione aggiungendo un lavello contaminante abiotico al sistema (cfr passo 6.4.1 ff del protocollo). Così, si è in grado di quantificare la quantità di influenza assorbita dalle fibre e l'importo lasciato all'interno del MMA e ife sovrastante. Per SAM(-), L'importo totale traslocato è indipendente dalla presenza di un lavandino contaminante (p> 0,9; Figura 5A). Tuttavia, un microcosmo con una maggiore superficie INFLUENZA assorbimento è stato anche testato come descritto in dettaglio in precedenza 15. Lì, un aumento significativo della quantità INFLUENZA traslocato potrebbe essere rilevato (Figura 5B).
Figura 1. Schema e le foto del setup microcosmo completo. Vista dall'alto (A) e dal lato (B). Tutte le patch agar sono stati collocati in cima ad una diapositiva con tre piccole cavità. Due mg di cristalli INFLUENZA stati collocati all'interno di una cavità (d = 5 mm) nel mezzo di PDA PDA 1. 2 era appena coperto con ife di P. ultimum fronte PDA 1. Un pezzo PDA curva è stato collocato tra il PDA 2 e la patch per MMA creare una barriera meccanica INFLUENZA insieme con il coperchio di un piatto Petri (d = 5 cm). Quattro cerotti agar contenenti carbone attivo sono stati collocati nel setup per diminuire ulteriormente la concentrazione FLU gassosa. Foto del microcosmo completa dall'alto (C) e vista diagonale (D) senza microrganismi e influenza. Figure 1A e 1B sono stati modificati con il permesso di Schamfuss et al. 15 Adattato con il permesso di Schamfuss, S. et al. Impatto dei miceli sull'accessibilità di fluorene al Pah-degradanti batteri. Environ. Sci. Technol. 47, 6908-6915. Copyright (2013) American Chemical Society. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Figura 2. proiezioni intensità massima confocale microscopio a scansione laser. Micrografie sono visualizzare l'induzione mCherry e eGFP della marcatura già batterio B. sartisoli RP037-Mche in MMA. Quando i batteri hanno avuto contatto con una sorgente FLU cristallina in MMA (CON POS; A), il segnale di eGFP è elevata rispetto ai controlli (CON AIR; B). I campioni con FLU e P. ultimum (SAM; C) mostrano anche un segnale di eGFP elevata, tuttavia meno marcata rispetto al controllo positivo. mCherry è espresso costitutivamente e serve quindi come un controllo visivo per rilevare le cellule. (Ingrandimento 630X, bar 20 micron). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. relativa induzione eGFP in B.sartisoli RP037-Che per CON NEG, CON AIR e SAM con miceli e FLU. Confronto della relativa induzione eGFP (eGFP rel) da B.sartisoli RP037-Che dopo 96hr in assenza di FLU (CON NEG), in presenza di influenza ma assenza di P.ultimum (CON AIR) e in presenza di entrambi influenza e P.ultimum (SAM). Differenze statisticamente significative CON NEG sono contrassegnati da un asterisco. Gli esperimenti sono stati eseguiti in triplicato indipendenti CON AIR e
. (. Cf Figura 1) Figura 4. Chemical FLU quantificazione quantità totali di influenza in ng estratta dalla patch MMA dopo 96hr per il trasporto in fase vapore, senza cellule (CON AIR (-)), mtrasporto ycelial senza celle (SAM (-)) e il trasporto del micelio con le cellule (SAM). Questo dato è stato modificato con il permesso di Schamfuss et al. 15 Adattato su autorizzazione di Schamfuss, S. et al. Impatto della miceli sull'accessibilità delle fluorene ai batteri Pah-degradante. Environ. Sci. Technol. 47, 6908-6915. Copyright (2013) American Chemical Society.
Figura 5. Chemical FLU quantificazione in presenza di un dissipatore di contaminante abiotico (A) quantità totali di influenza in ng estratta dal cerotto MMA dopo 96hr per il trasporto del micelio con o senza lavabo contaminante artificiale (SAM (. (Cfr. Figura 1) - ) con o senza PDMS cofibre ato). (B) stessi risultati per una vasta pista di prova con una maggiore area di assorbimento FLU micelio. Questo dato è stato modificato con il permesso di Schamfuss et al. 15 Adattato su autorizzazione di Schamfuss, S. et al. Impatto della miceli sull'accessibilità delle fluorene ai batteri Pah-degradante. Environ. Sci. Technol. 47, 6908-6915. Copyright (2013) American Chemical Society.
| Nome | FLU | Miceli | Cellule | Applicazione | Commenti |
| SAM | + | + | + | CLSM | |
| GC / MS | |||||
| SAM (-) | + | - | GC / MS | possibile anche con fibre PDMS come sink contaminante artificiale | |
| CON AIR | + | (+) | + | CLSM | miceli solo crescere a PDA barriera; MMA non coperti |
| CON AIR (-) | + | (+) | - | GC / MS | miceli solo crescere a PDA barriera; MMA non coperti |
| CON NEG | - | + | + | CLSM | |
| CON POS | + | - | + | CLSM | le cellule sono direttamente esposti a cristalli FLU |
Tabella 1. Panoramica di tutti i tipi di campioni Sintesi di tutti i campioni di controllo e di analisi, incluso l'applicazione (test di marcatura già - CLSM o la quantificazione chimico - GC / MS). E composizione (FLU, micelio e le cellule di marcatura già).
| Forno | |
| Temperatura iniziale | 50 ° C |
| Tempo iniziale | 2 min |
| Tasso | 15 ° C min -1 |
| Temperatura finale | 300 ° C |
| Tempo finale | 6.33 min |
| Injector (PTV) | |
| Volume di iniezione | 0,5 microlitri |
| Modo | splitless |
| Epurazione | 2.00 min |
| Flusso di spurgo | 50,0 ml min -1 |
| Temperatura iniziale | 80 ° C |
| Tempo iniziale | 0,02 min |
| Rampe: Tasso | 600 ° C min -1 |
| Temperatura finale | 300 ° C |
| Tempo finale | 10 min |
| Colonna | |
| Modello | J & W DB-5MS |
| Lunghezza nominale | 20 m |
| Diametro nominale | 180 micron |
| Spessore del film nominale | 0.18 micron |
| Gas vettore | elio 0,8 ml min -1 |
| MSD Transferline | 280 ° C |
| MSD | |
| Modalità Sim | |
| MS Fonte | 230 ° C |
| MS Quad | 150 ° C |
Tabella 2. Impostazioni per GC / MS. Sintesi di tutte le impostazioni per GC e MS di qfluorene uantify nelle configurazioni microcosmo.
| TRANELLI | COMMENTO | |
| 1 | Crescita preliminare e test di vitalità | Studiare la crescita dell'organismo micelio di scelta. Quanto tempo ci vuole per raggiungere la patch MMA? E 'inibita dalla barriera cicloeximide? Anche verificare se le cellule di marcatura già soggiornano vitale MMA tutto il tempo tramite saggi da intreccio. In caso contrario, si può anche aggiungere una fonte di carbonio per la MMA che non si traduca in induzione marcatura già. Escludi possibile l'inibizione reciproco di batteri e miceli. |
| 2 | Tasso di crescita del micelio | Il tasso di crescita del micelio organismo non dovrebbe essere troppo lento, perché altrimenti il trasporto del gas in fase di PAH aumenta con il tempo di incubazione prolungato. Il protocollo può essere adattatoaggiungere PAH in un punto secondo momento, ma poi di nuovo, miceli al punto di inoculazione possono non essere più attivo. |
| 3 | La mobilità batterica | Se un microscopio a scansione laser punto viene utilizzato e il ceppo batterico è mobile, la registrazione e la quantificazione di z-stack può essere impossibile a causa di movimento all'interno di MMA. Così, il movimento batterica occorre evitare, ad esempio, aumentando la solidità di MMA, utilizzando CLSM con uno scanner veloce o un microscopio laser disco rotante. |
| 4 | Trasporto in fase vapore | Trasporto in fase vapore della sostanza chimica (ad esempio, PAH) verso le cellule marcatura già deve essere escluso dal sufficientemente cellule marcatura già sono estremamente sensibili alle sostanze chimiche in fase vapore. Questo è il punto cruciale del intero protocollo per prevenire risultati falsi positivi causati dal trasporto gassosa. La fase gasconcentrazione può essere stimato mediante analisi chimica CON AIR (-) e le concentrazioni in fase vapore può essere regolata ad esempio aggiungendo più o meno patch agarosio con carbone attivo. |
| 5 | Tossicità | Tenete a mente, che alte concentrazioni della sostanza chimica testata potrebbero avere effetti tossici sull'organismo e / o batteri micelio. |
| 6 | Autofluorescenza | Controllare se l'organismo prescelto miceliale mostra alcuni autofluorescenza nell'intervallo del segnale previsto marcatura già. Assicuratevi di controllare in diversi stadi di crescita dal autofluorescenza può variare 17. Se viene rilevato autofluorescenza, assicurarsi di registrare z-stack in aree libere miceli. |
| 7 | Candeggio | mCherry fluorescenza è generalmente stabile e non sensibile al candeggio in bi applicatacellule oreporter. Al contrario, eGFP sbianca piuttosto rapidamente. Pertanto, non utilizzare il canale eGFP per visualizzare il campione prima registrazione z-stack. |
| 8 | induzione eGFP | Abbiamo notato una bassa induzione eGFP in SAM rispetto a CON POS. Questo si spiega con la forte limitazione spaziale e scarsa accessibilità della fonte FLU a mantenere la concentrazione molto bassa in fase vapore di FLU (cfr ultimi risultati paragrafo). A seconda del ceppo di marcatura già scelto e chimica, l'area di assorbimento al PDA 1 può essere variata per aumentare la velocità di trasporto (Figura 5B). Tuttavia, si deve considerare che questo aumenta anche il trasporto in fase vapore verso le cellule marcatura già. |
| 9 | Calcolo di eGFP rel | Il metodo di calcolo presentato per eGFP rel dove viene confrontato l'intensità dei pixel verdila zona di pixel rossi è solo una possibilità. Fare riferimento alla discussione per ulteriori informazioni. |
| 10 | Dimensione pixel | Si prega di essere consapevole del fatto che l'ingrandimento della lente scelto e un fattore di zoom potenzialmente applicato influenzano la dimensione in pixel dell'immagine. Questo deve essere preso in considerazione prima dell'analisi delle immagini. |
| 11 | Frazioni biodisponibile | Tenete a mente che la biodisponibilità del composto trasportato è valutata qualitativamente (non quantitativamente) tramite induzione eGFP. Nessuna correlazione della relativa eGFP induzione calcolata e la frazione biodisponibile ha tentato. Tuttavia, questo può essere affrontato in applicazioni future. |
| 12 | Limiti di rilevabilità | Individuazione di prodotti chimici. Per la quantificazione chimica di composti organici, una vasta gamma di concenzioni possono essere rilevati in modo affidabile. Abbiamo rilevato importi nella gamma 0 ng e 1,000ng. eGFP quantificazione. Abbiamo confrontato induzione relativa eGFP in campioni senza trasporto contaminante (cioè, 0NG trasportati), con il trasporto miceli-mediata (cioè tra 20 e 40ng trasportato; cfr Figure 4 e 5) e con contatto diretto con la sorgente contaminante (cioè massima quantità disponibile). Questi tre casi rivelati ben distinguibili con il metodo descritto. Tuttavia, non siamo in grado di fare una dichiarazione più dettagliata sulla risoluzione del relativo induzione eGFP. Questo problema può essere affrontato in futuro collegando diverse quantità di contaminanti con la correlazione induzione eGFP nelle configurazioni microcosmo. |
| 13 | Petri dish materiale | Piatti di plastica Petri possono comportare una sottostima del micelio traslocazione e / o biodisponibilità PAH. Questo non dovrebbeessere problematico, se le dichiarazioni qualitative sono aspirati. Nel caso in cui siano necessarie misurazioni quantitative precise, l'applicazione di vetro Petri devono essere considerati, nonostante la preparazione e la manipolazione sarà più scomodo. |
Tabella 3. Discussione di possibili insidie. Possibili insidie prima e durante l'esperimento e commenti e opzioni proposte.
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Discussion
La configurazione microcosmo presentato dimostrato adatto per studiare la biodisponibilità di sostanze chimiche spazialmente separate per degradare organismi dopo l'assorbimento e il trasporto da miceli. Potenziale di trasporto del gas in fase di composti volatili parzialmente è impedito e le cellule di marcatura già batteriche può essere visualizzato senza preparazione del campione elaborato e quindi con il minimo disturbo del sistema sensibile. Allo stesso tempo, l'analisi chimica del campione può essere facilmente condotto consentendo un buon controllo dei risultati ottenuti e per la quantificazione del trasporto totale. Tuttavia, alcuni punti devono essere attentamente considerati prima e durante l'esecuzione dell'esperimento. Un punto importante è quello di mantenere i microcosmi privo di contaminazioni incrociate batteriche o chimici. Questo può essere difficile, dal momento che molte microcosmi vengono eseguite in parallelo e, quindi, sono necessari grandi camere di incubazione (ad esempio essiccatori). Pertanto, è fondamentale per sterilizzare cura tutte le parti prima della costru configurazionezione. Un altro punto critico può essere l'applicazione di Petri piatti di plastica per i microcosmi. Sebbene PAH e marcatura già non entrare in contatto diretto, una certa quantità di PAH può essere assorbita dal materiale plastico. Tuttavia, si considera questo non problematico per il protocollo descritto, poiché ciò comporterebbe, eventualmente, una sottostima del micelio PAH-traslocazione e / o biodisponibilità. In ogni caso, se è necessaria una precisa quantificazione, va considerato scambiando le parti in plastica con parti in vetro, anche se movimentazione sarà più scomodo. Altri punti che devono essere considerati riguardano i ceppi prescelti batteriche e fungine (possibile inibizione reciproca, tasso di crescita, la mobilità e la possibile autofluorescenza), i prodotti chimici scelti (effetti tossici sui microrganismi, volatilità, limiti di rilevazione) e gli aspetti pratici (candeggio, limitazione di eGFP induzione e calcolo eGFP rel). Una sintesi di potenziali insidie e relativi commenti si trovano inTabella 3.
Abbiamo usato questa configurazione microcosmo modello per dimostrare trasporti FLU micelio e la successiva degradazione batterica in un sistema insaturo direttamente su un livello di interazione cellula-miceli. Il nostro modello set-up può essere variata e regolata per soddisfare diverse esigenze con vari ceppi batterici e fungini, composti chimici, ecc Pertanto, il sistema può essere utilizzato per esempio (i) per valutare l'influenza dei miceli sui batteri in presenza di una sostanza chimica altrimenti limitato (ad esempio, tossici) fonte, (ii) per prevedere l'influenza di miceli sulla biodisponibilità dei composti per la degradazione batterica, (iii) per studiare biodisponibilità contaminante a seconda della distanza dei batteri al vettore di trasporto o (iv) per studiare l'effetto di diverse fonti chimiche (ad esempio, cristallino, nel suolo o disciolti). Tuttavia, la regolazione del sistema ad unacondizioni lternate saranno delicata e deve essere condotto passo passo per ottenere risultati chiari. Finora, non abbiamo testato il sistema per altri ceppi batterici o fungini e altri composti di PAH. Tuttavia, dal momento che le reti miceliari sono noti per trasportare anche altri contaminanti di PAH come pesticidi o sostanze solubili 19 come salicilato 20, riteniamo che il sistema può essere ampliato a diversi composti chimici dato un biosensore batterica specifica-compound.
Si noti che a seconda del ceppo di marcatura già applicata una diversa calcolo eGFP rel potrebbe essere preferibile. Invece di equazione (1) le due seguenti opzioni potrebbero essere applicati:
(2)
(3)
However, nell'equazione protocollo presentato (1) è stato scelto per le seguenti ragioni: intensità (i) eGFP è stato segnalato per correlare al flusso PAH alla cella 14, mentre (ii) mCherry stato segnalato per mostrare considerevoli variazioni per diverse celle 13 . L'equazione (2) e (3), al contrario, può essere scelto per evitare false informazioni da potenziali manufatti leggeri nel campione. In ogni caso, abbiamo confrontato tutti e tre i metodi di calcolo con l'altro, per cui differenze statisticamente significative potrebbero essere trovati. Ancora, a causa delle variazioni riportate nell'intensità di fluorescenza del mCherry, si consiglia di utilizzare l'equazione (1) o (2).
Alla fine, devono essere considerate alcune limitazioni della tecnica. Poiché i microcosmi sono stati progettati per impedire il trasporto in fase gas del composto testato, assorbimento micelio del composto è ridotto. Ciò si traduce in prezzi di trasporto più bassi di quanto ci si aspetterebbe con assorbimento senza ostacoli. Quindi, la sensibilità del bioReceppo portiere deve essere sufficientemente alta per rilevare piccole variazioni di frazioni biodisponibili. Inoltre, l'installazione non sarà probabilmente adatto a ceppi fungini con un tasso di crescita basso. In questo caso, incubazione lungo termine potrebbe favorire il trasporto in fase gas del contaminante portando così a risultati falsi-positivi. Potrebbe essere possibile modificare la configurazione in modo che il contaminante può essere applicato in un punto secondo momento. Tuttavia, ife può allora essere già inattiva o morto nel punto di inoculazione. Infine, come si è detto, la gamma di composti chimici che sono trasportati da reti miceliari è grande. Tuttavia, la disponibilità di un ceppo di marcatura già appropriata potrebbe essere un fattore chiave limitante.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Confocal Microscope | Leica | TCS SP5X, LAS AF - Version 2.6.1; or equivalent CLSM | |
| GC HP 7890 Series GC and Agilent 5975C MSD | Agilent | an equivalent GC/MS may be used | |
| GC capillary column J&W 121-5522 | Agilent | ||
| Cork borer | Fisher Scientific | 12863952 | or any other |
| Cover slips | Marienfeld | 107222 | High performance, No.1.5H |
| GC/MS insterts | WICOM | WIC 47080 | |
| GC/MS vials 2 ml | WICOM | WIC 41150 | |
| Lids / septa for screw cap vials | DIONEX | 49463 / 049464 | |
| Lids for GC/MS vials | WICOM | WIC 43948/B | |
| Objective Slides | Menzel | ordinary | |
| PDMS coated glass fibers | Polymicro Technologies, Inc. | V (PDMS) = 13.55 ± 0.02 µl m-1 | |
| Petri Dishes small / big | Greiner | 633-102 / 628-102 | |
| Screw cap vials 40 ml | DIONEX | 48783 | other glass vials may be used |
| Screw cap vials 60 ml | DIONEX | 48784 | other glass vials may be used |
| Acenaphthylene d08 | Dr. Ehrenstorfer | C 20510100 | |
| Acetone | Carl Roth | 9372.2 | |
| Activated carbon | Sigma-Aldrich | 242276-1kg | |
| Agarose | Carl Roth | 2267.4 | |
| Fluorene | Fluka | 46880 | |
| Kanamycin sulfate | Carl Roth | T832.2 | 50 mg L-1 |
| Methanol | Carl Roth | P7171 | |
| Minimal Medium: 100 ml Solution 1 + 25 ml Solution 2 + 5 ml Solution 3 ad. 1,000 ml aqua dest | |||
| Solution 1 | |||
| Ammonium sulfate | Carl Roth | 3746.1 | 5 g L-1 |
| Magnesium chloride x 6 H2O | Carl Roth | 2189.1 | 1 g L-1 |
| Calcium nitrate x 4 H2O | Carl Roth | P740.1 | 0.5 g L-1 |
| Solution 2 | |||
| Disodium phosphate | Carl Roth | P030.1 | 55.83 g L-1 |
| Monopotassium phosphate | Carl Roth | 3904.1 | 20 g L-1 |
| Solution 3 (pH 6.0) | |||
| Disodium EDTA | MERCK | 1084180250 | 0.8 g L-1 |
| Iron(II) chloride x 4 H2O | MERCK | 1038610250 | 0.3 g L-1 |
| Cobalt(II) chloride x 6 H2O | Carl Roth | T889.3 | 4 mg L-1 |
| Manganese(II) chloride x 1 H2O | Carl Roth | 4320.2 | 10 mg L-1 |
| Copper(II) sulfate | Carl Roth | P023.1 | 1 mg L-1 |
| Sodium molybdate x 2 H2O | Carl Roth | 0274.1 | 3 mg L-1 |
| Zinc chloride | MERCK | 1088160250 | 2 mg L-1 |
| Lithium chloride | Carl Roth | P007.1 | 0.5 mg L-1 |
| Tin(II) chloride x 2 H2O | Carl Roth | 4473.1 | 0.5 mg L-1 |
| Boric acid | Riedel-de-Haen | 11606 | 1 mg L-1 |
| Potassium bromide | Carl Roth | A137.1 | 2 mg L-1 |
| Potassium iodide | Carl Roth | 6750.1 | 2 mg L-1 |
| Barium chloride | Carl Roth | 4453.1 | 0.5 mg L-1 |
| MMA | Minimal medium + agarose 0.2% | ||
| Phenanthrene d10 | Dr. Ehrenstorfer | C 20920100 | |
| Potato Dextrose Agar: 24 g L-1 broth + bacto-agar 1.5%; pH 6.8 | |||
| Potato Dextrose broth | Difco/ Beckton Dickinson | 254920 | |
| Bacto-agar | Difco/ Beckton Dickinson | 214040 | |
| Sodium acetate x 3 hydr. | Carl Roth | 6779.1 | |
| Sodium sulfate | MERCK | 1066495000 | |
| Toluene | MERCK | 1083252500 | |
| mTY medium: 3 g L-1 yeast extract, 5 g L-1 bacto tryptone and 50 mM NaCl | |||
| Yeast extract | Merck | 1037530500 | |
| Tryptone | Serva | 4864702 | |
| Sodium chloride | Carl Roth | 3957.1 | |
| ImageJ with logi tool plugin | http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html and http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/4.4.10 | ||
| Pythium ultimum strain 67-1 | Obtained from the lab of Dr. Christoph Keel; Department of Fundamental Microbiology, University of Lausanne, Switzerland | ||
| Burkholderia sartisoli RP037-mChe | Obtained from the lab of Prof. Jan Roelof van der Meer; Department of Fundamental Microbiology, University of Lausanne, Switzerland | ||
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