Abstract
Dendroecological forskning använder information lagrad i trädringar att förstå hur enskilda träd och till och med hela skogsekosystem svarade på miljöförändringar och för att slutligen rekonstruera sådana förändringar. Detta görs genom att analysera tillväxtvariationer tillbaka i tiden och korrelera olika anläggningsspecifika parametrar (till exempel) temperaturrekord. Integrera trä anatomiska parametrar i dessa analyser skulle stärka rekonstruktioner, även ner till inom årliga resolution. Vi presenterar därför ett protokoll om hur prov, förbereda och analysera trä exemplar för vanliga makroskopiska analyser, men också för efterföljande mikroskopiska analyser. Dessutom introducerar vi en potentiell lösning för att analysera digitala bilder som genereras från vanliga små och stora exemplar för att stödja tidsserier analyser. Protokollet presenteras de grundläggande stegen som de för närvarande kan användas. Utöver detta finns det ett fortsatt behov av förbättring av befintliga tekniker, och utveckling av nya techniques, för att spela in och kvantifiera tidigare och pågående miljöprocesser. Traditionella trä anatomiska forskningen måste utvidgas till att omfatta ekologisk upplysningar till detta forskningsområde. Detta skulle stödja dendrodata-forskare som avser att analysera nya parametrar och utveckla nya metoder för att förstå de kort- och långsiktiga effekter av specifika miljöfaktorer på anatomi vedartade växter.
Introduction
Träd, liksom buskar, dvärg buskar, och till och med örter, visar mångfaldiga svarsmönster relaterade till förändringar i sin miljö. Dessa mönster har varit föremål för botanik och växtfysiologi sedan mitten av 19-talet. Då, forskning om vedartade växter fokuserade mest på träd och en beskrivande analys av struktur och variabilitet årsringarna på ett ekologiskt sammanhang 1. När Andrew Ellicott Douglass uppfann tvär dejting teknik för trädringforskning 2, var detta ekologiska sammanhang mer eller mindre undertryckta av den nya förmågan att exakt datum trä fynd i arkeologi. Cross-dating för första gången möjliggjort exakt datering av trädringar till kalenderår och fram till nu betraktas som ryggraden i trädring forskning inom alla områden av dess tillämpning 1.
Parallellt sedan slutet av 19th century, trä anatomi utvecklats till ett viktigt forskningsdisciplin relaterad till många andra områden av naturliga och tillämpad vetenskap 3. Två huvuddomäner upprättas: systematisk trä anatomi, vilket är grunden för att identifiera trä i arkeologi 4, och den tillämpade trä anatomi, relaterat till träteknik, fysiologi, patologi, och ekologi 3,5.
I trädringforskning, dendroecology numera definieras som ett ämne som omfattar trädringsrelaterade studier som fokuserar på miljöstudier såsom geomorphic processer (dendrogeomorphology), temperatur och nederbörd rekonstruktioner (Dendroklimatologi), förändringar vatten nivå (dendrohydrology) eller till och med glaciär fluktuationer ( dendroglaciology) 6. Eftersom denna definition visar, har trädringsanalyser blivit allt viktigare inom dejting och rekonstruera miljöprocesser, såsom (i) tidigare klimatförhållanden genom att analysera de årliga variationerna i ringbredd 7,8, trä tätheten 9 eller isotop 10, eller (ii) than återfall intervall geomorphic processer 11. Dessa mycket detaljerade studier om ringbredd variationer och deras isotopinnehåll visar behovet av att analysera ringar mer i detalj, det vill säga, för att studera den anatomiska strukturen av ringarna. Men detaljerade studier av trä anatomiska funktioner i årsringarna rör miljöförändringar är sällsynta 12,13. Även om dessa mikroskopiska särdrag är kända 14, har de sällan tillämpats på en mikroskopisk nivå till dendroecological forskning. Dessutom exakt timing av dessa tillväxtreaktioner i naturligt odlade träd, essentiella för exakta dateringen, har sällan dokumenterats nyligen 15.
När det gäller effekterna av den globala uppvärmningen 16, till att förbättra befintliga och utveckling av nya tekniker registrera och kvantifiera tidigare och pågående miljöprocesser krävs, särskilt när det gäller klimatpåverkan forskning 11.Genom att utöka traditionella trä anatomiska forskningen till en ekologiskt baserad trä anatomi 17, kan dendrodata-forskarna analysera nya parametrar och utveckla nya metoder för att förstå kort- och långsiktiga effekter av specifika miljöfaktorer på anatomi vedartade växter 18. Detaljerad kunskap om variationer i olika cellparametrar inom enskilda ringar relaterade till specifika drivrutiner (t.ex. mekaniska krafter, klimatvariationer) är det grundläggande kravet för att förstå variationen i trädet ringbildning. Jämfört med vanliga ringbredd mätningar, identifiera trä anatomiska variationer kräver mer komplexa och expansiva beredningstekniker som kräver en hel del arbete och tid. Detaljerade förfaranden för prov skärning, färgning, och inbäddning är många och är alltid beroende på syftet med studien 19.
För makroskopisk analys av ringbredd i barrträd eller ens strukturer för antal, storlek eller distribution fartyg i lövträd, är ytan av ett prov som vanligen poleras med fin slippapper eller special slipmaskiner 20. En nackdel med detta förfarande är fyllningen av de enskilda cellerna med damm som förhindrar ytterligare halvautomatiska mikroskopisk analys 21. De bästa resultaten för makroskopisk provberedning uppnås när provytan skärs med ett rakblad eller annat vass kniv.
Även för små prover, rakblad är ett perfekt verktyg; större prov som kärnor kräver styckning av plana ytor över hela omfattningen av kärnor. I motsats till slipning, är cellerna inte fylld med damm, vilket möjliggör ytterligare förberedelse för successiv bildanalys. Vidare, de öppna celllumen, de korrekt skurna cellväggarna och den plana ytan av hela provet möjliggöra tillämpning av högfrekventa densitometri 22 till hela omfattningen av kärnan. För bildanalyser, ytan av prover (cellväggar) kan färgas med mörka bläck och de öppna cell lumen kan därefter fyllas med vit krita för att öka kontrasten mellan cellväggen och lumen området 19,23. Denna ganska enkel teknik möjliggör en grundläggande makroskopisk bedömning av större cellstrukturer för fartygets storleksmätningar.
Dessa tekniker för att skära plana ytor är tillräckliga för makroskopiska analyser. För en detaljerad trä anatomisk (dvs mikroskopisk) -analys, är överförd Ijusmikroskopi den vanligaste metoden tillämpas i dendrodata vetenskaper. Xylem celler differentierar genom komplexa processer som omfattar celltyp beslutsamhet, celldelning, celldifferentiering och programmerad celldöd 24. Eftersom tidpunkten och hastigheten med vilken dessa processer sker bestämma cell anatomiska egenskaper, kan miljöförhållanden som påverkar dessa processer generera anatomiska avvikelser i ringstrukturen. Som en viktig förutsättning för dessa analyserars, mikro sektioner måste vara beredd med en mikrotom 19. När man förbereder prover för sektione, är avgörande synlighet trakeid eller fiberriktning. Användningen av handdriven glid mikrotomer rekommenderas att skära mikro sektioner eftersom denna teknik underlättar högkvalitativa sektioner som behövs för bildanalyser 19. Beroende på det specifika syftet med en viss studie är mikro sektioner skärs vinkelrätt eller parallellt med längd utsträckning av cellerna. Dessa avsnitt är sedan fotograferas under ett mikroskop och celldimensioner som mäts med specialiserad bild analyser mjukvara.
Tills nyligen var förmågan att förbereda mikro sektioner begränsad till små provstorlekar bara (ca 1 cm x 1 cm). Detta är acceptabelt att analysera enstaka händelser som rubbad specifika år, men denna teknik tillåter inte den förlängda tidsserieanalys behövs för miljö rekonstruktioner. Denna insats kan bara insed genom utveckling av nya, effektiva och ekonomiska förberedelser och analysmetoder. Under senare år har medlemmarna i trädring lab vid den schweiziska federala Research Institute WSL i Schweiz startade ett intensivt arbete i denna fråga. Som ett resultat har nya enheter och analysera tekniker utvecklats för att stödja tanken på att integrera trä anatomiska funktioner till ett brett spektrum av miljö forskningsområden.
Protocol
1. Provtagnings Tekniker
- Kärn provtagning
- För provtagning trädstammar, extrahera minst två kärnor med hjälp av en steg corer från varje stam för att analysera sin tillväxtutveckling. Variera ställning provtagningen på forskningsuppgiften, t.ex. för gemensamma klimat rekonstruktioner tar kärnor parallellt med lutningen. När du arbetar med tropiska arter, ta minst tre eller fler kärnor.
- Använd en vässad inkrement corer (5, 10 eller 12 mm i diameter) och placera kärnborren vinkelrät mot den växande axeln hos skaftet.
OBS: För att få en kontrollerad och stabil position urkärnaren, använd en pådrivare för att undvika rörelser annat än dess rotation corer vid borrning in den i trädet. Bore in stammen hela vägen in i och genom märg. Till kärnan mycket tät skog (dvs, tropiska arter), använda speciella konfigureras motorsågsorgan med en adapter för tillväxtkärnor som tillåter att kärn även tät skog som Diospyrus ebenum (Ebony). </ Li> - Använd en extraktor och avlägsna den resulterande kärnan från trädet. Vänd ut kärnborren och ta bort den från stammen.
- Lägg ett specifikt ID till den extraherade kärnan med en mjuk penna genom att skriva på ett band, som sedan placeras direkt på kärnan. Upprepa proceduren på den motsatta sidan av skaftet.
- Förvara de två prover av trädet i plast eller papper rör eller speciella lådor för att förhindra skador.
OBS: Pappers sugrör är välgörande särskilt i tropiska miljöer eftersom de hindrar kärnorna från gjutning. - Slutligen, montera kärnorna (fiberriktning upprätt) på trä stöd balkar. Använd kallt vatten resistent trälim och låt dem torka.
OBS: Montera aldrig kärnorna på trä stöd om syftet med studien omfattar ytterligare kemisk, isotop eller densitet analys. För dessa ändamål, fixa kärnorna i öppna kabelledningar eller en ensidig wellpapp.
- Micro-kärnprovtagning
- Använd en speciell stansenheteller nål med en öppning på 2 mm. Beroende på barktjocklek använda en mejsel för att ta bort en nödvändig del av barken.
- Placera enheten vinkelrätt mot den växande axeln på skaftet såsom beskrivits ovan, och använda en hammare för att penetrera xylem av skaftet till ca 2 cm i djup.
- Vrid nålen går den resultemikrokärnan inuti verktyget och ta bort den från stammen. Förvara mikrokärnor i mikrocentrifugrör flaskor och märka dem.
- Skiv provtagning
- I särskilda fall (och särskilt i tropikerna), t.ex. vid provtagning stubbar och fallna träd eller när det är möjligt, ta skivor (tvärsnitt vinkelrätt mot den växande axeln) med en motorsåg. Helt enkelt märka skivorna och lagra dem tills vidare analys.
OBS: Denna provtagningsförfarande är oftast tillämpas för alla torr döda, historiskt, arkeologiskt och under fossilt material samt mycket täta lövträd som inte tillåter användning av tillväxt corers.
2. Provberedning
- Slip diskar
- Placera skivorna på en slipmaskin och slipa ytan med en sekvens av alltmer fina slipmedel, som börjar med sandpapper av 80-grit, följt av 120, 220, 300-grit. En slutlig polering med 400-grit är tillräckligt för de flesta barrträd. För lövträd och speciellt tropiska arter, användning slipkorn upp till 1.200 för att skilja de tillväxtringsgränserna.
- Skär plana ytorna på kärnor
- Fäst tillväxtkärnor i kärnan innehavaren av ett nyutvecklat kärn mikrotom möjliggör att skära plana ytor på kärnor över hela sin omfattning.
OBS: Korrigera orienteringen av kärnan inuti hållaren för att ha fiberriktn av provet upprätt, vilket är i en rät vinkel till kniven i mikrotomen. - Lyft kärnan tills den något vidrör bladet. Dra bladet, som är fast på kullager vägledning över omfattningen av kärnan till Cut från en första del av den övre.
- Tryck tillbaka kniven bakom kärnan, lyfter provhållaren med kärnan ca 10 pm och upprepa skärförfarandet. Gör detta tills ungefär en tredjedel av kärnan diameter skärs ned vilket resulterar i en kontinuerlig plan yta.
- Fäst tillväxtkärnor i kärnan innehavaren av ett nyutvecklat kärn mikrotom möjliggör att skära plana ytor på kärnor över hela sin omfattning.
- Förbereda mikro sektioner genom att lägga majsstärkelse lösning.
- För detaljerad bildanalys av den anatomiska strukturen, fixa kärnor eller andra prover avstyckade från skivor av innehavare av en mikrotom. Placera mikrotomen bladet, styrs av ett kullager ledning av en nyutvecklad släde mikrotom på den övre kanten av provet och dra över den.
- Tryck tillbaka bladet att lyfta upp provet med cirka 20 till 30 nm och dra bladet över provet igen. Upprepa denna procedur tills en kontinuerlig yta på toppen av provet skapas.
- Täck den resulterande ytan med en majsstärkelse-lösning (10 g majsstärkelse, 8 ml vatten, och 7 g av 100% glycerol) med en gemensam borste.
OBS: De stärkelsekorn fylla upp de öppna cellerna i provet för att stabilisera strukturen för den efterföljande skärning av de tunna sektionerna. - Lyft provet genom 15 um, placera en pensel på ytan av provet och drar bladet långsamt mot provet börjar att skära av en tunn sektion (under borsten). Medan skärning, den resulterande sektionen glider på bladet styrs av borsten.
- När hela avsnittet skärs bort mikro sektionen från bladet med en borste och vatten (för att minska friktionen) och placera avsnittet om en glasskiva för vidare beredning. För att förhindra dem från att torka, täcka dem med en liten mängd glycerol (33% = en del av 100% glycerol och två delar vatten).
3. Micro Framställning
- För den följande framställningen av permanenta bilder, först tvätta glycerolen bort från mikro avsnitt med en pipett och vatten.
- Täck den våta sigInsatser med några droppar Safranin (1 g Safranin pulver + 100 ml vatten) och Astrablue (0,5 g av Astra blått pulver + 2 ml 100% ättiksyra + 100 ml vatten) för att skilja mellan förvedade och icke förvedade strukturer, men också för att öka kontrasten för den efterföljande bildanalys.
- Låt avsnittet vila i 5 minuter som omfattas av färgämnet och sedan tvätta bort det med en pipett och vatten igen.
- Så snart som den överdrivna färgämnet avlägsnas, dehydratisera avsnittet med pipetterna genom att tvätta dem med en sekvens av 75% utspädd, 96% och slutligen 100% etanol.
- Använd pipetter att skölja proverna på glasskiva i stället för att placera proverna i ett bad för att minska handläggningstiden till ungefär två till tre minuter för hela dehydratiseringsprocessen.
OBS: Uttorkning med etanol förhindrar ömtåliga prover från att bryta. - Därefter skölj sektionen med 100% xylen.
OBS: Xylen är cancerframkallande och ventilation är obligatorisk i labbet när du använder den. Annatprodukter existerar ersätter xylol, men om det finns uppsåt att lagra proverna över längre tidsperioder (år, decennier) för en potentiell ny analys, är Kanadabalsam (steg 3.5.2) den enda bädda medium som förblir klar utan att ändra färg med tiden. Tyvärr Kanadabalsam behöver användas i kombination med xylol. - Så länge xylol vänder mjölkig (vitaktig), upprepa uttorkning processen eftersom det inte är tillräckligt uttorkad.
- Så snart xylol förblir klar, täcka avsnitt med en droppe 100% Kanadabalsam och täck den med ett skyddsglas på minst storleken på sektionen.
OBS: Var uppmärksam på att ta bort luftbubblor genom att försiktigt trycka ned täckglaset. - Placera den resultemikroglid mellan två remsor av värmetålig plast och placera den på en metallplatta. Placera en vikt (t.ex. en magnet) ovanpå bilden för att trycka ner den för att hålla sektionen platta under följande torkningsprocessen.
- Placera glasen i en ugn vid60 ° C under ca 12 h. Efter 12 h, ta de glider ut ur ugnen och placera dem på en hylla för att låta dem svalna till RT (cirka 20 ° C). Låt svalna och ta bort vikt och plastremsan och rengör glid använder rakblad för att avlägsna överskottet Kanadabalsam.
4. Visualisera cellinnehåll
- Bered Nawashin lösning 25.
- Bered en lösning (A) med 5 g av kromsyra, 50 ml 96% ättiksyra, och 320 ml avjoniserat vatten. Bered en annan lösning (B) med 200 ml formalin med 175 ml avjoniserat vatten.
- Blanda lösning A och lösning B i ett 1: 1-förhållande för att skapa den Nawashin lösningen.
- Att visualisera cellinnehållet, fixa provet med Nawashin lösning för 10 minuter för att stoppa alla nedbrytningsprocesser i cellen.
OBS: fixering bevarar cellkärnor möjliggör en uppskattning av cell livslängd (cell livslängd = kärnor närvarande / kärnor saknas; närvaro or frånvaro av kärnan anger om cellen är levande eller döda). - Efter fixering, tvätta delarna med vatten för att helt avlägsna Nawashin lösning innan färgning dem med Safranin-Astra blått och innan ytterligare färgning dem med pikrinsyra-anilin blå (1 del mättad vattenlösliga anilin blå + 4 delar 10% pikrinsyra) .
- Försiktigt värma provet till ca 80 ° C (i vilket fall som helst under kokpunkt) för att påskynda färgningsprocessen. För uttorkning och inbäddning av proverna följa protokollet steg 3,4-3,8.
5. Förbereda digitala bilder av Anatomiska funktioner
- Skapa digitala bilder av kärnytor för kärlanalys.
- Skär kärnan ytplan använder kärn mikrotomen och färga den resulte ytan svart genom att bara använda en filtmarkör.
- Så snart färgämnet torkas, gnugga ytan av kärnan med vit krita. Tryck på krita i cellerna genom att helt enkelt gnugga krita överyta med hjälp av ett finger. Ta också bort överskottet krita genom detta förfarande.
NOTERA: Som en följd cellväggarna är svarta och lumendelar kärlen är vita. Denna kontrast är en förutsättning för en automatiserad bildanalys. - Placera den beredda kärnan under ett binokulärt mikroskop utrustat med en digitalkamera. Ta en sekvens av något överlappande (ung. 10%) bilder som börjar på den ena sidan av kärnan tills hela ytan fångas. Sy de enstaka bilder för att skapa en fullständig bild av kärnans yta.
- Skapa digitala bilder från mikro diabilder
- Placera de rengjorda mikro glider under ett mikroskop och ta överlapp bilder från hela avsnittet.
- Definiera en specifik förstoring beroende på de strukturer som skall analyseras, som sträcker sig mellan 40X och 1,000X förstoring.
- Sy de enstaka bilder för att skapa en fullständig bild av sektionen. För att undvika eventuella snedvridningar under sömmen processen, använd "; Planen "-typ objektiv med mikroskop.
6. Kvantifiera anatomiska egenskaper
- För att upptäcka celler och ring gränser med hjälp av bildanalys verktyget ROXAS18 eller liknande mjukvara, ladda en komplett bild av en mikro avsnitt och tillhörande rumsliga kalibrering för att erhålla kvantitativa resultat i metriska enheter. Beräkna den rumsliga kalibreringen genom att mäta antalet pixlar mellan skalorna i en scenbilder mikrometer tagna vid samma förstoring och avdelar erhållna värdet med skaldelslängden i metriska enheter (t.ex. 1000 nm).
- Välj från den medföljande listan (förutsatt i programvaran) en lämplig konfiguration innan den automatiska delen av analysen.
ANMÄRKNING: En konfiguration är en tidigare optimerad uppsättning programinställningar som, till exempel, tar hänsyn till färgnings färgen på provet och storleken och formen intervallet för de celler som skall detekteras. Skräddarsydda konfigurationer därmedtillåta att producera optimala igenkänningsresultat för olika arter och bildkvaliteter.- Välj ytterligare alternativ som t.ex. användningen av regioner i bilden som ska inkluderas eller exkluderas för att undvika, t.ex. tomma bild marginaler eller sprickor i provet, om det behövs.
- Starta analysen genom att trycka på knappen Analysera. Om valt, definierar regioner i bilden som ska ingå eller uteslutas med hjälp av polygon, rektangel eller cirkel verktyg. Följande automatisk analys använder flexibla algoritmer för att korrigera vissa bild brister (t.ex. dålig kontrast) och förbättra kontrasten baserat på kvaliteten på bilden.
- I särskilda fall (och särskilt i tropikerna), t.ex. vid provtagning stubbar och fallna träd eller när det är möjligt, ta skivor (tvärsnitt vinkelrätt mot den växande axeln) med en motorsåg. Helt enkelt märka skivorna och lagra dem tills vidare analys.
Representative Results
Alla dendroecological analyser beroende noggranna prover, oavsett om skivor, kärnor, eller mikrokärnor tas. För detta måste enheterna vara i perfekt form (exakt slipade) för att undvika mikrosprickor inom trä provet. När man förbereder ytor på tillväxtkärnor, är viktigt att använda en kärna mikrotom. Förmågan att ha öppna celler, som kan behandlas ytterligare för att öka kontrasten för bilden analyser och kärlstorleksmätningar (Figur 1), är ett första viktigt steg mot anpassning av anatomiska strukturer i tidsserieanalyser. Ibland densiteten hos ett prov lövträ förhindrar användning av en mikrotom. I så fall en ordentlig polering och efterföljande borttagande av överdriven sågspån från fartyg med en kompressor eller vakuum är det bästa alternativet.
För mer detaljerade analyser av mindre cellstrukturer som earlywood och latewood tracheids i barrträd, behövs högkvalitativa mikro sektioner. Här, potential artefakter såsom sekundära cellväggar som klädde av den primära väggen måste undvikas (Figur 2). Om dessa artefakter förekommer i de digitala bilderna, inte längre är möjligt en automatiserad analys av celldimensioner. Montrarna måste sedan manuellt korrigeras, vilket är tidskrävande och i de flesta fall leder till felaktiga mätningar av celldimensioner. Den enkel tillämpning av en icke-Newtonsk vätska, dvs en majsstärkelse lösning, till toppen av provet stöder stabiliteten i strukturen och samtidigt minska förekomsten av artefakter till ett minimum (Figur 2) 26. Denna tillämpning av majsstärkelse, som lämpar sig för alla trä prover inklusive tropiska arter, gör tillämpningen av inbäddning förfarandet till proverna före styckning överflödig.
Micro sektioner möjliggör en säkrare bestämning av årsringar. Detta gäller särskilt för barrträd som växer på deras naturliga gränser, dvs </ Em>, vid trädgränsen i höga alpina områden. Extremt smala ringar är täta och svåra att upptäcka makroskopiskt (Figur 3). I extrema fall, ringarna består av en eller två rader av earlywood celler och en rad av tillplattade latewood celler, som saknar (i motsats till vanliga latewood celler) förtjockade cellväggar. För detta de är bättre eller ens bara synlig när du använder mikro sektioner. Dessutom kan fluktuationer densitet skiljas från ring gränser tydligare, vilket förenklar detektering av årsringar särskilt i Medelhavet och tropikerna (Figur 3).
Vid analys av bilder med en förstoring på 40X eller högre, enskilda celler är synliga och tjockleken på deras cellväggar är också upptäckas. Halvautomatisk analysprogram möjliggör mätning av specifika parametrar längs definierade stigar efter riktningen av deras temporala och spatiala utveckling (Figur 4). Med detta, chanGES av enstaka parametrar såsom cell lumen eller cellväggtjocklek kan bestämmas över hela utsträckningen av ett årligt ring (Figur 4). Detta kan göras för alla ringar synliga i bilden och detta stödjer fullt ut att det behövs en längre tidsserieanalys.
Bild analyser kan också användas för att bestämma de utvecklingsfaser årsringar inom vegetationsperioden (Figur 5). Vid en analys av bilden av ett avsnitt färgas med Safranin och Astra-blått använder polariserat ljus, även de olika stadierna av lignification, med början i de yttersta hörnen av cellväggarna tills full lignification av den sekundära cellväggen, blir synliga. Detta beror på att de förvedade (mogna) cellväggar lysa upp i polariserat ljus (Figur 5). Detaljerad information kan relateras till miljödata dokumenteras för respektive vegetationsperioden för att fastställa till exempel en mer detaljerad klimat tillväxt relati onship.
Figur 1. Exempel på en mikrosektion och en förberedd plan yta av en ek, inklusive ringbredd och fartygsstorlek mätningar Vänster:. Yttersta delen av en ek inkrement kärna. Kärna Den 5 mm diameter skars med användning av en kärna mikrotomen. Ytan sedan färgas svart med en filt markör och celler fylldes med vit krita efter fläcken var torr. Höger: grafen indikerar ring bredd och fartygsstorleksmätningar gjorda på ytan av kärnan som visas till vänster. Inga mikro sektioner behövdes för att göra dessa mätningar på grund av den klara ytan skapas av kärn mikrotomen (modifierad efter 21). Botten: Micro avsnitt avskurna en ökning kärna, färgade, uttorkad och fixeras i Kanada balsam. Tjocklek: 20 um, längd: 25 cm. g "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Bilder av mikro sektioner klippa utan stabilisering kontra ett avsnitt snitt använder majsstärkelse lösningen Vänster:. Micro avsnitt visar skär artefakter i earlywood tracheids av ett barrträd. Provet skars utan inbäddning och som ett resultat de ganska tunna sekundära väggarna hos de earlywood cellerna delades upp den primära väggen (blå pilar). Höger: Micro avsnitt utan några artefakter i earlywood tracheids av ett barrträd. Detta avsnitt (samma prov som visas till vänster) klipptes efter applicering av majsstärkelse lösningen med en borste på toppen av provytan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
. Figur 3. Exempel på knappt detekterbara årsring gränser Vänster: Micro delen av en ökning kärna (här: Lärk) visar en ringgräns (svart pil) indikeras med en enda rad av tillplattade latewood celler utan förtjockning av cellväggarna. Denna ring skulle inte vara synlig makroskopiskt. Höger: Intra-årliga densitet svängningar (vit pil) är vanliga i arter Medelhavs (micro avsnitt: Quercus ilex). Den gradvisa förändringen av cellstrukturen mot latewood och tillbaka till earlywood struktur (vit pil) möjliggör för differentiering densitetsfluktuationer från verkliga ring gränser (svart pil). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Illustration av lumen området och väggtjockleksmätning inom en årsring av ett barrträd Top:. Klipp ut bilden visar ett exempel på resultat från Roxas analys i ett träd-ring av Pinus sylvestris (tall). Ringgränserna visas i gult och skisserar av trakeid lumina i cyan. För en radiell fil (blå trakeid lumina) de uppmätta cellväggtjocklek representeras av röda cirklar. Svart skala bar = 100 nm. Nederst:. De inom årliga förändringar i trakeid lumen området och trakeid cellväggtjocklek för hela årsring Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. example av en formnings årsring. Bilden har tagits i ett ljusmikroskop med polariserat ljus från en Safranin och Astra-blå färgade mikro sektionen erhållits från ett mikrokärn samplas den 7 juli: e, 2007 från en Lärk växer i Lötschental på 1.300 meter över havet. På denna mikro avsnittet av cambial celler, cellerna i utvidgningsfasen, cellerna i väggen förtjockning fasen och de mogna cellerna är igenkännbar. Den tangentiella bredden på bilden täcker ~ 1 mm i xylem tvärsnitt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Utmaningarna i en framgångsrik och hållbar integrering av trä anatomi i dendroecological forskning är, förutom handa analytiska problem, främst på grund av tekniska aspekter. Dessa utmaningar allt från principen provtagning metoder för att skapa högkvalitativa mikro sektioner och deras efterföljande analys 19.
Vid första anblicken är provtagning av kärnor eller ens skivor en enkel procedur som har varit känt i många år nu. Det finns många saker som kan göras fel och en liten felaktighet i provtagningen kan resultera i allvarliga problem under de efterföljande beredning och analysfaser. Små felaktigheter såsom coring som inte är exakt vinkelrät mot stam axel eller med hjälp av en ofullständigt vässad corer är inte en fråga om syftet med studien är begränsad till ring-breddmått. Men när siktar på mikroskopisk analys av proverna, kanske en felaktig provtagning riktning resultera i optiska snedvridningar avcellväggar, medan användningen av trubbiga corers resulterar i mikrosprickor i härden. Som ett resultat, när man försöker skära mikro sektioner av dessa kärnor, de tunna sektionerna bara faller isär och en effektiv förberedelse ej garanteras. Detsamma gäller för mikrokärnprovtagning. En trubbig spets kommer att resultera i höga tryck när puncheren hamras in i stamved. Följaktligen cambial skiktet kommer att komprimeras. De cambial celler (Figur 5) följaktligen pressas och kan inte analyseras.
Skiv provtagning är verkligen den bästa strategin när man analyserar tillväxtvariationer att relatera dem till miljöförändringar. Tyvärr är det helt enkelt omöjligt att ta skivor från alla träd som är avsedda att provtas för vidare analyser. Ändå, speciellt i fall av tropiska dendrokronologi, behövs en viss mängd av stjälk diskar i kombination med tillväxtkärnor. Skivorna används som en bas för att definiera ringgränserna och för att detta skall stödja boundartalet definieras utifrån att analysera tillväxtkärnor 12,27,28.
För- och nackdelar med slipning kontra skärning ofta diskuteras 1,11,21. Som det nämns ovan, det bästa förfarandet beror alltid på frågeställningen och de parametrar som skall analyseras (makroskopisk eller mikroskopisk). Om isotop eller kemiska analyser projiceras i ett ytterligare arbetssteg, är det av yttersta vikt att slipdamm skapas genom slipning som kan fylla i cell lumina över hela provet, försiktigt avlägsnas genom dammsugning eller tryckluft.
Cutting mikro sektioner är för alla mikroskopiska analyser det lämpligaste sättet att förbereda prover för vidare analyser. Först av allt, är det avsnitt avskuren provet, som sedan kan hållas utan föroreningar för eventuella ytterligare analyser. Andra dessa avsnitt möjliggör högupplösta mätningar av encelliga parametrar. Vidare undviker den tidsödande inbäddningteknik med hjälp av en majsstärkelse lösning 26 för att stabilisera cellerna är en stor fördel i mikrosektione.
En nackdel med mikrosektione är fortfarande begränsade urvalet resulterar i långa förberedelsetider. På riktigt tidsserier analyser gå tillbaka i tiden under århundraden eller tom årtusenden, det finns ett behov av att vidareutveckla befintliga skäranordningar 17,19, men också bildbehandling och analys 18. Ett första steg i denna riktning är att utveckla kärn mikrotom 21, ursprungligen tillverkad för att skära plana ytor på kärnor (Figur 1). Nya tester visade förmågan att skära mikro sektioner av hela kärnor som använder den här enheten (figur 1).
Högkvalitativa mikro sektioner fastställa grundläggande principer för en effektiv bildanalys. Med bilderna i mikroskop är ett vanligt förfarande 19, men deras effektiv analys är fortfarande en uppgift som behöverutvecklas ytterligare 17. Alla befintliga bildanalysutrustningen är halvautomatisk, dvs., de måste vara mer eller mindre intensivt kontrolleras av teknikern. I många fall, bilderna måste korrigeras eller ens nya bilder måste göras för att öka kontrasten för en bättre registrering av strukturerna av programvaran utan att ändra cellväggtjocklek i bilden.
Specialiserade bildanalys verktyg som Roxas 18, WinCell eller särskilda skript för ImageJ 29 möjlighet att erbjuda grundläggande anatomiska data såsom cellantal, celldimension, cellväggtjocklek och cell position inom årsring. Många ytterligare anatomiska mått som är relevanta i ett dendroecological sammanhang kan beräknas från dessa grundläggande mätningar som storleken på de största kanalerna, storleksfördelning av ledningar, storlek earlywood eller den första raden i ledningar, (optisk) trä densitet, intra årig profiler av ledningsstorlek och cellväggentjocklek, och gruppering mönster ledningar (solitära, multiplar, etc.).
Med hjälp av programvaran Roxas 18, är konturerna av lednings lumina (dvs vatten genomför cell) och årliga ringgränserna automatiskt igen och visuellt representerade som överlägg över originalbilden. Detekteringsalgoritmer för ledningar är baserade på färg, storlek och form informationen, detekteringsalgoritmer för ring gränsar det lokala sammanhanget för varje kanal. En verktygslåda ger oss möjlighet att manuellt förbättra dessa resultat genom att direkt redigera overlay funktioner, dvs ta bort, lägga till och ändra ringgränser och lednings konturer. Efter redigering, den sista datautgång, inklusive cellväggtjocklek (barrträd), automatiskt genereras och sparas i ett kalkylblad. Fullt automatiserade system finns inte tillgängliga, inte ens för barrträd som visar en relativt enkel struktur, men detta är ett mål för den framtida utvecklingen. Detta skulle starkt stödja full integration av trä anatomiska parametrar i tidsserieanalyser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Increment corer | http://www.haglofinc.com/index.php?option=com_content&view=article &id=57&Itemid=88&lang=en |
||
| Core-Microtome | http://www.wsl.ch/dendro/products/microtomes/index_EN | ||
| Laboratory microtome | http://www.wsl.ch/dendro/products/microtomes/index_EN | ||
| Trephor micro corer | http://intra.tesaf.unipd.it/Sanvito/trephorEn.asp | ||
| Nawashin solution | Ten parts 1% chromic acid, four parts 4% formaldehyde and one part acetic acid | ||
| Picric-Anilin blue | One part saturated aniline blue and four parts Trinitrophenol dissolved in 95% ethanol | ||
| Safranin | Empirical Formula (Hill Notation) C20H19ClN4 | ||
| Astra-blue | Empirical Formula (Hill Notation) C47H52CuN14O6S3 | ||
| Ethanol | Linear Formula CH3CH2OH | ||
| Xylol (Xylene) | Linear Formula C6H4(CH3)2 | ||
| Canada Balsam | Embedding solution for microscopy | ||
| Roxas Software | http://www.wsl.ch/dienstleistungen/produkte/software/roxas/index_EN | ||
| ImageJ Software | http://imagej.nih.gov/ij/ | ||
| WinCell | http://imagej.nih.gov/ij/ |
References
- Schweingruber, F. H. Tree Rings and Environment: Dendroecology. , Haupt. Bern. (1996).
- Sheppard, P. R. Dendroclimatology: extracting climate from trees. Wiley Interdisciplinary Reviews: Climate Change. 1, 343-352 (2010).
- Wagenführ, R. Anatomie des Holzes: Strukturanalytik - Identifizierung - Nomenklatur - Mikrotechnologie. , DRW-Verlag Weinbrenner. (1999).
- Tennessen, D., Blanchette, R. A., Windes, T. C. Differentiating Aspen and Cottonwood in Prehistoric Wood from Chacoan Great House Ruins. Journal of Archaeological Science. 29, 521-527 (2002).
- Rowell, R. M. Handbook of Wood Chemistry and Wood Composites. , CRC Press, Taylor & Francis Group. Boca Raton, FL. (2005).
- Kaennel, M., Schweingruber, F. H. Multilingual Glossary of Dendrochronology. Terms and definitions in English, German, French, Spanish, Italian, Portuguese and Russian. , Haupt. Berne. (1995).
- Esper, J., Frank, D. C., Luterbacher, J., et al. A changing world: challenges for landscape research. On selected issues and challenges in dendroclimatology. Kienast, F. , Springer. Dordrecht. 113-132 (2007).
- Esper, J., Frank, D. C., Wilson, R. J. S., Büntgen, U., Treydte, K. Uniform growth trends among central Asian low and high elevation juniper tree sites. Trees. 21 (2), 141-150 (2007).
- Frank, D. C., Nievergelt, D., Esper, J. Summer temperature variations in the European Alps, AD 755-2004. Journal of Climate. 19 (2), 5606-5623 (2006).
- Treydte, K., et al. Millennium-long precipitation record from tree-ring oxygen isotopes in northern Pakistan. Nature. 440, 1179-1182 (2006).
- Heinrich, I. Dendrogeomorphology. The Encyclopedia of Quaternary Science. Elias, S. A. 2, Amsterdam, Elsevier. 91-103 (2013).
- Verheyden, A., De Ridder, F., Schmitz, N., Beeckman, H., Koedam, N. High-resolution time series of vessel density in Kenyan mangrove trees reveal a link with climate). New Phytologist. 167, 425-435 (2005).
- Abrantes, J., Campelo, F., García-González, I., Nabais, C. Environmental control of vessel traits in Quercus ilex under Mediterranean climate: relating xylem anatomy to function. Trees. 27, 655-662 (2013).
- Fengel, D., Wegener, G. W. ood Wood: Chemistry, Ultrastructure, Reactions. , Kessel Verlag, Remagen. (2003).
- Heinrich, I., Gärtner, H., Monbaron, M. Tension wood formed in Fagus sylvatica and Alnus glutinosa after simulated mass movement events. IAWA-Journal. 28 (1), 39-48 (2007).
- Climate Change 2013: The Physical Science Basis. Contribution of Working Group I to the Fifth Assessment Report of the Intergovernmental Panel on Climate Change. Stocker, T. F., et al. , Cambridge University Press. Cambridge, United Kingdom and New York, NY. (2013).
- Lucchinetti, S., Schweingruber, F. H. New perspectives for wood anatomical analysis in Dendrosciences: The GSL1-microtome). Dendrochronologia. 32 (1), 47-51 (2014).
- Arx, G., Carrer, M. ROXAS - a new tool to build centuries-long tracheid-lumen chronologies in conifers. Dendrochronologia. 32 (3), 290-293 (2014).
- Schweingruber, F. H. Microscopic Preparation Techniques for Plant Stem Analysis. , Verlag Dr Kessel, Remagen. (2013).
- Hoadley, R. B. Identifying wood: Accurate results with simple tools. , The Taunton Press. Newtown, CT. (1990).
- Nievergelt, D. The core-microtome. A new tool for surface preparation on cores and time series analysis of varying cell parameters. Dendrochronologia. 28 (2), 85-92 (2010).
- Von Schnakenburg, P., Bräuning, A., Helle, G. Detecting annual growth rhythms from high-frequency densitometry and carbon isotopes in tropical mountain rain forest trees in southern Ecuador. Tree Rings in Archaeology, Climatology and Ecology. Elferts, D., Brumelis, G., Gärtner, H., Helle, G., Schleser, G. 6, GFZ Potsdam. Potsdam. 96-99 (2008).
- Garcia Gonzalez, I., Fonti, P. Ensuring a representative sample of earlywood vessels for dendroecological studies: an example from two ring-porous species. Trees. 22 (2), 237-244 (2008).
- Fonti, P., et al. Studying global change through plastic responses of xylem anatomy in tree rings. New Phytologist. 185 (1), 42-53 (2010).
- Purvis, M. J., Collier, D. C., Walls, D. Laboratory techniques in Botany. , Butterworth, London. (1966).
- Schneider, L., Gärtner, H. The advantage of using non-Newtonian fluids to prepare micro sections. Dendrochronologia. 31 (3), 175-178 (2013).
- De Ridder, M., Vanden Bulcke, J., Van Ackera, J., Beeckman, H. Tree-ring analysis of an African long-lived pioneer species as a tool for sustainable forest management. Forest Ecology and Management. 304, 417-426 (2013).
- De Ridder, M., et al. A tree-ring based comparison of Terminalia superba climate–growth relationships in West and Central. Trees. 27 (5), 1225-1238 (2013).
- Redband, W. S. ImageJ. , U.S. National Institutes of Health. Bethesda, Maryland, USA. Available from: http://imagej.nih.gov/ij (1997).
