Summary
En hel cell bioreporter analys med Burkholderia sartisoli RP037-mChe utvecklades för att upptäcka fraktioner av en organisk förorening (dvs, fluoren) tillgängliga för bakteriell nedbrytning efter aktiv transport av mycel bryggluftfyllda porer i en vatten omättat modellsystem.
Introduction
Marken är tätt befolkat av ett brett spektrum av mikroorganismer 1,2 såsom bakterier. Men förhållandena i denna livsmiljö är utmanande, särskilt när det gäller tillgången på vatten 3. Bakterier permanent behöver söka efter optimala förhållanden i heterogena miljöer fyra, men frånvaron av kontinuerliga vatten filmer leder till begränsad rörlighet 5 hindrar dem att sprida sig fritt. Dessutom är diffusionshastigheter av lösta ämnen (t.ex. näringsämnen) sänks vid omättade förhållanden 6. Således är bakterier och näringsämnen ofta fysiskt separerade och närings tillgängligheten är begränsad 3. Som en konsekvens, kan en transportvektor för kemiska föreningar som inte kräver en kontinuerlig vatten-fasen bidrar till att övervinna dessa begränsningar. I själva verket har många mikroorganismer såsom svampar och oomyceter utvecklat en fintrådiga tillväxt formulär som gör det möjligt för dem att växa genom luftfyllda porutrymmen därigenom nå och mobilizing även fysiskt separerade näringsämnen 7 och kolhaltiga 8 ämnen över långa avstånd. De kan även fungera som biologiska transport vektorer som levererar socker och andra energikällor till bakterier 9. Upptag och transport i mycelie organismer har även visats för hydrofoba organiska föroreningar såsom polycykliska aromatiska kolväten (PAH) i Pythium ultimum 10 eller i arbuskulära mykorrhizasvampar 11. Eftersom PAH är allestädes närvarande och dåligt vattenlösliga föroreningar 12 i jord, kanske mycel-medierad transport bidra till att öka förorenings biotillgänglighet för potentiella bakterie nedbrytare. Det totala beloppet för föroreningsspridning kan kvantifieras direkt genom kemisk väg 10, biotillgänglighet av föroreningar som transporteras av mycel till nedbrytande bakterier och andra organismer kan inte bedömas lätt.
Följande protokoll presenterar en metod för att utvärdera effekten av mycelia på förorening biotillgänglighet för bakteriella nedbrytare i ett direkt sätt; det tillåter samla information om Spatiotemporal effekterna av föroreningar på mikrobiella ekosystem. Vi beskriver hur du ställer in ett utstuderat omättat mikrokosmos systemet härma gränssnitt luft vatten i jord genom att koppla ett fysiskt åtskilda PAH punktkälla med PAH-förnedrande bioreporter bakterier via mycelie transport vektorer. Eftersom luftburen transport är utesluten, kan studeras effekten av mycel baserade transporter på PAH biotillgänglighet för bakterier i ett isolerat sätt. Mer i detalj, var tre-ring PAH fluoren, den myceliala organismen Pythium ultimum och bioreporter bakterien Burkholderia sartisoli RP037-mChe 13 appliceras i de beskrivna mikrokosmos uppställningar. Bakterien B. sartisoli RP037-mChe byggdes ursprungligen för att studera fenantren flöden till cellen 14 och uttrycker förbättrade grönt fluorescerande protein (EGFP) som ett resultat av PAH flödet tillcellen, medan den röda fluorescerande mCherry uttrycks konstitutivt. Detaljerad information om reportern konstruktionen ges av al. Tecon et 13 I preliminära tester visade bakterien ingen simning och endast mycket långsamt myllrande förmåga. Det kunde migrera långsamt på hyfer av Pythium ultimum när den appliceras som en tät suspension ovanpå hyfer. Eftersom bakterier inbäddade i agaros i följande protokoll, gjorde migration på hyfer inte förekomma.
Använda konfokal laserscanningsmikroskopi (CLSM) kan bioreporter bakterier visualiseras direkt i mikrokosmos och expression av EGFP kan kvantifieras i förhållande till mängden av celler (i proportion till mCherry signal) med hjälp av programvaran ImageJ. Detta gör att man jämför biotillgängligheten kvalitativt i olika scenarier (dvs högre eller lägre). FLU befanns vara biotillgängligt efter mycel transporter av P. ultimum (dvs, detvar högre än i en negativ kontroll). Vidare beskriver protokollet hur man kvantifiera den totala mängden mycel-medierad transport via kemiska medel och att kontrollera förorenings biotillgänglighet använder silikonbelagda glasfibrer (SPME fibrer) i identiska mikrokosmos. Resultat som använder detta mikrokosmos inställning har publicerats och diskuterats för kombinationen av P. ultimum, fluoren och B. sartisoli RP037-mChe 15. Här ligger fokus på en detaljerad metodbeskrivning och identifiering av potentiella fallgropar i protokollet för att tillhandahålla denna kunskap för potentiella nya ansökningar. Ytterligare tillämpningar kan innebära olika svamp-, bakteriearter (t.ex., från förorenade områden), och andra föroreningar (t.ex. bekämpningsmedel) eller förorening-försörjning (t.ex. åldern jordar).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av rätter, diabilder och Inkubationsförhållanden Chambers
- Förbered följande material för varje mikrokosmos: en stor plastpetriskål botten (d = 10 cm), en modifierad (se steg 1.2) små plast petriskål botten (d = 5 cm) med lock och en räkningskammare slide med tre hålrum.
- Ta önskat antal petriskål bottendelarna (d = 5 cm). Avlägsna en del av brädden med en såg att exakt passa en slid (26 mm kantlängd). För att sterilisera systemet, blöt petriskål bottnar och lock i 70% etanol O / N och torka dem i minst 2 timmar i ett flöde skåp under UV-ljus. Förvara petriskålar i en tätt försluten plastbehållare, som också hade utsatts för UV-ljus i 2 timmar.
- Torka önskat antal bilder med 70% etanol och luft torka dem. Wrap diabilder i aluminiumfolie och lägg dem i en muffelugn under 5 timmar vid 450 ° C för att avlägsna eventuella föroreningar. Förbered glas inkubation kammare med lock. Rengör med 70% etanol och exponera öppna kamrar för UV-ljus i minst 2 timmar i ett flöde skåp.
OBS: Större exsickatorer (diameter ca 30 cm) med lock kan användas för detta ändamål; varje torkapparat kan hysa upp till tio mikrokosmos inställningar.
2. Beredning av media och kulturer
- För att köra 20 parallella mikrokosmos, få 100 ml modifierat trypton-jäst medium (MTY) 14, ca 150 ml 21C minimalmedium 16 (MM), 5 ml minimalmedium agar (MMA, 0,5%, vikt / volym), tre potatis-dextros-agarplattor (PDA, 1,5%, vikt / volym) för P. ultimum, fyra tomma tallrikar, en PDA tallrik innehållande 2 mg L -1 cykloheximid, fyra agarosplattor (3%, vikt / volym) innehållande 0,3 g ml -1 aktivt kol och 40 mg FLU i 2 mg portioner.
- Förbered Mty innehåller 50 mg L -1 av kanamycin (kanamycin är required att upprätthålla eGFP reporterplasmiden) och MM innehållande 10 mM acetat för bakteriell odling. Använd MM utan acetat att förbereda 0,5% MMA för immobilisering av bakterier i mikrokosmos och häll plattor (vardera 20 ml) av 1,5% PDA för odling av Pythium ultimum och mikrokosmos inställningar.
- Ympa några hyfer av P. ultimum på tre färska PDA-plattor och inkubera i mörker vid 25 ° C under ca 72 h. Sedan se till att plattorna är övervuxna helt av färska och fluffig mycel.
- Starta två kulturer av B. sartisoli RP037-mChe i 50 ml Mty från en glycerol lager. Inkubera vid 30 ° C med 230 rpm rotationskolv rörelse O / N.
- Mät kultur optisk densitet (OD) vid 578 nm och centrifugera vid 1000 xg under 10 min (för B. sartisoli RP037-mChe, är den förväntade OD 578 omkring 1,0 och cellerna är i exponentiell fas). Kassera supernatanten och slamma cellernai en lämplig mängd av MM för att nå en OD 578 av 0,4. Ympa 20 ml MM innehållande 50 mg L -1 kanamycin med 400 pl av de resuspenderade cellerna. Inkubera vid 30 ° C med 230 rpm rotationskolv rörelse O / N.
- Mät OD 578 av kulturen i MM (för B. sartisoli RP037-mChe, är den förväntade OD 578 ca 0,2 och celler är i början exponentiell fas). Centrifugera kultur vid 2000 xg under 10 minuter och åter suspendera cellerna i en lämplig mängd MM för att nå en OD på 0,4. Blanda 50 pl av cellsuspensionen med 500 pl av varm, flytande MMA i 2 ml rör och förvaras vid 50 ° C tills användning. Använd 150 pl celler i MMA för varje mikrokosmos.
- Häll plattor av agarosgel innehållande aktivt kol. Smält agaros (3%; vikt / volym) i dubbeldestillerat vatten. Blanda väl med aktivt kol (0,3 g ml -1) och häll blandningen i plastpetriskålar(D = 10 cm).
3. Microcosm Montering
OBS:. Den kompletta mikrokosmos installationen avbildas schematiskt i figur 1 Se Figur 1 för alla följande enskilda steg. Följande steg beskriver framställningen av ett prov (SAM) med mycelie transport vektorer och tre olika kontrollinställningar (CON AIR, CON NEG, CON POS). En sammanfattning av alla olika inställningar finns i tabell 1.
- Ta önskat antal petriskålar och diabilder och utsätta dem för UV-ljus under ett flöde skåp i 30 min.
- Placera liten petriskål inuti den stora en och montera sliden genom gapet av liten petriskål. Ta ett prov av den varma cellsuspensionen i MMA och lägga 150 l i mitten hålighet en bild. Upprepa detta steg tills mitten hålrummen i alla diabilder ärfylld med MMA. Vänta 5 min för MMA stelna.
- Använd en 1 cm korkborr för att stansa ut runda fläckar från en tom PDA platta. Placera ett plåster på ett avstånd av 2 mm bredvid MMA inuti liten petriskål. Lägg till detta att främja mycelietillväxt i setup (PDA 3 i figur 1).
- Skär böjda PDA patchar som mekaniska hinder. Använd en ren och steril liten petriskål underdel och tryck in en PDA platta. Använd en spatel för att skära en annan mindre ringen på ett avstånd av 0,5 cm in i agar, vilket resulterar i en PDA-ringen.
- Klipp ut en bit, vilket exakt passar in i gapet på den lilla petriskål i mikrokosmos setup och placera den inne i gapet på toppen av bilden. Kontrollera att avståndet mellan MMA och den cirkulära PDA barriären är ca 2 mm. Stäng locket på den liten petriskål försiktigt trycka in den i PDA barriären.
- Upprepa steg 3.4 och 3.4.1 med en handdator platta innehållande 2 g L -1av cykloheximid.
OBS: Detta är kontroll setup för luftburen transport (CON AIR) mot bioreporter cellerna, eftersom mycel hämmas av cykloheximid och inte växa över MMA.
- Använd en 1 cm korkborr för att stansa ut runda fläckar av en tom PDA platta. Använd en annan 0,5 cm korkborr för att skära ut mitt i det första plåstret. Placera resulterande små PDA-ringen på ett avstånd av 1 mm bredvid PDA barriären (PDA 1 i figur 1).
- Lägg 2 mg FLU i hålet för PDA 1. Använd en 1 cm korkborr för att skära ut runda fläckar från PDA plattor bevuxen med P. ultimum och placera ett plåster (PDA 2 i figur 1) botten ner på PDA ringen så att myceliemattan står inför influensan kristaller.
- Upprepa föregående steg utan att lägga FLU kristaller.
OBS: Detta är den negativa kontrollen setup (CON NEG) för att bestämma bakgrundsfluorescens av bioreporter celler.
- Upprepa föregående steg utan att lägga FLU kristaller.
- Använd en 1 cm korkborr för att stansa ut runda fläckar från agar innehållande aktivt kol. Placera fyra plåster i varje mikrokosmos setup för att ytterligare minska gasformiga FLU koncentration (Figur 1).
- Förbered en positiv kontroll (CON POS). Lägg till några FLU kristaller till 200 l av MMA cellsuspension och lägga den i en hålighet i en tom bild.
- Placera en petriskål (d = 10 cm) med vissa pulver av aktivt kol på botten av inkubationskammaren att minimera gasformig FLU koncentrationen i kammaren. Också placera 04:56 50 ml bägare med sterilt vatten på botten för att hålla hög luftfuktighet i kammaren.
- Överför mikrokosmos uppställningar ruvningen kammare och inkubera vid 25 ° C under 96 h. Placera prover slumpvis i de olika tillväxtkamrarna att utesluta lokaliseringseffekter.
OBS: Denna inkubationstid applies till Algsvampar P. ultimum. Det kan vara olika för andra organismer.
- Överför mikrokosmos uppställningar ruvningen kammare och inkubera vid 25 ° C under 96 h. Placera prover slumpvis i de olika tillväxtkamrarna att utesluta lokaliseringseffekter.
4. Confocal Laser Scanning Microscopy
- Helst använder en CLSM setup med upprätt mikroskop.
OBS: Det kan vara utrustat med konventionella lasrar som erbjuder t.ex. 488, 561 och 633 nm linjer för excitation eller med en avstämbar vit laserkälla. - Använd följande inställningar för bildsamling: Excite: 490 nm (eGFP) och 585 nm (mCherry) på lämplig laserintensiteten (simultan excitation); utsläppsintervall: 500-550 nm (EGFP) och 605-650 nm (mCherry); objektiv: 63X NA 0.9 vatten nedsänkningsbar (på grund av sin långa arbetsavstånd); stegstorlek för z-stackar: 0,5 | im.
- Öppna mikrokosmos installera och använda en skalpell för att ta bort PDA 1, 2, 3 och PDA barriären. Sätt en glaskupa slip ovanpå MMA och tryck den försiktigt för att ta bort luftbubblor. Montera glid på mikroskop scenen. Lägg en droppe vatten ovanpå the täckglas och använd mCherry inställningar för att hitta bioreporter celler i provet.
- Få en snabb överblick av provet och optimera signalbrusförhållande med hjälp av en glöd-over-under uppslagstabell för rött (mCherry) och grön (eGFP) kanal. Välj en slumpmässig position på provet för att analysera bioreporter fluorescens.
OBS: hyfer kan visa autofluorescens i intervallet bioreporter utsläppet (t.ex. grön autofluorescens) 17. Var noga med att välja områden utan hyfer om så är fallet. - Definiera och spela in z-stackar för varje position i det gröna (eGFP) och den röda (mCherry) kanal. Undvik blekning av provet genom lång exponering för epifluorescens ljus eller laserljus.
- Upprepa föregående steg för tio slumpmässigt, jämnt fördelade positioner.
- Upprepa alla steg som använder samma inställningar för alla prover av testbanan (SAM), Con Air, CON NEG och CON POS. 5. Bildanalys
- Se till att installera logi_tool plugin (http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/4.4.10/).
- Öppna filen i ImageJ. Välj "split kanaler" och nära gröna kanalen. Använd makrot "mCherry området" anges som kompletterande kod fil att kvantifiera området röd fluorescens i z-stack. Justera önskade inställningar i makro (anges i fetstil).
- Produktionen är en tabell med de uppmätta pixlar över tröskeln (och ovanför den definierade minimistorleken) i z stacken.
OBS: Summan av alla värden är det totala antalet röda pixlar (område) i stapeln.
- Produktionen är en tabell med de uppmätta pixlar över tröskeln (och ovanför den definierade minimistorleken) i z stacken.
- Öppna filen i ImageJ. Välj "split kanaler" och nära röda kanalen. Använd makrot 216; eGFP int 'anges som kompletterande kod fil att kvantifiera intensiteten av grön fluorescens i Z- stacken. Justera önskade inställningar i makro (anges i fetstil).
- Produktionen är ett bord med medelintensitet och området för alla gröna objekt över tröskeln (och ovanför den definierade minimistorleken) i z-stack. För att beräkna den totala intensiteten av gröna bildpunkter i stapeln, multiplicera varje medelintensiteten av motsvarande område.
- Beräkna den relativa eGFP induktion (eGFP rel):
(1)
Anmärkning Eftersom mCherry uttrycks konstitutivt, är det resulterande värdet av EGFP rel ett relativt mått för mängden av EGFP uttryckt av en viss mängd celler. Se även tabell 3 för ytterligare information om beräkning av eGFP rel. - Wrap 15 ml glasflaskor, 1 ml GC / MS flaskor och skär i aluminiumfolie. Fyll avdunstande rätter med Na 2 SO 4; placera alla i muffelugn under 5 h vid 450 ° C för att avlägsna eventuella föroreningar. Förvara Na 2 SO 4 insida av ett aktiverat exsickator.
- Klipp PDMS belagd glasfiber i 0,5 cm långa. Tvätta fibrer genom att skaka fyra gånger 2 tim i färsk metanol. Upprepa tvätt steg ytterligare fyra gånger med ultrarent vatten och lagra rena fibrer i ultrarent vatten i en förseglad glasflaska.
- Bered 1,5 L toluen / aceton (3: 1, volym / volym) innehållande 10 ^ g L -1 fenantren-d 10.
- Utför steg 1, 2 och 3 i protokollet. Förbered mikrokosmer utan bioreporter celler för att studera FLU transport (SAM (-) och Con Air (-)) och med bioreporter celler (SAM) för att verifiera FLU nedbrytning.
- Valfria (utan bioreporter celler): Placera tre PDMS belagda glasfibrer (som vanligtvis används för SPME experiment) som artificiell och kvantifierbar förorenings handfat inne MMA i SAM (-) med fin pincett.
- Ta bort glasfibrer som använder fin pincett och överföra varje in i en GC / MS-flaska med insats.
- Lägg 200 | il toluen och skaka vertikalt O / N och analysera via GC / MS. Använd inställningarna i tabell 2.
- Överför MMA från mitten hålrum i en 15 ml glasflaska och tillsätt ca tre spatlar av Na 2 SO 4. Blanda noggrant med en spatel och tillsätt 10 ml lösningsmedel. Vortex blandningen och skaka vågrätt O / N i mörker.
- Överför 1001, l av provet i GC / MS-ampull med insert. Lägg 10 pl acenaftylen-d 08 (10 mg L -1) och analysera via GC / MS med samma program som beskrivs i 6.4.3.
OBS: För att analysera rött (mCherry) och grön (eGFP) fluorescens i z-stackar inspelade, bland andra alternativ för fri programvara ImageJ 18 (http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html) kan vara användas.
(1) OBS: Microcosm inställningar kan också användas för att utföra kemisk kvantifiering av translokerade FLU mängder med eller utan en abiotisk förorening sink.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultaten som presenteras här har redan tidigare 15 publicerats. Se artikeln för detaljerad mekanistisk och miljödiskussionen.
Efter bildinspelning via CLSM, kan en maximal intensitet projektion utföras med respektive mikroskop programvara eller ImageJ för att få en första visuella intrycket av provet och kontrollerna (Figur 2). Senare kan de datamängder projiceras annorlunda för att visa meningsfulla funktioner genom specifika visualiseringsprogram. Den positiva kontrollen (CON POS) visar distinkt eGFP induktion (Figur 2A), medan den luftburna kontroll (CON AIR) uppvisar endast bakgrunds eGFP fluorescens (Figur 2B). EGFP-fluorescens i testprovet (SAM) verkar vara förhöjda jämfört med Con Air, yet inte lika markerad som CON POS (figur 2C). Den mCherry fluorescens är oberoende av PAH nedbrytning och därmed lika för alla prover. Dock något förhöjda EGFP signalerna inte detekteras med denna metod och efterföljande bildanalys är viktigt.
För de testade mikrokosmos, var visuell inspektion kompletteras med bildanalys och beräkning av relativ eGFP induktion (jfr steg 5 ff i protokollet, Figur 3). Den gröna bakgrundsfluorescens för icke-inducerad B. sartisoli RP037-mChe beräknas med CON NEG. Under givna förutsättningar, var den relativa eGFP induktion befunnits vara eGFP rel = 0,53. Ingen signifikant skillnad kunde påvisas mellan CON NEG och CON AIR (EGFP rel = 0,54; p> 0,95) vilket utesluter varje ångfas FLU transporter mot bioreporter cellerna. För CON POS, mycket förhöjd eGFP induktion (eGFP rel = 53,7) hittades bekräftar vitaliteten i cellerna i MMA efter 96hr och representerar den maximala eGFP induktion. I närvaro av mycel och FLU (SAM), fram EGFP inducerade signifikant i cellerna jämfört med de negativa kontrollerna (EGFP rel = 1,15; p <0,001). Dock är eGFP induktion relativt låg jämfört med den positiva kontrollen (jfr tabell 3, punkt 8).
Transport av FLU av mycel av P. ultimum i mikrokosmos installationen kvantifierades kemiskt (jfr steg 6 ff i protokollet, Figur 4). I närvaro av FLU och P. ultimum (SAM (-)), mycel tränsligger ca 25 ng av FLU inom 96hr vilket motsvarar en transporthastighet 37.5pmold -1 cm -1. Kontroller i frånvaro av mycel (Con Air (-)) avslöjade gasformig FLU transport in MMA i intervallet endast 2 ng inom 96hr, dvs., kan uteslutas induktion av bioreporter genom ång-fas-koncentrationer. När B.sartisoli RP037-mChe var närvarande (SAM), <1 ng av FLU upptäcktes i MMA plåstret. Detta verifieras effektiv bakteriell FLU degradering efter den mycel-medierad sloka.
Det är möjligt att undersöka påverkan av bakteriell nedbrytning, dvs en FLU diskbänk, på FLU sloka genom att lägga en abiotisk förorening diskbänk till systemet (jfr steg 6.4.1 ff i protokollet). Således är en möjlighet att kvantifiera mängden FLU absorberas av fibrerna och mängden kvar inne i MMA och liggande hyfer. För SAM(-), Är den totala translokeras belopp oberoende av närvaron av en förorening sink (p> 0,9; Fig 5A). Men ett mikrokosmos med ökad FLU upptag område testades också som beskrivs i detalj tidigare 15. Där kunde en signifikant ökning av flyttad FLU beloppet detekteras (figur 5B).
Figur 1. Schematisk ritning och bilder av kompletta mikrokosmos setup. Utsikt från toppen (A) och från sidan (B). Samtliga agar plåster placerades på toppen av en slid med tre små kaviteter. Två mg av influensa kristaller placeras inuti en hålighet (d = 5 mm) i mitten av PDA 1. PDA 2 var nyligen bevuxen med hyfer av P. ultimum inför PDA 1. En böjd PDA stycke placerades mellan PDA 2 och MMA patch skapa en mekanisk FLU hinder, tillsammans med locket av en petriskål (d = 5 cm). Fyra agar plåster innehållande aktivt kol placerades i setup för att ytterligare minska gasformiga FLU koncentrationen. Bilder av kompletta mikrokosmos uppifrån (C) och diagonala vy (D) utan mikroorganismer och influensa. Figurerna 1A och 1B har modifierats med tillstånd från Schamfuss et al. 15 Anpassad med tillstånd från Schamfuss, S. et al. Effekter av mycel om tillgänglighet till fluoren att PAH-nedbrytande bakterier. Environ. Sci. Technol. 47, 6908-6915. Copyright (2013) American Chemical Society. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
pg "/>
Figur 2. maximal intensitet projektioner av konfokala laserskanningsmikrofotografier. Micrographs är visualisera mCherry och eGFP induktion av bioreporter bakterien B. sartisoli RP037-mChe i MMA. När bakterierna hade kontakt med en kristallin FLU källa i MMA (CON POS, A), är eGFP signalen förhöjda jämfört med kontroller (CON AIR, B). Prover med FLU och P. ultimum (SAM; C) visar också en förhöjd eGFP signal, dock mindre markant än den positiva kontrollen. mCherry uttrycks konstitutivt och tjänar därför som en visuell kontroll för att upptäcka cellerna. (Förstoring 630X, bar 20 pm). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Relativ EGFP induktion i B.sartisoli RP037-Che för CON NEG, CON AIR och SAM med mycel och FLU. Jämförelse av den relativa EGFP induktion (EGFP rel) genom B.sartisoli RP037-Che efter 96hr i frånvaro av FLU (CON NEG), i närvaro av influensa men frånvaro av P.ultimum (Con Air) och i närvaro av både influensa och P.ultimum (SAM). Statistiskt signifikanta skillnader mot CON NEG är markerade med en asterisk. Experiment utfördes i oberoende triplikat för CON AIR och
. (. Jfr Figur 1) Figur 4. Kemisk FLU kvantifiering Totala mängder FLU i ng extraherats från MMA plåstret efter 96hr för ångfas transport utan celler (CON AIR (-)), mycelial transporter utan celler (SAM (-)) och mycel transporter med celler (SAM). Denna siffra har modifierats med tillstånd från et al. Schamfuss 15 Anpassad med tillstånd från Schamfuss, S. et al. Inverkan av mycel på tillgänglighet fluoren till Pah-nedbrytande bakterier. Environ. Sci. Technol. 47, 6908-6915. Copyright (2013) American Chemical Society.
Figur 5. Kemisk FLU kvantifiering i närvaro av en abiotisk förorening sink (A) Totala mängder FLU i ng utvinns från MMA plåstret efter 96hr för mycel transporter med eller utan artificiell förorening diskho (SAM (. (Jfr figur 1.) - ) med eller utan PDMS coated fibrer). (B) Samma resultat för en varierad testbana med ökad mycel FLU upptag område. Denna siffra har modifierats med tillstånd från et al. Schamfuss 15 Anpassad med tillstånd från Schamfuss, S. et al. Inverkan av mycel på tillgänglighet fluoren till Pah-nedbrytande bakterier. Environ. Sci. Technol. 47, 6908-6915. Copyright (2013) American Chemical Society.
| Namn | INFLUENSA | Mycel | Celler | Tillämpning | Kommentarer |
| SAM | + | + | + | CLSM | |
| GC / MS | |||||
| SAM (-) | + | - | GC / MS | också möjligt med PDMS fibrer som artificiell förorenings diskbänk | |
| CON AIR | + | (+) | + | CLSM | mycel bara växer upp till PDA barriär; MMA inte täcks |
| CON AIR (-) | + | (+) | - | GC / MS | mycel bara växer upp till PDA barriär; MMA inte täcks |
| CON NEG | - | + | + | CLSM | |
| CON POS | + | - | + | CLSM | cellerna direkt utsatta för FLU kristaller |
Tabell 1. Översikt över alla provtyper Sammanfattning av alla kontroll- och testprover inklusive ansökan (bioreporter analys - CLSM eller kemisk kvantifiering - GC / MS). Och composining (FLU, mycel och bioreporter celler).
| Ugn | |
| Initial temp | 50 ° C |
| Ursprunglig tid | 2 min |
| Betyg | 15 ° C min -1 |
| Slutlig temp | 300 ° C |
| Slutlig tid | 6,33 min |
| Injector (PTV) | |
| Injektionsvolym | 0,5 | il |
| Läge | splitless |
| Purge | 2,00 min |
| Reningsflöde | 50,0 ml min -1 |
| Initial temp | 80 ° C |
| Ursprunglig tid | 0,02 min |
| Ramper: Pris | 600 ° C min -1 |
| Slutlig temp | 300 ° C |
| Slutlig tid | 10 min |
| Kolumn | |
| Modell | J & W DB-5MS |
| Nominell längd | 20 m |
| Nominell diameter | 180 | im |
| Nominell skikttjocklek | 0,18 um |
| Bärargas | helium 0,8 ml min -1 |
| MSD Transferline | 280 ° C |
| MSD | |
| Sim-läge | |
| MS Källa | 230 ° C |
| MS Quad | 150 ° C |
Tabell 2. Inställningar för GC / MS. Sammanfattning av alla inställningar för GC och MS till quantify fluoren i mikrokosmos uppställningar.
| FALLGROPAR | KOMMENTAR | |
| 1 | Preliminär tillväxt och vitalitet tester | Studera tillväxten av mycel organism val. Hur lång tid tar det att nå MMA plåstret? Är det hämmas av cykloheximid barriären? Också kontrollera om bioreporter celler stannar avgörande i MMA hela tiden via rotting analyser. Om inte, en även kan lägga till en kolkälla till MMA som inte resulterar i bioreporter induktion. Uteslut möjligt ömsesidig hämning av bakterier och mycel. |
| 2 | Mycelietillväxt takt | Tillväxttakten för mycel organism bör inte vara för långsam, för annars gasfas transport av PAH ökar med förlängd inkubationstid. Protokollet kan anpassasatt lägga PAH vid en senare tidpunkt, men sedan igen, kan mycel vid inokuleringspunkten inte aktiv längre. |
| 3 | Bakteriell rörlighet | Om en punkt avsökande lasermikroskop används och bakteriestammen är motila, kan vara omöjligt registrering och kvantifiering av z-stackar på grund av rörelse inne i MMA. Därför bör bakteriell rörelse förhindras, t.ex. genom att öka soliditeten i MMA, med hjälp CLSM med en snabb scanner eller en snurrskiva lasermikroskop. |
| 4 | Vapor-fas transport | Ångfas transport av kemikalien (t.ex. PAH) mot bioreporter cellerna måste uteslutas tillräckligt eftersom bioreporter celler är extremt känsliga för kemikalier i ångfas. Detta är den avgörande punkten i hela protokollet för att förhindra falskt positiva resultat orsakade av gasformigt transporter. Gasfasenkoncentration kan uppskattas via kemisk analys av CON AIR (-) och ångfas koncentrationer kan justeras till exempel genom att lägga mer eller mindre agaros fläckar med aktivt kol. |
| 5 | Toxicitet | Tänk, att höga koncentrationer av den testade kemikalien kan ha toxiska effekter på mycel organismen och / eller bakterier. |
| 6 | Autofluorescens | Kontrollera om den valda myceliala organismen visar några autofluorescens i intervallet för den förväntade bioreporter signalen. Var noga med att kolla i olika skeden tillväxt sedan autofluorescens kan variera 17. Om autofluorescens upptäcks, se till att spela in z-stackar i mycel fria områden. |
| 7 | Blekning | mCherry fluorescens är oftast stabil och inte känslig för blekning i tillämpad bioreporter celler. Däremot bleker EGFP ganska snabbt. Därför ska du inte använda eGFP kanal för att visualisera provet före z-stack inspelning. |
| 8 | EGFP-induktion | Vi märkte en låg eGFP induktion i SAM jämfört CON POS. Detta förklaras av den starka rumsliga begränsning och låg tillgänglighet av FLU källan att hålla mycket låg koncentration i ångfas av FLU (jfr sista resultaten punkt). Beroende på den valda bioreporter stammen och kemisk, kan upptagningen området vid PDA 1 varieras för att öka transporthastigheten (figur 5B). Men måste det anses att detta ökar också ångfas transporter mot bioreporter cellerna. |
| 9 | Beräkning av eGFP rel | Den presenterade beräkningsmetod för eGFP rel där intensiteten av gröna pixlar jämförstill området av röda pixlar är bara en möjlighet. Se diskussionen för ytterligare information. |
| 10 | Pixelstorlek | Var medveten om att förstoringen av den valda linsen och en potentiellt tillämpas zoomfaktor påverkar pixelstorlek på bilden. Detta måste tas i beaktande före bildanalys. |
| 11 | Biotillgänglig fraktioner | Tänk på att biotillgängligheten av det transporterade föreningen bedöms kvalitativt (ej kvantitativt) via eGFP induktion. Ingen korrelation av den beräknade relativa eGFP induktion och biotillgängliga fraktionen försök. Emellertid kan detta tas upp i framtida tillämpningar. |
| 12 | Detektionsgränserna | Kemiska upptäckt. För kemisk kvantifiering av organiska föreningar, ett brett utbud av koncentrationer kan detekteras tillförlitligt. Vi upptäckt mängder i intervallet 0ng och 1,000ng. eGFP kvantifiering. Vi jämförde relativa eGFP induktion i prover utan föroreningsspridning (dvs 0ng transporteras), med mycel-medierad transport (dvs mellan 20 och 40 ng transporteras, jfr figur 4 och 5) och med direktkontakt till föroreningskälla (dvs max tillgängliga belopp). Dessa tre fall visade sig vara väl urskiljbara med den beskrivna metoden. Men vi kan inte göra en mer detaljerad redogörelse om resolutionen av den relativa eGFP induktion. Denna fråga kan tas upp i framtiden genom att länka olika förorenings mängder med korrelera eGFP induktion i mikrokosmos uppställningar. |
| 13 | Petriskål material | Plast petriskålar kan resultera i en underskattning av mycel PAH translokation och / eller biotillgänglighet. Detta bör intevara problematiskt, om kvalitativa uttalanden strävat. I fallet krävs exakta kvantitativa mätningar, tillämpning av glaspetriskålar bör beaktas trots förberedelser och hantering kommer att vara mer obekvämt. |
Tabell 3. Diskussion om möjliga fallgropar. Möjliga fallgropar före och under försöket och föreslagna synpunkter och alternativ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den presenterade mikrokosmos installationen visade lämpligt att studera biotillgängligheten av rumsligt separerade kemikalier till förnedrande organismer efter upptag och transport av mycel. Potentiell transport av delvis flyktiga föreningar gasfas förhindras och bakterie bioreporter celler kan visualiseras utan arbetade provberedning och därmed med minimal störning av känsligt system. Samtidigt, kan kemisk analys av provet lätt bedrivas möjliggör en god kontroll av uppnådda resultat och för kvantifiering av den totala transport. Men vissa punkter måste beaktas noga före och under utförandet av experimentet. En viktig punkt är att hålla mikrokosmos fri från bakterie- eller kemiska tvär föroreningar. Detta kan vara en utmaning, eftersom många mikrokosmos drivs parallellt och därmed är stor inkubation kammare (t.ex. exsickatorer) krävs. Därför är det viktigt att sterilisera alla delar noggrant före installation byggtion. En annan kritisk punkt kan vara att tillämpa plastpetriskålar för mikrokosmos. Även PAH och bioreporter inte komma i direkt kontakt, kan en viss mängd av PAH att absorberas av plastmaterialet. Men vi anser att detta inte problematiskt för den beskrivna protokollet, eftersom detta skulle leda till, om någon, i en underskattning av mycel PAH-translokation och / eller biotillgänglighet. I alla fall om exakt kvantifiering krävs, bör det betraktas utbyta plastdetaljer med glaspartier, även om hanteringen blir mer besvärligt. Andra punkter som bör beaktas engagera Vald bakterie- och svampstammar (möjligt ömsesidig hämning, tillväxthastighet, rörlighet och eventuella autofluorescens), de valda kemikalier (giftiga effekter på mikroorganismer, volatilitet, detektionsgränser) och praktiska aspekter (blekning, begränsning av eGFP induktion och beräkning av eGFP rel). En sammanfattning av potentiella fallgropar och respektive kommentarer kan hittas iTabell 3.
Vi använde denna modell mikrokosmos setup för att demonstrera mycel FLU transporter och efterföljande bakteriell nedbrytning i en omättad systemet direkt på en cell-mycel interaktionsnivå. Vår modell set-up kan varieras och justeras för att tillgodose olika behov med olika bakterie- och svampstammar, kemiska föreningar, etc. Sålunda skulle systemet kunna användas till exempel (i) för att utvärdera inverkan av mycel på bakterier i närvaro av ett annat sätt begränsade kemiska (t.ex. toxisk) källa, (ii) för att förutsäga inverkan av mycel på biotillgängligheten för föreningarna för bakteriell nedbrytning, (iii) för att studera kontaminant biotillgänglighet beroende på avståndet av bakterier till transportvektor eller (iv) att undersöka effekten av olika kemiska källor (t.ex. kristallin, i jord eller lösta). Emellertid justering av systemet till enlternate förhållandena kommer att vara känslig och bör utföras steg för steg i syfte att uppnå tydliga resultat. Hittills har vi inte testat systemet för andra bakteriella eller svampstammar och andra föreningar än PAH. Eftersom mycelie nätverk är kända för att transportera även andra föroreningar än PAH som bekämpningsmedel 19 eller lösliga substanser såsom salicylat 20, tror vi att systemet kan utökas till olika kemiska föreningar som ges en förening specifik bakteriell biosensor.
Observera att beroende på tillämpad bioreporter stam en annan beräkning av eGFP rel kan vara att föredra. Istället för ekvation (1) de två följande alternativ skulle kunna tillämpas:
(2)
(3)
However, i den presenterade protokollet ekvation (1) valdes på grund av följande orsaker: (i) eGFP intensitet rapporterades att korrelera till PAH flödet till cellen 14 medan (ii) mCherry rapporterades att visa stora variationer för olika celler 13 . Ekvation (2) och (3), däremot kan väljas för att förhindra att falsk information från potentiella ljus artefakter i provet. I varje fall har vi jämfört alla tre beräkningsmetoder med varandra, varigenom inga statistiskt signifikanta skillnader kunde hittas. Fortfarande på grund av de rapporterade variationer i fluorescensintensiteten hos mCherry, rekommenderar vi användning av ekvation (1) eller (2).
I slutändan bör vissa begränsningar av tekniken beaktas. Eftersom mikrokosmos var utformade för att förhindra gasfas transport av den testade föreningen, är mycel upptag av föreningen reduceras. Detta resulterar i lägre fraktsatser än vad som förväntas med obehindrat upptag. Följaktligen känslighet Bioreporter stam måste vara tillräckligt hög för att upptäcka små förändringar i biotillgängliga fraktioner. Vidare kommer installationen troligen inte vara lämpliga för svampstammar med låg tillväxttakt. I detta fall kan långtids inkubation gynna gasfas transport av föroreningen vilket leder till falskt positiva resultat. Det kan vara möjligt att modifiera inställningen på ett sätt som det främmande ämnet kan anbringas vid en senare tidpunkt. Dock kan hyfer då redan vara inaktiv eller döda vid inokuleringspunkten. Slutligen, såsom angivits ovan, är stora området av kemiska föreningar som transporteras av mycelie nätverk. Men kanske att det finns en lämplig bioreporter stam vara en begränsande nyckelfaktor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Confocal Microscope | Leica | TCS SP5X, LAS AF - Version 2.6.1; or equivalent CLSM | |
| GC HP 7890 Series GC and Agilent 5975C MSD | Agilent | an equivalent GC/MS may be used | |
| GC capillary column J&W 121-5522 | Agilent | ||
| Cork borer | Fisher Scientific | 12863952 | or any other |
| Cover slips | Marienfeld | 107222 | High performance, No.1.5H |
| GC/MS insterts | WICOM | WIC 47080 | |
| GC/MS vials 2 ml | WICOM | WIC 41150 | |
| Lids / septa for screw cap vials | DIONEX | 49463 / 049464 | |
| Lids for GC/MS vials | WICOM | WIC 43948/B | |
| Objective Slides | Menzel | ordinary | |
| PDMS coated glass fibers | Polymicro Technologies, Inc. | V (PDMS) = 13.55 ± 0.02 µl m-1 | |
| Petri Dishes small / big | Greiner | 633-102 / 628-102 | |
| Screw cap vials 40 ml | DIONEX | 48783 | other glass vials may be used |
| Screw cap vials 60 ml | DIONEX | 48784 | other glass vials may be used |
| Acenaphthylene d08 | Dr. Ehrenstorfer | C 20510100 | |
| Acetone | Carl Roth | 9372.2 | |
| Activated carbon | Sigma-Aldrich | 242276-1kg | |
| Agarose | Carl Roth | 2267.4 | |
| Fluorene | Fluka | 46880 | |
| Kanamycin sulfate | Carl Roth | T832.2 | 50 mg L-1 |
| Methanol | Carl Roth | P7171 | |
| Minimal Medium: 100 ml Solution 1 + 25 ml Solution 2 + 5 ml Solution 3 ad. 1,000 ml aqua dest | |||
| Solution 1 | |||
| Ammonium sulfate | Carl Roth | 3746.1 | 5 g L-1 |
| Magnesium chloride x 6 H2O | Carl Roth | 2189.1 | 1 g L-1 |
| Calcium nitrate x 4 H2O | Carl Roth | P740.1 | 0.5 g L-1 |
| Solution 2 | |||
| Disodium phosphate | Carl Roth | P030.1 | 55.83 g L-1 |
| Monopotassium phosphate | Carl Roth | 3904.1 | 20 g L-1 |
| Solution 3 (pH 6.0) | |||
| Disodium EDTA | MERCK | 1084180250 | 0.8 g L-1 |
| Iron(II) chloride x 4 H2O | MERCK | 1038610250 | 0.3 g L-1 |
| Cobalt(II) chloride x 6 H2O | Carl Roth | T889.3 | 4 mg L-1 |
| Manganese(II) chloride x 1 H2O | Carl Roth | 4320.2 | 10 mg L-1 |
| Copper(II) sulfate | Carl Roth | P023.1 | 1 mg L-1 |
| Sodium molybdate x 2 H2O | Carl Roth | 0274.1 | 3 mg L-1 |
| Zinc chloride | MERCK | 1088160250 | 2 mg L-1 |
| Lithium chloride | Carl Roth | P007.1 | 0.5 mg L-1 |
| Tin(II) chloride x 2 H2O | Carl Roth | 4473.1 | 0.5 mg L-1 |
| Boric acid | Riedel-de-Haen | 11606 | 1 mg L-1 |
| Potassium bromide | Carl Roth | A137.1 | 2 mg L-1 |
| Potassium iodide | Carl Roth | 6750.1 | 2 mg L-1 |
| Barium chloride | Carl Roth | 4453.1 | 0.5 mg L-1 |
| MMA | Minimal medium + agarose 0.2% | ||
| Phenanthrene d10 | Dr. Ehrenstorfer | C 20920100 | |
| Potato Dextrose Agar: 24 g L-1 broth + bacto-agar 1.5%; pH 6.8 | |||
| Potato Dextrose broth | Difco/ Beckton Dickinson | 254920 | |
| Bacto-agar | Difco/ Beckton Dickinson | 214040 | |
| Sodium acetate x 3 hydr. | Carl Roth | 6779.1 | |
| Sodium sulfate | MERCK | 1066495000 | |
| Toluene | MERCK | 1083252500 | |
| mTY medium: 3 g L-1 yeast extract, 5 g L-1 bacto tryptone and 50 mM NaCl | |||
| Yeast extract | Merck | 1037530500 | |
| Tryptone | Serva | 4864702 | |
| Sodium chloride | Carl Roth | 3957.1 | |
| ImageJ with logi tool plugin | http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html and http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/4.4.10 | ||
| Pythium ultimum strain 67-1 | Obtained from the lab of Dr. Christoph Keel; Department of Fundamental Microbiology, University of Lausanne, Switzerland | ||
| Burkholderia sartisoli RP037-mChe | Obtained from the lab of Prof. Jan Roelof van der Meer; Department of Fundamental Microbiology, University of Lausanne, Switzerland | ||
References
- Holden, P. A., Fierer, N. Microbial processes in the vadose zone. Vadose Zone Journal. 4, 1-21 (2005).
- Whitman, W. B., Coleman, D. C., Wiebe, W. J. Prokaryotes: The unseen majority. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95, 6578-6583 (1998).
- Kieft, T. L., et al. Microbial abundance and activities in relation to water potential in the vadose zones of arid and semiarid sites. Microbial ecology. 26, 59-78 (1993).
- Wang, G., Or, D. Aqueous films limit bacterial cell motility and colony expansion on partially saturated rough surfaces. Environ. Microbiol. 12, 1363-1373 (2010).
- Griffin, D. M. Water Potential Relations in Soil Microbiology SSSA Special Publication. Parr, J. F., Gardner, W. R., Elliott, L. F. , Soil Science Society of America. 141-151 (1981).
- Papendick, R. I., Camprell, G. S. Water Potential Relations in Soil Microbiology SSSA Special Publication. Parr, J. F., Gardner, W. R., Elliott, L. F. , Soil Science Society of America. 1-22 (1981).
- Boswell, G. P., Jacobs, H., Davidson, F. A., Gadd, G. M., Ritz, K. Functional consequences of nutrient translocation in mycelial fungi. J. Theor. Biol. 217, 459-477 (2002).
- Jennings, D. H. Translocation of solutes in fungi. Biol. Rev. Camb. Philos. Soc. 62, 215-243 (1987).
- Bais, H. P., Weir, T. L., Perry, L. G., Gilroy, S., Vivanco, J. M. The role of root exudates in rhizosphere interactions with plants and other organisms. Annu. Rev. Plant Biol. 57, 233-266 (2006).
- Furuno, S., et al. Mycelia promote active transport and spatial dispersion of polycyclic aromatic hydrocarbons. Environ. Sci. Technol. 46, 5463-5470 (2012).
- Gao, Y., Cheng, Z., Ling, W., Huang, J. Arbuscular mycorrhizal fungal hyphae contribute to the uptake of polycyclic aromatic hydrocarbons by plant roots. Bioresour. Technol. 101, 6895-6901 (2010).
- Semple, K. T., Morriss, A. W. J., Paton, G. I. Bioavailability of hydrophobic organic contaminants in soils: fundamental concepts and techniques for analysis. Eur. J. Soil. Sci. 54, 809-818 (2003).
- Tecon, R., Binggeli, O., vander Meer, J. R. Double-tagged fluorescent bacterial bioreporter for the study of polycyclic aromatic hydrocarbon diffusion and bioavailability. Environ. Microbiol. 11, 2271-2283 (2009).
- Tecon, R., Wells, M., vander Meer, J. R. A new green fluorescent protein-based bacterial biosensor for analysing phenanthrene fluxes. Environ. Microbiol. 8, 697-708 (2006).
- Schamfuss, S., et al. Impact of mycelia on the accessibility of fluorene to PAH-degrading bacteria. Environ. Sci. Technol. 47, 6908-6915 (2013).
- Smibert, R. M., Krieg, R. M., et al. Manual of methods for general bacteriology. Gerhardt, P., Murray, R. G. E., Costilow, R. N., Nester, E. W., Wood, W. A., Krieg, N. R., Phillips, G. B. 19, American Society for Microbiology. Washington, D.C. 409-443 (1981).
- Wu, C. H., Warren, H. L. Natural autofluorescence in fungi and its correlation with viability. Mycologia. 76, 1049-1058 (1984).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
- Pedersen, C., Sylvia, D. Ch. 8 Concepts in Mycorrhizal Research. Handbook of Vegetation Science. Mukerji, K. G. Vol. 19, Springer. Netherlands. 195-222 (1996).
- Furuno, S., et al. Fungal mycelia allow chemotactic dispersal of polycyclic aromatic hydrocarbon-degrading bacteria in water-unsaturated systems. Environ. Microbiol. 12, 1391-1398 (2010).
