Summary
Gallium (III) 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole och dess freebase analog uppvisar låg mikromolära cellcytotoxicitet. Detta manuskript beskriver en RNA-transkription reaktion, imaging-RNA med en etidiumbromid-färgade gelén, och kvantifiera RNA med UV-Vis-spektroskopi, för att bedöma transkription hämning av corroles och visar en enkel metod för att utvärdera cancer kandidat egenskaper.
Abstract
Cytostatika innebär ofta bredspektrum cytotoxiska medel med många biverkningar och begränsad inriktning. Corroles är en klass av tetrapyrrolic makrocykler som uppvisar differential cytostatiska och cytotoxiska egenskaper i specifika cellinjer, beroende på identiteten på kelaterade metallen och funktionella grupper. Den unika beteende funktion corroles mot specifika cellinjer införs möjligheten riktade kemoterapi.
Många anticancerläkemedel utvärderas genom deras förmåga att inhibera RNA-transkription. Här presenterar vi en steg-för-steg-protokoll för RNA-transkription i närvaro av kända och potentiella inhibitorer. Utvärderingen av RNA produkter av transkriptionsreaktionen med gelelektrofores och UV-Vis-spektroskopi ger information om hämmande egenskaper hos potentiella anticancer läkemedelskandidater och med ändringar i analysen, mer om deras verkningsmekanism.
Litenär känt om den molekylära verkningsmekanismen för corrole cytotoxicitet. I detta experiment, anser vi två corrole föreningar: gallium (III) 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (Ga (tpfc)) och fri bas analog 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (tpfc). En RNA-transkription analys användes för att undersöka de inhiberande egenskaperna hos corroles. Fem transkriptionsreaktioner framställdes: DNA behandlades med aktinomycin D, triptolid, Ga (tpfc), tpfc vid en [komplex]: [mall-DNA bas] förhållande av 0,01, respektive, och en obehandlad kontroll.
De transkriptionsreaktioner analyserades efter 4 h med användning av agarosgelelektrofores och UV-Vis-spektroskopi. Det finns tydliga inhibition av Ga (tpfc), Actinomycin D, och triptolid.
Detta RNA transkriptionsanalys kan modifieras för att ge mer mekanistisk detalj genom att variera koncentrationerna av anticancer-komplex, DNA eller polymerasenzym, eller genom att inkubera DNA eller polymeras med kompletxes före RNA-transkription; dessa ändringar skulle skilja mellan en hämning mekanism som involverar DNA eller enzymet. Lägga komplexet efter RNA-transkription kan användas för att testa om komplexen försämra eller hydrolysera RNA. Denna analys kan också användas för att studera ytterligare anticancer kandidater.
Introduction
Cytostatika innebär ofta bredspektrum cytotoxiska medel med oönskade biverkningar och begränsad inriktning, men med större förståelse för cancerbiologi, det finns en ständigt ökande efterfrågan på anticancermedel med högre cancermåls effekt och färre biverkningar. 1 Mänskliga cancerceller blir ofta beroende av en enda aktiverad eller överuttryckt onkogen för överlevnad. 2 Således är många anticancerläkemedel utvärderades genom deras förmåga att inhibera RNA-transkription. Behandlingar som blockerar uttrycket av dessa transformerande gener är effektiva i att eliminera cancerceller och leder till celldöd. 3 Transformerade celler är mer känsliga för störningar i RNA-transkription än är motsvarande normala celler. 4 Anticancer läkemedel som hämmar transkription förväntas selektivt hämmar expression av onkogener som är nödvändiga för cancercellen för att överleva. 5 Följaktligen RNA-transkription inhibition är ett bra sätt att identifiera potentiella cancerläkemedel läkemedelskandidater och lära sig mer om deras verkningsmekanism. Detta protokoll visar att Ga (tpfc) hämmar RNA-transkription på samma ordning som de cytostatika Actinomycin D och triptolid; liknande jämförelser kan göras med hjälp av detta protokoll med andra cancer läkemedelskandidater. Aktinomycin D är en RNA-transkriptionshämmare som vanligen används för att behandla graviditets trofoblastisk cancer, testikelcancer, Wilms tumör, rhabdomyosacoma och Ewings sarkom 6. Actinomycin D har använts inom cancerterapi för nästan femtio år sedan den första godkända av FDA i 1964.Triptolide är en selektiv transkriptionshämmare som har undersökts in vitro och i olika tumörbärande djurmodeller för 30 år. 7
Den amfifila makrocykliska natur corroles ger betydande fördelar jämfört med andra läkemedelsklasser såsom små molekyler eller biologiskas. 8-14 Den makrocykliska karaktär möjliggör cellulär permeabilitet som är större än förväntat för sådana stora molekyler, och de är tillräckligt stora för att interagera med makromolekylära ytor, såsom de av proteiner. 8 Corroles är kända för att bilda täta icke-kovalenta komplex med biomolekyler och droger. 10 Förutom den inneboende cytotoxicitet av corrole ram, har vi visat att en sulfonerad corrole fungerar som en bärarmolekyl för kemoterapeutiska medel, specifikt DNA-interkalerande antracyklin drogen doxorubicin. När sulfonerade corrole administrerades tillsammans med doxorubicin, var en 3-faldig förbättring i IC 50 av doxorubicin observerats för DU-145-celler. 9 corrole ram är stabil och har inneboende absorbans och fluorescens egenskaper som, när de funktion, genomgår unika absorbans skift som kan användas för karakterisering. 10 Funktionalisering av den byggnadsställning inte inneboende affect de fotofysikaliska egenskaperna hos corrole, 9-15, men, sett med en sulfonerad corrole, selektivt modifiera ramen för corrole kan väsentligt ändra dess biologiska egenskaper. 16 Vi har tidigare utvärderat sex metallocorroles mot sju humana cancercellinjer. Resultaten tyder på att toxicitet mot humana cancerceller är beroende av den specifika metalljoner, liksom funktionell grupp-substitution. Till exempel, sulfonerade gallium corroles upplevt hög cellulärt upptag och trängde selektivt in i kärnan av hjärnmetastaserprostatacancerceller (DU-145); samma corrole, även om det inte tränger in i kärnan hos andra cellinjer, uppvisar större cytotoxicitet för bröst (MDA-MB-231), melanom (SK-MEL-28), och äggstocks (OVCAR-3) cancerceller än för prostatacancer. 9
Initiala cellbaserade analyser indikerar att dessa föreningar visar lovande som anticancer terapeutiska medel, vilka meriter further undersökning av verkningsmekanism. Transkription hämning med vissa metallorganiska komplex 17-27 och vi försökte undersöka denna process som en möjlig mekanism för den cytotoxiska beteende corrole familjen. Denna transkriptionsanalys ger en enkel, billig och enkel metod för att bedöma transkription inhibition, vilket kommer att leda till mer detaljerad information om effekterna av dessa molekyler i levande celler.
Här, transkriptionen hämning av gallium (III) 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (Ga (tpfc)) och dess freebase analog 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (tpfc) (Figur 1) testas. Till skillnad från vissa övergångsmetallkomplex, (III) är gallium redox inaktiv och därför inte är direkt involverad i redox process redox-baserade metabola vägar. 28 Oavsett, gallium (III) inte uppvisar cytotoxiska egenskaper och har undersökts i terapeutiska syften. Gallium är den näst mest lovande metall för cancer läkemedel efter platina och har genomgått många studier och undersökningar; nitrat och klorid gallium alter har utvärderats i kliniska prövningar mot hepatom, lymfom, blåscancer, och andra sjukdomar. 29-34 Gallium (III) är därför idealisk för cancer corrole studier. Initiala data visar Ga (tpfc) och tpfc har lågt GI 50, den koncentration som är nödvändig läkemedlet för att hämma 50% av maximal cellproliferation, med olika cancercellinjer (se figur 2); Detta bekräftar giltigheten av ytterligare experiment på dessa två föreningar för att bestämma deras hämmande egenskaper. Vi jämför dessa föreningar med vanliga cytostatika Actinomycin D och triptolid. Actinomycin D interkalerar DNA, hämmar RNA töjning, och inducerar apoptos i vissa cellinje vid pikomolar koncentrationer 6,35-37 Triptolid har visats hämma tumörtillväxt. det binder till humant XPB / ERCC3, en subenhet of transkriptionsfaktor TFIIH, vilket leder till hämning av RNA-polymeras II aktivitet. 6-7,38-40
Även om det är allmänt känt att corroles uppvisar cytotoxiska egenskaper, det finns lite information om de olika mekanismer som följer av funktion. Corrole hämning av RNA-transkription skulle erbjuda större insikt om deras interaktioner med biomakromolekyler. Andra komplex kända för att binda till DNA, såsom dirhodium (II, II) -komplex, krom (III) -komplex, rutenium (II) polypyridyl komplex, rodium (III) komplex, och diverse andra, utsattes för RNA-transkriptionsanalyser, 18- 27 vilket resulterar i större förståelse för deras interaktioner med biomakromolekyler. Denna lättköpt och allmänt tillgängliga experiment är också ett bra första test för att bedöma cytotoxicitet egenskaperna hos en given molekyl och avgöra om den förtjänar ytterligare biologisk testning. Den RNA-transkription analysen möjliggör även för många modifieringar, såsom varying mängden av föreningen eller enzymer som används; att variera inkubationstiden, reaktionstid och prov tidpunkter; och varierande DNA-mallen längd och sekvens, bland andra variabler av intresse, således potentiellt ge en stor mängd data. Denna transkriptions analys är också lätt tillgänglig som prisvärda kit med alla nödvändiga reaktionskomponenter som, även om komponenterna kan köpas och förberett sig. I dessa experiment använder vi en kommersiellt tillgänglig kit kända för att ha hög avkastning. 41
För att bedöma transkription inhibition, använder vi två metoder: agarosgelelektrofores och UV-Vis spektroskopi. Agarosgelelektrofores är en enkel och effektiv metod för separering, identifiering och rening av 0,5- till 25-kb DNA och RNA-fragment. 42 UV-Vis-spektroskopi kan användas för att bestämma koncentrationen och renheten hos RNA. 43
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: När du arbetar med RNA upprätthålla en ren arbetsmiljö för att undvika föroreningar av DNas och RNas enzymer som bryter ner DNA och RNA. Se till att pipettspetsarna och rör är DNas och RNas gratis. Det är också bra att torka av labbytor och utrustning såsom pipetter, hållare röret, etc. med en saneringslösning.
1. RNA Transkription med Corrole Behandling
- Förbered corrole och hämmarföreningar i en 0,01: 1 molförhållande av [komplex]: [DNA].
OBS: I vårt fall, förhållandet var 4,3 fmol komplex: 0,43 pmol DNA, där DNA-mall som användes var APET-28c vektor med LIGA genen från E. coli under kontroll av T7-promotorn. Andra DNA med T7 promotorn är också giltiga kandidater för att köra transkriptionen analysen.- Lös Actinomycin D, triptolid, tpfc och Ga (tpfc) i dimetylsulfoxid (DMSO) i rena, separata behållare. Erhållande av den slutliga koncentrationen av en 0,01: 1-molförhållande av [complex]: [DNA] genom användning av serieutspädningar med nukleasfritt vatten.
- Lös 1 mg Actinomycin D i 1,8 ml DMSO. Alikvot 10 pl till en separat behållare och späd till 1 ml med nukleasfritt vatten för att skapa en 1/100 utspädning. Alikvot 1 l av utspädningen till en separat behållare och späd till 1 ml med nukleasfritt vatten för att skapa en 1/1000 utspädning.
OBS: Koncentrationen av den slutliga lösningen av aktinomycin D är 4,3 fmol. - Lös 1 mg triptolid i 0,64 ml DMSO. Alikvot 1 pl till en separat behållare och späd till 1 ml med nukleasfritt vatten för att skapa en 1/1000 utspädning. Alikvot 1 l av utspädningen till en separat behållare och späd till 1 ml med nukleasfritt vatten för att skapa en andra 1/1000 utspädning.
OBS: Koncentrationen av den slutliga lösningen av triptolid är 4,3 fmol. - Lös 1 mg tpfc i 2,9 ml DMSO. Alikvot 10 pl till en separat behållare och späd till 1 ml med nukleasfritt vatten för att skapa en 1/100 dilution. Alikvot 1 l av utspädningen till en separat behållare och späd till 1 ml med nukleasfritt vatten för att skapa en 1/1000 utspädning.
OBS: Koncentrationen av den slutliga lösningen av tpfc är 4,3 fmol. - Lös 1 mg Ga (tpfc) i 2,6 ml DMSO. Alikvot 10 pl till en separat behållare och späd till 1 ml med nukleasfritt vatten för att skapa en 1/100 utspädning. Alikvot 1 l av utspädningen till en separat behållare och späd till 1 ml med nukleasfritt vatten för att skapa en 1/1000 utspädning.
OBS: Koncentrationen av den slutliga lösningen av Ga (tpfc) är 4,3 fmol.
OBS: Dessa corroles och hämmare är inte lösliga i vatten och måste i förväg löst i DMSO. Små mängder DMSO (under 1%) inte framkalla cytotoxicitet i cellerna (opublicerade data).
- Lös 1 mg Actinomycin D i 1,8 ml DMSO. Alikvot 10 pl till en separat behållare och späd till 1 ml med nukleasfritt vatten för att skapa en 1/100 utspädning. Alikvot 1 l av utspädningen till en separat behållare och späd till 1 ml med nukleasfritt vatten för att skapa en 1/1000 utspädning.
- Lös Actinomycin D, triptolid, tpfc och Ga (tpfc) i dimetylsulfoxid (DMSO) i rena, separata behållare. Erhållande av den slutliga koncentrationen av en 0,01: 1-molförhållande av [complex]: [DNA] genom användning av serieutspädningar med nukleasfritt vatten.
- Före början transkriptionsreaktionen, förbereda de nödvändiga reagenser individuellt eller köpa dem från en kommersiell leverantör.
- Tina på is all frösn reagenser (se tabell 1 för en lista över frysta reagenser).
- Låt 10x Reaction Buffer och 4 ribonukleotid (ATP, CTP, GTP och UTP) lösningar tid att blanda tills de är fullständigt upplösta i lösning.
- Centrifugera korthet alla reagenser för att förhindra förlust av material på kanten av röret. När tinats, butiks ribonukleotider på is samtidigt som 10x Reaction Buffer vid RT.
- Kombinera reagenser för transkription reaktion vid RT (se tabell 2 för en lista över reagenser).
OBS: spermidin i 10x Reaction Buffer kan samutfällning templat-DNA, om reaktionen är monterad på is i stället för vid RT. - Blanda noggrant genom att ställa röret eller pipettera blandningen upp och ner försiktigt. Efter blandning, att centrifugera kort samla reaktionsblandningen vid botten av röret.
- Inkubera reaktionsblandningen vid 37 ° C under totalt 2-4 tim.
OBS: De nödvändiga reaktionstider varierarmed DNA-templat storlek och sekvens. Detta steg kan kräva optimering för specifika sekvenser. Kortare mallar kan kräva längre reaktionstider för en hög avkastning av totalt RNA. - Ta 4 l alikvoter från varje reaktion efter varje timme och förvara vid -20 ° C. Ändra vid behov för önskade tidpunkter.
2. RNA-Spin Column
- Efter transkription reaktion, rena RNA med hjälp mikrocentrifugrör-kompatibla kromatografikolonner.
OBS:. Användning av RNA spin kolonner för att rena RNA med mer än 20 baser ger mer än 80% återvinning 44
OBS: Kolonnkromatografi är en vanlig och bekväm metod för att rena RNA. Andra reningsmetoder existerar också såsom litiumklorid utfällning, fenol: kloroformextraktion, isopropanolutfällning, liksom andra kommersiellt tillgängliga kit.- Jämnt resuspendera Sephadex matrisen i kolumnen bufferten genom kraftig inverterakolumn tre eller fler gånger. Gör detta genom att ställa kolumnen kraftigt.
- Avlägsna den övre kåpan från kolonnen. Det kommer att finnas en viss rest Sephadex matris i hatten; om locket är fylld med matrisen, sätta tillbaka locket på kolonnen och upprepa det föregående steget tills majoriteten av matrisen är i kolumnen.
- Snäpp från botten spetsen av kolonnen.
OBS: Vissa vätska kan fly från kolonnen. - Packa kolonnen.
- Placera kolonnen i en steril (RNas och DNas gratis) 1,5 ml mikrocentrifugrör.
- Centrifugera röret i en bordscentrifug vid 1000 xg under 1 min.
- Kasta 1,5 ml mikrocentrifugrör med eluerat buffert från kolonnen.
- Placera omedelbart kolonnen i ett nytt sterilt 1,5 ml mikrocentrifugrör och pipet provet till mitten på kolonnbädden. Använd 20-50 l av prov för att undvika överbelastning av kolonnen.
- Centrifugera röret i en bordscentrifug vid 1000 xgunder 1 min.
OBS: Elueringsmedlet är det renade RNA-prov.
3. Agarosgelelektrofores (1% agarosgel) 42
OBS: Etidiumbromid fluorescerar vid bindning till DNA och RNA, följaktligen dessa biomolekyler kan visualiseras med UV-ljus genom att inkubera dem med 0,5 pg / ml etidiumbromid lösning.
- Bered en 1,000x stamlösning av etidiumbromid (0,5 mg / ml) genom att lösa 5 mg etidiumbromid i 10 ml vatten.
- Förbered Tris acetat EDTA (TAE) kör buffert för gelelektrofores. För att göra en 50x TAE-buffert kombinera 2,0 M Tris-acetat med 0,05 M etylendiamintetraättiksyra (EDTA) och justera pH till 8,5.
- Bered en 1% (vikt / volym) agarosgel genom att lösa 10 g Ultrapure Agarose i 1 L 1x TAE buffert och smälta agarosen med en konventionell mikrovågsugn. När den har svalnat till 50 ° C, tillsätt 1 ml av 1,000x etidiumbromid till 1% agarosgel soluning, blanda genom att snurra eller genom invertering i en sluten behållare, häll sedan agaroslösningen till en gel-casting plattform och låta gelén stelna vid RT.
OBS: Etidiumbromid är en mutagen och potentiellt cancerframkallande. Använd handskar och hantera lösningar noggrant. För en korrekt hantering av etidiumbromid, se: http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927667 . - Efter gelen har stelnat, placera den inställda gel i elektroforestanken. Tillsätt tillräckligt TAE-buffert för att täcka gelen tills brunnarna är nedsänkta. Kontrollera att nivån av TAE-buffert är ca 1 mm ovanför nivån av gelén. Ta gelen kam.
OBS: Ta bort kammen efter brunnar nedsänkta hindrar luftfickor från att bli instängd i brunnarna. - Förbered RNA-proven. Kombinera 1 pl av varje renat provalikvot med 1 pl gelladdningsbuffert (eller med 1 pl 10x laddningsbuffert och diluted till 10 l med nukleasfritt vatten) och blanda väl genom att pipettera upp och ner med en mikropipett.
OBS: 10x laddningsbuffert innehåller 20% Ficoll 400, 0,1 M Na2EDTA, pH 8,0, 1,0% SDS, 0,25% bromfenolblått. 0,25% xylencyanol kan också tillsättas till laddningsbufferten, eftersom den körs ~ 50% så fort som bromfenolblått och kan vara användbart för att övervaka mycket långa körningar. 42 - Fyll på gelén med varje prov genom att försiktigt pipettera lösningen i botten av varje brunn. Se till att inte lämna några luftbubblor eller blanda prover mellan brunnar.
OBS: En RNA stege kan också användas för att bestämma storleken på utskriften. - Fäst ledningarna så att DNA kommer att migrera in i gelén mot den positiva ledningen. Ställ in spänningen till önskad nivå, typiskt 1 till 10 V / cm av gelén. Kör gelen för oavsett hur länge är tillräckligt för att markant separation mellan RNA-fragment, med användning av migration av färgämnen för att övervaka förloppet för separationen.
NOTE: En 23 cm x 25 cm gel vid 250 V tar ca 1 timme, medan en 8 cm x 8 cm gel vid 150 V tar ca 20 min. Mindre RNA-fragment har bättre upplösning när den körs vid högre spänningar. - Stäng av strömmen när färgen från laddningsbuffert har migrerat en sträcka bedöms tillräcklig för separation mellan RNA-fragment.
- Bild RNA under UV-ljus som etidiumbromid fluorescerar.
- Ta en bild av bilden och jämföra fluorescensintensiteter av det renade RNA från varje tillstånd.
4. RNA Kvantifiering via UV-Vis spektroskopi
- Placera 2 ^ il H2O på en Nanodrop 2000, eller liknande maskin, och mät Blank.
- Därefter placerar 2 | il av varje RNA-prov, efter rening, på spektrofotometern och mäta UV-Vis från ett våglängdsområde av 200 nm till 800 nm.
ANMÄRKNING: En A 260 läsning av 1,0 är ekvivalent med ca 40 ng / ml av RNA,och ren RNA har en A 260 / A 280-förhållande på 2,1. 45 - I det fall att absorbansen är över ett OD, späd proverna i nukleasfritt vatten för erhållande av ett OD mindre än ett.
- Använd grafiska program för att rita de olika proven och jämföra OD vid 260 nm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
RNA-transkription kvalitativt genom agarosgelelektrofores
Agarosgelelektrofores används för att avbilda den transkriberade RNA. Etidiumbromid fluorescerar vid bindning (λ em = 605 nm, λ ex = 210 nm, 285 nm) 46 möjliggör avbildning av RNA. Mörkare banden i gelén motsvarar högre koncentrationer av RNA. Om Aktinomycin D, hämmar triptolid, eller antingen corrole komplex RNA-transkription, är produktionen av RNA minskade och bandet kommer att visas ljusare. Med hjälp av detta begrepp, kan relativa hämningen bedömas.
Figur 3 visar den etidiumbromidfärgad agarosgel (1%) av RNA-transkriptionsreaktioner förbehandlade med ingen komplex, aktinomycin D, triptolid, tpfc eller Ga (tpfc) vid en [komplex]: [mall-DNA bas] förhållande av 0,01 : 1. Actinomycin D och triptolid visar en tydlig minskning av RNA jämfört med den för kontroll, som förväntas avdessa lång studerade hämmare. Den Ga (tpfc) band har också en mycket låg nivå av RNA, medan tpfc bandet visar liten eller ingen hämning och uppvisar samma relativa intensitet som kontrollen.
RNA-transkription kvantifierades genom UV-Vis spektroskopi
UV-Vis mätningar togs för varje prov som genomgår efter RNA-transkription under 4 timmar och renades med RNA-spinn-kolonn-kromatografi. Spektra av våglängder 220 nm till 350 nm visas i figur 4, med λ max uppträder vid 260 nm, vilket motsvarar RNA-absorption, och en extinktionskoefficient av 0,025 (ig / ml) -1 cm -1. Absorbansen vid 260 nm och 280 nm rapporteras i tabell 3. En A 260 läsning av 1,0 är ekvivalent med omkring 40 ^ g / ml av RNA, och ren-RNA har en A 260 / A 280-förhållande av 2,1, vilket möjliggör kvantitativa beräkningar av RNA som framställs under tränskoras reaktion och en bedömning av renheten hos RNA efter att ha använt RNA spinnkolonn. 44 Tre av de fyra hämmare behandlade transkriptionsreaktioner gav mindre RNA än kontroll, med Ga (tpfc) -behandlat DNA transkribera endast 0.07 gånger så mycket RNA som den obehandlade DNA. tpfc-behandlade DNA uppvisade ingen uppenbar inhibering. Alla prover har ett A 260 / A 280 förhållande av ca 2,2, vilket indikerar relativt rena prover. Rening genom RNA spin kolonner avlägsnar korta RNA strängar 20 eller färre nukleotider lång. Rest DNA eller trådar som är längre än 20 nukleotider kan vara närvarande i vad som anses vara de renade proven. Dessa små föroreningar skulle resultera i en A 260 / A 280-förhållande som är något större än 2,1.
Figur 1. molekylära strukturer av gallium (III) 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (Ga (tPFC)) och fria basen analoga 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (tpfc). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Cytotoxicitet kurvor och GI 50 värden av corroles i prostata (DU-145) (grå), bröst (MDA-MB-231) (blå), hud (SK-MEL-28) (orange), och äggstocks (OVCAR -3) (grön) cancercellinjer. Celler inkuberades med (A) Ga (tpfc) och (B) tpfc, följt av bestämning av viabilitet med användning av MTS-baserad kolorimetrisk cellviabiliteten analys enligt tillverkarens protokoll. Klicka här för en större version av dennafigur.
Figur 3. etidiumbromidfärgad agarosgel (1%) av transkriptionsreaktioner efter 4 h inkubation. Bana 1 är en 1000 bp DNA-stege som en standard. Raderna 2-6 visar RNA som transkriberats från 0,43 pmol DNA och behandlades med 4,3 fmol av varje inhibitor (en [komplex]: [mall-DNA bas] förhållande av 0,01): kontroll (spår 2), aktinomycin D (spår 3), triptolid (spår 4), tpfc (spår 5), och Ga (tpfc) (spår 6).
Figur 4. UV-Vis-spektrumet för en:. 200-spädning av transkriberat RNA efter den 4 h av inkubation DNA-mallen för transkriptionsreaktionen behandlades med ingen komplex, eller med aktinomycin D, triptolid, tpfc eller Ga (tpfc) vid a [komplex]: [mall DNA bas] förhållande på 0,01: 1. RNA-koncentrationen mäts genom OD vid 260 nm.
| Tina frysta reagenser på is: |
| 75 mM lösningar av adenosintrifosfat, guanosintrifosfat, Cytidintrifosfat och uridin trifosfat (ATP, CTP, GTP, UTP) |
| Nukleasfritt vatten |
| 10x Reaction Buffer (1x reaktionsbuffert: 40 mM Tris-HCl, 6 mM MgCl2, 2 mM spermidin, 10 mM ditiotreitol, pH 7,9) |
| Linjäriserad mall DNA (0,5 mikrogram / ml, 1,85 kb) |
| RNA-polymerasenzymet (20 U / | il) |
Tabell 1. Förteckning över frysta reagenser.
| Till att börja transkriptionsreaktioner, lägg till följande belopp för varje reagens i 0,2 ml tunnväggiga PCR-rör: |
| 2 | ilATP-lösning (75 mM) |
| 2 pl CTP-lösning (75 mM) |
| 2 pl GTP-lösning (75 mM) |
| 2 pl UTP-lösning (75 mM) |
| 1 pl nukleasfritt vatten |
| 2 ul 10x Reaction Buffer |
| 2 pl 0,5 mikrogram / l linjär mall-DNA |
| 5 pl komplex (nucleus fritt vatten som tomt, aktinomycin D, triptolid, tpfc, Ga (tpfc)) |
| 2 | il RNA-polymeras (20 U / | il) |
Tabell 2. Förteckning över reagens för transkriptionsreaktion.
| Tidpunkt (h) | Komplexa | En 260 | En 280 </ Strong> | En 260 / A 280 | Spädningsfaktor | [RNA]: En 260 (Ig / ml) | [RNA] (mg / ml) |
| 4 | Kontroll | 7,583 | 3,516 | 2,16 | 200 | 40 | 60,67 |
| 4 | Aktinomycin D | 0,955 | 0,438 | 2,18 | 200 | 40 | 7,638 |
| 4 | triptolid | 1,794 | 0,816 | 2,2 | 200 | 40 | 14,35 |
| 4 | tpfc | 7,858 | 3,631 | 2,16 | 200 | 40 | 62,87 |
| 4 | Ga (tpfc) | 0,554 | 0,232 | 2,39 | 200 | 40 | 4,434 |
Tabell 3. Koncentration och renhet av transkriberad RNA efter 4 h uppmätt genom UV-Vis spektroskopi. Extinktionskoefficienten av enkelsträngat RNA är 0,025 (ig / ml) -1 cm -1, motsvarar ungefär en A 260 läsning av 1,0 40 | ig / ml av RNA, och ren-RNA har en A 260 / A 280-förhållande av 2,1. 45
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna analys visar att tillsatsen av Ga (tpfc) inhiberar RNA-transkription jämförbar med de kända DNA-bindande anticancerkomplex aktinomycin D och triptolid. Den cytotoxiska beteende Ga (tpfc) (GI 50 = 58,1 till 154,7 M) kan på grund av sin hämmande egenskaper. Eftersom ingen transkriptions inhibering observerades i tpfc, inte beror på RNA-transkription hämning cytotoxiciteten av tpfc utan orsakas av andra medel som ännu inte studerats.
I de fyra transkriptionsreaktioner utförda avsöktes DNA behandlades med aktinomycin D, triptolid, tpfc eller Ga (tpfc), vid en [komplex]: [mall-DNA bas] förhållande av 0,01, respektive, eller en obehandlad kontroll. De transkriptionsreaktionsreagens kombinerades och transkriptionsreaktionen tilläts fortskrida under 4 h vid 37 ° C. Den transkriberade RNA renades genom en RNA-spinnkolonn och utbytet analyseras med UV-Vis och gelelektrofores. Arten av transkriptions inhibering kan furthennes undersöktes med hjälp av samma teknik med olika modifikationer, eller föreningarna kan utsättas för alternativa in vitro och in vivo-studier. Ytterligare experiment som kan hjälpa bestämma molekyl karaktären av hämningen inkluderar röntgenkristallografi av möjliga corrole-DNA-addukter eller datormodellering av transkriptionsreaktionen. Syftet med detta experiment var att bestämma om föreningarna inhiberar transkription för att samla information om deras potentiella cancer egenskaper. Det målet uppnåddes: tpfc uppvisade ingen inhibition, medan Ga (tpfc) uppvisade tydliga hämning och förtjänar ytterligare studier.
RNA transkriptionsanalys kan modifieras för att ge mer mekanistisk detalj. Tillsats av anticancermedel (t.ex., de corrole komplex) efter transkriptionsreaktionen är fullständig kan visa om komplexen försämra eller hydrolysera RNA. En annan rekommenderad experimentet är att bedrivatranskriptionsreaktionen med alla komponenter med undantag för den RNA-polymerasenzymet 10-faldigt lägre för att möjliggöra differentiering mellan en hämning mekanism som involverar DNA eller enzymet. Slutligen inkubering av DNA eller polymeraset med komplexen före RNA-transkription skulle möjliggöra ökad bindning mellan komplexet och respektive mål, huruvida de komplexa hämmande egenskaper är inblandade i DNA eller polymerasbindning, respektive.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi tackar uppriktigt Dr Cindy N. Chiu för hjälp med gelelektrofores, och Andy Zhou och Michael Grodick för deras generösa donation av DNA och restriktionsenzym. Vi tackar professor J. Heath och professor D. Prober för generösa tillgång till utrustning och material. Vi tackar Dr Karn Sorasaenee för användbara förslag. Vi tackar Maria H. Tang för att skapa bilden används i schematisk översikt i videon. Finansieringen kom från Johnson & Johnson och USC Y86786.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Actinomycin D | Sigma-Aldrich | A1410 | Store at 2-8 °C , protect from light |
| Triptolide | Sigma-Aldrich | T3652 | Store at 2-8 °C , protect from light |
| nuclease-free H2O | Life Technologies | AM9938 | |
| MEGAscript T7 Transcription Kit | Life Technologies | AM1334 | Store at –20 °C |
| Ethidium Bromide | Sigma-Aldrich | E7637 | CAUTION: For proper handling procedures of ethidium bromide, please see: http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927667 |
| Tris Acetate | Sigma-Aldrich | T6025 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | EDS | |
| UltraPure Agarose | Life Technologies | 16500-100 | |
| mini Quick Spin RNA Columns | Roche Life Science | 11814427001 | Store at 2-8 °C , do not freeze |
| 1 kb DNA Ladder | New England Biolabs | N3232S | Store at –20 °C |
References
- American Cancer Society. , American Cancer Society. Atlanta. Available from: http://www.cancer.org (2014).
- Weinstein, I. B. Addiction to oncogenes—The Achilles heel of cancer. Science. 297, 63-64 (2002).
- Derheimer, F. A., Chang, C. W., Ljungman, M. Transcription inhibition: A potential strategy for cancer therapeutics. Eur. J. Cancer. 41 (16), 2569-2576 (2005).
- Koumenis, C., Giaccia, A. Transformed cells require continuous activity of RNA polymerase II to resist oncogene-induced apoptosis. Mol. Cell. Biol. 17 (12), 7306-7316 (1997).
- Stellrecht, C. M., Chen, L. S. Transcription Inhibition as a Therapeutic Target for Cancer. Cancers. 3 (4), 4170-4190 (2011).
- Bensaude, O. Inhibiting eukaryotic transcription: Which compound to choose? How to evaluate its activity. Transcription. 2 (3), 103-108 (2011).
- Liu, Q. Triptolide and its expanding multiple pharmacological functions. International Immunopharmacology. 11 (3), 377-383 (2011).
- Mahammed, A., Gray, H. B., Weaver, J. J., Sorasaenee, K., Gross, Z. Amphiphilic corroles bind tightly to human serum albumin. Bioconjugate Chemistry. 15 (4), 738-746 (2004).
- Lim, P. Differential cytostatic and cytotoxic action of metallocorroles against human cancer cells: Potential platforms for anticancer drug development. Chemical Research in Toxicology. 25 (2), 400-409 (2012).
- Bendix, J., Dmochowski, I. J., Gray, H. B., Mahammed, A., Simkhovich, L., Gross, Z. Structural, electrochemical, and photophysical properties of gallium(III) 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corrole. Angewandte Chemie-International Edition. 39 (22), 4048-4051 (2000).
- Hwang, J. Y., Gross, Z., Gray, H. B., Medina-Kauwe, L. K., Farkas, D. L. Ratiometric spectral imaging for fast tumor detection and chemotherapy monitoring in vivo. Journal of Biomedical Optics. 16 (6), 1-6 (2011).
- Agadjanian, H. Tumor detection and elimination by a targeted gallium corrole. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (15), 6105-6110 (2009).
- Hwang, J. Y. Photoexcitation of tumor-targeted corroles induces singlet oxygen-mediated augmentation of cytotoxicity. Journal of Controlled Release. 163 (3), 368-373 (2012).
- Hwang, J. Y., et al. Investigating photoexcitation-induced mitochondrial damage by chemotherapeutic corroles using multimode optical imaging. Journal of Biomedical Optics. 17 (1), 11 (2012).
- Hwang, J. Y. A Mechanistic Study of Tumor-Targeted Corrole Toxicity. Molecular Pharmaceutics. 8 (6), 2233-2243 (2011).
- Saltsman, I., Mahammed, A., Goldberg, I., Tkachenko, E., Botoshansky, M., Gross, Z. Selective substitution of corroles: Nitration, hydroformylation, and chlorosulfonation. Journal of the American Chemical Society. 124 (25), 7411-7420 (2002).
- Gershman, Z., Goldberg, I., Gross, Z. DNA Binding and Catalytic Properties of Positively Charged Corroles. Angewandte Chemie. 46 (23), 4320-4324 (2007).
- Fu, P. K., Bradley, P. M., Turro, C. Stabilization of duplex DNA structure and suppression of transcription in vitro by bis(quinone diimine) complexes of rhodium(III) and ruthenium(II). Inorganic Chemistry. 42 (3), 878-884 (2003).
- Sorasaenee, K., Fu, P. K. -L., Angeles-Boza, A. M., Dunbar, K. R., Turro, C. Inhibition of Transcription in Vitro by Anticancer Active Dirhodium(II) Complexes. Inorg. Chem. 42 (4), 1267-1271 (2003).
- Aguirre, J. D., Lutterman, D. A., Angeles-Boza, A. M., Dunbar, K. R., Turro, C. Effect of axial coordination on the electronic structure and biological activity of dirhodium(II,II) complexes. Inorganic Chemistry. 46 (18), 7494-7502 (2007).
- Raja, N. S., Nair, B. U. Chromium(III) complexes inhibit transcription factors binding to DNA and associated gene expression. Toxicology. 251 (1-3), 61-65 (2008).
- Gao, F., Chen, X., Wang, J. Q., Chen, Y., Chao, H., Ji, L. N. In Vitro Transcription Inhibition by Ruthenium(II) Polypyridyl Complexes with Electropositive Ancillary Ligands. Inorganic Chemistry. 48 (13), 5599-5601 (2009).
- Chen, X., Gao, F., Zhou, Z. X., Yang, W. Y., Guo, L. T., Ji, L. N. Effect of ancillary ligands on the topoisomerases II and transcription inhibition activity of polypyridyl ruthenium(II) complexes. Journal of Inorganic Biochemistry. 104 (5), 576-582 (2010).
- Chen, X., Gao, F., Yang, W. Y., Sun, J., Zhou, Z. X., Ji, L. N. Effects of intercalative ligands on the DNA binding, DNA topoisomerase II and DNA transcription inhibition of polypyridyl ruthenium(II) complexes. Inorganica Chimica Acta. 378 (1), 140-147 (2011).
- Chen, X., Gao, F., Yang, W. Y., Zhou, Z. X., Lin, J. Q., Ji, L. N. Structure-activity relationship of polypyridyl ruthenium(II) complexes as DNA intercalators, DNA photocleavage reagents, and DNA topoisomerase and RNA polymerase inhibitors. Chemistry & Biodiveristy. 10 (3), 367-384 (2013).
- Chifotides, H. T., Fu, P. K., Dunbar, K. R., Turro, C. Effect of equatorial ligands of dirhodium(II,II) complexes on the efficiency and mechanism of transcription inhibition in vitro. Inorganic Chemistry. 43 (3), 1175-1183 (2004).
- Pauly, M., Kayser, I., Schmitz, M., Dicato, M., Del Guerzo, A., Kolber, I., Moucheron, C., Kirsch-De Mesmaeker, A. In vitro inhibition of gene transcription by novel photo-activated polyazaaromatic ruthenium(II) complexes. Chemical Communications. 10, 1086-1087 (2002).
- Richardson, D. R. Iron and gallium increase iron uptake from transferring by human melanoma cells: Further examination of the ferric ammonium citrate-activated iron uptake process. Biochimica et Biophysica Acta. 1536 (1), 43-54 (2001).
- Collery, P., Keppler, B., Madoulet, C., Desoize, B. Gallium in cancer treatment. Critical Reviews in Oncology / Hematology. 42 (3), 283-296 (2002).
- Hedley, D. W., Tripp, E. H., Slowiaczek, P., Mann, G. J. Effect of gallium on DNA synthesis by human T-cell lymphoblasts. Cancer Research. 48 (11), 3014-3018 (1988).
- Chitambar, C. R., Narasimhan, J., Guy, J., Sem, D. S., O’Brien, W. J. Inhibition of ribonucleotide reductase by gallium in murine leukemic L1210 cells. Cancer Research. 51, 6199-6201 (1991).
- Seidman, A. D. Continuous infusion gallium nitrate for patients with advanced refractory urothelial tract tumors. Cancer. 68, 2561-2565 (1991).
- Chitambar, C. R. Medical applications and toxicities of gallium compounds. International Journal of Environmental Research and Public Health. 7 (5), 2337-2361 (2010).
- Chitambar, C. R. Gallium-containing anticancer compounds. Future Medicinal Chemistry. 4 (10), 1257-1272 (2012).
- Trask, D. K., Muller, M. T. Stabilization of type I topoisomerase-DNA covalent complexes by actinomycin D. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (5), 1417-1421 (1988).
- Chang, T. C., Tsai, L. C., Hung, M. W., Chu, L. L., Chu, J. T., Chen, Y. C. Effects of transcription and translation inhibitors on a human gastric carcinoma cell line. Potential role of Bcl-X(S) in apoptosis triggered by these inhibitors. Biochemical Pharmacology. 53 (7), 969-977 (1997).
- Mischo, H. E., Hemmerich, P., Grosse, F., Zhang, S. Actinomycin D induces histone gamma-H2AX foci and complex formation of gamma-H2AX with Ku70 and nuclear DNA helicase II. The Journal of Biological Chemistry. 280 (10), 9586-9594 (2005).
- Titov, D. V. XPB, a subunit of TFIIH, is a target of the natural product triptolide. Nature Chemical Biology. 7 (3), 182-188 (2011).
- Leuenroth, S. J., Crews, C. M. Triptolide-induced transcriptional arrest is associated with changes in nuclear substructure. Cancer Researcg. 68 (13), 5257-5266 (2008).
- Vispé, S. Triptolide is an inhibitor of RNA polymerase I and II-dependent transcription leading predominantly to down-regulation of short-lived mRNA. Molecular Cancer Therapeutics. 8 (10), 2780-2790 (2009).
- MEGAscript T7 Transcription Kit User Guide. Current Protocols in Molecular Biology. , Life Technologies. Carlsbad. Available from: http://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/1330M_G.pdf (2014).
- Fleige, S., Pfaffl, M. W. RNA integrity and the effect on the real-time qRT-PCR performance. Molecular Aspects of Medicine. 27 (2-3), 126-139 (2006).
- Quick Spin Columns Protocol. , Roche Diagnostics GmbH. Mannheim. Available from: https://pim-eservices.roche.com/LifeScience/Document/95c2b1f8-7cf1-e311-98a1-00215a9b0ba8 (2013).
- RNA quality control. , KU Leuven: Biomedical Genomics. Leuven. Available from: http://biomedicalgenomics.org/RNA_quality_control.html (2007).
- Sabris, R. W. Handbook of biological dyes and stains: synthesis and industrial application. , Wiley. Hoboken, NJ. (2010).
