Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Environment

גישת Bioreporter תא כל להערכת תחבורה וזמינות ביולוגית של מזהמים אורגניים במערכות לא רוויים מים

doi: 10.3791/52334 Published: December 24, 2014

Summary

Assay bioreporter התא שלם עם sartisoli Burkholderia RP037-mChe פותח כדי לזהות שברים של מזהמים אורגניים (כלומר, fluorene) זמינים לשפלת חיידקים לאחר תחבורה פעילה על ידי mycelia גישור נקבוביות אוויר מלא במערכת מודל בלתי רוויה מים.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

אדמה מאוכלסת בצפיפות על ידי מגוון רחב של מיקרואורגניזמים 1,2 כגון חיידקים. עם זאת, תנאים בבית גידול זה הם מאתגרים, במיוחד במונחים של מים זמינות 3. חיידקים זקוקים באופן קבוע כדי לחפש תנאים אופטימליים בסביבות הטרוגניות 4, אבל היעדר סרטי מים רציפים וכתוצאה מכך הניידות הוגבלה 5 מעכב אותם כדי להפיץ באופן חופשי. כמו כן, שיעורי דיפוזיה של מומסים (למשל, חומרים מזינים) הם הורידו בתנאים בלתי רוויים 6. לפיכך, חיידקים וחומרים מזינים לעתים קרובות מופרדים פיזי ונגישות תזונתית מוגבלת 3. כתוצאה מכך, וקטור תחבורה לתרכובות כימיות שאינו דורש מים שלב רציף יכול לעזור להתגבר על מגבלות אלה. למעשה, מיקרואורגניזמים רבים כגון פטריות וoomycetes פיתחו צורת צמיחת פילמנטיות מאפשרת להם לגדול דרך נקבובי אוויר מלא ובכך להגיע וmobilizing גם פיזי מופרד חומרים מזינים 7 ו -8 חומרי פחמני על פני מרחקים ארוכים. הם עשויים אפילו לשמש כוקטורי תחבורה ביולוגיים אשר מספקים סוכרים ומקורות אנרגיה אחרים לחיידקי 9. ספיגה והובלה ביצורים mycelial גם הוכחו למזהמים אורגניים הידרופובי כגון פחמימנים ארומטיים polycyclic (PAH) בPythium ultimum 10 או בפטריות mycorrhizal arbuscular 11. מאז PAH הם מזהמי מים נמצאים בכל מקום ומסיסים היטב 12 באדמה, תחבורה בתיווך mycelia עשויה לסייע להגביר את הזמינות הביולוגית מזהם לdegraders חיידקים פוטנציאלי. למרות שהסכום הכולל של מזהם ניתן לכמת באופן ישיר על ידי אמצעים כימיים 10, הזמינות הביולוגית של מזהמים מועברים על ידי mycelia לחיידקי מפרקים ואורגניזמים אחרים לא ניתן להעריך בקלות.

הפרוטוקול הבא מציג שיטה להערכת ההשפעה של myceליה על זמינות ביולוגית מזהם לdegraders חיידקים באופן ישיר; הוא מאפשר איסוף מידע על השפעת spatiotemporal של מזהמים על מערכות אקולוגיות של חיידקים. אנו מתארים כיצד להגדיר את מערכת מיקרוקוסמוס בלתי רוויה משוכללת מחקה ממשקי אוויר-מים בקרקע על ידי קישור מקור נקודת PAH מופרד פיזי עם חיידקי bioreporter PAH-משפיל באמצעות וקטורי תחבורת mycelial. בגלל תחבורה מוטסת מודרה, את ההשפעה של תחבורה מבוססת mycelial על זמינות ביולוגית PAH לחיידקים ניתן ללמוד בדרך מבודדת. בפירוט רב יותר, RP037-mChe sartisoli fluorene שלוש טבעות PAH, האורגניזם mycelial Pythium ultimum וbioreporter חיידק Burkholderia 13 יושמו בsetups מיקרוקוסמוס תאר. B. החיידק sartisoli RP037-mChe נבנה במקור כדי ללמוד והנתיבים phenanthrene לתא 14 ומביע משופר חלבון פלואורסצנטי ירוק (eGFP) כתוצאה משטף PAH להתא, ואילו fluorescing האדום mCherry בא לידי ביטוי constitutively. מידע מפורט על בניית הכתב ניתן על ידי Tecon et al. 13 בבדיקות ראשוניות, עולה כי אין החיידק שחייה ורק יכולת רץ איטית מאוד. זה היה יכול להעביר לאט בעובש של ultimum Pythium כאשר מיושמים כהשעיה צפופה על גבי העובש. מאז חיידקים היו משובצים בagarose בפרוטוקול הבא, הגירה על העובש לא התרחשה.

באמצעות מיקרוסקופ confocal סריקת לייזר (CLSM), ניתן דמיינו חיידקי bioreporter ישירות במיקרוקוסמוס וביטוי של eGFP ניתן לכמת ביחס לכמות תאים (הפרופורציונלית לאות mCherry) בעזרת ImageJ התוכנה. זה מאפשר השוואת זמינות ביולוגית איכותית בתרחישים שונים (כלומר, גבוה או נמוך יותר). שפעת נמצאה זמין ביולוגי לאחר תחבורת mycelial על ידי פ ' ultimum (כלומר, זההיה גבוה יותר מאשר בבקרה שלילית). יתר על כן, הפרוטוקול מתאר כיצד לכמת את הסכום הכולל של תחבורה בתיווך mycelia באמצעים כימיים וכדי לוודא את הזמינות הביולוגית מזהם באמצעות סיבים מצופים סיליקון זכוכית (סיבי SPME) במיקרוקוסמוס הזהה. תוצאות באמצעות התקנת מיקרוקוסמוס זה פורסמו ונדונו לשילוב של פ ultimum, fluorene ו- B. sartisoli 15 RP037-mChe. כאן, במוקד נמצא על תיאור מפורט ושיטת זיהוי בעיות הפוטנציאליות של הפרוטוקול כדי לספק את הידע הזה ליישומים נוספים פוטנציאליים. יישומים נוספים עשויים להיות כרוכים בפטריות שונות, מיני חיידקים (למשל, מאתרים מזוהמים), ומזהמים אחרים (למשל, חומרי הדברה) או זיהום אספקה ​​(למשל, קרקעות בגיל).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. הכנת מנות, צ'יימברס שקופיות והדגירה

  1. הכן את החומר הבא לכל מיקרוקוסמוס: פלסטיק אחד גדול תחתון פטרי צלחת (ד = 10 סנטימטרים), אחד שונה (ראה שלב 1.2) פלסטיק קטן תחתון פטרי צלחת (d = 5 סנטימטרים) עם מכסים והחלק תא ספירה אחת עם שלושה חללים.
  2. קח את המספר הרצוי של חלקים תחתון צלחת פטרי (d = 5 סנטימטרים). הסר חלק מגדותיו עם מסור כדי שיתאים לשקופית (אורך קצה 26 מ"מ) בדיוק. כדי לעקר את המערכת, לספוג תחתית צלחת פטרי ומכסים ב -70% אתנול O / N ולייבש אותם לפחות שעה 2 בזרימה ממשלה תחת UV-אור. אחסן את צלחות פטרי במכל פלסטיק סגור היטב, שגם נחשף לקרינת UV-אור עבור 2 שעות.
  3. נגב את המספר הרצוי של שקופיות עם אתנול 70% ואוויר יבשים אותם. לעטוף שקופיות בנייר אלומיניום ומכניס אותם בתנורי מופל במשך 5 שעות ב 450 מעלות צלזיוס כדי להסיר זיהומים אפשריים. הכן תאי דגירה זכוכית עם מכסים. לנקות עם 70% אתנול ולחשוף תאים פתוחים לUV-אור לפחות 2 שעות בזרימה ממשלה.
    הערה: ייבוש גדול (קוטר כ -30 סנטימטרים) עם מכסים עשוי לשמש למטרה זו; כל ייבוש עשוי לאכלס עד עשרה setups מיקרוקוסמוס.

2. הכנת מדיה ותרבויות

  1. כדי להפעיל 20 מיקרוקוסמוס המקביל, לקבל משינוי tryptone-שמרים בינוניים (MTY) 14, כ -150 מיליליטר של 21C 16 בינוניים מינימאליים (MM), 5 מיליליטר של אגר בינוני המינימלי של 100 מיליליטר (MMA; 0.5%, w / v), שלוש צלחות אגר דקסטרוז תפוחי האדמה (PDA; 1.5%, w / v) לפ ultimum, ארבע צלחות ריקות, צלחת PDA אחד המכילה 2 מ"ג L -1 cycloheximide, ארבע צלחות agarose (3%, w / v) המכיל 0.3 גרם מיליליטר -1 פחם פעיל ו -40 מ"ג של שפעת ב2 חלקי מ"ג.
  2. הכן MTY המכיל L מ"ג -1 50 של kanamycin (kanamycin הוא required לשמור eGFP פלסמיד כתב) וMM המכיל 10 אצטט מ"מ לגידול חיידקים. השתמש MM ללא אצטט להכין 0.5% MMA לקיבוע של חיידקים במיקרוקוסמוס ויוצקים צלחות (כל 20 מיליליטר) של מחשב כף יד 1.5% לגידול של setups ultimum ומיקרוקוסמוס Pythium.
  3. לחסן כמה העובש של פ ultimum על שלוש צלחות PDA טריות והדגירה בחושך ב 25 מעלות צלזיוס במשך כ -72 שעות. ואז לוודא שהצלחות הן מגודל לחלוטין על ידי תפטיר טרי ורך.
  4. התחל שתי תרבויות של B. sartisoli RP037-mChe ב 50 מיליליטר של MTY ממניות גליצרול. לדגור על 30 מעלות צלזיוס עם התנועה סיבובית בקבוק 230 סל"ד O / N.
  5. צפיפות תרבות מדד אופטית (OD) בשעה 578 ננומטר ו צנטריפוגות XG ב 1000 למשך 10 דקות (לsartisoli B. RP037-mChe, OD הצפוי 578 הוא כ 1.0 ותאים נמצאים בשלב מעריכי). בטל supernatant מחדש להשעות התאיםבכמות מתאימה של MM להגיע OD 578 של 0.4. לחסן 20 מיליליטר של MM המכיל 50 מ"ג L -1 kanamycin עם 400 μl של תאי resuspended. לדגור על 30 מעלות צלזיוס עם התנועה סיבובית בקבוק 230 סל"ד O / N.
  6. למדוד OD 578 של התרבות בMM (לsartisoli B. RP037-mChe, OD הצפוי 578 הוא כ 0.2 ותאים נמצאים בשלב מוקדם מעריכי). תרבות צנטריפוגה XG ב 2000 עבור 10 דקות מחדש להשעות את התאים בכמות מתאימה של MM להגיע OD של 0.4. מערבבים 50 μl של ההשעיה התא עם 500 μl של חם MMA, נוזל בצינורות 2 מיליליטר ולאחסן ב -50 ° C עד שימוש. השתמש 150 μl של תאים בMMA לכל מיקרוקוסמוס.
  7. יוצקים צלחות של ג'ל agarose המכיל פחם פעיל. להמס agarose (3%; w / v) במים מזוקקים כפולים. מערבבים היטב עם פחם פעיל (0.3 g מיליליטר -1) ויוצקים את התערובת לתוך צלחות פטרי פלסטיק(ד = 10 סנטימטרים).

3. מיקרוקוסמוס הרכבה

הערה:. התקנת מיקרוקוסמוס השלמה מתוארת באופן סכמטי באיור 1 עיין באיור 1 עבור כל הצעדים הבודדים הבאים. השלבים הבאים מתארים את הכנת מדגם (SAM) עם וקטורי תחבורת mycelial ושלוש הגדרות שונות שליטה (AIR CON, נג CON, POS CON). ניתן למצוא סיכום של כל המערכים השונים בטבלה 1.

  1. קח מספר רצוי של צלחות פטרי ושקופיות ולחשוף אותם לאור UV תחת זרימת ממשלה למשך 30 דקות.
  2. מניחים את צלחת פטרי הקטנה בתוך אחד הגדול ולהתאים את החלק דרך הפער של צלחת פטרי הקטנה. קח לדוגמא אחד מהשעית התא החמה בMMA ולהוסיף 150 μl לתוך חלל אמצע שקופית אחת. חזור על פעולה זו עד לחללי אמצע כל השקופיותמלא בMMA. חכה 5 דקות לMMA כדי לחזק.
  3. השתמש דקור פקק 1 סנטימטר לאגרוף החוצה כתמים עגולים מצלחת PDA ריקה. הנח תיקון אחד במרחק של 2 מ"מ בסמוך לMMA בתוך צלחת פטרי הקטנה. הוסף את זה כדי לקדם את צמיחת mycelial בהתקנה (PDA 3 באיור 1).
  4. חותך תיקוני מחשב כף יד מעוגלים כמו מחסומים מכאניים. השתמש בחלק תחתון צלחת פטרי הקטנה נקי וסטרילי ולחץ אותו לתוך צלחת PDA. השתמש במרית כדי לחתוך עוד טבעת קטנה במרחק של 0.5 סנטימטרים לתוך אגר שתוצאת PDA-טבעת.
    1. לגזור חתיכה שמתאימה בדיוק לפער של צלחת פטרי הקטנה בהתקנת מיקרוקוסמוס, ולמקם אותו בתוך הפער על גבי השקופית. ודא שהמרחק בין MMA ומחסום PDA החוזר הוא כ -2 מ"מ. סגור את המכסה של צלחת פטרי הקטנה בעדינות הטביעה אותו בתוך מחסום PDA.
    2. חזור על שלבים 3.4 ו3.4.1 עם צלחת PDA המכילה 2 ליטר g -1של cycloheximide.
      הערה: זו הגדרת השליטה לתחבורה אווירית (AIR CON) לתאי bioreporter, מאז mycelia מעוכבת על ידי cycloheximide ולא לגדול יותר MMA.
  5. השתמש דקור פקק 1 סנטימטר לאגרוף החוצה כתמים עגולים של צלחת PDA ריקה. שימוש נוסף דקור פקק 0.5 סנטימטר לחתוך את האמצע של התיקון הראשון. הנח את כף יד-הטבעת הקטנה וכתוצאה מכך במרחק של 1 מ"מ בסמוך למחסום PDA (מחשבי כף יד 1 באיור 1).
  6. הוסף 2 מ"ג של שפעת לתוך החור של מחשב כף יד 1. השתמש דקור פקק 1 סנטימטר לחתוך את תיקוני חוזר מצלחות PDA מגודל עם פ ultimum ולמקם את תיקון אחד (PDA 2 באיור 1) תחתונה כלפי מטה על טבעת PDA כך שמחצלת mycelial עומדת בפני גבישי השפעת.
    1. חזור על השלב הקודם מבלי להוסיף גבישי שפעת.
      הערה: זו הגדרת בקרה השלילית (NEG CON) כדי לקבוע רקעהקרינה של תאי bioreporter.
  7. השתמש דקור פקק 1 סנטימטר לאגרוף החוצה כתמים עגולים מאגר המכילים פחם פעיל. הנח ארבעה תיקונים בכל התקנת מיקרוקוסמוס כדי להקטין את ריכוז שפעת הגזים (איור 1) נוסף.
  8. הכן בקרה חיובית (POS CON). הוסף כמה גבישי שפעת 200 μl של השעיה תא MMA ולשים אותו בחלל אחד שקופית ריקה.
  9. מניחים צלחת פטרי (ד = 10 סנטימטרים) עם קצת אבקה של פחם פעיל בחלק התחתון של תא הדגירה כדי למזער ריכוז שפעת גזים בתא. כמו כן, מקום 04:56 50 כוסות מיליליטר עם מים סטריליים בתחתית כדי לשמור על לחות גבוהה בחדר.
    1. העבר את הגדרות מיקרוקוסמוס לתאי דגירה דגירה של 25 מעלות צלזיוס למשך 96 שעות. דגימות מקום באופן אקראי בתאי הגידול השונים שלא לכלול השפעות מיקום.
      הערה: AP זמן דגירה זהplies לפ oomycete ultimum. זה יכול להיות שונה עבור אורגניזמים אחרים.

4. Confocal סריקת לייזר מיקרוסקופית

  1. באופן אידיאלי להשתמש התקנת CLSM עם מיקרוסקופ הזקוף.
    הערה: ייתכן שיהיה מצויד בלמשל הצעת לייזרים קונבנציונליים, 488, 561 וקווי 633 nm לעירור או עם מקור לייזר לבן מתכונן.
  2. השתמש בהגדרות הבאות לאוסף של תמונות: עירור: 490 ננומטר (eGFP) ו585 ננומטר (mCherry) בעוצמת הלייזר המתאימה (עירור סימולטני); טווחי פליטה: 500-550 ננומטר (eGFP) ו605-650 ננומטר (mCherry); עדשה אובייקטיבית: immersible 63X NA 0.9 מים (בשל מרחק העבודה הארוך שלה); גודל צעד לZ- ערימות: 0.5 מיקרומטר.
  3. התקנת מיקרוקוסמוס פתוחה ולהשתמש באזמל כדי להסיר 1 PDA, 2, 3 ומחסום PDA. שים להחליק את מכסה זכוכית על גבי MMA ולחץ אותו בעדינות כדי להסיר בועות אוויר. שקופית הר על הבמה מיקרוסקופ. להוסיף טיפה של מים על גבי התלוש דואר כיסוי ולהשתמש בהגדרות mCherry למצוא תאי bioreporter במדגם.
  4. קבל סקירה מהירה של המדגם ולייעל את יחס אות לרעש באמצעות ערוץ זוהר-על מתחת לשולחן בדיקה לאדומה (mCherry) וירוק (eGFP). בחר מיקום אקראי במדגם לנתח הקרינה bioreporter.
    הערה: העובש עשוי להראות autofluorescence בטווח של פליטת bioreporter (למשל, autofluorescence הירוק) 17. הקפד לבחור אזורים ללא העובש אם זה המקרה.
  5. להגדיר ולהקליט Z- ערימות לכל תפקיד בירוק (eGFP) והאדום ערוץ (mCherry). למנוע הלבנה של המדגם על ידי חשיפה ארוכה לepifluorescence אור או אור הלייזר.
    1. חזור על שלב קודם לעשר עמדות אקראיות, תחולקנה באופן שווה.
  6. חזור על כל השלבים באמצעות אותן ההגדרות עבור כל הדגימות של מסלול המבחן (SAM), AIR CON, נג CON וPOS CON.
  7. ניתוח 5. תמונה

    הערה: כדי לנתח אדומה (mCherry) וירוק הקרינה (eGFP) בZ- ערימות נרשמו, בין אפשרויות אחרות ImageJ התוכנה החופשי 18 (http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html) יכול להיות בשימוש.

    1. הקפד להתקין את תוסף logi_tool (http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/4.4.10/).
    2. קובץ פתוח בImageJ. בחר "ערוצים לפצל" וערוץ ירוק קרוב. השתמש ב'אזור mCherry 'מאקרו מסופק כקובץ קוד משלים לכמת אזור של הקרינה אדומה בZ- מחסנית. התאם את הגדרות המועדפות במאקרו (מסומן באותיות מודגשות).
      1. פלט הוא שולחן עם פיקסלים שנמדדו מעל הסף (ומעל לגודל המינימאלי המוגדר) בערימת Z-.
        הערה: הסכום של כל הערכים הוא המספר הכולל של פיקסלים אדומים (אזור) בערימה.
    3. קובץ פתוח בImageJ. בחר "ערוצים לפצל" וערוץ אדום קרוב. השתמש במאקרו 216; int eGFP 'מסופק כקובץ קוד משלים לכמת עוצמת הקרינה ירוקה בערימת Z-. התאם את הגדרות המועדפות במאקרו (מסומן באותיות מודגשות).
      1. פלט הוא שולחן עם העוצמות והאזור הממוצעים של כל האובייקטים הירוקים מעל הסף (ומעל לגודל המינימאלי המוגדר) בZ- מחסנית. כדי לחשב את עוצמת הכוללת של פיקסלים ירוקים בערימה, להכפיל כל משמעות עוצמתם בשטח המקביל.
    4. לחשב את האינדוקציה היחסית eGFP (rel eGFP):
      משוואת 1 (1)
      הערה: מאחר mCherry בא לידי ביטוי constitutively, הערך כתוצאה של rel eGFP הוא מדד יחסי לסכום של eGFP בא לידי ביטוי בכמות מסוימת של תאים. אנא להתייחס גם לטבלה 3 לקבלת מידע נוספת על חישוב rel eGFP.
    "> 6. כימות כימית tle

    הערה: גם setups מיקרוקוסמוס ניתן להשתמש כדי לבצע כימות כימיות של כמויות שפעת translocated עם או בלי כיור מזהם א-ביוטי.

    1. לעטוף 15 בקבוקוני מיליליטר זכוכית, GC מיליליטר 1 בקבוקונים / MS ומוסיף ברדיד אלומיניום. מלא מתאדה מנות עם Na 2 SO 4; למקם את כל בתנורי מופל במשך 5 שעות ב 450 מעלות צלזיוס כדי להסיר זיהומים אפשריים. אחסן בתוך Na 2 SO 4 של ייבוש הופעל.
    2. חותך סיבי זכוכית מצופה PDMS לאורך סנטימטר 0.5. לשטוף סיבים ידי ניעור ארבע פעמים שעה 2 במתנול הטרי. חזור על השלבים כביסה עוד ארבע פעמים עם מים ultrapure וסיבים נקיים חנות במי ultrapure בבקבוקון זכוכית אטומה.
    3. הכן 1.5 L של טולואן / אצטון (3: 1, v / v) L 10 מיקרוגרם מכיל -1 phenanthrene-ד 10.
    4. בצע את השלבים 1, 2 ו -3 לפרוטוקול. הכן מיקרוקוסמוס ללא ביאורתאי eporter ללמוד תחבורת שפעת (SAM (-) וAIR CON (-)) ועם תאי bioreporter (SAM) כדי לוודא השפלה שפעת.
      1. אופציונאלי (ללא תאי bioreporter): שלושה PDMS מקום מצופה סיבי זכוכית (בדרך כלל משמש לניסויי SPME) ככיור מזהם מלאכותי וכמותיים בתוך MMA של SAM (-) באמצעות מלקחיים בסדר.
      2. הסר סיבי זכוכית באמצעות מלקחיים עדינים ולהעביר כל אחד לתוך בקבוקון / MS GC עם הוספה.
      3. הוסף 200 μl של טולואן ולנער אנכי O / N ולנתח באמצעות GC / MS. השתמש בהגדרות הניתנות בטבלה 2.
    5. העבר את MMA מחלל האמצע לתוך בקבוקון זכוכית 15 מ"ל ולהוסיף על שלוש מריות של Na 2 SO 4. מערבבים בעזרת מרית ביסודיות ולהוסיף 10 מיליליטר של ממס. מערבולת את התערובת ולנער אופקי O / N בחושך.
      1. העברה 1001; l מדגם לתוך בקבוקון GC / MS עם הוספה. הוסף 10 μl של acenaphthylene-ד 08 (-1 L 10 מ"ג) ולנתח באמצעות GC / MS באמצעות אותה התכנית כפי שמתואר ב6.4.3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

התוצאות שהוצגו כאן כבר פורסמה קודם לכן 15. נא עיין במאמר לדיון מכניסטית וסביבתי מפורט.

לאחר הקלטת תמונה באמצעות CLSM, הקרנת עוצמה מקסימלית ניתן לבצע באמצעות תוכנת מיקרוסקופ המתאימה או ImageJ כדי לקבל רושם ראשוני חזותי של המדגם וקבוצת הביקורת (איור 2). מאוחר יותר, ערכות נתונים עשויים להיות מוקרנות באופן שונה כדי להראות תכונות משמעותיות על ידי תוכנת הדמיה ספציפית. הבקרה החיובית (POS CON) מראה אינדוקציה ברורה eGFP (איור 2 א), ואילו השליטה באוויר (AIR CON) מציגה רקע רק הקרינה eGFP (איור 2). הקרינה eGFP במדגם הבדיקה (SAM) מופיעה להיות גבוהה בהשוואה לCON AIR, yet לא כפי שמסומן כCON POS (איור 2 ג). הקרינה mCherry היא עצמאית משפלת PAH ולכן דומה עבור כל הדגימות. עם זאת, אותות eGFP מעט מוגבהים לא יזוהו על ידי שיטה זו וניתוח תמונה הבא הוא חיוני.

למיקרוקוסמוס נבדק, בדיקה ויזואלית הושלמה בניתוח תמונה וחישוב של אינדוקציה eGFP היחסית (שלב 5 השווה ff של הפרוטוקול; איור 3). הקרינה הרקע הירוקה לB. המושרה שאינו sartisoli RP037-mChe מחושב עם NEG CON. בתנאים נתון, האינדוקציה eGFP היחסית נמצאה rel eGFP = 0.53. לא נמצא הבדל משמעותי ניתן היה לזהות בין NEG CON וAIR CON (rel eGFP = 0.54; p> 0.95) ובכך לא כולל כל הובלת שפעת אדים-שלב לכיוון תאי bioreporter. לקופת CON, אינדוקציה eGFP הגבוהה ביותר (rel eGFP = 53.7) נמצאו מאשרות את החיוניות של התאים בMMA לאחר 96hr ומייצגים את האינדוקציה eGFP המרבית. בנוכחות mycelia והשפעת (SAM), eGFP היה מושרה באופן משמעותי בהשוואה לתאי הבקרה השלילית (rel eGFP = 1.15; p <0.001). עם זאת, האינדוקציה eGFP היא יחסית נמוכה בהשוואה לביקורת החיובית (ראה טבלת 3, נקודה 8).

תחבורה של שפעת על ידי mycelia של פ ultimum בהתקנת מיקרוקוסמוס היה לכמת באופן כימי (שלב השווה 6 ff של הפרוטוקול; איור 4). בנוכחות של שפעת וP. ultimum (SAM (-)), mycelia טראנסממוקם כ 25ng של שפעת בתוך 96hr אשר שווה לשיעור תחבורה של 37.5pmold -1 -1 סנטימטר. בקרות בהעדר mycelia (AIR CON (-)) תחבורת שפעת גזים לMMA חשפו בטווח של 2ng רק בתוך 96hr, כלומר, אינדוקציה של bioreporter על ידי אדים-שלב-ריכוזים יכולה להיות שלילית. כאשר B.sartisoli RP037-mChe היה נוכח (SAM), <1ng של שפעת התגלה בתיקון MMA. השפלה זו אומתה יעילה שפעת חיידקים לאחר טרנסלוקציה בתיווך mycelia.

אפשר לחקור את ההשפעה של השפלה חיידקים, כלומר, של כיור שפעת, על טרנסלוקציה שפעת על ידי הוספת כיור מזהם אביוטי למערכת (שלב השווה 6.4.1 ff לפרוטוקול). לפיכך, אחד הוא מסוגל לכמת את הכמות של שפעת נקלטה על ידי הסיבים והסכום שנותר בתוך MMA והעובש שמעליה. לSAM(-), הסכום הכולל של translocated הוא עצמאי מנוכחותו של כיור מזהם (p> 0.9; איור 5 א '). עם זאת, מיקרוקוסמוס עם אזור ספיגה מוגבר שפעת נבדק גם כפי שתואר בפירוט קודם לכן 15. יש, עלייה משמעותית מסכום השפעת translocated ניתן הייתה לזהות (איור 5).

איור 1
איור 1. ציור סכמטי ותמונות של התקנת מיקרוקוסמוס השלמה. מבט מלמעלה () ומן הצד (B). כל התיקונים אגר הונחו על גבי שקופית עם שלושה חללים קטנים. שני מ"ג של גבישי שפעת הונח בתוך חלל (d = 5 מ"מ) באמצע כף היד PDA 1. 2 היה טרי מגודל עם העובש של פ ultimum מול מחשב כף היד 1. חתיכת PDA מעוקלת הוצבה בין מחשב כף היד 2 ותיקון MMA ל ליצור חיץ שפעת מכאני יחד עם המכסה של צלחת פטרי (d = 5 סנטימטרים). ארבעה תיקונים אגר המכילים פחם פעיל הונחו בהתקנה כדי להקטין את ריכוז שפעת גזים נוסף. תמונות של המיקרוקוסמוס המלא מלמעלה (C) ומבט אלכסוני (ד ') ללא מיקרואורגניזמים ושפעת. דמויות 1A ו -1 B שונו באישור et al Schamfuss. 15 מעובד באישור Schamfuss, S. et al. השפעה של mycelia על הנגישות של fluorene לPAH-משפיל חיידקים. Environ. Sci. Technol. 47, 6,908-6,915. כל זכויות שמורות (2013) האגודה האמריקנית לכימיה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

pg "/>
2. תחזיות איור מרבי עוצמת micrographs סריקת לייזר confocal. Micrographs הם לדמיין את האינדוקציה mCherry וeGFP של B. חיידק bioreporter sartisoli RP037-mChe בMMA. כאשר היו לי חיידקי קשר למקור שפעת גבישים בMMA (POS CON;), אות eGFP היא גבוה בהשוואה לקבוצת ביקורת (AIR CON; B). דוגמאות עם שפעת וP. ultimum (SAM; C) גם להראות אות eGFP גבוהה, אולם מתון יותר מאשר הביקורת החיובית. mCherry בא לידי ביטוי constitutively ולכן משמש כבקרה חזותית כדי לזהות את התאים. (הגדלה 630X, בר 20 מיקרומטר). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

"Fo: לשמור-together.within-page =" תמיד "> איור 3
איור 3. אינדוקציה יחסית eGFP בB.sartisoli RP037-צ'ה לנג CON, AIR CON וSAM עם mycelia ושפעת. השוואה בין האינדוקציה eGFP היחסית (rel eGFP) על ידי B.sartisoli RP037-צ'ה לאחר 96hr בהעדר של שפעת (NEG CON), בנוכחות של שפעת אך היעדר P.ultimum (AIR CON) ובנוכחותם של שתי שפעת וP.ultimum (SAM). הבדלים מובהקים סטטיסטי לנג CON מסומנים בכוכבית. ניסויים בוצעו בtriplicates העצמאי לAIR CON ו לנג CON, בהתאמה. דגימה אחת נבדקה לקופת CON וrel eGFP חושבה עם 53.7. נתון זה השתנה באישור Schamfuss et al. 15 מעובד באישור Schamfuss, S. et al. ההשפעה של mycelia על הנגישות של fluorene לPAH-משפיל חיידקים. Environ. Sci. Technol. 47, 6,908-6,915. כל זכויות שמורות (2013) האגודה האמריקנית לכימיה.

איור 4
(AIR CON (-)) איור 4. כימות שפעת כימית סה"כ כמויות של שפעת בNG מופק מתיקון MMA לאחר 96hr לתחבורת אדים-שלב ללא תאים. (Cf איור 1.), מ 'תחבורת ycelial ללא תאים (SAM (-)) ותחבורה mycelial עם תאים (SAM). נתון זה השתנה באישור Schamfuss et al. 15 מעובד באישור Schamfuss, S. et al. ההשפעה של mycelia על הנגישות של fluorene לPAH-משפיל חיידקים. Environ. Sci. Technol. 47, 6,908-6,915. כל זכויות שמורות (2013) האגודה האמריקנית לכימיה.

איור 5
איור 5. כימות כימי שפעת בנוכחותו של כיור מזהם א-ביוטי () סה"כ כמויות של שפעת בNG מופק מתיקון MMA לאחר 96hr לתחבורת mycelial עם או בלי כיור מזהם מלאכותי (SAM (. (Cf איור 1). - ) עם או בלי שיתוף PDMSסיבי ated). תוצאות (B) באותו למסלול בדיקה מגוון עם אזור ספיגה שפעת mycelial מוגבר. נתון זה השתנה באישור Schamfuss et al. 15 מעובד באישור Schamfuss, S. et al. ההשפעה של mycelia על הנגישות של fluorene לPAH-משפיל חיידקים. Environ. Sci. Technol. 47, 6,908-6,915. כל זכויות שמורות (2013) האגודה האמריקנית לכימיה.

שם שפעת Mycelia תאים יישום תגובות
SAM + + + CLSM
GC / MS
SAM (-) + - GC / MS אפשר גם עם סיבי PDMS ככיור מזהם מלאכותי
CON AIR + (+) + CLSM mycelia גדלה רק למחסום PDA; MMA אינו מכוסה
CON AIR (-) + (+) - GC / MS mycelia גדלה רק למחסום PDA; MMA אינו מכוסה
CON NEG - + + CLSM
POS CON + - + CLSM תאים ישירות נחשפים לגבישי שפעת

סקירת טבלת 1. מכל סוגי מדגם סיכום של כל דגימות הבקרה ובדיקה כוללים יישום (assay bioreporter - CLSM או כימות כימי - GC / MS). וcomposition (שפעת, mycelia ותאי bioreporter).

תנור
טמפ הראשוני 50 ° C
פעם ראשונה 2 דקות
שיעור C ° 15 דקות -1
טמפ 'סופי 300 ° C
זמן סופי 6.33 דקות
מזרק (PTV)
נפח הזרקה 0.5 μl
מצב splitless
לְטַהֵר 2.00 דקות
זרימת טיהור 50.0 מיליליטר דקות -1
טמפ הראשוני 80 ° C
פעם ראשונה 0.02 דקות
רמפות: שיעור 600 מעלות צלזיוס דקות -1
טמפ 'סופי 300 ° C
זמן סופי 10 דקות
טור
דגם J & W DB-5ms
אורך נומינלי 20 מ '
קוטר נומינלי 180 מיקרומטר
עובי סרט נומינלי 0.18 מיקרומטר
גז מוביל הליום 0.8 מיליליטר דקות -1
MSD Transferline 280 ° C
MSD
מצב SIM
MS מקור 230 ° C
MS Quad 150 ° C

טבלה 2. הגדרות לGC / MS. סיכום של כל ההגדרות לGC ו- MS לqfluorene uantify בsetups מיקרוקוסמוס.

החסרונות תגובה
1 צמיחה ראשונית ובדיקות חיוניות ללמוד את הצמיחה של האורגניזם mycelial של בחירה. כמה זמן ייקח להגיע לתיקון MMA? האם זה מעוכב על ידי מחסום cycloheximide? כמו כן לבדוק אם תאי bioreporter להישאר חיוניים בMMA כל הזמן באמצעות מבחני קליעה. אם לא, אחד יכול גם להוסיף מקור פחמן לMMA שאינו לגרום לאינדוקצית bioreporter. תכלול ניגוד הדדי אפשרי של חיידקים וmycelia.
2 שיעור צמיחת mycelial שיעור הצמיחה של האורגניזם mycelial לא צריך להיות איטי מדי, כי אחר תחבורת גז שלב של PAH עולה עם זמן דגירה ממושך. הפרוטוקול עשוי להיות מותאםכדי להוסיף PAH בשלב מאוחר יותר, אבל אז שוב, mycelia בנקודת החיסון לא יכולה להיות פעילה יותר.
3 ניידות חיידקים אם מיקרוסקופ לייזר סריקת נקודה משמש וזן החיידקים הוא ניעתי, ההקלטה והכימות של Z- ערימות עשויות להיות בלתי אפשריות בשל תנועה הפנימית של MMA. לפיכך, תנועת חיידקים יש למנוע, למשל, על ידי הגדלת האיתנות של MMA, באמצעות CLSM עם סורק מהיר או מיקרוסקופ לייזר דיסק מסתובב.
4 תחבורת אדים-שלב תחבורת אדים-שלב של כימי (לדוגמא, PAH) לתאי bioreporter חייבת להיות שלילית במידה מספקת שכן תאי bioreporter רגישים במיוחד לחומרים כימיים באדים-השלב. זוהי הנקודה הקריטית של כל הפרוטוקול כדי למנוע תוצאות חיוביות שגויות שנגרמו על ידי תחבורת גזים. שלב הגזריכוז יכול להיות מוערך באמצעות אנליזה כימית של AIR CON (-) וריכוזי אדים-שלב עשוי להיות מותאם לדוגמא על ידי הוספה יותר או פחות תיקוני agarose עם פחם פעיל.
5 רעילות זכור, כי ריכוזים גבוהים של חומר כימי שנבדק עשויים להיות השפעה רעילה על האורגניזם ו / או חיידקי mycelial.
6 Autofluorescence בדוק אם האורגניזם mycelial נבחר מראה כמה autofluorescence בטווח של אות bioreporter הצפויה. הקפד לבדוק בשלבי צמיחה שונים מאז autofluorescence עשוי להשתנות 17. אם autofluorescence מזוהה, כדי להיות בטוח להקליט Z- ערימות באזורים נטול mycelia.
7 הלבנה הקרינה mCherry היא בדרך כלל יציבה ואינו רגישה להלבנה בדו מיושםתאי oreporter. בניגוד לכך, eGFP מחמצנת די מהר. לכן, אין להשתמש בערוץ eGFP לדמיין המדגם לפני הקלטת Z- מחסנית.
8 אינדוקציה eGFP שם לב אינדוקציה eGFP נמוך בהשוואה לSAM CON POS. זה מוסבר על ידי ההגבלה מרחבית החזקה ונגישות נמוכה של מקור השפעת כדי לשמור על ריכוז נמוך מאוד אדים-שלב של שפעת (סעיף התוצאות האחרונות ע"ע). בהתאם לזן bioreporter נבחר וכימי, אזור הספיגה ליום 1 במחשב כף היד יכול להיות מגוון כדי להגדיל את שיעור התחבורה (איור 5). עם זאת, יש לו כדי להיחשב שזה גם מגדיל תחבורת אדים-שלב לכיוון תאי bioreporter.
9 חישוב rel eGFP שיטת החישוב שהוצגה לrel eGFP בי עוצמת פיקסלים ירוק בהשוואהלאזור של פיקסלים אדומים הוא רק אפשרות אחת. נא עיין בדיון לקבלת מידע נוסף.
10 גודל פיקסל שים לב שההגדלה של העדשה נבחרה וגורם זום פוטנציאל מיושם משפיעים על גודל פיקסל של התמונה. זה חייב להילקח בחשבון לפני ניתוח תמונה.
11 שברים זמינים ביולוגיים זכור כי הזמינות הביולוגית של המתחם מועבר מוערכת איכותית (לא כמותית) דרך האינדוקציה eGFP. לא נמצא קשר של eGFP-האינדוקציה היחסית מחושבת והשבריר הזמין הביולוגי היה ניסיון. עם זאת, זה ניתן להפנות ביישומים עתידיים.
12 מגבלות זיהוי זיהוי כימי. לכימות כימית של תרכובות אורגניות, מגוון רחב של concenניתן לאתר trations באופן מהימן. אנחנו הבחנו סכומים ב0ng הטווח ו1,000ng. כימות eGFP. אנחנו לעומת אינדוקציה היחסית eGFP בדגימות ללא מזהם (כלומר, 0ng מועבר), עם תחבורה בתיווך mycelia (כלומר, בין 20 ל 40ng מועבר; ראה איורים 4 ו -5) ועם קשר ישיר למקור הזיהום (כלומר, לכל היותר סכום זמין). שלושת מקרים אלה הוכיחו את עצמו גם להבחנה בשיטה שתוארה. עם זאת, אנחנו לא יכולים לצאת בהצהרה מפורטת יותר על הרזולוציה של האינדוקציה eGFP היחסית. בעיה זו ניתן לפנות בעתיד על ידי קישור כמויות מזהמים שונות עם האינדוקציה eGFP מקשרת בsetups מיקרוקוסמוס.
13 חומר צלחת פטרי צלחות פלסטיק פטרי עלולות לגרום להערכה נמוכה מדי של טרנסלוקציה PAH mycelial ו / או זמינות ביולוגית. לא זה צריךלהיות בעייתי, אם דוחות איכותיים הם שאפו. במקרה מדידות כמותיות מדויקות נדרשות, יישום של צלחות פטרי מזכוכית, צריך להיחשב למרות הכנה וטיפול יהיה נוח יותר.

דיון שולחן 3. מלכודות אפשריות. חסרונות אפשריים לפני ובמהלך הניסוי וההערות ואפשרויות מוצעים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

התקנת מיקרוקוסמוס הציגה הוכיחה מתאימה ללמוד את הזמינות הביולוגית של כימיקלים מופרדים מרחבית למשפילה אורגניזמים לאחר הספיגה והובלה בmycelia. תחבורת גז שלב פוטנציאלית של תרכובות נדיפות באופן חלקי מנוע ויכול להיות דמיינו תאי bioreporter חיידקים ללא הכנת מדגם משוכללת ובכך עם הפרעה מינימאלית של המערכת רגישה. באותו הזמן, אנליזה כימית של המדגם יכולה להתנהל בקלות ומאפשרת לשליטה טובה של התוצאות שנרכשו ולכימות של התחבורה הכוללת. עם זאת, כמה נקודות צריכים לשקול בזהירות לפני ותוך כדי ביצוע הניסוי. נקודה חשובה היא לשמור על מיקרוקוסמוס חופשי מכל זיהומים צולבים חיידקים או כימיים. זה יכול להיות מאתגר, מאז מיקרוקוסמוס רב מנוהלים במקביל ובכך, תאים גדולים דגירה (כגון ייבוש) נדרשים. לפיכך, חשוב לעקר את כל החלקים בזהירות לפני ההתקנה construction. עוד נקודה קריטית עשויה להיות היישום של צלחות פטרי פלסטיק למיקרוקוסמוס. למרות PAH וbioreporter לא מקבלים במגע ישיר, כמות מסוימת של PAH יכולה להיספג על ידי החומר הפלסטי. עם זאת, אנחנו רואים את זה לא בעייתי לפרוטוקול המתואר, שכן זה יביא, אם בכלל, בהערכה נמוכה מדי של PAH-טרנסלוקציה ו / או זמינות ביולוגית mycelial. בכל מקרה, אם נדרש כימות מדויק, יש לשקול החלפת חלקי פלסטיק עם חלקי זכוכית, למרות שהטיפול יהיה נוח יותר. נקודות נוספות שיש לשקול לערב את הזנים הנבחרים של חיידקים ופטריות (עיכוב אפשרי הדדי, צמיחה, ניידות וautofluorescence האפשרי), כימיקלים נבחרו (השפעות רעילות על מיקרואורגניזמים, התנודתיות, מגבלות זיהוי) והיבטים מעשיים (הלבנה, הגבלה של eGFP אינדוקציה וחישוב rel eGFP). ניתן למצוא סיכום של בעיות פוטנציאליות והערות המתאימות בטבלה 3.

השתמשנו התקנת מיקרוקוסמוס מודל זה כדי להדגים תחבורת mycelial שפעת והשפלה חיידקים שלאחר מכן במערכת בלתי רוויה ישירות על רמת אינטראקציה התא-mycelia. הגדרת המודל שלנו יכולה להיות מגוונת ומותאמת לצרכי שונים עם זנים שונים של חיידקים ופטריות, תרכובות כימיות, וכו 'לכן, המערכת יכולה לשמש לדוגמא (i) כדי להעריך את ההשפעה של mycelia על חיידקים בנוכחות כימי מוגבל אחר (למשל, רעיל) מקור, (ii) כדי לחזות את ההשפעה של mycelia על הזמינות הביולוגית של תרכובות לשפלת חיידקים, (iii) ללמוד את הזמינות הביולוגית מזהם בהתאם למרחק של חיידקים לווקטור או התחבורה (iv) כדי לחקור את ההשפעה של מקורות שונים כימיים (לדוגמא, גבישים, באדמה או מומסים). עם זאת, ההתאמה של המערכת לתנאי lternate יהיו עדינים וצריכים להתנהל צעד אחר צעד על מנת להשיג תוצאות ברורות. עד כה, יש לנו לא בחנתי את המערכת לזני חיידקים או פטרייתי אחרות ותרכובות אחרות מאשר PAH. עם זאת, מאז רשתות mycelial ידועות להובלה גם מזהמים אחרים מאשר PAH כמו חומרי הדברה 19 או חומרים מסיסים כמו salicylate 20, אנחנו חושבים שהמערכת ניתן להרחיב לתרכובות כימיות שונות שניתנו biosensor חיידקי מתחם ספציפי.

אנא שים לב כי בהתאם לbioreporter מיושם להתאמץ חישוב rel eGFP שונה עשוי להיות עדיף. במקום משוואה (1) שתי האפשרויות הבאות יכולות להיות מיושמות:

משוואה 2 (2)

משוואה 3 (3)

However, במשוואת הפרוטוקול המובאת (1) נבחר בשל הסיבות הבאות: עוצמת eGFP (i) דווחה לתאם לשטף PAH לתא 14 ואילו (ii) mCherry דווח להראות וריאציות רבות לתאים שונים 13 . משוואה (2) ו- (3), בניגוד לכך, ניתן לבחור כדי למנוע מידע כוזב מחפצי אור פוטנציאל במדגם. בכל מקרה, השווינו את כל שלוש שיטות חישוב אחד עם השני, לפיה ניתן היו למצוא הבדלים משמעותיים מבחינה סטטיסטית. ובכל זאת, כתוצאה מהשינויים שדווחו בעוצמת הקרינה של mCherry, אנו ממליצים להשתמש במשוואה (1) או (2).

בסופו של כמה מגבלות של הטכניקה, צריכים להיחשב. מאז מיקרוקוסמוס נועד למנוע תחבורת גז שלב של המתחם נבדק, ספיגת mycelial של המתחם מצטמצמת. כתוצאה מכך שיעורי תחבורה נמוכים מאשר היה צפוי עם ספיגה ללא הפרעה. לפיכך, את הרגישות של-הרפואיזן השוער חייב להיות גבוה מספיק כדי לזהות שינויים קטנים שבברים זמינים ביולוגיים. יתר על כן, ההגדרה סבירה להניח שלא להיות מתאימה לזני פטריות עם שיעור צמיחה נמוך. במקרה זה, דגירה ארוכת טווח עשויה להעדיף תחבורת גז שלב של החומר המזהם ובכך מוביל לתוצאות חיוביות שגויות. זה יכול להיות אפשרי לשנות את ההגדרה באופן שהזיהום יכול להיות מיושם בשלב מאוחר יותר. עם זאת, העובש יכול להיות אז כבר לא פעיל או מת בנקודת החיסון. לבסוף, כאמור לעיל, מגוון של תרכובות כימיות המועברים על ידי רשתות mycelial הוא גדול. עם זאת, על זמינותו של זן bioreporter מתאים עשויה להיות גורם מפתח הגבלה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Confocal Microscope Leica TCS SP5X, LAS AF - Version 2.6.1; or equivalent CLSM
GC HP 7890 Series GC and Agilent 5975C MSD Agilent an equivalent GC/MS may be used
GC capillary column J&W 121-5522              Agilent
Cork borer Fisher Scientific 12863952 or any other
Cover slips Marienfeld 107222 High performance, No.1.5H
GC/MS insterts WICOM WIC 47080
GC/MS vials 2 ml WICOM WIC 41150
Lids / septa for screw cap vials DIONEX 49463 / 049464 
Lids for GC/MS vials WICOM WIC 43948/B
Objective Slides Menzel ordinary
PDMS coated glass fibers Polymicro Technologies, Inc. V (PDMS) = 13.55 ± 0.02 µl m-1
Petri Dishes small / big Greiner 633-102 / 628-102
Screw cap vials 40 ml DIONEX 48783 other glass vials may be used
Screw cap vials 60 ml DIONEX 48784 other glass vials may be used
Acenaphthylene d08 Dr. Ehrenstorfer C 20510100
Acetone Carl Roth 9372.2
Activated carbon Sigma-Aldrich 242276-1kg
Agarose Carl Roth 2267.4
Fluorene Fluka 46880
Kanamycin sulfate Carl Roth T832.2 50 mg L-1
Methanol Carl Roth P7171
Minimal Medium: 100 ml Solution 1 + 25 ml Solution 2 + 5 ml Solution 3 ad. 1,000 ml aqua dest
Solution 1
Ammonium sulfate Carl Roth 3746.1 5 g L-1 
Magnesium chloride x 6 H2O Carl Roth 2189.1 1 g L-1
Calcium nitrate x 4 H2O Carl Roth P740.1 0.5 g L-1
Solution 2
Disodium phosphate Carl Roth P030.1 55.83 g L-1
Monopotassium phosphate Carl Roth 3904.1 20 g L-1
Solution 3 (pH 6.0)
Disodium EDTA MERCK 1084180250 0.8 g L-1
Iron(II) chloride x 4 H2O MERCK 1038610250 0.3 g L-1
Cobalt(II) chloride x 6 H2O Carl Roth T889.3 4 mg L-1
Manganese(II) chloride x 1 H2O Carl Roth 4320.2 10 mg L-1
Copper(II) sulfate Carl Roth P023.1 1 mg L-1
Sodium molybdate x 2 H2O Carl Roth 0274.1 3 mg L-1
Zinc chloride MERCK 1088160250 2 mg L-1
Lithium chloride Carl Roth P007.1 0.5 mg L-1
Tin(II) chloride x 2 H2O Carl Roth 4473.1 0.5 mg L-1
Boric acid Riedel-de-Haen              11606 1 mg L-1
Potassium bromide Carl Roth A137.1 2 mg L-1
Potassium iodide Carl Roth 6750.1 2 mg L-1
Barium chloride Carl Roth 4453.1 0.5 mg L-1
MMA Minimal medium + agarose 0.2%
Phenanthrene d10 Dr. Ehrenstorfer C 20920100
Potato Dextrose Agar: 24 g L-1 broth + bacto-agar 1.5%; pH 6.8
Potato Dextrose broth Difco/ Beckton Dickinson 254920
Bacto-agar Difco/ Beckton Dickinson 214040
Sodium acetate x 3 hydr. Carl Roth 6779.1
Sodium sulfate MERCK 1066495000
Toluene MERCK 1083252500
mTY medium: 3 g L-1 yeast extract, 5 g L-1 bacto tryptone and 50 mM NaCl
Yeast extract Merck 1037530500
Tryptone Serva 4864702
Sodium chloride Carl Roth 3957.1
ImageJ with logi tool plugin http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html and http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/4.4.10
Pythium ultimum strain 67-1 Obtained from the lab of Dr. Christoph Keel; Department of Fundamental Microbiology, University of Lausanne, Switzerland
Burkholderia sartisoli RP037-mChe Obtained from the lab of Prof. Jan Roelof van der Meer; Department of Fundamental Microbiology, University of Lausanne, Switzerland

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Holden, P. A., Fierer, N. Microbial processes in the vadose zone. Vadose Zone Journal. 4, 1-21 (2005).
  2. Whitman, W. B., Coleman, D. C., Wiebe, W. J. Prokaryotes: The unseen majority. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95, 6578-6583 (1998).
  3. Kieft, T. L., et al. Microbial abundance and activities in relation to water potential in the vadose zones of arid and semiarid sites. Microbial ecology. 26, 59-78 (1993).
  4. Wang, G., Or, D. Aqueous films limit bacterial cell motility and colony expansion on partially saturated rough surfaces. Environ. Microbiol. 12, 1363-1373 (2010).
  5. Griffin, D. M. Water Potential Relations in Soil Microbiology SSSA Special Publication. Parr, J. F., Gardner, W. R., Elliott, L. F. Soil Science Society of America. 141-151 (1981).
  6. Papendick, R. I., Camprell, G. S. Water Potential Relations in Soil Microbiology SSSA Special Publication. Parr, J. F., Gardner, W. R., Elliott, L. F. Soil Science Society of America. 1-22 (1981).
  7. Boswell, G. P., Jacobs, H., Davidson, F. A., Gadd, G. M., Ritz, K. Functional consequences of nutrient translocation in mycelial fungi. J. Theor. Biol. 217, 459-477 (2002).
  8. Jennings, D. H. Translocation of solutes in fungi. Biol. Rev. Camb. Philos. Soc. 62, 215-243 (1987).
  9. Bais, H. P., Weir, T. L., Perry, L. G., Gilroy, S., Vivanco, J. M. The role of root exudates in rhizosphere interactions with plants and other organisms. Annu. Rev. Plant Biol. 57, 233-266 (2006).
  10. Furuno, S., et al. Mycelia promote active transport and spatial dispersion of polycyclic aromatic hydrocarbons. Environ. Sci. Technol. 46, 5463-5470 (2012).
  11. Gao, Y., Cheng, Z., Ling, W., Huang, J. Arbuscular mycorrhizal fungal hyphae contribute to the uptake of polycyclic aromatic hydrocarbons by plant roots. Bioresour. Technol. 101, 6895-6901 (2010).
  12. Semple, K. T., Morriss, A. W. J., Paton, G. I. Bioavailability of hydrophobic organic contaminants in soils: fundamental concepts and techniques for analysis. Eur. J. Soil. Sci. 54, 809-818 (2003).
  13. Tecon, R., Binggeli, O., vander Meer, J. R. Double-tagged fluorescent bacterial bioreporter for the study of polycyclic aromatic hydrocarbon diffusion and bioavailability. Environ. Microbiol. 11, 2271-2283 (2009).
  14. Tecon, R., Wells, M., vander Meer, J. R. A new green fluorescent protein-based bacterial biosensor for analysing phenanthrene fluxes. Environ. Microbiol. 8, 697-708 (2006).
  15. Schamfuss, S., et al. Impact of mycelia on the accessibility of fluorene to PAH-degrading bacteria. Environ. Sci. Technol. 47, 6908-6915 (2013).
  16. Smibert, R. M., Krieg, R. M., et al. Manual of methods for general bacteriology. Gerhardt, P., Murray, R. G. E., Costilow, R. N., Nester, E. W., Wood, W. A., Krieg, N. R., Phillips, G. B. 19, American Society for Microbiology. Washington, D.C. 409-443 (1981).
  17. Wu, C. H., Warren, H. L. Natural autofluorescence in fungi and its correlation with viability. Mycologia. 76, 1049-1058 (1984).
  18. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
  19. Pedersen, C., Sylvia, D. Ch. 8 Concepts in Mycorrhizal Research. Handbook of Vegetation Science. Mukerji, K. G. Vol. 19, Springer. Netherlands. 195-222 (1996).
  20. Furuno, S., et al. Fungal mycelia allow chemotactic dispersal of polycyclic aromatic hydrocarbon-degrading bacteria in water-unsaturated systems. Environ. Microbiol. 12, 1391-1398 (2010).
גישת Bioreporter תא כל להערכת תחבורה וזמינות ביולוגית של מזהמים אורגניים במערכות לא רוויים מים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schamfuß, S., Neu, T. R., Harms, H., Wick, L. Y. A Whole Cell Bioreporter Approach to Assess Transport and Bioavailability of Organic Contaminants in Water Unsaturated Systems. J. Vis. Exp. (94), e52334, doi:10.3791/52334 (2014).More

Schamfuß, S., Neu, T. R., Harms, H., Wick, L. Y. A Whole Cell Bioreporter Approach to Assess Transport and Bioavailability of Organic Contaminants in Water Unsaturated Systems. J. Vis. Exp. (94), e52334, doi:10.3791/52334 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter