Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

En Published: March 18, 2015 doi: 10.3791/52355
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 1, 1
1Division of Chemistry and Chemical Engineering, California Institute of Technology, 2Department of Molecular Medicine, Beckman Research Institute of the City of Hope

Summary

Gallium (III) 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole og dets frie base analog udviser lav mikromolære celle cytotoksicitet. Dette håndskrift beskriver en RNA-transkription reaktion, imaging RNA med en ethidiumbromid-farvet gel, og kvantificere RNA med UV-Vis-spektroskopi med henblik på at vurdere transkription inhibering med corroles og viser en enkel metode til at evaluere anticancer kandidat egenskaber.

Abstract

Kemoterapi indebærer ofte bredspektrede cytotoksiske midler med mange bivirkninger og begrænset målretning. Corroles er en klasse af tetrapyrroliske makrocykler der udviser differentielle cytostatiske og cytotoksiske egenskaber i specifikke cellelinier, afhængigt af identiteten af ​​den chelaterede metal og funktionelle grupper. Den unikke opførsel af funktionaliserede corroles til specifikke cellelinier indfører en mulighed for målrettet kemoterapi.

Mange anticancerlægemidler evalueres ved deres evne til at inhibere RNA-transkription. Her præsenterer vi en trin-for-trin-protokollen for RNA-transkription i nærvær af kendte og potentielle inhibitorer. Evalueringen af ​​RNA produkter af transkription reaktion ved gelelektroforese og UV-Vis spektroskopi giver oplysninger om inhibitive egenskaber af potentielle anticancer lægemiddelkandidater, og med modifikationer af analysen, mere om deres virkningsmekanisme.

Lilleer kendt om den molekylære virkningsmekanisme af corrole cytotoksicitet. I dette forsøg ser vi to corrole forbindelser: gallium (III) 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (Ga (tpfc)) og Freebase analog 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (tpfc). En RNA-transkription-assay blev anvendt til at undersøge de inhiberende egenskaber corroles. Fem transkriptionsreaktioner fremstillet: DNA behandlet med Actinomycin D, triptolide, Ga (tpfc), tpfc på en [kompleks]: [template DNA basen] forhold på 0,01, henholdsvis og en ubehandlet kontrol.

Transkriptionen reaktioner blev analyseret efter 4 timer ved anvendelse af agarosegelelektroforese og UV-Vis-spektroskopi. Der er klare hæmning af Ga (tpfc), Actinomycin D, og ​​triptolide.

Denne RNA-transkription assay kan modificeres for at tilvejebringe mere mekanistisk detalje ved at variere koncentrationerne af komplekset anticancer, DNA eller polymerase enzym eller ved at inkubere DNA eller polymerase med komplexes før RNA-transkription; Disse modifikationer vil skelne mellem en inhibering, der omfatter DNA eller enzymet. Tilføjelse komplekset efter RNA-transkription kan anvendes til at teste, om komplekserne nedbrydes eller hydrolysere RNA. Dette assay kan også anvendes til at studere yderligere kandidater anticancer.

Introduction

Kemoterapi involverer ofte bredspektrede cytotoksiske midler med uønskede bivirkninger og begrænset målretning, men med større forståelse af cancer biologi, er der et stadigt stigende behov for anticancermidler med højere cancer-targeting effekt og færre bivirkninger. 1 cancerceller Menneskelige ofte blevet afhængige af en enkelt aktiveres eller overudtrykt onkogen for overlevelse. 2 er således mange anticancerlægemidler vurderes efter deres evne til at inhibere RNA-transkription. Behandlinger, der blokerer ekspression af disse transformerende gener er effektiv til at eliminere cancerceller og føre til celledød. 3 Transformerede celler er mere følsomme over for forstyrrelser i RNA-transkription end der tilsvarende normale celler. 4 anticancerlægemidler, der hæmmer transkription forventes at selektivt inhiberer ekspression af onkogener, som er nødvendige for cancercelle at overleve. 5 Følgelig RNA-transkription inhibition er en nyttig måde at identificere potentielle anticancer lægemiddelkandidater og lære mere om deres virkningsmekanisme. Denne protokol viser, at Ga (tpfc) hæmmer RNA-transkription på samme rækkefølge som kemoterapi narkotika Actinomycin D og triptolide; lignende sammenligninger kan foretages ved hjælp af denne protokol med andre anticancer lægemiddelkandidater. Actinomycin D er en RNA-transkription inhibitor almindeligt anvendt til behandling gestational trophoblastic cancer, testikelkræft, Wilms tumor, rhabdomyosacoma og Ewings sarkom 6. Actinomycin D har været anvendt i cancerterapi i næsten 50 år, siden den først blev godkendt af FDA i 1964.Triptolide er en selektiv transkription inhibitor, er blevet undersøgt in vitro og i forskellige tumorbærende dyremodeller for 30 år. 7

Den amfifile makrocykliske karakter corroles bibringer væsentlige fordele i forhold til andre lægemiddelklasser, såsom små molekyler eller biologiskes. 8-14 den makrocykliske karakter tillader cellulær permeabilitet, der er større end forventet for sådanne store molekyler, og de ​​er store nok til at interagere med makromolekylære overflader, såsom dem af proteiner. 8 Corroles er kendt for at danne tætte ikke-kovalente komplekser med biomolekyler og lægemidler. 10 Ud over den iboende cytotoksicitet corrole ramme, har vi vist, at en sulfoneret corrole virker som et bærermolekyle for kemoterapeutiske midler, specifikt DNA-interkalerende anthracyclin lægemiddel doxorubicin. Når den sulfonerede corrole blev administreret samtidig med doxorubicin blev en 3-fold forøgelse i IC 50 af doxorubicin observeret for DU-145-celler. 9 corrole ramme er stabil og har iboende absorbans og fluorescensegenskaber at når funktionaliseret, undergår unikke absorbans skift der kan anvendes til karakterisering. 10 funktionalisering af stilladset ikke selv affect de fotofysiske egenskaber af corrole, 9-15, men som set med en sulfoneret corrole, selektivt modificere for rammerne af corrole kan væsentligt ændre sine biologiske egenskaber. 16. Vi har tidligere vurderet seks metallocorroles mod syv menneskelige kræftceller. Resultaterne indikerer, at toksicitet mod humane cancerceller er afhængig af det specifikke metal ion, såvel som funktionelle gruppe substitution. For eksempel sulfonerede gallium corroles oplevet høj cellulær optagelse og trængte selektivt i kernen i hjernen metastatisk prostatacancer celler (DU-145); samme corrole, selvom det ikke trænger ind i kernen af ​​andre cellelinjer udviser større cytotoksicitet for brystkræft (MDA-MB-231), melanom (SK-MEL-28) og ovarie (OVCAR-3) cancerceller end for prostatacancer. 9

Indledende cellebaserede assays indikerer, at disse forbindelser viser lovende som anti-cancer terapeutiske midler, som fortjener FürthER undersøgelse af virkningsmekanismen. Transskription hæmning observeres med visse organometalliske komplekser 17-27 og vi søgte at undersøge denne proces som en mulig mekanisme for den cytotoksiske adfærd corrole familie. Denne transskription assay giver en enkel, billig og letkøbt metode til vurdering af transskription hæmning, hvilket vil føre til mere detaljerede oplysninger om virkningerne af disse molekyler i levende celler.

Her transskription hæmning af gallium (III) 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (Ga (tpfc)) og dens Freebase analog 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (tpfc) (Figur 1) testes. I modsætning til nogle overgangsmetalkomplekser, gallium (III) er redox inaktiv og derfor ikke er direkte involveret i redox proces med redox-baserede metaboliske veje. 28. Uanset, gallium (III) har cytotoksisk egenskaber og er blevet undersøgt til terapeutiske formål. Gallium er den anden mest lovende metal til anticancer lægemidler efter platin og har gennemgået mange undersøgelser og undersøgelser; nitrat og klorid gallium salte er blevet evalueret i kliniske forsøg mod hepatom, lymfom, blære kræft og andre sygdomme. 29-34 Gallium (III) er derfor ideel til anticancer corrole studier. Indledende data viser Ga (tpfc) og tpfc har lav GI 50, den nødvendige koncentration lægemiddel for at inhibere 50% af maksimal celleproliferation, med forskellige cancercellelinier (se figur 2); dette bekræfter gyldigheden af ​​yderligere forsøg på disse to forbindelser for at bestemme deres inhibitive egenskaber. Vi sammenligner disse forbindelser med de fælles lægemidler mod cancer Actinomycin D og triptolide. Actinomycin D interkalerer DNA, inhiberer RNA forlængelse, og inducerer apoptose i visse cellelinie ved picomolære koncentrationer 6,35-37 Triptolide har vist sig at hæmme tumorvækst.; det binder til humant XPB / ERCC3 en underenhed of transkriptionsfaktor TFIIH, hvilket fører til hæmning af RNA-polymerase II-aktivitet. 6-7,38-40

Selv om det er almindeligt kendt, at corroles udviser cytotoksiske egenskaber, der findes kun få oplysninger om de forskellige mekanismer, der følger af funktionalisering. Corrole hæmning af RNA-transkription vil give større indsigt i deres interaktion med biomakromolekyler. Andre komplekser vides at binde til DNA, såsom dirhodium (II, II) komplekser, chrom (III) komplekser, ruthenium (II) polypyridyl komplekser, rhodium (III) komplekser, og forskellige andre blev udsat for RNA-transkription assays, 18- 27 medfører større forståelse for deres samspil med biomakromolekyler. Denne letkøbt og bredt tilgængelige eksperiment er også en god indledende test for at vurdere cytotoksicitet egenskaber af en given molekyle og afgøre, om det fortjener yderligere biologisk test. Den RNA-transkription assay også giver mulighed for mange modifikationer, såsom varying mængden af ​​forbindelsen eller enzymer; variere inkubationstiden, reaktionstid og Prøvetidspunkter; og varierende DNA-skabelonen længde og sekvens, blandt andre variabler af interesse, hvilket potentielt giver en stor mængde data. Denne transskription assay er også let tilgængelige som overkommelige kits med alle nødvendige reaktionskomponenter forudsat, selvom dele kan købes og udarbejdes individuelt. I disse eksperimenter bruger vi et kommercielt tilgængeligt kit kendt for at have et højt udbytte. 41

For at vurdere transkription hæmning, bruger vi to metoder: agarosegelelektroforese og UV-VIS spektroskopi. Agarosegelelektroforese er en enkel og effektiv metode til at adskille, identificere og oprense 0,5- til 25-kb DNA-og RNA-fragmenter. 42 UV-Vis-spektroskopi kan anvendes til at bestemme koncentrationen og renheden af RNA. 43

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

BEMÆRK: Når du arbejder med RNA opretholde et rent arbejdsmiljø at undgå forurening med DNase og RNase enzymer, der nedbryder DNA og RNA. Sørg for, at pipettespidser og rør er DNase og RNase gratis. Det er også nyttigt at tørre ned lab overflader og udstyr såsom pipetter, rørholdere mv med en dekontaminering løsning.

1. RNA-transkription med Corrole Behandling

  1. Forbered corrole og inhibitorforbindelser i et 0,01: 1 molforhold [kompleks]: [DNA].
    BEMÆRK: I vores tilfælde var forholdet 4,3 fmol kompleks: 0,43 pmol DNA, hvor DNA-skabelon, der anvendes var APET-28c vektor med Liga-gen fra E. coli under kontrol af T7-promotoren. Andre DNA med T7-promotoren er også gyldige kandidater til at køre transskription analysen.
    1. Opløs Actinomycin D, triptolide, tpfc, og Ga (tpfc) i dimethylsulfoxid (DMSO) i rene, separate beholdere. Opnå den endelige koncentration af en 0,01: 1 molforhold [complex]: [DNA] ved anvendelse af serielle fortyndinger med nuclease-frit vand.
      1. Opløs 1 mg Actinomycin D i 1,8 ml DMSO. Alikvot 10 pi til en separat beholder og fortyndes til 1 ml med nuclease-frit vand til at skabe en 1/100 fortynding. Alikvot 1 pi af fortynding til en separat beholder og fortyndes til 1 ml med nuklease-frit vand til at oprette en 1 / 1.000 fortynding.
        BEMÆRK: Koncentrationen af ​​den endelige opløsning af Actinomycin D er 4,3 fmol.
      2. Opløs 1 mg triptolide i 0,64 ml DMSO. Alikvot 1 pi til en separat beholder og fortyndes til 1 ml med nuklease-frit vand til at oprette en 1 / 1.000 fortynding. Alikvot 1 pi af fortynding til en separat beholder og fortyndes til 1 ml med nuklease-frit vand for at skabe en anden 1 / 1.000 fortynding.
        BEMÆRK: Koncentrationen af ​​den endelige opløsning af triptolide er 4,3 fmol.
      3. Opløs 1 mg tpfc i 2,9 ml DMSO. Alikvot 10 pi til en separat beholder og fortyndes til 1 ml med nuklease-frit vand for at skabe en 1/100 dilution. Alikvot 1 pi af fortynding til en separat beholder og fortyndes til 1 ml med nuklease-frit vand til at oprette en 1 / 1.000 fortynding.
        BEMÆRK: Koncentrationen af ​​den endelige opløsning af tpfc er 4,3 fmol.
      4. 1 mg Ga (tpfc) opløses i 2,6 ml DMSO. Alikvot 10 pi til en separat beholder og fortyndes til 1 ml med nuclease-frit vand til at skabe en 1/100 fortynding. Alikvot 1 pi af fortynding til en separat beholder og fortyndes til 1 ml med nuklease-frit vand til at oprette en 1 / 1.000 fortynding.
        BEMÆRK: Koncentrationen af ​​den endelige opløsning af Ga (tpfc) er 4,3 fmol.
        BEMÆRK: Disse corroles og inhibitorer er ikke opløselige i vand og skal være præ-opløst i DMSO. Små mængder af DMSO (under 1%) ikke inducerer cytotoksicitet i cellerne (upublicerede data).
  2. Før du begynder transkriptionsreaktion, forberede de nødvendige reagenser enkeltvis eller købe dem fra en kommerciel leverandør.
    1. Thaw på is alle frøsn reagenser (se tabel 1 for en liste over frosne reagenser).
    2. Lad 10x Reaction Buffer og 4 ribonukleotid (ATP, CTP, GTP og UTP) løsninger tid til at blande, indtil de er fuldstændig opløst i opløsningen.
    3. Kort fortalt centrifugeres alle reagenser for at forhindre tab af materiale på kanten af ​​røret. Når optøet, gemme ribonukleotider på is og samtidig holde 10x Reaction Buffer ved stuetemperatur.
    4. Kombiner reagenser til transkription reaktion ved stuetemperatur (se tabel 2 for en liste af reagenser).
      BEMÆRK: spermidin i 10x Reaction Buffer kan copræcipitat template-DNA, hvis reaktionen samles på is snarere end ved stuetemperatur.
    5. Bland grundigt ved at stille rør eller pipettering af blandingen op og ned forsigtigt. Efter blanding centrifugeres kortvarigt indsamle reaktionsblandingen ved bunden af ​​røret.
    6. Inkubér reaktionsblandingen ved 37 ° C i alt 2-4 timer.
      BEMÆRK: De nødvendige reaktionstider vil varieremed DNA-template størrelse og sekvens. Dette trin kan kræve optimering for specifikke sekvenser. Kortere skabeloner kan kræve længere reaktionstider for et højt udbytte af totalt RNA.
    7. Fjern 4 pi prøver fra hver reaktion efter hver time og opbevares ved -20 ° C. Ændre behov for ønskede tidspunkter.

2. RNA spinsøjle

  1. Efter transkriptionsreaktion, oprense RNA ved anvendelse af mikrocentrifuge-kompatible kromatografisøjler.
    BEMÆRK:. Anvendelse af RNA spinkolonner at oprense RNA med mere end 20 baser resulterer i mere end 80% genvinding 44
    BEMÆRK: Søjlekromatografi er en almindelig og bekvem metode til at oprense RNA. Andre oprensningsmetoder også eksistere såsom lithiumchlorid nedbør, phenol: chloroform-ekstraktion, isopropanol udfældning samt andre kommercielt tilgængelige kits.
    1. Genopslæmme Sephadex matrix i søjlepuffer ved kraftig invertering afkolonne tre eller flere gange. Gør dette ved at stille kolonnen kraftigt.
    2. Fjern den øverste hætte fra søjlen. Der vil være nogle resterende Sephadex matrix i den fælles landbrugspolitik; hvis hætten er fyldt med matrixen, udskifte hætten på søjlen og gentag det foregående trin, indtil størstedelen af ​​matrixen i kolonnen.
    3. Bræk den nederste spids af kolonnen.
      Bemærk: Nogle væske kan slippe ud af kolonnen.
    4. Pak kolonnen.
      1. Placer kolonne i en steril (RNase og DNase fri) 1,5 ml mikrocentrifugerør.
      2. Centrifugeres røret i en bordcentrifuge ved 1.000 xg i 1 min.
    5. Kassér 1,5 ml mikrocentrifugerør med eluerede buffer fra søjlen.
    6. Umiddelbart placere søjlen i en ny steril 1,5 ml mikrocentrifugerør og pipette prøven til midten af ​​søjlen sengen. Brug 20-50 pi prøve at undgå overbelastning af kolonnen.
    7. Centrifugeres røret i en bordplade centrifuge ved 1.000 xgfor 1 min.
      BEMÆRK: Eluenten er den oprensede RNA-prøve.

3. agarosegelelektroforese (1% agarosegel) 42

BEMÆRK: Ethidiumbromid fluorescerer efter binding til DNA og RNA, hvorfor disse biomolekyler kan visualiseres med UV-lys ved at inkubere dem med 0,5 ug / ml ethidiumbromid-opløsning.

  1. Der fremstilles en 1.000 x stamopløsning af ethidiumbromid (0,5 mg / ml) ved at opløse 5 mg ethidiumbromid i 10 ml vand.
  2. Forbered Tris Acetate EDTA (TAE), der forløber buffer til gelelektroforese. For at gøre en 50x TAE buffer kombinere 2,0 M Tris-acetat med 0,05 M ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) og justere pH til 8,5.
  3. Der fremstilles en 1% (vægt / volumen) agarosegel ved at opløse 10 g UltraPure agarose i 1 L 1x TAE buffer og smeltning af agarose med en konventionel mikrobølgeovn. Når det er afkølet til 50 ° C, tilsættes 1 ml af 1.000 x ethidiumbromid til 1% agarosegel Solution, bland ved forsigtigt hvirvlende eller ved at vende i en lukket beholder, så hæld agarose opløsningen i en gel-casting platform og lade gelen at størkne ved stuetemperatur.
    BEMÆRK: Ethidiumbromid er et mutagen og potentielt kræftfremkaldende stof. Bær handsker og håndtere løsninger omhyggeligt. For korrekte procedurer for ethidiumbromid håndtering, se venligst: http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927667 .
  4. Efter gelen er størknet, anbringes sættet gel i elektroforese tank. Tilføj nok TAE buffer til at dække gelen, indtil brøndene neddykket. Kontroller, at niveauet af TAE-buffer er ca. 1 mm over niveauet af gelen. Fjern kammen gel.
    BEMÆRK: Fjernelse af kammen efter brønde neddykket forhindrer luftlommer i at blive fanget i brøndene.
  5. Forbered RNA-prøver. Kombiner 1 pi af hvert oprenset prøvealikvot med 1 pi Gel Loading Buffer (eller med 1 pi 10x loading buffer og diluted til 10 pi med nuklease-frit vand) og blandes ved pipettering op og ned med en mikropipette.
    BEMÆRK: 10x loading buffer indeholder 20% Ficoll 400, 0,1 M Na2EDTA, pH 8,0, 1,0% SDS, 0,25% bromphenolblåt. 0,25% xylencyanol kan også sættes til loadingpufferen, som det kører ~ 50% så hurtigt som bromphenolblåt og kan være nyttige til overvågning af meget lange kørsler. 42
  6. Læg gelen med hver prøve ved omhyggeligt at pipettere opløsningen i bunden af ​​hver brønd. Pas på ikke at efterlade nogen luftbobler eller blande prøver mellem brønde.
    BEMÆRK: En RNA Stigen kan også anvendes til at bestemme størrelsen af ​​transkriptet.
  7. Fastgør ledningerne således at DNA'et vil migrere ind i gelen mod pluskablet. Indstil spænding til det ønskede niveau, typisk 1 til 10 V / cm af gelen. Kør gel til dog længe er tilstrækkelig til signifikant adskillelse mellem RNA-fragmenter ved hjælp af migration af farvestoffer til at overvåge udviklingen i adskillelsen.
    NOTE: En 23 cm x 25 cm gel ved 250 V vil tage ca. 1 time, mens en 8 cm x 8 cm gel ved 150 V vil tage cirka 20 minutter. Mindre RNA-fragmenter har bedre opløsning, når det køres ved højere spændinger.
  8. Sluk for strømmen, når farvestoffet fra loadingpufferen har migreret en afstand dømt tilstrækkelig til adskillelse mellem RNA-fragmenterne.
  9. Billede RNA under UV-lys som ethidiumbromid fluorescerer.
  10. Tag et billede af billedet og sammenligne fluorescensintensiteter af de oprensede RNA fra hver tilstand.

4. RNA Kvantificering via UV-VIS spektroskopi

  1. Place 2 pi H2O på en NanoDrop 2000 eller lignende maskine, og måle Blank.
  2. Dernæst placeres 2 pi af hver RNA-prøve, efter oprensning på spektrofotometer og måle UV-Vis fra et bølgelængdeområde fra 200 nm til 800 nm.
    BEMÆRK: Et A 260 læsning af 1,0 svarer til ca. 40 ug / ml RNA,og ren RNA har en A260 / A280-forhold på 2,1. 45
  3. I tilfælde af, at absorbansen er over 1 OD, fortyndes prøverne i nuclease-frit vand til opnåelse af en OD på mindre end 1.
  4. Brug graftegning software til at plotte de forskellige prøver og sammenligne OD ved 260 nm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

RNA-transkription vurderet kvalitativt ved agarosegelelektroforese

Agarosegelelektroforese anvendes til at afbilde det transkriberede RNA. Ethidiumbromid fluorescerer efter binding (λ em = 605 nm, λ ex = 210 nm, 285 nm) 46 tillader billeddannelse af RNA. Mørkere bånd i gelen svarer til højere koncentrationer af RNA. Hvis Actinomycin D, triptolide, eller enten corrole kompleks hæmmer RNA-transkription, er produktionen af ​​RNA reduceret, og bandet vil se lysere ud. Hjælp af dette koncept kan relative inhibering vurderes.

Figur 3 viser ethidiumbromidfarvet agarosegel (1%) af reaktioner RNA-transkription forbehandlet med ingen komplekse, actinomycin D, triptolide, tpfc eller Ga (tpfc) ved en [kompleks]: [template DNA basen] forholdet 0,01 : 1. Actinomycin D og triptolide viser et klart fald af RNA sammenlignet med kontrollen, som forventes afDisse lange undersøgte inhibitorer. Den Ga (tpfc) Bandet har også et meget lavt niveau af RNA, mens tpfc bandet viser lidt at ingen hæmning og udviser den samme relative intensitet som kontrol.

RNA-transkription kvantificeret ved UV-VIS spektroskopi

UV-Vis-målinger blev taget for hver prøve efter undergår RNA-transkription i 4 timer og oprenset med RNA spin-søjlekromatografi. Spektrene af bølgelængder 220 nm til 350 nm, er vist i figur 4, med λ max forekommer ved 260 nm, svarende til RNA absorption, og en ekstinktionskoefficient på 0,025 (pg / ml) -1 cm -1. Absorbansen ved 260 nm og 280 nm er anført i tabel 3. Et A 260 læsning af 1,0 svarer til ca. 40 ug / ml RNA og ren RNA har en A260 / A280-forhold på 2,1, hvilket giver kvantitative beregninger af RNA produceret i den transvarebetegnelse reaktion og en vurdering af renheden af RNA efter brug RNA spinkolonne. 44 Tre af de fire inhibitor-behandlede transkriptionsreaktioner gav mindre RNA end kontrollen, med Ga (tpfc) -behandlede DNA transskribere kun 0,07 gange så meget RNA som den ubehandlede DNA. tpfc-behandlede DNA viste ingen tilsyneladende inhibering. Alle prøver har en A 260 / A 280-forhold på ca. 2,2, hvilket indikerer forholdsvis rene prøver. Oprensning af RNA spinkolonner fjerner korte RNA-strenge 20 eller færre nukleotider lang. Resterende DNA eller strenge er længere end 20 nukleotider, kan være til stede i hvad der betragtes som de oprensede prøver. Disse små urenheder ville resultere i en A260 / A280-forholdet lidt større end 2,1.

Figur 1
Figur 1. Molekylære strukturer af Gallium (III) 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (Ga (tPFC)), og den frie base analog 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (tpfc). Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 2
Figur 2. Cytotoksicitet kurver og GI 50 værdier corroles i prostata (DU-145) (grå), bryst (MDA-MB-231) (blå), hud (SK-MEL-28) (orange), og ovarie (OVCAR -3) (grøn) cancercellelinier. Celler blev inkuberet med (A) GA (tpfc) og (B) tpfc, efterfulgt af bestemmelse af levedygtighed ved hjælp af MTS-baseret kolorimetrisk celleviabilitetstest ifølge producentens protokol. Venligst klik her for at se en større udgave af dettefigur.

Figur 3
Figur 3. ethidiumbromidfarvet agarosegel (1%) af transkriptionsreaktioner efter 4 timers inkubation. Bane 1 er en 1.000 bp DNA-stige som en standard. Bane 2-6 viser RNA transkriberet fra 0,43 pmol DNA og behandlet med 4,3 fmol af hver inhibitor (a [kompleks]: [template DNA basen] forholdet 0,01): kontrol (bane 2), Actinomycin D (bane 3), triptolide (bane 4), tpfc (bane 5), og Ga (tpfc) (bane 6).

Figur 4
Figur 4. UV-Vis-spektret af 1:. 200 fortynding af transkriberet RNA efter 4 timers inkubation DNA template til transkription reaktion blev behandlet med nogen kompleks eller med actinomycin D, triptolide, tpfc eller Ga (tpfc) ved en [kompleks]: [template DNA basen] forholdet 0,01: 1. RNA-koncentrationen måles ved OD ved 260 nm.

Optø frosne reagenser på is:
75 mM opløsninger af adenosintriphosphat, guanosintriphosphat, Cytidintrifosfat og uridin-triphosphat (ATP, CTP, GTP, UTP)
Nuclease-frit vand
10x Reaction Buffer (1x Reaction Buffer: 40 mM Tris-HCI, 6 mM MgCl2, 2 mM spermidin, 10 mM dithiothreitol, pH 7,9)
Lineariseret template-DNA (0,5 ug / ml, 1,85 kb)
RNA-polymerase-enzym (20 U / pl)

Tabel 1. Liste over frosne reagenser.

Til at begynde transkriptionsreaktioner, tilføje følgende værdi af hvert reagens i 0,2 ml tyndvæggede PCR-rør:
2 piATP-opløsning (75 mM)
2 pi CTP-opløsning (75 mM)
2 pi GTP-opløsning (75 mM)
2 pi UTP-opløsning (75 mM)
1 pi nuclease-frit vand
2 pi 10x Reaction Buffer
2 pi 0,5 pg / pl lineær template-DNA
5 pi kompleks (kerne-frit vand som blind, actinomycin D, triptolide, tpfc, Ga (tpfc))
2 pi RNA-polymerase (20 U / pl)

Tabel 2. Liste over reagenser til transkription reaktion.

Tidspunkt (hr) Complex A 260 A 280 </ Strong> A260 / A280 Fortyndingsfaktor [RNA]: A 260
(Ug / ml) 		[RNA] (mg / ml)
4 Kontrol 7,583 3,516 2.16 200 40 60,67
4 Actinomycin D 0,955 0,438 2.18 200 40 7,638
4 triptolide 1,794 0,816 2.2 200 40 14.35
4 tpfc 7,858 3,631 2.16 200 40 62,87
4 Ga (tpfc) 0,554 0,232 2.39 200 40 4,434

Tabel 3. Koncentration og renhed af transkriberet RNA efter 4 timer målt ved UV-VIS spektroskopi. Ekstinktionskoefficienten for enkeltstrenget RNA er 0,025 (pg / ml) -1 cm -1, en ​​A 260 læsning af 1,0 svarende til ca. 40 ug / ml RNA og ren RNA har en A260 / A280-forhold på 2,1. 45

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dette assay demonstrerer, at tilsætningen af ​​Ga (tpfc) inhiberer RNA-transkription sammenligneligt med de kendte DNA-bindende anticancer komplekser Actinomycin D og triptolide. Den cytotoksiske adfærd Ga (tpfc) (GI 50 = 58,1 til 154,7 uM) kan på grund af sin inhibitive egenskaber. Da ingen transkription inhibering blev observeret i tpfc, cytotoksicitet tpfc ikke skyldes RNA-transkription hæmning men er forårsaget af andre midler endnu ikke undersøgt.

I de fire transkriptionsreaktioner udført blev DNA behandlet med actinomycin D, triptolide, tpfc eller Ga (tpfc) ved en [kompleks]: [template DNA basen] forholdet 0,01, henholdsvis, eller en ubehandlet kontrol. Transskriptionsreaktionen reagenser blev kombineret, og transkription reaktionen fik lov at forløbe i 4 timer ved 37 ° C. Det transskriberede RNA blev oprenset ved en RNA spinkolonne og udbyttet analyseret ved UV-VIS og gelelektroforese. Arten af ​​transkription hæmning kan Furthendes undersøgt ved hjælp samme teknik med forskellige modifikationer, eller forbindelserne kan underkastes alternativ in vitro og in vivo undersøgelser. Yderligere eksperimenter, som kan hjælpe med at bestemme den molekylære beskaffenhed af inhiberingen omfatter røntgenkrystallografi af mulige corrole-DNA-addukter eller datamodellering af transkriptionsreaktion. Formålet med dette forsøg var at bestemme, om forbindelserne inhiberer transskription for at indsamle oplysninger om deres potentielle egenskaber kræft. Dette mål blev nået: tpfc udviste ingen hæmning, mens Ga (tpfc) udviste klar hæmning og fortjener yderligere undersøgelse.

RNA transskription assay kan modificeres for at tilvejebringe mere mekanistiske detaljer. Tilsætning af anticancermidler (fx de corrole komplekser) efter transkription reaktionen er fuldstændig, kan vise, om komplekserne nedbrydes eller hydrolysere RNA. En anden anbefalede eksperiment er at foretagetranskription reaktion med alle komponenter med undtagelse af RNA polymerase enzym 10 gange lavere for at tillade differentiering mellem en inhibering, der omfatter DNA eller enzymet. Endelig inkubation af DNA eller polymerase med komplekserne før RNA-transkription ville give mulighed for forøget binding mellem komplekset og den respektive mål, undersøge, om de komplekse inhibitive egenskaber er involveret i DNA eller polymerase binding hhv.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Vi oprigtigt takke Dr. Cindy N. Chiu om hjælp med gelelektroforese, og Andy Zhou og Michael Grodick for deres generøse donation af DNA og restriktionsenzym. Vi takker professor J. Heath og professor D. Prober for generøse adgang til udstyr og materialer. Vi takker Dr. Karn Sorasaenee for nyttige forslag. Vi takker Mary H. Tang for at skabe illustrationen anvendes i den skematiske oversigt i videoen. Finansieringen blev leveret af Johnson & Johnson og USC Y86786.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Actinomycin D Sigma-Aldrich A1410 Store at 2-8 °C , protect from light
Triptolide Sigma-Aldrich T3652 Store at 2-8 °C , protect from light
nuclease-free H2O  Life Technologies AM9938
MEGAscript T7 Transcription Kit Life Technologies AM1334 Store at –20 °C 
Ethidium Bromide Sigma-Aldrich E7637 CAUTION: For proper handling procedures of ethidium bromide, please see: http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927667
Tris Acetate Sigma-Aldrich T6025
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich EDS
UltraPure Agarose Life Technologies 16500-100
mini Quick Spin RNA Columns Roche Life Science 11814427001 Store at 2-8 °C , do not freeze
1 kb DNA Ladder New England Biolabs N3232S Store at –20 °C 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. American Cancer Society. , American Cancer Society. Atlanta. Available from: http://www.cancer.org (2014).
  2. Weinstein, I. B. Addiction to oncogenes—The Achilles heel of cancer. Science. 297, 63-64 (2002).
  3. Derheimer, F. A., Chang, C. W., Ljungman, M. Transcription inhibition: A potential strategy for cancer therapeutics. Eur. J. Cancer. 41 (16), 2569-2576 (2005).
  4. Koumenis, C., Giaccia, A. Transformed cells require continuous activity of RNA polymerase II to resist oncogene-induced apoptosis. Mol. Cell. Biol. 17 (12), 7306-7316 (1997).
  5. Stellrecht, C. M., Chen, L. S. Transcription Inhibition as a Therapeutic Target for Cancer. Cancers. 3 (4), 4170-4190 (2011).
  6. Bensaude, O. Inhibiting eukaryotic transcription: Which compound to choose? How to evaluate its activity. Transcription. 2 (3), 103-108 (2011).
  7. Liu, Q. Triptolide and its expanding multiple pharmacological functions. International Immunopharmacology. 11 (3), 377-383 (2011).
  8. Mahammed, A., Gray, H. B., Weaver, J. J., Sorasaenee, K., Gross, Z. Amphiphilic corroles bind tightly to human serum albumin. Bioconjugate Chemistry. 15 (4), 738-746 (2004).
  9. Lim, P. Differential cytostatic and cytotoxic action of metallocorroles against human cancer cells: Potential platforms for anticancer drug development. Chemical Research in Toxicology. 25 (2), 400-409 (2012).
  10. Bendix, J., Dmochowski, I. J., Gray, H. B., Mahammed, A., Simkhovich, L., Gross, Z. Structural, electrochemical, and photophysical properties of gallium(III) 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corrole. Angewandte Chemie-International Edition. 39 (22), 4048-4051 (2000).
  11. Hwang, J. Y., Gross, Z., Gray, H. B., Medina-Kauwe, L. K., Farkas, D. L. Ratiometric spectral imaging for fast tumor detection and chemotherapy monitoring in vivo. Journal of Biomedical Optics. 16 (6), 1-6 (2011).
  12. Agadjanian, H. Tumor detection and elimination by a targeted gallium corrole. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (15), 6105-6110 (2009).
  13. Hwang, J. Y. Photoexcitation of tumor-targeted corroles induces singlet oxygen-mediated augmentation of cytotoxicity. Journal of Controlled Release. 163 (3), 368-373 (2012).
  14. Hwang, J. Y., et al. Investigating photoexcitation-induced mitochondrial damage by chemotherapeutic corroles using multimode optical imaging. Journal of Biomedical Optics. 17 (1), 11 (2012).
  15. Hwang, J. Y. A Mechanistic Study of Tumor-Targeted Corrole Toxicity. Molecular Pharmaceutics. 8 (6), 2233-2243 (2011).
  16. Saltsman, I., Mahammed, A., Goldberg, I., Tkachenko, E., Botoshansky, M., Gross, Z. Selective substitution of corroles: Nitration, hydroformylation, and chlorosulfonation. Journal of the American Chemical Society. 124 (25), 7411-7420 (2002).
  17. Gershman, Z., Goldberg, I., Gross, Z. DNA Binding and Catalytic Properties of Positively Charged Corroles. Angewandte Chemie. 46 (23), 4320-4324 (2007).
  18. Fu, P. K., Bradley, P. M., Turro, C. Stabilization of duplex DNA structure and suppression of transcription in vitro by bis(quinone diimine) complexes of rhodium(III) and ruthenium(II). Inorganic Chemistry. 42 (3), 878-884 (2003).
  19. Sorasaenee, K., Fu, P. K. -L., Angeles-Boza, A. M., Dunbar, K. R., Turro, C. Inhibition of Transcription in Vitro by Anticancer Active Dirhodium(II) Complexes. Inorg. Chem. 42 (4), 1267-1271 (2003).
  20. Aguirre, J. D., Lutterman, D. A., Angeles-Boza, A. M., Dunbar, K. R., Turro, C. Effect of axial coordination on the electronic structure and biological activity of dirhodium(II,II) complexes. Inorganic Chemistry. 46 (18), 7494-7502 (2007).
  21. Raja, N. S., Nair, B. U. Chromium(III) complexes inhibit transcription factors binding to DNA and associated gene expression. Toxicology. 251 (1-3), 61-65 (2008).
  22. Gao, F., Chen, X., Wang, J. Q., Chen, Y., Chao, H., Ji, L. N. In Vitro Transcription Inhibition by Ruthenium(II) Polypyridyl Complexes with Electropositive Ancillary Ligands. Inorganic Chemistry. 48 (13), 5599-5601 (2009).
  23. Chen, X., Gao, F., Zhou, Z. X., Yang, W. Y., Guo, L. T., Ji, L. N. Effect of ancillary ligands on the topoisomerases II and transcription inhibition activity of polypyridyl ruthenium(II) complexes. Journal of Inorganic Biochemistry. 104 (5), 576-582 (2010).
  24. Chen, X., Gao, F., Yang, W. Y., Sun, J., Zhou, Z. X., Ji, L. N. Effects of intercalative ligands on the DNA binding, DNA topoisomerase II and DNA transcription inhibition of polypyridyl ruthenium(II) complexes. Inorganica Chimica Acta. 378 (1), 140-147 (2011).
  25. Chen, X., Gao, F., Yang, W. Y., Zhou, Z. X., Lin, J. Q., Ji, L. N. Structure-activity relationship of polypyridyl ruthenium(II) complexes as DNA intercalators, DNA photocleavage reagents, and DNA topoisomerase and RNA polymerase inhibitors. Chemistry & Biodiveristy. 10 (3), 367-384 (2013).
  26. Chifotides, H. T., Fu, P. K., Dunbar, K. R., Turro, C. Effect of equatorial ligands of dirhodium(II,II) complexes on the efficiency and mechanism of transcription inhibition in vitro. Inorganic Chemistry. 43 (3), 1175-1183 (2004).
  27. Pauly, M., Kayser, I., Schmitz, M., Dicato, M., Del Guerzo, A., Kolber, I., Moucheron, C., Kirsch-De Mesmaeker, A. In vitro inhibition of gene transcription by novel photo-activated polyazaaromatic ruthenium(II) complexes. Chemical Communications. 10, 1086-1087 (2002).
  28. Richardson, D. R. Iron and gallium increase iron uptake from transferring by human melanoma cells: Further examination of the ferric ammonium citrate-activated iron uptake process. Biochimica et Biophysica Acta. 1536 (1), 43-54 (2001).
  29. Collery, P., Keppler, B., Madoulet, C., Desoize, B. Gallium in cancer treatment. Critical Reviews in Oncology / Hematology. 42 (3), 283-296 (2002).
  30. Hedley, D. W., Tripp, E. H., Slowiaczek, P., Mann, G. J. Effect of gallium on DNA synthesis by human T-cell lymphoblasts. Cancer Research. 48 (11), 3014-3018 (1988).
  31. Chitambar, C. R., Narasimhan, J., Guy, J., Sem, D. S., O’Brien, W. J. Inhibition of ribonucleotide reductase by gallium in murine leukemic L1210 cells. Cancer Research. 51, 6199-6201 (1991).
  32. Seidman, A. D. Continuous infusion gallium nitrate for patients with advanced refractory urothelial tract tumors. Cancer. 68, 2561-2565 (1991).
  33. Chitambar, C. R. Medical applications and toxicities of gallium compounds. International Journal of Environmental Research and Public Health. 7 (5), 2337-2361 (2010).
  34. Chitambar, C. R. Gallium-containing anticancer compounds. Future Medicinal Chemistry. 4 (10), 1257-1272 (2012).
  35. Trask, D. K., Muller, M. T. Stabilization of type I topoisomerase-DNA covalent complexes by actinomycin D. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (5), 1417-1421 (1988).
  36. Chang, T. C., Tsai, L. C., Hung, M. W., Chu, L. L., Chu, J. T., Chen, Y. C. Effects of transcription and translation inhibitors on a human gastric carcinoma cell line. Potential role of Bcl-X(S) in apoptosis triggered by these inhibitors. Biochemical Pharmacology. 53 (7), 969-977 (1997).
  37. Mischo, H. E., Hemmerich, P., Grosse, F., Zhang, S. Actinomycin D induces histone gamma-H2AX foci and complex formation of gamma-H2AX with Ku70 and nuclear DNA helicase II. The Journal of Biological Chemistry. 280 (10), 9586-9594 (2005).
  38. Titov, D. V. XPB, a subunit of TFIIH, is a target of the natural product triptolide. Nature Chemical Biology. 7 (3), 182-188 (2011).
  39. Leuenroth, S. J., Crews, C. M. Triptolide-induced transcriptional arrest is associated with changes in nuclear substructure. Cancer Researcg. 68 (13), 5257-5266 (2008).
  40. Vispé, S. Triptolide is an inhibitor of RNA polymerase I and II-dependent transcription leading predominantly to down-regulation of short-lived mRNA. Molecular Cancer Therapeutics. 8 (10), 2780-2790 (2009).
  41. MEGAscript T7 Transcription Kit User Guide. Current Protocols in Molecular Biology. , Life Technologies. Carlsbad. Available from: http://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/1330M_G.pdf (2014).
  42. Fleige, S., Pfaffl, M. W. RNA integrity and the effect on the real-time qRT-PCR performance. Molecular Aspects of Medicine. 27 (2-3), 126-139 (2006).
  43. Quick Spin Columns Protocol. , Roche Diagnostics GmbH. Mannheim. Available from: https://pim-eservices.roche.com/LifeScience/Document/95c2b1f8-7cf1-e311-98a1-00215a9b0ba8 (2013).
  44. RNA quality control. , KU Leuven: Biomedical Genomics. Leuven. Available from: http://biomedicalgenomics.org/RNA_quality_control.html (2007).
  45. Sabris, R. W. Handbook of biological dyes and stains: synthesis and industrial application. , Wiley. Hoboken, NJ. (2010).

Tags

Bioengineering Corrole RNA transskription hæmning anti-cancer DNA binding actinomycin D triptolide
En<em&gt; In vitro</em&gt; Enzymatisk assay til måling Transskription Inhibering af gallium (III) og H<sub&gt; 3</sub&gt; 5,10,15-tris (pentafluorphenyl) corroles
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tang, G. Y., Pribisko, M. A.,… More

Tang, G. Y., Pribisko, M. A., Henning, R. K., Lim, P., Termini, J., Gray, H. B., Grubbs, R. H. An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by Gallium(III) and H3 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corroles. J. Vis. Exp. (97), e52355, doi:10.3791/52355 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter