A custom protocol is described to differentiate mouse ES cells into defined populations of highly pure neurons exhibiting functioning synapses and emergent network behavior. Electrophysiological analysis demonstrates the loss of synaptic transmission following exposure to botulinum neurotoxin serotypes /A-/G and tetanus neurotoxin.
Terapeutiske og mekanistiske studier av presynaptisk målrettede clostridial nervegifter (CNTs) har vært begrenset av behovet for en skalerbar, celle-basert modell som produserer fungerende synapser og gjennomgår fysiologiske responser til rus. Her beskriver vi en enkel og robust metode for å effektivt skille mus embryonale stamceller (ESCs) i definerte linjer av postsynaptisk aktive, nettverksbaserte nevroner. Etter en åtte dagers differensiering protokollen, mus embryonale stamcelle-avledet nevroner (ESNs) raskt uttrykke og compartmentalize neurotypic proteiner, danner nevrale morfologi og utvikle iboende elektriske responser. Etter 18 dager etter differensiering (DIV 18), ESNs vise aktiv glutamaterg og γ-aminosmørsyre (GABA) giske synapser og emergent nettverks atferd preget av en eksitatoriske: hemmende balanse. Å avgjøre om rus med CNTs funksjonelt antagonizes synaptic nevrotransmisjon, og dermed kopiere the in vivo patofysiologi som er ansvarlig for kliniske manifestasjoner av botulisme eller stivkrampe, ble hel-celle patch clamp elektrofysiologi brukes til å kvantifisere spontane miniatyr eksitatoriske postsynaptiske strømmer (mEPSCs) i ESNs utsatt for stivkrampe neurotoxin (telt) eller botulinumnevrotoksin (Bont) serotyper / A- / G. I alle tilfeller, ESNs oppviste nesten fullstendig tap av synaptisk aktivitet innen 20 timer. Berusede nevroner forble levedyktig, som demonstrert ved uendret hviler membranpotensialer og iboende elektriske responser. For ytterligere å karakterisere følsomheten av denne tilnærmingen, ble doseavhengige virkninger av forgiftning på synaptisk aktivitet målt 20 timer etter tilsetning av bont / A. Forgiftning med 0.005 pM bont / A resulterte i en betydelig minsk i mEPSCs, med en median inhiberende konsentrasjon (IC50) på 0,013 pM. Sammenligninger av median doser indikerer at funksjonelle målinger av synaptic hemming er raskere, mer konkret og mer sensitiv enn SNAREcleavage analyser eller musen letalitetsprøven. Disse data validere bruk av postsynaptisk kombinert, stamcelle-avledet nevroner for svært spesifikk og sensitiv påvisning av CNTs.
Det overordnede målet med denne metoden er å funksjonelt evaluere synaptisk aktivitet i nettverks kulturer av stamcelle-avledet nevroner utsatt for clostridial nervegifter. Dette er den første demonstrasjonen av en in vitro avledet modell som funksjonelt reproduserer pathophysiologies ansvarlige for kliniske manifestasjoner av botulisme og validerer ESNs som en egnet modell for påvisning av CNTs, terapeutisk screening og mekanistiske studier.
BoNTs er svært dødelige bakterie neurotoxins produsert av medlemmer av Clostridium arter. Inkludert den nylig foreslåtte Bont / H, har åtte antigenically distinkte Bont serotyper er beskrevet (/ A- / H) 1,2. Alle serotyper er uttrykt som 150 kDa peptidene som er post-translasjonelt bretter for å produsere en dichain sammensatt av et 100 kDa-tungkjede (HC) og en 50 kDa lettkjede (LC) forbundet med en disulfidbinding 3. HC medierer binding til presynaptiske reseptorer og entry av toksinet inn i nervecellen via synaptic endocytose. Under endosomale behandling, gjennomgår HC strukturell omorganisering for å danne en pore i vesikkelmembranen, legge til rette for translokasjon av LC i presynaptiske cytosol. LC da spesielt rettet mot og kløyver løselig N -ethylmaleimide følsomme fusjon vedlegg protein reseptor (SNARE) proteiner i den presynaptiske rommet: SNAP-25 (Bont / A, / C, / E), VAMP2 (Bont / B, / D, / F / G) eller syntaxin (bont / C) 1. Spalting av en hvilken som helst av disse SNARE proteiner forhindrer montering av synaptiske exocytose maskiner, for derved å blokkere neurotransmitterfrigjørelse. Denne kombinasjonen av effektive neuronal målretting og presynaptisk lokalisering gjengir BoNTs de mest potente kjente giftstoff, med estimerte humane letale doser så lave som 0,1 til 1 ng / kg 1.
Biokjemiske analyser kan bli anvendt for å detektere tilstedeværelse eller aktivitet av CNT LC'er med høy følsomhet. Imidlertid er disse metoder ikke klarer å interrogate evne til å binde toksinet, angir, aktivere og funksjon i nerveceller, og derfor er indirekte og eventuelt villedende mål på nærvær av aktivt toksin. I kontrast, funksjonelle analyser av rus som mus letalitetsprøven (MLA) grundig vurdere muligheten av CNTs å kunne forhandle alle faser av opptak og aktivisering, og gir mer relevante og konkrete vurderinger av toksin aktivitet. Mens MLA er gull-standarden på bont deteksjon, er det en in vivo metode som bruker død som et sluttpunkt, og har derfor begrenset anvendelse som et forskningsplattform. Forsøk på å utvikle cellebaserte modeller av CNT rus egnet for mekanistiske studier og terapeutisk screening har også lidd betydelige begrensninger. Mens primære nevronkulturer tilby en høy grad av fysiologisk betydning, er deres bruk kompliseres av en rekke faktorer, inkludert høy ressurs kost, relativt lavt utbytte, tilstedeværelse av multiple neuronal subtyper og omfattende regelverk og administrativ forglemmelse involvert med dyr bruk. Som et alternativ til primære neuroner, har nevrogene cellelinjer (som kan bli indusert til å adoptere neuron-lignende egenskaper ved kjemisk stimulering) som neuroblastomer og adrenale kromaffinceller blitt anvendt som in vitro-modeller av intoksikasjon. Siden disse cellene er dyrket kontinuerlig før induksjon, er de svært skalerbar, og derfor godt egnet for moderat gjennomstrømning tilnærminger. Imidlertid er deres relevans tvilsom siden induserte fenotyper er typisk heterogene, er dårlig følsomme for CNTs og ikke klarer å stille kritiske nevronale atferd, herunder manglende evne til å danne pre- og postsynaptiske avdelinger som settes sammen til fungerende synapser 4. I fravær av fysiologisk intakte presynaptiske avdelinger, hele spekteret av toksin: kan Nevron interaksjoner ikke bli kopiert og derfor funksjonelle målinger av beruselse er ikke mulig 5. Ikket overraskende, forsøk på å gjennomføre mekanistiske studier eller narkotika screening for BoNTs bruker indusert nevrogene cellelinjer har resultert i funn som er i strid med in vivo og primær nevroner studier 6.
Det har blitt foreslått at stamcelle-avledet sentralnervesystemet (CNS) nevroner kan gi neste generasjons cellebasert plattform for Bont forskning som kombinerer relevansen av primære nevroner med fleksibiliteten til dyrkede cellelinjer 7-10. Spesielt har musestamcelle-avledede nevroner (ESNs) blitt funnet å være meget følsom for fysiologiske doser av bont / A- / g og til å replikere i mange vivo responser til forgiftning, inkludert differensial persistences, aktivitet med forbedret rus og serotype -spesifikke potenser 5,8,11. Disse atferd tyder på at in vivo mekanismer for Bont opptak, prosessering, handel og aktivitet er konservert i ESNs. Imidlertid inhibering av synaptisk activity er signaturen manifestasjon av botulisme, og derfor viser et tap av synaptisk aktivitet etter forgiftning ved CNTs er viktig før de konkluderer med at ESNs er en passende in vitro avledet celle-basert modell for CNT studier.
For å måle effekten av rus med CNTs på synaptisk aktivitet, ble hel-celle patch-clamp elektrofysiologi brukes til å kvantifisere monosynaptisk strømninger i vehikkelbehandlede eller CNT-behandlet DIV 21 + ESNs. Vi fant ut at rus av ESNs med Bont / A- / G eller telt forårsaket> 95% tap av synaptisk aktivitet innen 20 timer i alle tilfeller. Ytterligere karakterisering utført 20 timer etter forgiftning med bont / A viste en doseavhengig effekt på synaptisk aktivitet med en deteksjonsgrense på under 0.005 pM og en IC50-verdi på 0,013 pM. Disse funnene tyder på at følsomheten og tidsramme for elektrofysiologisk registrering av rus er betydelig forbedret i forhold til sammenlignbare immunoblot-baserte analyserer av SNAP-25 cleavage og in vivo-mus dødelighet analyser, som viser at funksjonelle målinger av rus i postsynaptisk aktive nevroner kulturer kan bidra til mer sensitive, spesifikke og raske metoder for å karakterisere den cellulære responsen til Bont.
Dagens gullstandard for CNT deteksjon, serotype besluttsomhet og kvantifisering er MLA. MLA interrogates hele bredden av verts: toksin interaksjoner som er nødvendige for forgiftning forekommer in vivo (f.eks toksin binding til en celleoverflatereseptor, internalisering av toksinet-reseptor-komplekset, LC translokasjon inn i cytoplasma, LC-formidlet kløyving av substrat og hemming av synaptiske nerveoverføringer) 18. Men selv om MLA tilbyr en fysiologisk relevant modell av rus, er det ressurskrevende, kan bli gjort til skamme av forurensninger og involverer et stort antall mus med døden som et endepunkt. Alternativt har cellebaserte assayer for påvisning og kvantifisering bont vært begrenset til primære nevronkulturer, noe som også krever bruk av dyr, eller for å neuroblastom-cellelinjene, som ikke klarer å danne synapser og typisk oppviser dårlig følsomhet overfor neurotoksiner 8. Hittil har de fleste målinger av rus i thESE celle-baserte plattformer har stolt på påvisning av proteolytisk spalting av SNAP-25, VAMP1 / 2 eller syntaxin-1 11. Dette er problematisk, fordi SNARE protein spalting er blitt vist å være ikke-lineært forbundet med synaptisk inhibering in vivo, og kan derfor ikke nøyaktig representerer forgiftning eller utvinning fra forgiftning 19,20.
En ideell cellebasert modellsystem for deteksjon ville CNT (i) være neuron-baserte; (Ii) være postsynaptisk kombinert med neurotypic elektriske svar; (Iii) være svært følsom for alle CNT serotyper eller undertyper; og (iv) tilbyr skalerbarhet, gjennomstrømming og analyse tider som er lik eller bedre enn den MLA, til en lavere kostnad, og uten å kreve bruk av dyr. For å møte disse kravene, har vi utviklet en metode for å produsere store mengder høyanriket, nettverksbaserte kulturer av glutamaterg og gabaergic nevroner fra kommersielt tilgjengelige mus ESC linjer. Vi deretter utviklet MIST analyse for å kvantifiseresynaptic hemming som svar på forgiftning med telt og Bont / A- / G. Mens MIST analysen kan gjennomføres på noen postsynaptisk aktiv nevron befolkningen (f.eks primære nevroner eller hjerneskiver), for tiden ESNs er de eneste in vitro avledet nevron modell som reproduserbart utvikler framnettverks atferd og er derfor egnet for MIST analysen.
Produsere tilstrekkelige mengder av nevroner av definert avstamning for CNT studier kreves flere nyvinninger i ESC kultur og differensiering. Først, ved å velge for og dyrke ESCs som kan overleve suspensjon-tilpasning, elimineres vi muligheten for forurensning av feeder-celler og behovet for å rense mateceller fra ESCs ved starten av differensieringen. Selv om de molekylære mekanismene bak suspensjon-tilpasning er ukjent, suspensjon-tilpasset ESCs forbli mitotisk aktiv, beholde Oct3 / 4 uttrykk og fortsette å være nevrogen. Ved hjelp av denne metoden, ~ 1,5 x 10 7 ESentre er vanligvis utvinnes hver passering. Sekund, produksjon av NPCer ble økt ~ 300% ved å innlemme mekanisk agitasjon for å hindre tettbebyggelse under differensiering, tilsynelatende økende næringsstoff tilgjengelighet til interiøret av aggregater. I løpet av prosessen, fant vi at serum brukes for ESC kultur og nevronale differensiering er den mest kritiske komponenten i å opprettholde nevrogene ESCs. For best suksess, anbefaler vi suspensjon tilpasse ES-celler til hvert parti av serum og lagring serum ved -20 ° C for å støtte ESC kultur og nevronale differensiering gjennom utløpsdatoen.
Som med de fleste postsynaptisk aktive kulturer, DIV 14 + ESNs er svært utsatt for brå endringer i pH, og selv en kort eksponering for atmosfærisk CO 2 konsentrasjoner kan føre til nevro innen 24 timer. For eksperimentene som krever behandling av kulturer fulgt av inkubasjoner med varighet O / N eller lenger, nevroner bør behandles direkte in inkubatoren eller overføres til en konstant CO 2 kammer før eksperimentering.
En rekke forskjellige teknikker bekreftet nevrogenesen og neuronal modning, inkludert ICC, transkripsjonen profilering og hel-celle-patch-clamp elektrofysiologi. Tidsmessige endringer i genuttrykk og neuron morfologi var i samsvar med en rask progresjon gjennom utviklingsstadier av neurogenesis, og av DIV 16, ESNs utstilt eksitatoriske og hemmende miniatyr postsynaptiske strømninger som utvikler nettverk Adferd 16. Bevis på synaptisk aktivitet antydet at ESNs kan gjenskape pathophysiologies ansvarlige for de kliniske manifestasjoner av botulisme og stivkrampe. Dette ble bekreftet ved hjelp av MIST å vise at rus med Bont / A- / G eller telt svekket mEPSC frekvenser ved> 95% sammenlignet med placebobehandlede eller ubehandlede nevroner.
Målinger av følsomheten av tåke for bont / A indikerte en midlere inhiberendekonsentrasjon (IC50) av 0,013 pM (tilsvarende 0,5 mus dødelige enheter / ml) og en ramme-for-påvisning under 0.005 pM, målt ved 20 timer etter tilsetning bad. Basert på disse verdiene, er MIST omtrent dobbelt så følsom som og 2 – 4 ganger raskere enn den MLA og 30 ganger mer følsom enn immunoblot-basert gjenkjenning av kløyvde SNAP-25.
Sammen er disse dataene antyder at bestander av stamcelle-avledet nevroner nettverk tilbyr en fysiologisk relevant, cellebasert modell av beruselse. I kombinasjon med forbedrede metoder for å utlede nettverks ESN kulturer fra suspensjon tilpassede ESCs, bør bruk av MIST redusere behovet for dyreforsøk og de tilhørende ulemper, kostnader og etiske bekymringene til MLA samtidig som det gir en mer hurtig, sensitiv og spesifikk mål på beruselse. Selv hel-celle patch-clamp elektrofysiologi er en lav-throughput metode for å identifisere tilstedeværelsen av aktive nervegifter, og tilbyr en oppløsning og speed som er uoppnåelig bruker molekylære metoder. Disse funn gir også bevis for at anvendelsen av aktivitetsavhengige metoder for å evaluere synaptisk aktivitet og nettverks oppførsel kan muliggjøre rask og spesifikk påvisning av nervegifter. Slike høyere throughput tilnærminger ville gjøre mekanistiske studier, terapeutisk screening eller diagnostiske analyser gjennomførbare for et bredt spekter av neuromodulatory agenter, inkludert CNTs.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble finansiert av National Institutes of Health National Institute of Allergy og smittsomme sykdommer (IAA nummer AOD12058-0001-0000) og Forsvars Threat Reduction Agency – Joint Science and Technology Office Medical S & T Division (stipend tall CBM.THRTOX.01.10 .RC.023 og CBM.THRTOX.01.RC.014). Denne forskningen ble utført mens PB holdt en Defense Threat Reduction Agency-National Research Council Forskning Associateship Award og KH holdt en National Research Council Forskning Associateship Award. Vi takker Angela Adkins og Kaylie Tuznik (USAMRICD) for teknisk assistanse; og Cindy Kronman (USAMRICD) for redaksjonell bistand. Synspunktene i denne artikkelen er de av forfatterne, og reflekterer ikke den offisielle politikk ved Institutt for Hæren, Department of Defense, eller den amerikanske regjeringen.
Table 1. ESC and ESN | ||||
Knockout DMEM | Life Technologies | 10829-018 | Media: ESC culture medium Formulation and notes: 500 mL |
|
100x MEM NEAA | Life Technologies | 11140-050 | Media: store at 4 °C for up to 1 month Formulation and notes: 6 mL |
|
200 mM L-Alanyl-L-Glutamine | ATCC | 30-2115 | 6 mL | |
ES qualified FBS | Applied Stem Cell | ASM-5007 | 90 mL | |
100x antibiotics | Sigma-Aldrich | A5955 | 3 mL | |
55 mM 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | 1.1 mL | |
107 Units/mL LIF | Millipore | ESG1107 | 60 μL | |
Knockout DMEM | Life Technologies | 10829-018 | Media: ESC differentiation medium Formulation and notes: 436.6 mL |
|
100x MEM NEAA | Life Technologies | 11140-050 | Media: store at 4 °C for up to 1 month Formulation and notes: 5 mL |
|
200 mM L-Alanyl-L-Glutamine | ATCC | 30-2115 | 5 mL | |
ESC-qualified serum | Applied Stem Cell | ASM-5007 | 50 mL | |
100x antibiotics | Sigma-Aldrich | A5955 | 2.5 mL | |
55 mM 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | 0.9 mL | |
Dulbecco's PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | Media: NPC trypsinization medium Formulation and notes: 100 mL |
|
0.5 M EDTA (18.3%) | Sigma-Aldrich | 3690 | Media: freeze in 5 mL aliquote Formulation and notes: 0.266 mL |
|
Trypsin | Sigma-Aldrich | T8802 | 50 mg | |
Polyethyleneimine (PEI) | Sigma-Aldrich | P3143 | Media: Surface coating solutions Formulation and notes: 2.5 µg/mL in H20 |
|
Poly-D-lysine (PDL) | Sigma-Aldrich | P7280 | Media: use within 1 wk Formulation and notes: 100 µg/mL in H20 |
|
Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | 5 µg/mL in H20 | |
DMEM/F12 + GlutaMAX | Life Technologies | 10565-018 | Media: NPC culture medium Formulation and notes: 492.5 mL |
|
100x N2 vitamins | Life Technologies | 17502-048 | Media: store at 4 °C for up to 1 month Formulation and notes: 5 mL |
|
100x antibiotics | Sigma-Aldrich | A5955 | 2.5 mL | |
Neurobasal A | Life Technologies | 10888-022 | Media: ESN culture medium Formulation and notes: 482.5 mL |
|
50x B27 vitamins | Life Technologies | 17504-044 | Media: store at 4 °C for up 1 month Formulation and notes: 10 mL |
|
200 mM L-Alanyl-L-Glutamine | ATCC | 30-2115 | 5 mL | |
100x antibiotics | Sigma-Aldrich | A5955 | 2.5 mL | |
5-fluoro-2'-deoxyuridine (5FDU) | Sigma-Aldrich | F0503 | Media: 2000x Mitotic inhibitors aliquot and store at -20 °C Formulation and notes: dd 150 mg 5FDU and 350 mg uridine to 10 mL Neurobasal A. Sterile filter, aliquot and freeze. Use 2000x in ESN culture medium. |
|
Uridine | Sigma-Aldrich | U3003 | ||
TrypLE Express Trypsin | Life Technologies | 12605-010 | Media: Miscellaneous Formulation and notes: store at RT |
|
DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | store at RT | |
soybean trypsin inhibitor (STI) | Sigma-Aldrich | T6414 | store at -20 °C | |
ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | store at RT | |
ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4403 | Prepare 100 mM stock by dissolving 100 mg ascorbic acid in 5.7 mL of 50:50 DMSO/ethanol mix. | |
retinoic acid (RA) | Sigma-Aldrich | R2625 | Resuspend 15 mg RA in 9 mL 50:50 DMSO/ethanol. Supplement with 1 mL of 100 mM ascorbic acid stock. Aliquot and stored at -80 °C. Stable for 6 mos. | |
Table 2. MIST | ||||
NaCl | Sigma-Aldrich | 71386 | Media: Extracellular Recording Buffer Final Concentration (mM): 58.44 MW: 140 |
|
KCl | Sigma-Aldrich | 60135 | Media: (ERB; pH = 7.3, 315 mO) Final Concentration (mM): 74.56 MW: 3.5 |
|
NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S3139 | Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo. Final Concentration (mM): 119.98 MW: 1.25 |
|
CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21115 | Final Concentration (mM): 110.98 MW: 2 |
|
MgCl2 | Sigma-Aldrich | 63069 | Final Concentration (mM): 95.21 MW: 1 |
|
D-glucose | Sigma-Aldrich | G8644 | Final Concentration (mM): 180.16 MW: 10 |
|
HEPES | Sigma-Aldrich | H0887 | Final Concentration (mM): 238.3 MW: 10 |
|
K-gluconate | Sigma-Aldrich | P1847 | Media: Intracellular Recording Buffer Final Concentration (mM): 234.5 MW: 140 |
|
NaCl | Sigma-Aldrich | 71386 | Media: (IRB; pH = 7.3, 320 mO) Final Concentration (mM): 58.44 MW: 5 |
|
Mg-ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo. Final Concentration (mM): 507.18 MW: 2 |
|
Li-GTP | Sigma-Aldrich | G5884 | Final Concentration (mM): 523.18 MW: 0.5 |
|
CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21115 | Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo. Final Concentration (mM): 110.98 MW: 0.1 |
|
MgCl2 | Sigma-Aldrich | 63069 | Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo. Final Concentration (mM): 95.21 MW: 1 |
|
EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | 380.35 | Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo. Final Concentration (mM): 380.35 MW: 1 |
HEPES | Sigma-Aldrich | H0887 | Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo. Final Concentration (mM): 238.3 MW: 10 |
|
bicuculline | Tocris | 131 | Media: Miscellaneous Final Concentration (mM): 0.01 MW: 417.85 |
|
CNQX | Sigma-Aldrich | C239 | Final Concentration (mM): 0.01 MW: 276.12 |
|
Tetrodotoxin | Sigma-Aldrich | A8001 | Final Concentration (mM): 0.005 MW: 645.74 |
|
BoNT/A-/G | Metabiologics | N/A | Media: Final Concentration (mM): TBD MW: 150,000 |
|
Tetanus toxin | Sigma-Aldrich | T3194 | Final Concentration (mM): TBD MW: 150,000 |
|
Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL-2 | Final Concentration (mM): N/A MW: N/A |
|
Table 3. Equipment and Software | ||||
MiniAnalysis (version 6.0.7) | Synaptosoft, Inc. | N/A | Event detection software | |
Igor Pro (version 6.22A) | WaveMetrics | N/A | Software for visualization of recordings | |
Patchmaster | Heka | N/A | Data acquisition software | |
Olympus IX51 inverted microscope | Olympus | N/A | ||
micromanipulator | Sutter Instrument | MPC-365 | ||
patch-clamp amplifier | Heka | ECB10USB | ||
micropipette puller | Sutter Instrument | P-1000 | ||
borosilicate capillary tubes | Sutter Instrument | B150-86-10 | Corning 7740 | |
18 mm glass coverslips | Fisher | 12-545-84 | ||
plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | ||
cell strainer (40 µm) | Fisher | 08-771-1 | ||
Stovall Belly Dancer Shaker | Fisher | 15-453-211 | ||
low adhesion dishes | Fisher | 05-539-101 | Corning 3262 | |
bacterial dishes | VWR | 25384-302 | 100 x 15 mm |