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Environment

एक पूरे सेल Bioreporter दृष्टिकोण जल असंतृप्त सिस्टम में कार्बनिक contaminants के परिवहन और bioavailability का आकलन करने के लिए

doi: 10.3791/52334 Published: December 24, 2014

Summary

Burkholderia sartisoli RP037-mChe के साथ एक पूरे सेल bioreporter परख एक पानी असंतृप्त मॉडल प्रणाली में हवा से भरा pores के ब्रिजिंग mycelia द्वारा सक्रिय परिवहन के बाद बैक्टीरियल गिरावट के लिए उपलब्ध एक जैविक प्रदूषक (यानी, fluorene) के भागों का पता लगाने के लिए विकसित किया गया था।

Introduction

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मिट्टी घनी बैक्टीरिया जैसे सूक्ष्म जीवाणुओं 1,2 की एक विस्तृत श्रृंखला की आबादी है। हालांकि, इस निवास स्थान में स्थिति विशेष रूप से पानी की उपलब्धता 3 के मामले में चुनौती दे रहे हैं। जीवाणु स्थायी रूप से विषम वातावरण में 4 इष्टतम स्थितियों के लिए खोज करने की जरूरत है, लेकिन निरंतर पानी फिल्मों के अभाव में स्वतंत्र रूप से प्रसार करने के लिए उन्हें निरोधक प्रतिबंधित गतिशीलता 5 में जिसके परिणामस्वरूप है। इसके अलावा, विलेय के प्रसार की दर (जैसे, पोषक तत्वों) असंतृप्त शर्तों 6 के तहत कम कर रहे हैं। इस प्रकार, बैक्टीरिया और पोषक तत्वों अक्सर शारीरिक रूप से अलग हो रहे हैं और पोषक तत्वों की पहुँच क्षमता 3 सीमित है। एक परिणाम के रूप में, एक निरंतर पानी चरण की आवश्यकता नहीं है, जो रासायनिक यौगिकों के लिए एक परिवहन वेक्टर इन सीमाओं को पार करने के लिए मदद कर सकता है। वास्तव में, इस तरह के कवक और oomycetes के रूप में कई सूक्ष्मजीवों जिससे तक पहुँचने और Mobi हवा से भरा ताकना रिक्त स्थान के माध्यम से विकसित करने के लिए उन्हें सक्षम एक filamentous विकास के रूप में विकसित किया हैLIZING भी शारीरिक लंबी दूरी पर पोषक तत्वों 7 और कारबोनकेयस 8 पदार्थों अलग कर दिया। वे भी बैक्टीरिया से 9 तक शर्करा और अन्य ऊर्जा स्रोतों वितरित जो जैविक परिवहन वैक्टर के रूप में कार्य कर सकते हैं। तेज और फुई वाला जीवों में परिवहन भी ऐसे Pythium ultimum 10 में या arbuscular Mycorrhizal कवक 11 में POLYCYCLIC सुरभित हाइड्रोकार्बन (पीएएच) के रूप में हाइड्रोफोबिक जैविक प्रदूषण के लिए दिखाया गया है। पीएएच सर्वव्यापी और खराब पानी में घुलनशील contaminants को मिट्टी में 12 हैं, mycelia की मध्यस्थता परिवहन संभावित बैक्टीरियल degraders के लिए संदूषक जैव उपलब्धता बढ़ाने के लिए मदद कर सकता है। संदूषक परिवहन की कुल राशि रासायनिक द्वारा सीधे मात्रा निर्धारित किया जा सकता है जबकि अपमानजनक बैक्टीरिया और अन्य जीवों के लिए mycelia द्वारा पहुँचाया contaminants के जैव उपलब्धता आसानी से मूल्यांकन नहीं किया जा सकता है, 10 का मतलब है।

निम्नलिखित प्रोटोकॉल myce के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करता हैएक सीधे तरीके से बैक्टीरिया degraders को संदूषक जैव उपलब्धता पर Lia; यह माइक्रोबियल पारिस्थितिक तंत्र पर contaminants के spatiotemporal प्रभाव के बारे में जानकारी एकत्र करने की अनुमति देता है। हम कैसे फुई वाला परिवहन वैक्टर के माध्यम से पीएएच अपमानजनक bioreporter बैक्टीरिया के साथ एक शारीरिक रूप से अलग पीएएच बिंदु स्रोत को जोड़ने के द्वारा मिट्टी में हवा-पानी इंटरफेस नकल उतार एक विस्तृत असंतृप्त सूक्ष्म जगत प्रणाली स्थापित करने का वर्णन है। हवाई परिवहन को बाहर रखा गया है, क्योंकि बैक्टीरिया के लिए पीएएच जैव उपलब्धता पर फुई वाला आधारित परिवहन के प्रभाव को एक अलग तरीके से अध्ययन किया जा सकता है। अधिक विस्तार में, तीन अंगूठी पीएएच fluorene, फुई वाला जीव Pythium ultimum और bioreporter जीवाणु Burkholderia sartisoli RP037-mChe 13 में वर्णित सूक्ष्म जगत setups में लागू किया गया। जीवाणु बी sartisoli RP037-mChe मूल कोशिका से 14 phenanthrene अपशिष्टों का अध्ययन करने के लिए निर्माण किया गया था और करने के लिए पीएएच प्रवाह का एक परिणाम के रूप में हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (EGFP) बढ़ी व्यक्त कियाmCherry अनिवार्यता से व्यक्त किया जाता है लाल fluorescing जबकि सेल,। संवाददाता निर्माण पर विस्तृत जानकारी Tecon एट अल। प्रारंभिक परीक्षणों में 13 द्वारा दिया जाता है, जीवाणु कोई तैराकी और केवल बहुत धीमी गति से रेंगनेवाले क्षमता का पता चला। यह hyphae के शीर्ष पर एक घने निलंबन के रूप में लागू किया जब Pythium ultimum की hyphae पर धीरे-धीरे विस्थापित करने में सक्षम था। बैक्टीरिया निम्नलिखित प्रोटोकॉल में agarose में एम्बेडेड किए गए थे, hyphae पर माइग्रेशन नहीं होती थी।

लेजर confocal माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग (CLSM) का उपयोग करना, bioreporter बैक्टीरिया लघु में सीधे देखे जा सकते हैं और EGFP की अभिव्यक्ति सॉफ्टवेयर ImageJ की मदद से (mCherry संकेत करने के लिए आनुपातिक) कोशिकाओं की राशि के संबंध में मात्रा निर्धारित किया जा सकता है। यह विभिन्न परिदृश्यों में गुणात्मक जैव उपलब्धता की तुलना की अनुमति देता है (यानी, अधिक या कम)। फ्लू पी द्वारा फुई वाला परिवहन बाद bioavailable हो पाया था ultimum (यानी, यह) एक नकारात्मक नियंत्रण की तुलना में अधिक था। इसके अलावा, प्रोटोकॉल रासायनिक तरीकों के माध्यम से mycelia की मध्यस्थता परिवहन की कुल राशि यों के लिए और समान लघु में सिलिकॉन लेपित ग्लास फाइबर (SPME के ​​रेशों) का उपयोग संदूषक जैव उपलब्धता सत्यापित करने के लिए कैसे करें। इस सूक्ष्म जगत स्थापना का उपयोग कर परिणाम प्रकाशित और पी के संयोजन के लिए चर्चा की गई है ultimum, fluorene और बी sartisoli RP037-mChe 15। इधर, फोकस संभावित आगे अनुप्रयोगों के लिए इस ज्ञान प्रदान करने के लिए एक विस्तृत विधि विवरण और प्रोटोकॉल के संभावित नुकसान की पहचान पर स्थित है। इसके अलावा आवेदन पत्र (दूषित साइटों से जैसे,) विभिन्न कवक, जीवाणु प्रजातियों शामिल है, और अन्य contaminants (जैसे, कीटनाशकों) या दूषित-आपूर्ति (जैसे, वृद्ध मिट्टी) हो सकता है।

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Protocol

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व्यंजन, स्लाइड और ऊष्मायन कक्षों की 1. तैयारी

  1. प्रत्येक सूक्ष्म जगत के लिए निम्नलिखित सामग्री तैयार: एक बड़े प्लास्टिक पेट्री डिश नीचे (डी = 10 सेमी), संशोधित एक (कदम 1.2 देखें) lids के साथ छोटे प्लास्टिक पेट्री डिश नीचे (डी = 5 सेमी) और तीन cavities के साथ एक गिनती चैम्बर स्लाइड।
  2. पेट्री डिश नीचे भागों की वांछित संख्या (घ = 5 सेमी) ले लो। क्या वास्तव में एक स्लाइड (26 मिमी बढ़त लंबाई) फिट करने के लिए एक देखा के साथ सीमा का हिस्सा निकालें। प्रणाली बाँझ करने के लिए, 70% इथेनॉल हे / एन में पेट्री डिश पैंदा और lids लेना और यूवी प्रकाश के तहत एक प्रवाह कैबिनेट में कम से कम 2 घंटे के लिए उन्हें सूखी। भी दो घंटे के लिए यूवी प्रकाश को उजागर किया गया था, जो एक कसकर मोहरबंद प्लास्टिक कंटेनर में पेट्री डिश स्टोर।
  3. 70% इथेनॉल और साथ स्लाइड्स की वांछित संख्या साफ कर लें उन्हें हवा-सूखी। एल्यूमीनियम पन्नी में स्लाइड्स लपेटें और संभव संदूषण को दूर करने के लिए 450 डिग्री सेल्सियस पर 5 घंटे के लिए एक ओढ़ना भट्ठी में डाल दिया। Lids के साथ कांच ऊष्मायन कक्षों तैयार करें। 70% इथेनॉल के साथ स्वच्छ और एक प्रवाह कैबिनेट में कम से कम 2 घंटे के लिए यूवी प्रकाश के लिए खुला कक्षों बेनकाब।
    नोट: lids के साथ बड़े desiccators (30 सेमी के आसपास व्यास) इस उद्देश्य के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है; प्रत्येक desiccator दस सूक्ष्म जगत setups के लिए ऊपर घर हो सकता है।

मीडिया और संस्कृतियों के 2. तैयारी

  1. संशोधित tryptone-खमीर मध्यम (mTY) 14, 21C न्यूनतम मध्यम 16 (एम एम) के बारे में 150 मिलीलीटर, कम से कम मध्यम अगर की 5 मिलीलीटर की 100 मिलीलीटर प्राप्त, 20 समानांतर लघु चलाने के लिए;, तीन (एमएमए, 0.5% w / v) आलू डेक्सट्रोज अगर प्लेट (पीडीए, 1.5%, डब्ल्यू / वी) पी के लिए ultimum, चार खाली प्लेटें, 2 मिलीग्राम एल -1 cycloheximide, चार agarose प्लेटें युक्त एक पीडीए प्लेट (3%, डब्ल्यू / वी) 0.3 युक्त जी मिलीलीटर -1 सक्रिय कार्बन और 2 मिलीग्राम भागों में फ्लू के 40 मिलीग्राम।
  2. MTY केनामाइसिन के 50 मिलीग्राम एल -1 युक्त तैयार करें (केनामाइसिन requir हैएड बैक्टीरिया की खेती के लिए 10 मिमी एसीटेट युक्त EGFP संवाददाता प्लाज्मिड) और एम एम बनाए रखने के लिए। लघु में जीवाणुओं की स्थिरीकरण के लिए 0.5% एमएमए तैयार करने के लिए एसीटेट बिना एमएम का प्रयोग करें और Pythium ultimum और सूक्ष्म जगत setups की खेती के लिए 1.5% पीडीए की प्लेट (प्रत्येक 20 मिलीलीटर) डालना।
  3. पी के कुछ hyphae टीका लगाना तीन ताजा पीडीए प्लेटों पर ultimum और के बारे में 72 घंटे के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में सेते हैं। तब प्लेटों ताजा और शराबी फुई से पूरी तरह से ऊंचा हो गया है कि यह सुनिश्चित करें।
  4. बी की दो संस्कृतियों प्रारंभ एक ग्लिसरॉल स्टॉक से mTY के 50 मिलीलीटर में sartisoli RP037-mChe। 230 आरपीएम रोटरी कुप्पी आंदोलन हे / एन के साथ 30 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  5. उपाय संस्कृति ऑप्टिकल घनत्व (ओवर ड्राफ्ट) 578 एनएम और अपकेंद्रित्र 10 मिनट के लिए 1000 XG पर (बी sartisoli RP037-mChe के लिए उम्मीद है, आयुध डिपो 578 के बारे में 1.0 है और कोशिकाओं घातीय चरण में हैं)। सतह पर तैरनेवाला त्यागें और कोशिकाओं को फिर से निलंबितएमएम का एक उचित मात्रा में एक आयुध डिपो 0.4 से 578 तक पहुंचने के लिए। 50 मिलीग्राम एल -1 resuspended कोशिकाओं के 400 μl साथ kanamycin युक्त एमएम की 20 मिलीलीटर टीका लगाना। 230 आरपीएम रोटरी कुप्पी आंदोलन हे / एन के साथ 30 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  6. मिमी में संस्कृति के आयुध डिपो 578 उपाय (बी sartisoli RP037-mChe के लिए उम्मीद है, आयुध डिपो 578 के बारे में 0.2 है और कोशिकाओं जल्दी घातीय चरण में हैं)। अपकेंद्रित्र संस्कृति 10 मिनट के लिए 2000 XG पर 0.4 के एक आयुध डिपो तक पहुंचने के लिए एमएम का एक उचित मात्रा में कोशिकाओं को फिर से निलंबित। उपयोग जब तक 50 डिग्री सेल्सियस पर सेल 2 मिलीलीटर ट्यूब में गर्म, तरल एमएमए के 500 μl के साथ निलंबन और दुकान के 50 μl मिलाएं। प्रत्येक सूक्ष्म जगत के लिए एमएमए में कोशिकाओं के 150 μl का प्रयोग करें।
  7. सक्रिय कार्बन युक्त agarose जेल की प्लेटें डालो। Agarose पिघल (3%, w / v) दोहरा आसुत जल में। (छ मिलीलीटर -1 0.3) सक्रिय कार्बन के साथ अच्छी तरह मिक्स और प्लास्टिक पेट्री डिश में मिश्रण डालना(घ = 10 सेमी)।

बढ़ते 3. सूक्ष्म जगत

नोट:। पूरा सूक्ष्म जगत सेटअप चित्रा 1 में रेखाचित्र के रूप में दर्शाया गया है निम्न सभी अलग अलग चरणों के लिए एक चित्र को देखें। निम्नलिखित चरणों फुई वाला परिवहन वैक्टर और तीन अलग अलग नियंत्रण setups के (कोन एयर, चुनाव neg, कांग्रेस पीओएस) के साथ एक नमूना (एसएएम) की तैयारी के वर्णन कर रहे हैं। सब अलग अलग setups के एक सारांश तालिका 1 में पाया जा सकता है।

  1. पेट्री डिश और स्लाइड के वांछित नंबर ले लो और 30 मिनट के लिए एक प्रवाह कैबिनेट के तहत यूवी प्रकाश के लिए उन्हें बेनकाब।
  2. बड़ा एक के अंदर छोटे पेट्री डिश प्लेस और छोटे पेट्री डिश के अंतराल के माध्यम से स्लाइड फिट बैठते हैं। एमएमए में गर्म सेल निलंबन का एक नमूना ले लो और एक स्लाइड के बीच गुहा में 150 μl जोड़ें। सभी स्लाइड के बीच cavities के हैं जब तक इस चरण को दोहराएँएमएमए के साथ भर दिया। एमएमए जमना करने के लिए 5 मिनट तक प्रतीक्षा करें।
  3. एक खाली पीडीए थाली से परिपत्र पैच बाहर पंच के लिए एक 1 सेमी काग छिद्रक का प्रयोग करें। छोटे पेट्री डिश के अंदर एमएमए के लिए अगले 2 मिमी की दूरी पर एक पैच रखें। (चित्रा 1 में पीडीए 3) सेटअप में फुई वाला विकास को बढ़ावा देने के लिए इस जोड़ें।
  4. मैकेनिकल बाधाओं के रूप में घुमावदार पीडीए पैच काटें। एक स्वच्छ और बाँझ छोटे पेट्री डिश नीचे हिस्से का प्रयोग करें और एक पीडीए थाली में यह दबाएँ। एक पीडीए अंगूठी में जो परिणाम अगर में 0.5 सेमी की दूरी पर एक और छोटे अंगूठी कटौती करने के लिए एक रंग का प्रयोग करें।
    1. बिल्कुल सूक्ष्म जगत सेटअप में छोटे पेट्री डिश के अंतराल में फिट बैठता है जो एक टुकड़ा है, बाहर कट और स्लाइड के शीर्ष पर अंतर अंदर जगह है। एमएमए और परिपत्र पीडीए बाधा के बीच की दूरी के बारे में 2 मिमी है कि सुनिश्चित करें। धीरे पीडीए बाधा में दबाने छोटे पेट्री डिश के ढक्कन को बंद करें।
    2. दोहराएँ 2 जी एल युक्त एक पीडीए थाली के साथ 3.4 और 3.4.1 कदमों -1की cycloheximide।
      नोट: mycelia cycloheximide से हिचकते हैं और एमएमए ऊंचा हो जाना नहीं है, क्योंकि यह bioreporter कोशिकाओं की दिशा में हवाई परिवहन (कोन एआईआर) के लिए नियंत्रण सेटअप है।
  5. एक खाली पीडीए थाली के परिपत्र पैच बाहर पंच के लिए एक 1 सेमी काग छिद्रक का प्रयोग करें। पहले पैच के बीच बाहर कटौती करने के लिए एक और 0.5 सेमी काग छिद्रक का प्रयोग करें। पीडीए बाधा (चित्रा 1 में पीडीए 1) के बगल में एक मिमी की दूरी पर है जिसके परिणामस्वरूप छोटे पीडीए अंगूठी रखें।
  6. पीडीए 1. इस्तेमाल की छेद पी के साथ ऊंचा हो गया पीडीए प्लेटों से परिपत्र पैच बाहर कटौती करने के लिए एक 1 सेमी काग छिद्रक में फ्लू के 2 मिलीग्राम जोड़ें ultimum और फुई वाला चटाई फ्लू क्रिस्टल का सामना करना पड़ रहा है इतना है कि पीडीए अंगूठी पर नीचे नीचे (चित्रा 1 में पीडीए 2) एक पैच जगह है।
    1. फ्लू क्रिस्टल जोड़ने के बिना पिछले चरण को दोहराएँ।
      नोट: इस पृष्ठभूमि निर्धारित करने के लिए नकारात्मक नियंत्रण सेटअप (कांग्रेस NEG) हैbioreporter कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति।
  7. सक्रिय कार्बन युक्त अगर से परिपत्र पैच बाहर पंच के लिए एक 1 सेमी काग छिद्रक का प्रयोग करें। आगे गैसीय फ्लू एकाग्रता (चित्रा 1) में कमी करने के लिए प्रत्येक सूक्ष्म जगत सेटअप में चार पैच रखें।
  8. एक सकारात्मक नियंत्रण (कोन पीओएस) तैयार करें। एमएमए सेल निलंबन के 200 μl के लिए कुछ फ्लू क्रिस्टल जोड़ें और एक खाली स्लाइड का एक गुहा में डाल दिया।
  9. चैम्बर में गैसीय फ्लू एकाग्रता कम करने के लिए ऊष्मायन कक्ष के तल पर सक्रिय कार्बन के कुछ पाउडर के साथ एक पेट्री डिश (डी = 10 सेमी) रखें। इसके अलावा, चैम्बर में उच्च आर्द्रता बनाए रखने के लिए तल पर बाँझ पानी के साथ 4-5 50 मिलीलीटर बीकर जगह है।
    1. ऊष्मायन कक्षों में सूक्ष्म जगत setups के स्थानांतरण और 96 घंटे के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। बेतरतीब ढंग से विभिन्न विकास कक्षों में जगह नमूने स्थान प्रभाव बाहर करने के लिए।
      नोट: इस ऊष्मायन समय एपीoomycete पी को plies ultimum। यह अन्य जीवों के लिए अलग-अलग हो सकता है।

4. Confocal लेज़र स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी

  1. आदर्श रूप में ईमानदार माइक्रोस्कोप के साथ एक CLSM सेटअप का उपयोग करें।
    नोट: यह परंपरागत लेज़रों भेंट जैसे, उत्तेजना के लिए या एक tunable सफेद लेजर स्रोत के साथ 488, 561 और 633 एनएम लाइनों के साथ सुसज्जित किया जा सकता है।
  2. उत्तेजना: छवियों के संग्रह के लिए निम्न सेटिंग्स का उपयोग 490 एनएम (EGFP) और उपयुक्त लेजर तीव्रता (एक साथ उत्तेजना) पर 585 एनएम (mCherry); उत्सर्जन पर्वतमाला: 500 550 एनएम (EGFP) और 605-650 एनएम (mCherry) के लिए; उद्देश्य लेंस: (इसकी वजह से लंबे समय तक काम दूरी तक) 63X एनए 0.9 पानी immersible; 0.5 माइक्रोन: Z-ढेर के लिए कदम आकार।
  3. ओपन सूक्ष्म जगत सेटअप और पीडीए 1, 2, 3 और पीडीए बाधा दूर करने के लिए एक स्केलपेल का उपयोग करें। एमएमए के शीर्ष पर एक गिलास को कवर पर्ची रखो और हवाई बुलबुले को दूर करने के लिए धीरे यह दबाएँ। खुर्दबीन मंच पर माउंट स्लाइड। वें के शीर्ष पर पानी की एक छोटी बूंद जोड़ेंई कवर पर्ची और नमूने में bioreporter कोशिकाओं को खोजने के लिए mCherry सेटिंग्स का उपयोग करें।
  4. नमूने की एक त्वरित अवलोकन पाने के लिए और एक चमक से अधिक के तहत देखने की मेज लाल के लिए (mCherry) और ग्रीन (EGFP) चैनल का उपयोग शोर अनुपात करने के लिए संकेत का अनुकूलन। Bioreporter प्रतिदीप्ति का विश्लेषण करने के लिए नमूना पर एक यादृच्छिक स्थान चुनें।
    नोट: hyphae bioreporter उत्सर्जन (जैसे, हरी autofluorescence) 17 की रेंज में autofluorescence दिखा सकते हैं। यदि यह मामला है hyphae बिना क्षेत्रों का चयन करना न भूलें।
  5. परिभाषित करें और ग्रीन (EGFP) और लाल (mCherry) चैनल में प्रत्येक स्थिति के लिए Z-ढेर रिकॉर्ड है। Epifluorescence के प्रकाश या लेजर रोशनी करने के लिए लंबे समय जोखिम से नमूने के विरंजन से बचें।
    1. दस यादृच्छिक, समान रूप से वितरित पदों के लिए दोहराएँ पिछले चरण।
  6. परीक्षण ट्रैक (एसएएम), कोन एयर, चुनाव neg और कांग्रेस पीओएस के सभी नमूनों के लिए एक ही सेटिंग्स का उपयोग कर सभी चरणों को दोहराएँ।
  7. 5. छवि विश्लेषण

    नोट: अन्य विकल्पों के बीच मुक्त सॉफ्टवेयर ImageJ 18 (http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html) हो सकता है, दर्ज की गई जेड के ढेर में लाल (mCherry) और ग्रीन (EGFP) प्रतिदीप्ति का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया।

    1. Logi_tool प्लगइन (http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/4.4.10/) स्थापित करने के लिए सुनिश्चित करें।
    2. ImageJ में फाइल खोलें। "विभाजन चैनल" और करीब ग्रीन चैनल का चयन करें। Z ढेर में लाल प्रतिदीप्ति के क्षेत्र यों के लिए अनुपूरक कोड फ़ाइल के रूप में प्रदान की जाती मैक्रो 'mCherry क्षेत्र' का प्रयोग करें। मैक्रो में पसंदीदा सेटिंग्स समायोजित (बोल्ड में संकेत दिया)।
      1. आउटपुट Z-ढेर में मापा पिक्सल सीमा से ऊपर (और परिभाषित न्यूनतम आकार से ऊपर) के साथ एक टेबल है।
        नोट: सभी मूल्यों का योग ढेर में लाल पिक्सल (क्षेत्र) की कुल संख्या है।
    3. ImageJ में फाइल खोलें। "विभाजन चैनल" और करीबी लाल चैनल का चयन करें। मैक्रो का प्रयोग करें 216; अनुपूरक कोड फ़ाइल के रूप में प्रदान की जाती EGFP पूर्णांक 'Z-ढेर में हरी प्रतिदीप्ति की तीव्रता यों की। मैक्रो में पसंदीदा सेटिंग्स समायोजित (बोल्ड में संकेत दिया)।
      1. आउटपुट z ढेर सारे हरी वस्तुओं सीमा से ऊपर (और परिभाषित न्यूनतम आकार से ऊपर) का मतलब तीव्रता और क्षेत्र के साथ एक टेबल है। ढेर में हरे पिक्सल की कुल तीव्रता की गणना करने के लिए, प्रत्येक इसी क्षेत्र से तीव्रता मतलब गुणा।
    4. रिश्तेदार EGFP प्रेरण (EGFP रिलायंस एनर्जी) की गणना:
      1 समीकरण (1)
      नोट: mCherry अनिवार्यता से व्यक्त किया जाता है के बाद से, EGFP रिलायंस एनर्जी के परिणामी मूल्य कोशिकाओं की एक निश्चित राशि के द्वारा व्यक्त EGFP की राशि के लिए एक रिश्तेदार उपाय है। यह भी EGFP रिलायंस एनर्जी की गणना पर अधिक जानकारी के लिए 3 टेबल देखें।
    TLE "> 6। रासायनिक मात्रा

    नोट: सूक्ष्म जगत setups के भी साथ या एक अजैव संदूषक सिंक के बिना translocated फ्लू मात्रा में रासायनिक मात्रा का ठहराव प्रदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

    1. एल्यूमीनियम पन्नी में 15 मिलीलीटर कांच की शीशियों, 1 मिलीलीटर जीसी / एमएस शीशियों और आवेषण लपेटें। ना 2 के साथ तो चार बर्तन evaporating भरें; संभव संदूषण को दूर करने के लिए 450 डिग्री सेल्सियस पर 5 घंटे के लिए ओढ़ना भट्ठी में सभी जगह है। एक सक्रिय desiccator की ना 2 अतः 4 की दुकान के अंदर।
    2. 0.5 सेमी लंबाई में PDMS लेपित ग्लास फाइबर कट। ताजा मेथनॉल में चार बार 2 घंटा झटकों से फाइबर धो लें। दोहराएँ वाशिंग एक मोहरबंद कांच की शीशी में ultrapure पानी में ultrapure पानी और दुकान साफ ​​फाइबर के साथ एक और चार बार दोहराएँ।
    3. (: 1, वी / वी 3) युक्त 10 माइक्रोग्राम प्रति एल -1 phenanthrene-डी 10 टोल्यूनि / एसीटोन के 1.5 एल तैयार करें।
    4. चरण 1, 2 और प्रोटोकॉल के 3 प्रदर्शन करते हैं। Bior बिना लघु तैयार करेंफ्लू गिरावट सत्यापित करने के लिए और bioreporter कोशिकाओं (एसएएम) के साथ () - (-) और कोन एयर सैम () eporter कोशिकाओं फ्लू परिवहन अध्ययन करने के लिए।
      1. (Bioreporter कोशिकाओं के बिना) वैकल्पिक: सैम की एमएमए के अंदर कृत्रिम और quantifiable संदूषक सिंक के रूप में (आमतौर पर SPME के प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया) फाइबर ग्लास लेपित प्लेस तीन PDMS (-) ठीक संदंश का उपयोग कर।
      2. ठीक संदंश का उपयोग ग्लास फाइबर निकालें और डालने के साथ एक जीसी / एमएस शीशी में से हर एक को हस्तांतरण।
      3. टोल्यूनि के 200 μl जोड़ें और खड़ी हे / एन मिलाने और जीसी / एमएस के माध्यम से विश्लेषण करते हैं। तालिका 2 में प्रदान की सेटिंग्स का उपयोग करें।
    5. एक 15 मिलीलीटर कांच की शीशी में मध्य गुहा से एमएमए स्थानांतरण और अतः 4 ना 2 के तीन spatulas के बारे में जोड़ सकते हैं। अच्छी तरह से एक रंग का उपयोग मिक्स और विलायक के 10 मिलीलीटर जोड़ें। भंवर का मिश्रण है और अंधेरे में क्षैतिज हे / एन हिला।
      1. स्थानांतरण 1001; डालने के साथ जीसी / एमएस शीशी में नमूने के एल। Acenaphthylene-डी 08 (10 मिलीग्राम एल -1) के 10 μl जोड़ें और 6.4.3 में वर्णित के रूप में एक ही प्रोग्राम का उपयोग कर जीसी / एमएस के माध्यम से विश्लेषण करते हैं।

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Representative Results

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यहाँ प्रस्तुत परिणाम पहले से ही पहले 15 प्रकाशित किया गया है। विस्तृत यंत्रवत और पर्यावरण चर्चा के लिए लेख देखें।

CLSM के माध्यम से छवि रिकॉर्डिंग के बाद, एक अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण नमूना के पहले दृश्य प्रभाव और नियंत्रण (चित्रा 2) हासिल करने के लिए संबंधित माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर या ImageJ का उपयोग किया जा सकता है। बाद में, डेटा सेट विशिष्ट दृश्य सॉफ्टवेयर द्वारा सार्थक सुविधाओं को दिखाने के क्रम में अलग ढंग से पेश किया जा सकता है। सकारात्मक नियंत्रण (कोन पीओएस) हवाई नियंत्रण (कोन एयर), जबकि केवल पृष्ठभूमि EGFP प्रतिदीप्ति (चित्रा 2B) दर्शाती है, अलग EGFP प्रेरण (2A चित्रा) से पता चलता है। परीक्षण नमूना (एसएएम) में EGFP प्रतिदीप्ति कोन एयर, वाई की तुलना में ऊंचा हो गया लगता हैईटी कांग्रेस पीओएस (चित्रा -2) के रूप में चिह्नित के रूप में नहीं। mCherry प्रतिदीप्ति पीएएच गिरावट से स्वतंत्र और सभी नमूनों के लिए इसलिए समान है। हालांकि, थोड़ा ऊपर उठाया EGFP संकेतों इस विधि और बाद में छवि विश्लेषण से पता नहीं होगा आवश्यक है।

परीक्षण किया लघु लिए, दृश्य निरीक्षण छवि विश्लेषण और रिश्तेदार EGFP प्रेरण की गणना से पूरित था (Cf. कदम प्रोटोकॉल का 5 एफएफ, चित्रा 3)। गैर प्रेरित बी के लिए हरे रंग की पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति sartisoli RP037-mChe कांग्रेस NEG के साथ गणना की है। दी गई शर्तों के तहत, रिश्तेदार EGFP प्रेरण EGFP रिलायंस एनर्जी होना पाया गया = 0.53। कोई महत्वपूर्ण अंतर (EGFP रिलायंस एनर्जी कांग्रेस neg और कांग्रेस हवा के बीच पता लगाया जा सकता है = 0.54; p> 0.95) इस प्रकार bioreporter कोशिकाओं की दिशा में कोई वाष्प चरण फ्लू परिवहन को छोड़कर। कांग्रेस पीओएस के लिए, अत्यधिक ऊंचा EGFP प्रेरण (EGFP रिलायंस एनर्जी = 53.7) 96hr के बाद एमएमए में कोशिकाओं के जीवन शक्ति की पुष्टि और अधिकतम EGFP प्रेरण का प्रतिनिधित्व पाया गया था। Mycelia और फ्लू (एसएएम) की उपस्थिति में, EGFP (नकारात्मक नियंत्रण की तुलना में कोशिकाओं में काफी EGFP रिलायंस एनर्जी प्रेरित किया गया था = 1.15; पी <0.001)। हालांकि, EGFP प्रेरण सकारात्मक नियंत्रण (सीएफ 3 टेबल, बिंदु 8) की तुलना में अपेक्षाकृत कम है।

पी के mycelia द्वारा फ्लू के परिवहन ultimum सूक्ष्म जगत सेटअप में (; चित्रा 4 सीएफ कदम प्रोटोकॉल के 6 एफएफ) रासायनिक मात्रा निर्धारित किया गया था। फ्लू और पी की उपस्थिति में ultimum (एसएएम (-)), mycelia पार37.5pmold -1 सेमी -1 के परिवहन की दर के बराबर होती है जो 96hr भीतर फ्लू के 25ng के बारे में स्थित है। Mycelia के अभाव में नियंत्रण (कोन एयर (-)) केवल यानी, वाष्प चरण-सांद्रता द्वारा bioreporter की प्रेरण बाहर रखा जा सकता है, 96hr भीतर 2ng की रेंज में एमएमए में गैसीय फ्लू परिवहन का पता चला। B.sartisoli RP037-mChe (एसएएम) मौजूद था, <फ्लू के 1ng एमएमए पैच में खोजा गया था। Mycelia की मध्यस्थता स्थानान्तरण के बाद यह सत्यापित प्रभावी बैक्टीरियल फ्लू गिरावट।

यह सिस्टम (सीएफ कदम प्रोटोकॉल का 6.4.1 एफएफ) के लिए एक अजैव संदूषक सिंक जोड़कर फ्लू स्थानान्तरण पर एक फ्लू सिंक के जीवाणु गिरावट, यानी, के प्रभाव की जांच के लिए संभव है। इस प्रकार, एक फाइबर द्वारा अवशोषित फ्लू की राशि और एमएमए और overlying hyphae के अंदर छोड़ दिया राशि यों करने में सक्षम है। सैम के लिए(-), कुल translocated राशि एक contaminant सिंक की उपस्थिति से स्वतंत्र है (P> 0.9, चित्रा 5A)। पहले 15 विस्तार में वर्णित के रूप में हालांकि, वृद्धि हुई फ्लू तेज क्षेत्र के साथ एक सूक्ष्म जगत भी परीक्षण किया गया था। वहाँ, translocated फ्लू राशि का एक महत्वपूर्ण वृद्धि (चित्रा 5 ब) का पता लगाया जा सकता है।

चित्रा 1
चित्रा 1. योजनाबद्ध ड्राइंग और पूरा सूक्ष्म जगत सेटअप की तस्वीरें। शीर्ष (ए) से देखें और पक्ष से (बी)। सभी अगर पैच तीन छोटे cavities के साथ एक स्लाइड के शीर्ष पर रखा गया था। फ्लू क्रिस्टल के दो मिलीग्राम पीडीए 1. के बीच पीडीए 2 में एक गुहा (घ = 5 मिमी) के अंदर रखा गया पी के hyphae साथ हौसले से ऊंचा हो गया था पीडीए 1. सामना करना पड़ रहा ultimum एक घुमावदार पीडीए टुकड़ा पीडीए दो और एमएमए पैच के बीच रखा गया था एक पेट्री डिश (डी = 5 सेमी) के ढक्कन के साथ एक साथ एक यांत्रिक फ्लू बाधा पैदा करते हैं। सक्रिय कार्बन युक्त चार अगर पैच आगे गैसीय फ्लू एकाग्रता में कमी करने के लिए सेटअप में रखा गया था। सूक्ष्मजीवों और फ्लू के बिना शीर्ष (सी) और विकर्ण दृश्य (डी) से पूरा सूक्ष्म जगत की तस्वीरें। आंकड़े 1 ए और 1 बी Schamfuss एट अल से अनुमति के साथ संशोधित किया गया है। 15 Schamfuss, एस एट अल से अनुमति के साथ अनुकूलित। Mycelia का प्रभाव fluorene की पहुंच पर बैक्टीरिया PAH-अपमानजनक। पर्यावरण। विज्ञान। तकनीक। 47, 6908-6915। कॉपीराइट (2013) अमेरिकन केमिकल सोसायटी। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पीजी "/>
लेजर confocal स्कैनिंग micrographs की चित्रा 2. अधिकतम तीव्रता के अनुमानों। Micrographs हैं bioreporter जीवाणु बी के mCherry और EGFP प्रेरण visualizing एमएमए में sartisoli RP037-mChe। बैक्टीरिया एमएमए में एक क्रिस्टलीय फ्लू स्रोत के लिए संपर्क किया था जब (कोन पीओएस, एक), EGFP संकेत नियंत्रण करने के लिए (कोन एयर; बी) की तुलना में ऊंचा है। फ्लू और पी के साथ नमूने ultimum (एसएएम; सी) भी हालांकि कम सकारात्मक नियंत्रण से चिह्नित एक ऊंचा EGFP संकेत, दिखाते हैं। mCherry अनिवार्यता से व्यक्त किया है और इसलिए कोशिकाओं का पता लगाने के लिए एक दृश्य नियंत्रण के रूप में कार्य करता है। (बढ़ाई 630X, बार 20 माइक्रोन)। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

"के लिए: रख-together.within पृष्ठ =" हमेशा "> चित्रा 3
फ्लू के अभाव में 96hr के बाद mycelia और फ्लू B.sartisoli RP037-चे द्वारा रिश्तेदार EGFP प्रेरण (EGFP रिलायंस एनर्जी) की। तुलना के साथ कांग्रेस neg, कोन एयर और सैम के लिए B.sartisoli RP037-चे में चित्रा 3. सापेक्ष EGFP प्रेरण फ्लू लेकिन P.ultimum (कोन एआईआर) के अभाव की उपस्थिति में (कोन NEG), और फ्लू और P.ultimum (एसएएम) दोनों की उपस्थिति में। आंकड़ों कांग्रेस NEG के लिए महत्वपूर्ण मतभेद एक तारांकित द्वारा चिह्नित कर रहे हैं। प्रयोगों कोन एयर के लिए स्वतंत्र triplicates में प्रदर्शन किया गया और कांग्रेस neg, के लिए डुप्लिकेट। एक नमूना कांग्रेस पीओएस के लिए परीक्षण किया गया था और EGFP रिलायंस एनर्जी 53.7 के साथ गणना की गई। यह आंकड़ा बैक्टीरिया-अपमानजनक PAH को Schamfuss एट अल। 15 fluorene की पहुंच पर Schamfuss, एस एट अल। Mycelia के प्रभाव से अनुमति के साथ अनुकूलित से अनुमति के साथ संशोधित किया गया है। पर्यावरण। विज्ञान। तकनीक। 47, 6908-6915। कॉपीराइट (2013) अमेरिकन केमिकल सोसायटी।

चित्रा 4
(। CF 1 चित्रा) चित्रा 4. रासायनिक फ्लू मात्रा का ठहराव एमएमए पैच से निकाले एनजी में फ्लू के कुल मात्रा में कोशिकाओं के बिना वाष्प चरण परिवहन के लिए 96hr के बाद (कोन एयर (-)), मीकोशिकाओं के साथ और फुई वाला परिवहन (एसएएम) - कोशिकाओं के बिना ycelial परिवहन () सैम ()। यह आंकड़ा बैक्टीरिया-अपमानजनक PAH को Schamfuss एट अल। 15 fluorene की पहुंच पर Schamfuss, एस एट अल। Mycelia के प्रभाव से अनुमति के साथ अनुकूलित से अनुमति के साथ संशोधित किया गया है। पर्यावरण। विज्ञान। तकनीक। 47, 6908-6915। कॉपीराइट (2013) अमेरिकन केमिकल सोसायटी।

चित्रा 5
चित्रा 5. एक अजैव संदूषक सिंक की उपस्थिति में रासायनिक फ्लू मात्रा का ठहराव (ए) एमएमए पैच से निकाले एनजी में फ्लू के कुल मात्रा के साथ या कृत्रिम संदूषक सिंक के बिना फुई वाला परिवहन (एसएएम के लिए 96hr के बाद (। (CF 1 चित्रा।) - ) के साथ या PDMS सह बिनापैदा फाइबर)। बढ़ी हुई फुई वाला फ्लू तेज क्षेत्र के साथ एक विविध परीक्षण ट्रैक के लिए (बी) उसी का परिणाम है। यह आंकड़ा बैक्टीरिया-अपमानजनक PAH को Schamfuss एट अल। 15 fluorene की पहुंच पर Schamfuss, एस एट अल। Mycelia के प्रभाव से अनुमति के साथ अनुकूलित से अनुमति के साथ संशोधित किया गया है। पर्यावरण। विज्ञान। तकनीक। 47, 6908-6915। कॉपीराइट (2013) अमेरिकन केमिकल सोसायटी।

नाम फ्लू Mycelia प्रकोष्ठों आवेदन कमेंट्स
एसएएम + + + CLSM
जीसी / एमएस
सैम (-) + - जीसी / एमएस यह भी संभव कृत्रिम संदूषक सिंक के रूप में PDMS फाइबर के साथ
कोन एयर + (+) + CLSM mycelia केवल पीडीए बाधा के लिए आगे बढ़ रही है; एमएमए कवर नहीं
कोन एयर (-) + (+) - जीसी / एमएस mycelia केवल पीडीए बाधा के लिए आगे बढ़ रही है; एमएमए कवर नहीं
कांग्रेस NEG - + + CLSM
कांग्रेस पीओएस + - + CLSM कोशिकाओं सीधे फ्लू क्रिस्टल को उजागर कर रहे हैं

सभी नमूना प्रकार की तालिका 1. अवलोकन आवेदन (bioreporter परख - CLSM या रासायनिक मात्रा का ठहराव - जीसी / एमएस) सहित सभी नियंत्रण और परीक्षण के नमूने का सारांश। और composition के (फ्लू, mycelia और bioreporter कोशिकाओं)।

ओवन
प्रारंभिक अस्थायी 50 डिग्री सेल्सियस
प्रारंभिक समय 2 मिनट
दर 15 डिग्री सेल्सियस मिनट -1
अंतिम अस्थायी 300 डिग्री सेल्सियस
अंतिम समय 6.33 मिनट
इंजेक्टर (पीटीवी)
इंजेक्शन की मात्रा 0.5 μl
साधन splitless
शुद्ध करना 2.00 मिनट
शुद्ध प्रवाह 50.0 मिलीलीटर मिनट -1
प्रारंभिक अस्थायी 80 डिग्री सेल्सियस
प्रारंभिक समय 0.02 मिनट
रैंप: दर 600 डिग्री सेल्सियस मिनट -1
अंतिम अस्थायी 300 डिग्री सेल्सियस
अंतिम समय 10 मिनट
स्तंभ
आदर्श जम्मू और डब्ल्यू डीबी-5ms
नाममात्र की लंबाई 20 मीटर
नाममात्र व्यास 180 माइक्रोन
नाममात्र फिल्म मोटाई 0.18 माइक्रोन
वाहक गैस 0.8 मिलीलीटर मिनट हीलियम -1
एमएसडी Transferline 280 डिग्री सेल्सियस
एमएसडी
सिम मोड
एमएस स्रोत 230 डिग्री सेल्सियस
एमएस ट्रैक्टर 150 डिग्री सेल्सियस

टेबल क्यू को जीसी और एमएस के लिए सभी व्यवस्था की जीसी / एमएस। सारांश के लिए 2. सेटिंग्ससूक्ष्म जगत setups में uantify fluorene।

नुकसान कमेंट
1 प्रारंभिक विकास और जीवन शक्ति परीक्षण पसंद की फुई वाला जीव के विकास का अध्ययन करें। कब तक यह एमएमए पैच तक पहुँचने के लिए ले करता है? यह cycloheximide बाधा से हिचकते हैं? इसके अलावा bioreporter कोशिकाओं एमएमए में Plaiting assays के माध्यम से पूरे समय महत्वपूर्ण रहना चाहे जाँच करें। यदि नहीं, तो एक भी bioreporter प्रेरण में परिणाम नहीं करता जो एमएमए के लिए एक कार्बन स्रोत जोड़ सकते हैं। बैक्टीरिया और mycelia के संभावित आपसी निषेध बाहर निकालें।
2 Mycelial विकास दर पीएएच का अन्यथा गैस चरण परिवहन लंबे समय तक ऊष्मायन समय के साथ बढ़ जाती है क्योंकि फुई वाला जीव की वृद्धि दर भी धीमी गति से नहीं होना चाहिए। प्रोटोकॉल अनुकूलित किया जा सकता हैएक बाद में समय बिंदु पर पीएएच जोड़ने के लिए है, लेकिन फिर, टीका बिंदु पर mycelia अब और सक्रिय नहीं हो सकता।
3 बैक्टीरियल गतिशीलता एक बिंदु लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप का इस्तेमाल किया और बैक्टीरियल तनाव, गतिशील है, तो जेड के ढेर की रिकॉर्डिंग और मात्रा का ठहराव के कारण एमएमए के अंदर आंदोलन करने के लिए असंभव हो सकता है। इस प्रकार, बैक्टीरियल आंदोलन एक तेजी से स्कैनर या एक कताई डिस्क लेजर खुर्दबीन के साथ CLSM का उपयोग करके, एमएमए की दृढ़ता को बढ़ाने के द्वारा, जैसे, रोका जाना चाहिए।
4 भाप चरण परिवहन Bioreporter कोशिकाओं वाष्प चरण में रसायनों के प्रति बेहद संवेदनशील हैं क्योंकि bioreporter कोशिकाओं की दिशा में रासायनिक (जैसे, पीएएच) के वाष्प चरण परिवहन पर्याप्त बाहर रखा जाना चाहिए। इस गैस का परिवहन की वजह से झूठी सकारात्मक परिणाम को रोकने के क्रम में पूरे प्रोटोकॉल का महत्वपूर्ण बिंदु है। गैस चरण(-) एकाग्रता कोन एयर का रासायनिक विश्लेषण के माध्यम से अनुमान लगाया जा सकता है और वाष्प चरण सांद्रता सक्रिय कार्बन के साथ कम या ज्यादा agarose पैच जोड़कर उदाहरण के लिए समायोजित किया जा सकता है।
5 विषाक्तता का परीक्षण रसायन की उच्च सांद्रता फुई वाला जीव और / या बैक्टीरिया पर विषाक्त प्रभाव हो सकता है, कि मन में रखो।
6 Autofluorescence चुना फुई वाला जीव होने की उम्मीद है bioreporter संकेत की सीमा में कुछ autofluorescence से पता चलता है की जाँच करें। Autofluorescence 17 अलग-अलग हो सकता है के बाद से विभिन्न विकास चरणों में जांच सुनिश्चित करें। Autofluorescence पाया जाता है, mycelia-मुक्त क्षेत्रों में जेड के ढेर को दर्ज करने के लिए सुनिश्चित हो।
7 सफेद करना mCherry प्रतिदीप्ति आम तौर पर स्थिर और लागू द्वि में विरंजन के प्रति संवेदनशील नहीं हैoreporter कोशिकाओं। इसके विपरीत, EGFP बल्कि जल्दी bleaches। इसलिए, z ढेर रिकॉर्डिंग करने से पहले नमूना कल्पना करने के लिए EGFP चैनल का उपयोग नहीं करते।
8 EGFP प्रेरण हम सैम में एक कम EGFP प्रेरण पीओएस चुनाव की तुलना में देखा। इस फ्लू का बहुत कम वाष्प चरण एकाग्रता (सीएफ पिछले परिणामों के पैरा) बनाए रखने के लिए मजबूत स्थानिक प्रतिबंध और फ्लू के स्रोत की कम पहुंच क्षमता से हिसाब है। चुना bioreporter तनाव और रासायनिक पर निर्भर करता है, पीडीए 1 पर तेज क्षेत्र परिवहन दर (चित्रा 5 ब) को बढ़ाने के लिए अलग किया जा सकता है। हालांकि, यह इस पर भी bioreporter कोशिकाओं की ओर वाष्प चरण परिवहन बढ़ जाती है कि विचार किया जाना है।
9 EGFP रिलायंस एनर्जी की गणना हरे पिक्सल की तीव्रता की तुलना में है, जहां EGFP रिलायंस एनर्जी के लिए प्रस्तुत गणना पद्धतिलाल पिक्सल के क्षेत्र के लिए केवल एक ही संभावना है। अधिक जानकारी के लिए चर्चा करने के लिए देखें।
10 पिक्सेल आकार चुना लेंस की बढ़ाई और एक संभावित लागू किया जूम कारक छवि के पिक्सेल आकार को प्रभावित कृपया ध्यान रखें कि। इस छवि विश्लेषण करने से पहले ध्यान में रखा जाना चाहिए।
11 Bioavailable अंशों पहुँचाया यौगिक की bioavailability EGFP प्रेरण के माध्यम से (न कि मात्रात्मक) गुणात्मक मूल्यांकन किया है कि मन में रखो। गणना की रिश्तेदार EGFP-प्रेरण और bioavailable अंश का कोई संबंध प्रयास किया गया था। बहरहाल, यह भविष्य के अनुप्रयोगों में संबोधित किया जा सकता है।
12 पहचान की सीमा रासायनिक पता लगाने। कार्बनिक यौगिकों के रासायनिक मात्रा का ठहराव, ध्यान केंद्रित की एक विस्तृत श्रृंखला के लिएtrations मज़बूती से पता लगाया जा सकता है। हम रेंज 0ng और 1,000ng में मात्रा का पता चला। EGFP मात्रा का ठहराव। (; म चार आंकड़े और 5 यानी, 20 और पहुँचाया 40ng के बीच) और दूषित पदार्थों स्रोत के लिए सीधे संपर्क के साथ (यानी, अधिकतम हम mycelia की मध्यस्थता परिवहन के साथ संदूषक परिवहन बिना नमूनों में रिश्तेदार EGFP प्रेरण (यानी, पहुँचाया 0ng), की तुलना उपलब्ध राशि)। इन तीन मामलों में वर्णित विधि के साथ अच्छी तरह से अलग पहचाना साबित हुई। हालांकि, हम रिश्तेदार EGFP शामिल करने के प्रस्ताव पर एक अधिक विस्तृत बयान नहीं कर सकता। यह समस्या सूक्ष्म जगत setups में correlating EGFP प्रेरण के साथ अलग अलग संदूषक मात्रा में जोड़ने के द्वारा भविष्य में संबोधित किया जा सकता है।
13 पेट्री डिश सामग्री प्लास्टिक पेट्री डिश फुई वाला पीएएच स्थानान्तरण और / या जैव उपलब्धता की एक मूल्यवान समझना में हो सकता है। यह नहीं होना चाहिएगुणात्मक बयानों आकांक्षी रहे हैं, समस्याग्रस्त हो। मामले में सटीक मात्रात्मक मापन, आवश्यक हैं कांच पेट्री डिश के आवेदन अधिक असुविधाजनक हो जाएगा तैयारी और हैंडलिंग के बावजूद माना जाना चाहिए।

संभव नुकसान की तालिका 3. चर्चा। पहले और प्रयोग और प्रस्तावित टिप्पणियों और विकल्पों के दौरान संभावित नुकसान।

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Discussion

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प्रस्तुत सूक्ष्म जगत सेटअप mycelia से तेज और परिवहन के बाद जीवों अपमानजनक करने spatially अलग रसायनों की bioavailability अध्ययन करने के लिए उपयुक्त साबित कर दिया। आंशिक रूप से अस्थिर यौगिकों के संभावित गैस चरण परिवहन रोका है और बैक्टीरियल bioreporter कोशिकाओं संवेदनशील प्रणाली की न्यूनतम अशांति के साथ इस प्रकार विस्तृत नमूना तैयारी के बिना कल्पना और किया जा सकता है। इसी समय, नमूना के रासायनिक विश्लेषण आसानी से प्राप्त की परिणामों का एक अच्छा नियंत्रण के लिए और कुल परिवहन की मात्रा का ठहराव के लिए अनुमति का आयोजन किया जा सकता है। हालांकि, कुछ बिंदुओं को ध्यान से पहले और प्रयोग करते हुए प्रदर्शन पर विचार किया जाना है। एक महत्वपूर्ण बात किसी भी बैक्टीरिया या रासायनिक पार संदूषण से मुक्त लघु रखना है। कई लघु समानांतर में चलाए जा रहे हैं और इस प्रकार, (जैसे desiccators के रूप में) बड़ा ऊष्मायन कक्षों की आवश्यकता होती है, क्योंकि यह चुनौतीपूर्ण हो सकता है। इसलिए, यह सेटअप निर्माण करने के लिए सावधानी से पूर्व सभी भागों बाँझ के लिए महत्वपूर्ण हैtion। एक अन्य महत्वपूर्ण बिंदु लघु लिए प्लास्टिक पेट्री डिश का आवेदन किया जा सकता है। पीएएच और bioreporter सीधे संपर्क में नहीं मिलता है, पीएएच में से कुछ राशि प्लास्टिक सामग्री द्वारा अवशोषित किया जा सकता है। इस परिणाम के बाद से हालांकि, हम फुई वाला पीएएच-स्थानान्तरण और / या जैव उपलब्धता की एक मूल्यवान समझना में, यदि कोई हो, वर्णित प्रोटोकॉल के लिए इस समस्याग्रस्त नहीं मानते हैं। सटीक मात्रा का ठहराव आवश्यक है, तो हैंडलिंग अधिक असुविधाजनक हो जाएगा, हालांकि किसी भी मामले में, यह, कांच के कुछ हिस्सों के साथ प्लास्टिक के हिस्सों का आदान प्रदान पर विचार किया जाना चाहिए। माना जाना चाहिए कि अन्य अंक चुना बैक्टीरियल और फंगल उपभेदों (संभव आपसी निषेध, विकास दर, गतिशीलता और संभव autofluorescence), चुना रसायन और व्यावहारिक पहलुओं (विरंजन, EGFP की सीमा (सूक्ष्मजीवों, अस्थिरता, का पता लगाने सीमा पर विषाक्त प्रभाव) शामिल प्रेरण और EGFP रिलायंस एनर्जी की गणना)। संभावित नुकसान और संबंधित टिप्पणियों का एक सारांश में पाया जा सकता है3 टेबल।

हम सीधे एक सेल mycelia बातचीत स्तर पर एक असंतृप्त प्रणाली में फुई वाला फ्लू परिवहन और बाद में बैक्टीरियल गिरावट प्रदर्शित करने के लिए इस मॉडल सूक्ष्म जगत सेटअप का उपयोग किया। हमारे मॉडल सेट अप विविध और की उपस्थिति में बैक्टीरिया पर mycelia के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए इस प्रकार, प्रणाली उदाहरण (i) के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है आदि विभिन्न बैक्टीरियल और फंगल उपभेदों, रासायनिक यौगिकों के साथ अलग-अलग जरूरतों को पूरा करने के लिए समायोजित किया जा सकता है एक अन्यथा प्रतिबंधित रासायनिक (जैसे, विषाक्त) स्रोत (ii) जीवाणु गिरावट के लिए यौगिकों की bioavailability पर mycelia के प्रभाव की भविष्यवाणी करने के लिए, (iii) के परिवहन वेक्टर या बैक्टीरिया की दूरी के आधार पर संदूषक जैव उपलब्धता अध्ययन करने के लिए (चार) विभिन्न रासायनिक सूत्रों का कहना है (उदाहरण के लिए, स्फटिक, मिट्टी में या भंग) के प्रभाव की जांच करने के लिए। हालांकि, एक करने के लिए प्रणाली का समायोजनlternate शर्तों नाजुक हो जाएगा और स्पष्ट परिणाम प्राप्त करने के क्रम में कदम से कदम आयोजित किया जाना चाहिए। अब तक हम अन्य बैक्टीरियल या फंगल उपभेदों और पीएएच के अलावा अन्य यौगिकों के लिए प्रणाली का परीक्षण नहीं किया है। फुई वाला नेटवर्क कीटनाशकों 19 या सैलिसिलेट 20 तरह घुलनशील पदार्थ की तरह पीएएच से भी अन्य contaminants के परिवहन के लिए जाना जाता है के बाद से हालांकि, हम इस प्रणाली के एक मिश्रित-विशिष्ट जीवाणु biosensor दिया विभिन्न रासायनिक यौगिकों के लिए विस्तारित किया जा सकता है कि लगता है।

लागू किया bioreporter के आधार पर EGFP रिलायंस एनर्जी का एक अलग गणना बेहतर हो सकता है तनाव है कि कृपया ध्यान दें। इसके बजाय समीकरण (1) के दो निम्न विकल्पों में लागू किया जा सकता है:

2 समीकरण (2)

3 समीकरण (3)

Howeveआर, प्रस्तुत प्रोटोकॉल समीकरण (1) में निम्न कारणों से चुना गया था: (द्वितीय) mCherry विभिन्न कोशिकाओं 13 के लिए काफी विविधताओं को दिखाने के लिए सूचना मिली थी जबकि (मैं) EGFP तीव्रता सेल से 14 पीएएच प्रवाह करने के लिए सहसंबंधी सूचना मिली थी । समीकरण (2) और (3), इसके विपरीत, नमूने में संभावित प्रकाश कलाकृतियों से झूठी सूचना को रोकने के लिए चुना जा सकता है। किसी भी मामले में, हम कोई सांख्यिकीय महत्वपूर्ण मतभेद पाया जा सकता है, जिसके तहत एक दूसरे के साथ सभी तीन गणना के तरीकों की तुलना में। फिर भी, mCherry के प्रतिदीप्ति तीव्रता की रिपोर्ट में विविधताओं के कारण, हम समीकरण का उपयोग करना चाहिये (1) या (2)।

अंत में, तकनीक की कुछ सीमाएं विचार किया जाना चाहिए। लघु परीक्षण किया यौगिक की गैस चरण परिवहन रोकने के लिए बनाया गया था, परिसर के फुई वाला तेज कम हो जाता है। यह निर्बाध तेज के साथ उम्मीद होगी की तुलना में कम परिवहन दरों में यह परिणाम है। Biore की इसलिए, संवेदनशीलताकुली तनाव bioavailable भागों में छोटे परिवर्तन का पता लगाने के लिए पर्याप्त उच्च किया जाना चाहिए। इसके अलावा, सेटअप शायद एक कम विकास दर के साथ कवक उपभेदों के लिए उपयुक्त नहीं होगा। इस मामले में, दीर्घकालिक ऊष्मायन इस प्रकार झूठी सकारात्मक परिणाम के लिए अग्रणी contaminant के गैस चरण परिवहन के पक्ष में हो सकता है। यह संदूषक एक बाद में समय बिंदु पर लागू किया जा सकता है कि एक तरह से सेटअप को संशोधित करने के लिए संभव हो सकता है। हालांकि, hyphae तो टीका बिंदु पर पहले से ही निष्क्रिय या मृत हो सकता है। जैसा कि ऊपर कहा अंत में, फुई वाला नेटवर्क के द्वारा ले जाया जाता है, जो रासायनिक यौगिकों की सीमा बड़ा है। हालांकि, एक उपयुक्त bioreporter तनाव की उपलब्धता एक सीमित महत्वपूर्ण कारक हो सकता है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Confocal Microscope Leica TCS SP5X, LAS AF - Version 2.6.1; or equivalent CLSM
GC HP 7890 Series GC and Agilent 5975C MSD Agilent an equivalent GC/MS may be used
GC capillary column J&W 121-5522              Agilent
Cork borer Fisher Scientific 12863952 or any other
Cover slips Marienfeld 107222 High performance, No.1.5H
GC/MS insterts WICOM WIC 47080
GC/MS vials 2 ml WICOM WIC 41150
Lids / septa for screw cap vials DIONEX 49463 / 049464 
Lids for GC/MS vials WICOM WIC 43948/B
Objective Slides Menzel ordinary
PDMS coated glass fibers Polymicro Technologies, Inc. V (PDMS) = 13.55 ± 0.02 µl m-1
Petri Dishes small / big Greiner 633-102 / 628-102
Screw cap vials 40 ml DIONEX 48783 other glass vials may be used
Screw cap vials 60 ml DIONEX 48784 other glass vials may be used
Acenaphthylene d08 Dr. Ehrenstorfer C 20510100
Acetone Carl Roth 9372.2
Activated carbon Sigma-Aldrich 242276-1kg
Agarose Carl Roth 2267.4
Fluorene Fluka 46880
Kanamycin sulfate Carl Roth T832.2 50 mg L-1
Methanol Carl Roth P7171
Minimal Medium: 100 ml Solution 1 + 25 ml Solution 2 + 5 ml Solution 3 ad. 1,000 ml aqua dest
Solution 1
Ammonium sulfate Carl Roth 3746.1 5 g L-1 
Magnesium chloride x 6 H2O Carl Roth 2189.1 1 g L-1
Calcium nitrate x 4 H2O Carl Roth P740.1 0.5 g L-1
Solution 2
Disodium phosphate Carl Roth P030.1 55.83 g L-1
Monopotassium phosphate Carl Roth 3904.1 20 g L-1
Solution 3 (pH 6.0)
Disodium EDTA MERCK 1084180250 0.8 g L-1
Iron(II) chloride x 4 H2O MERCK 1038610250 0.3 g L-1
Cobalt(II) chloride x 6 H2O Carl Roth T889.3 4 mg L-1
Manganese(II) chloride x 1 H2O Carl Roth 4320.2 10 mg L-1
Copper(II) sulfate Carl Roth P023.1 1 mg L-1
Sodium molybdate x 2 H2O Carl Roth 0274.1 3 mg L-1
Zinc chloride MERCK 1088160250 2 mg L-1
Lithium chloride Carl Roth P007.1 0.5 mg L-1
Tin(II) chloride x 2 H2O Carl Roth 4473.1 0.5 mg L-1
Boric acid Riedel-de-Haen              11606 1 mg L-1
Potassium bromide Carl Roth A137.1 2 mg L-1
Potassium iodide Carl Roth 6750.1 2 mg L-1
Barium chloride Carl Roth 4453.1 0.5 mg L-1
MMA Minimal medium + agarose 0.2%
Phenanthrene d10 Dr. Ehrenstorfer C 20920100
Potato Dextrose Agar: 24 g L-1 broth + bacto-agar 1.5%; pH 6.8
Potato Dextrose broth Difco/ Beckton Dickinson 254920
Bacto-agar Difco/ Beckton Dickinson 214040
Sodium acetate x 3 hydr. Carl Roth 6779.1
Sodium sulfate MERCK 1066495000
Toluene MERCK 1083252500
mTY medium: 3 g L-1 yeast extract, 5 g L-1 bacto tryptone and 50 mM NaCl
Yeast extract Merck 1037530500
Tryptone Serva 4864702
Sodium chloride Carl Roth 3957.1
ImageJ with logi tool plugin http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html and http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/4.4.10
Pythium ultimum strain 67-1 Obtained from the lab of Dr. Christoph Keel; Department of Fundamental Microbiology, University of Lausanne, Switzerland
Burkholderia sartisoli RP037-mChe Obtained from the lab of Prof. Jan Roelof van der Meer; Department of Fundamental Microbiology, University of Lausanne, Switzerland

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References

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एक पूरे सेल Bioreporter दृष्टिकोण जल असंतृप्त सिस्टम में कार्बनिक contaminants के परिवहन और bioavailability का आकलन करने के लिए
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Schamfuß, S., Neu, T. R., Harms, H., Wick, L. Y. A Whole Cell Bioreporter Approach to Assess Transport and Bioavailability of Organic Contaminants in Water Unsaturated Systems. J. Vis. Exp. (94), e52334, doi:10.3791/52334 (2014).More

Schamfuß, S., Neu, T. R., Harms, H., Wick, L. Y. A Whole Cell Bioreporter Approach to Assess Transport and Bioavailability of Organic Contaminants in Water Unsaturated Systems. J. Vis. Exp. (94), e52334, doi:10.3791/52334 (2014).

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