A custom protocol is described to differentiate mouse ES cells into defined populations of highly pure neurons exhibiting functioning synapses and emergent network behavior. Electrophysiological analysis demonstrates the loss of synaptic transmission following exposure to botulinum neurotoxin serotypes /A-/G and tetanus neurotoxin.
Estudios terapéuticos y mecanicistas de las neurotoxinas clostridiales presinápticamente específicas (CNTs) han sido limitados por la necesidad de un modelo escalable, basado en la célula que produce sinapsis funcionales y experimenta respuestas fisiológicas a la intoxicación. Aquí se describe un método simple y robusto para diferenciar eficazmente células madre embrionarias murinas (CES) en linajes definidos de neuronas, conectadas en red sinápticamente activos. A raíz de un protocolo de diferenciación 8 días, las neuronas derivadas de células madre embrionarias de ratón (SNE) rápidamente expresar y compartimentar proteínas neurotypic, forman morfologías neuronales y desarrollar respuestas eléctricas intrínsecas. A los 18 días después de la diferenciación (DIV 18), SNE exhiben glutamatérgica activa y γ-aminobutírico (GABA) sinapsis adrenérgicos y comportamientos de la red emergente que se caracterizan por un excitador: equilibrio inhibitorio. Para determinar si la intoxicación con CNT antagoniza funcionalmente neurotransmisión sináptica, replicando de este modo ªe in vivo fisiopatología que es responsable de las manifestaciones clínicas de botulismo o tétanos, se usó la electrofisiología de células enteras patch clamp para cuantificar las corrientes espontáneas en miniatura excitatorios postsinápticos (mEPSCs) en SNE expuestas a la neurotoxina del tétanos (TeNT que) o la neurotoxina botulínica (BoNT) serotipos / A- / G. En todos los casos, SNE exhibió la pérdida casi completa de la actividad sináptica dentro de 20 hr. Neuronas intoxicados permanecieron viables, como lo demuestra sin cambios potenciales de membrana en reposo y respuestas eléctricas intrínsecas. Para caracterizar aún más la sensibilidad de este enfoque, se midieron los efectos dependientes de la dosis de la intoxicación sobre la actividad sináptica 20 hr después de la adición de BoNT / A. La intoxicación con 0.005 pM BoNT / A dio como resultado una disminución significativa de la mEPSCs, con una concentración inhibitoria media (IC 50) de 0.013 pM. Las comparaciones de dosis mediana indican que las mediciones funcionales de inhibición sináptica son más rápidos, más específica y más sensible que SNAREdivisión ensayos o el ensayo de letalidad en ratones. Estos datos validan el uso de sinápticamente acoplados, frenar las neuronas derivadas de células para la detección altamente específica y sensible de la CNT.
El objetivo general de este método es evaluar funcionalmente la actividad sináptica en cultivos en red de neuronas derivadas de células madre expuestos a neurotoxinas clostridiales. Esta es la primera demostración de un modelo derivado in vitro que se replica funcionalmente las fisiopatologías responsables de las manifestaciones clínicas de botulismo y valida SNE como un modelo adecuado para la detección de los CNT, el cribado terapéutica y estudios mecanísticos.
BoNTs son neurotoxinas bacterianas altamente letales producidos por miembros de las especies de Clostridium. Incluyendo el recientemente propuesto BoNT / H, ocho serotipos de BoNT antigénicamente diferentes se han descrito (/ A- / H) 1,2. Todos los serotipos se expresan como 150 kDa que son péptidos después de la traducción muescas para producir una doble cadena compuesta de un 100 kDa de la cadena pesada (HC) y un 50 kDa de la cadena ligera (LC) unidos por un enlace disulfuro 3. El HC media la unión a los receptores presinápticos y entry de la toxina en la neurona a través de endocitosis sináptica. Durante el procesamiento endosomal, el HC se somete a re-organización estructural para formar un poro en la membrana de la vesícula, lo que facilita la translocación de la LC en el citosol presináptica. La LC entonces se dirige específicamente a, y se unirá soluble del receptor de N-proteína de fijación de fusión -ethylmaleimide sensible (SNARE) las proteínas en el compartimiento presináptica: SNAP-25 (BoNT / A, / C, / E), VAMP2 (BoNT / B, / D, / F, / G) o sintaxina (Bont / C) 1. La escisión de cualquiera de estas proteínas SNARE impide el montaje de la maquinaria exocitosis sináptica, bloqueando de este modo la liberación de neurotransmisores. Esta combinación de focalización neuronal eficiente y localización presináptica hace BoNTs los venenos más potentes que se conocen, con dosis letales humanos estimados tan bajas como 0.1 – 1 ng / kg 1.
Ensayos bioquímicos se pueden utilizar para detectar la presencia o actividad de CNT CL con alta sensibilidad. Sin embargo, estos métodos no logran interrogate la capacidad de la toxina para unirse, entrar, activar y función dentro de las neuronas, y por lo tanto son medidas indirectas y posiblemente engañosas de la presencia de la toxina activa. Por el contrario, los ensayos funcionales de intoxicación, tales como el ensayo de letalidad en ratones (MLA) evaluar exhaustivamente la capacidad del CNT para negociar con éxito todas las fases de captación y activación, proporcionando evaluaciones más relevantes y específicos de la actividad de la toxina. Mientras que el diputado es el estándar de oro de la detección BoNT, es un método in vivo que utiliza la muerte como un punto final y por lo tanto tiene una utilidad limitada como una plataforma de investigación. Los intentos de desarrollar modelos basados en células de CNT intoxicación adecuado para estudios de mecánica y detección terapéutico también han sufrido importantes limitaciones. Mientras que cultivos de neuronas primarias ofrecen un alto grado de relevancia fisiológica, su uso se complica por una serie de factores, incluyendo el coste de alta de recursos, rendimiento relativamente bajo, la presencia de múltiples sub neuronaltipos y extensa supervisión regulatoria y administrativa involucrado con el uso de animales. Como una alternativa a las neuronas primarias, líneas celulares neurogénicos (que pueden ser inducidos a adoptar propiedades similares a neuronas por la estimulación química), tales como neuroblastomas y las células cromafines adrenales se han utilizado como modelos in vitro de la intoxicación. Puesto que estas células son cultivadas de forma continua antes de la inducción, son altamente escalable y por lo tanto muy adecuado para enfoques moderado rendimiento. Sin embargo, su relevancia es cuestionable ya que los fenotipos inducidos son típicamente heterogéneo, son poco sensibles a la CNT y dejan de exhibir comportamientos neuronales críticos, incluyendo la incapacidad para formar compartimentos pre y post-sinápticas que se ensamblan en las sinapsis funcionales 4. En ausencia de compartimentos presinápticos fisiológicamente intactas, la gama completa de la toxina: interacciones neurona no puede ser replicado y por lo tanto las mediciones funcionales de intoxicación no son posibles 5. Not sorprendentemente, los intentos de llevar a cabo estudios sobre el mecanismo o la detección de drogas para BoNTs utilizando líneas celulares neurogénica inducida han dado lugar a resultados que no son consistentes con estudios in vivo y de neuronas primarias 6.
Se ha propuesto que se derivan del sistema nervioso (CNS), las neuronas centrales derivados de células pueden proporcionar una plataforma basada en células de próxima generación para la investigación BoNT que combina la relevancia de las neuronas primarias con la flexibilidad de las líneas celulares cultivadas 7-10. En particular, las neuronas derivadas de células madre de ratón (SNE) se han encontrado para ser altamente sensibles a dosis fisiológicas de BoNT / A- / G y para replicar muchos en las respuestas in vivo a la intoxicación, incluyendo persistencias diferenciales, actividad mejorada intoxicación, y serotipo potencias específico de 5,8,11. Estos comportamientos indican que en los mecanismos in vivo de la captación de BoNT, el procesamiento, el tráfico y la actividad se conservan en SNE. Sin embargo, la inhibición de activit sinápticay es la firma manifestación de botulismo, y por lo tanto demostrar una pérdida de actividad sináptica tras la intoxicación por CNTs es esencial antes de concluir que SNE son un adecuado en el modelo basado en células derivadas vitro para los estudios de la CNT.
Para medir los efectos de la intoxicación con nanotubos de carbono en la actividad sináptica, se utilizó de células enteras electrofisiología patch-clamp para cuantificar las corrientes monosynaptic en 21 + SNE tratados con vehículo o DIV tratado-CNT. Encontramos que la intoxicación del SNE con BoNT / A- / G o TeNT que causó la pérdida de> 95% de la actividad sináptica dentro de 20 horas en todos los casos. Además de la caracterización realizada 20 horas después de la intoxicación con BoNT / A reveló un efecto dependiente de la dosis en la actividad sináptica, con un límite de detección inferior al 0,005 pM y un valor de IC50 de 0,013 pM. Estos hallazgos indican que el marco de la sensibilidad y el tiempo de detección electrofisiológica de intoxicación se mejoran considerablemente en comparable a base de inmunoblot analisis de SNAP-25 de escisión y en ensayos de letalidad en ratón in vivo, lo que demuestra que las mediciones funcionales de intoxicación en cultivos de neuronas sinápticamente activos pueden facilitar métodos más sensibles, específicos y rápidos para caracterizar la respuesta celular a BoNT.
El actual estándar de oro para la detección de la CNT, la determinación del serotipo y cuantificación es la MLA. El MLA interroga a toda la gama de host: la escisión de toxina interacciones necesarias para la intoxicación que se produzca in vivo (por ejemplo, la toxina de la unión a un receptor de superficie celular, la internalización del complejo de toxina-receptor, LC translocación en el citoplasma, mediada-LC de sustrato y la inhibición de la neurotransmisión sináptica) 18. Sin embargo, a pesar de la MLA ofrece un modelo fisiológicamente relevantes de la intoxicación, es intensivo en recursos, puede ser confundido por los contaminantes e involucra a un gran número de ratones con la muerte como un punto final. Alternativamente, los ensayos basados en células para la detección y cuantificación de BoNT se han limitado a cultivos de neuronas primarias, que también requieren el uso de animales, o para líneas celulares de neuroblastoma, que no pueden formar sinapsis y típicamente exhiben pobre sensibilidad a neurotoxinas 8. Hasta la fecha, la mayoría de las mediciones de la intoxicación en ªplataformas basadas en células ESE se han basado en la detección de la escisión proteolítica de SNAP-25, VAMP1 / 2 o sintaxina-1 11. Esto es problemático porque corte de la proteína SNARE se ha demostrado ser no lineal asociado con la inhibición sináptica in vivo y por lo tanto pueden no representar con precisión la intoxicación o la recuperación de intoxicación 19,20.
Un modelo de sistema basado en células ideal para la detección CNT sería (i) ser a base de neurona; (Ii) ser acoplado sinápticamente con respuestas eléctricas neurotypic; (Iii) ser altamente sensible a todos los serotipos de la CNT o subtipos; y (iv) la oferta de escalabilidad, rendimiento y ensayo de tiempos que son equivalentes o mejorado en el eje de acción, a menor costo, y sin que sea necesario el uso de animales. Para cumplir estos requisitos, hemos desarrollado un método para producir grandes cantidades de altamente enriquecido, culturas red de neuronas glutamatérgicas y GABAérgicas de líneas ESC ratón comercialmente disponibles. Desarrollamos entonces el ensayo MIST cuantificarinhibición sináptica en respuesta a la intoxicación con tienda de campaña y BoNT / A- / G. Mientras que el ensayo MIST puede llevarse a cabo en cualquier población sinápticamente activa neurona (por ejemplo, neuronas primarias o cortes de cerebro), actualmente SNE son el modelo de neurona sólo in vitro derivada que se desarrolla de forma reproducible comportamientos de la red emergentes y por lo tanto es apropiado para el ensayo de niebla.
La producción de una cantidad suficiente de neuronas del linaje definido para los estudios de la CNT requieren varias innovaciones en la cultura ESC y la diferenciación. En primer lugar, mediante la selección para el cultivo de los CES y que pueden sobrevivir suspensión de adaptación, eliminamos la posibilidad de contaminación por las células alimentadoras y la necesidad de purificar las células de alimentación de los CES en el inicio de la diferenciación. Aunque los mecanismos moleculares que subyacen a suspensión de adaptación son desconocidos, los CES de suspensión adaptada permanecen activas mitóticamente, retener Oct3 / 4 de expresión y siguen siendo neurogénica. Usando este método, ~ 1,5 x 10 7 ESC se recuperaron normalmente cada pasaje. En segundo lugar, la producción de NPC se aumentó ~ 300% mediante la incorporación de agitación mecánica para evitar la aglomeración durante la diferenciación, aparentemente aumentar la accesibilidad de nutrientes a los interiores de los agregados. Durante el proceso, se encontró que el suero utilizado para el cultivo ESC y la diferenciación neuronal es el componente más crítico en el mantenimiento de los CES neurogénica. Para un mejor éxito, se recomienda la suspensión adaptar células madre embrionarias para cada lote de suero y el almacenamiento de suero a -20 ° C para apoyar la cultura ESC y la diferenciación neuronal a través de la fecha de caducidad.
Al igual que con la mayoría de las culturas sinápticamente activos, DIV 14 + SNE son muy susceptibles a los cambios bruscos en el pH, e incluso una breve exposición a concentraciones de CO2 atmosférico pueden provocar neurotoxicidad dentro de las 24 horas. Para los experimentos que requieren tratamiento de los cultivos seguido de incubaciones O / N o más, las neuronas se debe tratar directamente duraderas in la incubadora o transferido a una cámara antes de la experimentación constante CO 2.
Una variedad de técnicas confirmó la neurogénesis y la maduración neuronal, incluyendo ICC, perfiles de transcripción y de células enteras de electrofisiología patch-clamp. Los cambios temporales en la expresión génica y la morfología de las neuronas fueron consistentes con una progresión rápida a través de las etapas de desarrollo de la neurogénesis, y por DIV 16, SNE exhibieron excitatorio y corrientes postsinápticas inhibitorias en miniatura con la red emergente los comportamientos que 16. La evidencia de la actividad sináptica sugirió que SNE puede replicar los fisiopatologías responsables de las manifestaciones clínicas del botulismo y el tétanos. Esto fue confirmado por el uso de MIST para mostrar que la intoxicación con BoNT / A- / G o TeNT deteriorado frecuencias mEPSC de> 95% en comparación con las neuronas tratadas con vehículo o no tratados.
Las mediciones de la sensibilidad de la NIEBLA de BoNT / A indicaron un inhibidor medianaconcentración (IC 50) de 0,013 pM (equivalente a 0,5 ratón letal unidades / ml) y un límite de detección por debajo de 0.005 pM, medido a 20 hr después de la adición del baño. Sobre la base de estos valores, MIST es aproximadamente dos veces tan sensible como y 2 – 4 veces más rápido que la MLA y 30 veces más sensible que la detección basada en inmunoblot de escinde SNAP-25.
Colectivamente, estos datos sugieren que las poblaciones en red de neuronas derivadas de células madre ofrecen un modelo fisiológicamente relevante, basada en células de la intoxicación. En combinación con la mejora de los métodos para derivar culturas ESN en red de los CES de suspensión adaptada, el uso de MIST debería reducir la necesidad de experimentar con animales y las desventajas asociadas, los costos y las preocupaciones éticas de la MLA mientras que proporciona una medida más rápida, sensible y específica de intoxicación. Aunque la electrofisiología de células enteras patch-clamp es un método de bajo rendimiento para identificar la presencia de neurotoxinas activas, que ofrece una resolución y speed que es inalcanzable utilizando métodos moleculares. Estos resultados también proporcionan pruebas de que la aplicación de métodos dependientes de la actividad para evaluar la actividad sináptica y comportamiento de la red puede permitir la detección rápida y específica de neurotoxinas. Tales enfoques de mayor rendimiento harían estudios mecánicos, detección terapéutico o ensayos diagnósticos factibles para una amplia gama de agentes neuromoduladores, incluidos los NTC.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de la Salud Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas (IAA número AOD12058-0001-0000) y la Agencia de Reducción de Amenazas de Defensa – Conjunto de Ciencia y Tecnología Oficina, Médico S & T División (los números de subvención CBM.THRTOX.01.10 .RC.023 y CBM.THRTOX.01.RC.014). Esta investigación fue realizada mientras PB celebró una Defense Threat Reducción Premio Associateship Investigación Agencia-Consejo Nacional de Investigación y KH celebró un Premio Associateship Investigación del Consejo Superior de Investigaciones Científicas. Damos las gracias a Angela Adkins y Kaylie Tuznik (USAMRICD) para la asistencia técnica; y Cindy Kronman (USAMRICD) por su asistencia editorial. Las opiniones expresadas en este artículo son las de los autores y no reflejan la política oficial del Departamento del Ejército, el Departamento de Defensa, o el Gobierno de Estados Unidos.
Table 1. ESC and ESN | ||||
Knockout DMEM | Life Technologies | 10829-018 | Media: ESC culture medium Formulation and notes: 500 mL |
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100x MEM NEAA | Life Technologies | 11140-050 | Media: store at 4 °C for up to 1 month Formulation and notes: 6 mL |
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200 mM L-Alanyl-L-Glutamine | ATCC | 30-2115 | 6 mL | |
ES qualified FBS | Applied Stem Cell | ASM-5007 | 90 mL | |
100x antibiotics | Sigma-Aldrich | A5955 | 3 mL | |
55 mM 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | 1.1 mL | |
107 Units/mL LIF | Millipore | ESG1107 | 60 μL | |
Knockout DMEM | Life Technologies | 10829-018 | Media: ESC differentiation medium Formulation and notes: 436.6 mL |
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100x MEM NEAA | Life Technologies | 11140-050 | Media: store at 4 °C for up to 1 month Formulation and notes: 5 mL |
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200 mM L-Alanyl-L-Glutamine | ATCC | 30-2115 | 5 mL | |
ESC-qualified serum | Applied Stem Cell | ASM-5007 | 50 mL | |
100x antibiotics | Sigma-Aldrich | A5955 | 2.5 mL | |
55 mM 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | 0.9 mL | |
Dulbecco's PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | Media: NPC trypsinization medium Formulation and notes: 100 mL |
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0.5 M EDTA (18.3%) | Sigma-Aldrich | 3690 | Media: freeze in 5 mL aliquote Formulation and notes: 0.266 mL |
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Trypsin | Sigma-Aldrich | T8802 | 50 mg | |
Polyethyleneimine (PEI) | Sigma-Aldrich | P3143 | Media: Surface coating solutions Formulation and notes: 2.5 µg/mL in H20 |
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Poly-D-lysine (PDL) | Sigma-Aldrich | P7280 | Media: use within 1 wk Formulation and notes: 100 µg/mL in H20 |
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Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | 5 µg/mL in H20 | |
DMEM/F12 + GlutaMAX | Life Technologies | 10565-018 | Media: NPC culture medium Formulation and notes: 492.5 mL |
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100x N2 vitamins | Life Technologies | 17502-048 | Media: store at 4 °C for up to 1 month Formulation and notes: 5 mL |
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100x antibiotics | Sigma-Aldrich | A5955 | 2.5 mL | |
Neurobasal A | Life Technologies | 10888-022 | Media: ESN culture medium Formulation and notes: 482.5 mL |
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50x B27 vitamins | Life Technologies | 17504-044 | Media: store at 4 °C for up 1 month Formulation and notes: 10 mL |
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200 mM L-Alanyl-L-Glutamine | ATCC | 30-2115 | 5 mL | |
100x antibiotics | Sigma-Aldrich | A5955 | 2.5 mL | |
5-fluoro-2'-deoxyuridine (5FDU) | Sigma-Aldrich | F0503 | Media: 2000x Mitotic inhibitors aliquot and store at -20 °C Formulation and notes: dd 150 mg 5FDU and 350 mg uridine to 10 mL Neurobasal A. Sterile filter, aliquot and freeze. Use 2000x in ESN culture medium. |
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Uridine | Sigma-Aldrich | U3003 | ||
TrypLE Express Trypsin | Life Technologies | 12605-010 | Media: Miscellaneous Formulation and notes: store at RT |
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DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | store at RT | |
soybean trypsin inhibitor (STI) | Sigma-Aldrich | T6414 | store at -20 °C | |
ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | store at RT | |
ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4403 | Prepare 100 mM stock by dissolving 100 mg ascorbic acid in 5.7 mL of 50:50 DMSO/ethanol mix. | |
retinoic acid (RA) | Sigma-Aldrich | R2625 | Resuspend 15 mg RA in 9 mL 50:50 DMSO/ethanol. Supplement with 1 mL of 100 mM ascorbic acid stock. Aliquot and stored at -80 °C. Stable for 6 mos. | |
Table 2. MIST | ||||
NaCl | Sigma-Aldrich | 71386 | Media: Extracellular Recording Buffer Final Concentration (mM): 58.44 MW: 140 |
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KCl | Sigma-Aldrich | 60135 | Media: (ERB; pH = 7.3, 315 mO) Final Concentration (mM): 74.56 MW: 3.5 |
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NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S3139 | Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo. Final Concentration (mM): 119.98 MW: 1.25 |
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CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21115 | Final Concentration (mM): 110.98 MW: 2 |
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MgCl2 | Sigma-Aldrich | 63069 | Final Concentration (mM): 95.21 MW: 1 |
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D-glucose | Sigma-Aldrich | G8644 | Final Concentration (mM): 180.16 MW: 10 |
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HEPES | Sigma-Aldrich | H0887 | Final Concentration (mM): 238.3 MW: 10 |
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K-gluconate | Sigma-Aldrich | P1847 | Media: Intracellular Recording Buffer Final Concentration (mM): 234.5 MW: 140 |
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NaCl | Sigma-Aldrich | 71386 | Media: (IRB; pH = 7.3, 320 mO) Final Concentration (mM): 58.44 MW: 5 |
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Mg-ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo. Final Concentration (mM): 507.18 MW: 2 |
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Li-GTP | Sigma-Aldrich | G5884 | Final Concentration (mM): 523.18 MW: 0.5 |
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CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21115 | Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo. Final Concentration (mM): 110.98 MW: 0.1 |
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MgCl2 | Sigma-Aldrich | 63069 | Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo. Final Concentration (mM): 95.21 MW: 1 |
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EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | 380.35 | Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo. Final Concentration (mM): 380.35 MW: 1 |
HEPES | Sigma-Aldrich | H0887 | Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo. Final Concentration (mM): 238.3 MW: 10 |
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bicuculline | Tocris | 131 | Media: Miscellaneous Final Concentration (mM): 0.01 MW: 417.85 |
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CNQX | Sigma-Aldrich | C239 | Final Concentration (mM): 0.01 MW: 276.12 |
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Tetrodotoxin | Sigma-Aldrich | A8001 | Final Concentration (mM): 0.005 MW: 645.74 |
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BoNT/A-/G | Metabiologics | N/A | Media: Final Concentration (mM): TBD MW: 150,000 |
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Tetanus toxin | Sigma-Aldrich | T3194 | Final Concentration (mM): TBD MW: 150,000 |
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Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL-2 | Final Concentration (mM): N/A MW: N/A |
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Table 3. Equipment and Software | ||||
MiniAnalysis (version 6.0.7) | Synaptosoft, Inc. | N/A | Event detection software | |
Igor Pro (version 6.22A) | WaveMetrics | N/A | Software for visualization of recordings | |
Patchmaster | Heka | N/A | Data acquisition software | |
Olympus IX51 inverted microscope | Olympus | N/A | ||
micromanipulator | Sutter Instrument | MPC-365 | ||
patch-clamp amplifier | Heka | ECB10USB | ||
micropipette puller | Sutter Instrument | P-1000 | ||
borosilicate capillary tubes | Sutter Instrument | B150-86-10 | Corning 7740 | |
18 mm glass coverslips | Fisher | 12-545-84 | ||
plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | ||
cell strainer (40 µm) | Fisher | 08-771-1 | ||
Stovall Belly Dancer Shaker | Fisher | 15-453-211 | ||
low adhesion dishes | Fisher | 05-539-101 | Corning 3262 | |
bacterial dishes | VWR | 25384-302 | 100 x 15 mm |