A custom protocol is described to differentiate mouse ES cells into defined populations of highly pure neurons exhibiting functioning synapses and emergent network behavior. Electrophysiological analysis demonstrates the loss of synaptic transmission following exposure to botulinum neurotoxin serotypes /A-/G and tetanus neurotoxin.
Terapeutiske og mekanistiske studier af præsynaptisk målrettede clostridielle nervegifte (CNTs) er blevet begrænset af behovet for en skalerbar, celle-baserede model, der producerer fungerende synapser og gennemgår fysiologiske reaktioner på forgiftning. Her beskriver vi en enkel og robust metode til effektivt at differentiere murine embryonale stamceller (EKSF) i definerede slægter af synaptisk aktive, netværksbaserede neuroner. Efter en 8 dages differentiering protokol, mus embryonale stamceller-afledte neuroner (ESNs) hurtigt udtrykke og inddeler neurotypic proteiner, danner neuronale morfologi og udvikle iboende elektriske reaktioner. Med 18 dage efter differentiering (DIV 18), ESNs udviser aktiv glutamaterge og γ-aminosmørsyre (GABA) erge synapser og adfærd emergent netværk kendetegnet ved en excitatorisk: hæmmende balance. For at bestemme om forgiftning med CNTs funktionelt antagoniserer synaptic neurotransmission og derved replikerende the in vivo patofysiologi, der er ansvarlig for de kliniske manifestationer af botulisme eller tetanus blev helcelle-patch clamp elektrofysiologi anvendes til at kvantificere spontane miniature excitatoriske postsynaptiske strømme (mEPSCs) i ESNs udsat for tetanusneurotoksin (telt) eller botulinum neurotoksin (BoNT) serotyper / A- / G. I alle tilfælde udviste ESNs næsten fuldstændig tab af synaptisk aktivitet inden for 20 timer. Berusede neuroner forblev levedygtige, hvilket fremgår af uændrede hvilende membran potentialer og iboende elektriske reaktioner. For yderligere at karakterisere følsomheden af denne tilgang, var dosisafhængige virkninger af forgiftning på synaptisk aktivitet målt 20 timer efter tilsætning af BoNT / A. Forgiftning med 0,005 pM BoNT / A resulterede i en signifikant dekrement i mEPSCs, med en median hæmmende koncentration (IC50) af 0,013 pM. Sammenligninger af median doser viser, at funktionelle målinger af synaptisk hæmning er hurtigere, mere specifikke og mere følsomme end SNAREspaltningsanalyser eller musen letalitet assay. Disse data validere anvendelse af synaptisk koblet stamceller afledt neuroner for den meget specifikke og følsomme påvisning af CNTs.
Det overordnede mål med denne metode er at funktionelt evaluere synaptisk aktivitet i netbaserede kulturer af stamceller celleafledte neuroner udsat for clostridiale nervegifte. Dette er den første demonstration af en in vitro afledt model, funktionelt replikerer de patofysiologier ansvarlige for kliniske manifestationer af botulisme og validerer ESNs som en passende model til påvisning af CNTs, terapeutisk screening og mekanistiske undersøgelser.
BoNTs er meget dødelige bakterielle neurotoxiner produceret af medlemmer af Clostridium arter. Herunder den nyligt foreslåede BoNT / H er otte antigent forskellige BoNT serotyper blevet beskrevet (/ A- / H) 1,2. Alle serotyper er udtrykt som 150 kDa peptider, som er posttranslationelt nicked at frembringe en dichain består af en 100 kDa tung kæde (HC) og en 50 kDa let kæde (LC) forbundet af en disulfidbinding 3. HC medierer binding til præsynaptiske receptorer og entRy af toksinet ind i neuron via synaptiske endocytose. Under endosomal behandling, HC undergår strukturelle omorganisering for at danne en pore i vesikelmembranen lette translokation af LC i den præsynaptiske cytosol. LC derefter specifikt mål og spalter opløselig N -ethylmaleimide-sensitive binding fusionsprotein receptor (SNARE) proteiner i præsynaptiske rum: SNAP-25 (BoNT / A, / C, / E), VAMP2 (BoNT / B, / D, / F, / G) eller syntaxin (BoNT / C) 1. Spaltning af nogen af disse SNARE proteiner forhindrer samling af den synaptiske exocytose maskiner derved blokerer neurotransmitterfrigivelse. Denne kombination af effektiv neuronal målretning og præsynaptiske lokalisering gør BoNTs de mest potente giftstoffer kendte med skønnede humane dødelige doser helt ned til 0,1-1 ng / kg 1..
Biokemiske assays kan anvendes til at detektere tilstedeværelsen eller aktiviteten af CNT LC'ere med høj følsomhed. Men disse metoder ikke interrogate evne toksin til at binde, indtaste, aktivere og funktion i neuroner, og derfor er indirekte og muligvis vildledende foranstaltninger af tilstedeværelsen af aktivt toksin. Derimod funktionelle assays på forgiftning, såsom mus dødelighed assay (MLA) omfattende evaluering evne CNTs at kunne forhandle alle faser af optagelse og aktivering, der giver mere relevante og konkrete vurderinger af toksin aktivitet. Mens MLA er guld-standard for BoNT afsløring, det er en in vivo metode, der bruger døden som et endepunkt og har derfor begrænset anvendelighed som en forskningsplatform. Forsøg på at udvikle cellebaserede modeller af CNT forgiftning egnet til mekanistiske undersøgelser og terapeutiske screening har også lidt betydelige begrænsninger. Mens primære neuron kulturer giver en høj grad af fysiologisk relevans, er deres anvendelse kompliceres af en række faktorer, herunder høj ressource omkostninger, relativt lavt udbytte, tilstedeværelsen af multiple neuronal subtyper og omfattende lovgivningsmæssige og administrative tilsyn involveret med brug af dyr. Som et alternativ til de primære neuroner har neurogene cellelinier (som kan induceres til at vedtage neuron-lignende egenskaber ved kemisk stimulation), såsom neuroblastomer og adrenale chromaffinceller blevet anvendt som in vitro-modeller af forgiftning. Da disse celler kontinuerligt dyrket før induktion, er de meget skalerbar og derfor velegnet til moderat gennemløb tilgange. Men deres relevans er tvivlsom, da inducerede fænotyper er typisk heterogene, er dårligt følsomme over for CNTs og undlader at udvise kritiske neuronale adfærd, herunder manglende evne til at danne præ- og post-synaptiske rum, der samler til fungerende synapser 4. I mangel af fysiologisk intakte præsynaptiske rum, hele spektret af toksin: kan neuron interaktioner ikke blive gentaget, og derfor funktionelle målinger af forgiftning er ikke muligt 5. Ingent overraskende, forsøger at gennemføre mekanistiske undersøgelser eller narkotika screening for BoNTs hjælp af inducerede neurogene cellelinjer har resulteret i fund, der er uforenelige med in vivo og primære neuron undersøgelser 6.
Det er blevet foreslået, at stamceller afledt centrale nervesystem (CNS) neuroner kan tilvejebringe en næste generation cellebaseret platform for BoNT forskning, der kombinerer relevansen af primære neuroner med fleksibiliteten af dyrkede cellelinier 7-10. Især har muse stamceller celleafledte neuroner (ESNs) vist sig at være meget følsomme over for fysiologiske doser af BoNT / A / G og at replikere mange in vivo respons på forgiftning, herunder differentierede persistences, aktivitet forbedret forgiftning, og serotype -specifikke potenser 5,8,11. Disse adfærdsmønstre tyder på, at in vivo mekanismer BoNT optagelse, behandling, handel og aktivitet er konserveret i ESNs. Men hæmning af synaptisk Aktivitety er signaturen manifestation af botulisme, og dermed demonstrerer et tab af synaptisk aktivitet efter forgiftning af CNTs er afgørende før den konkluderede, at ESNs er en egnet in vitro afledt celle-baserede model for CNT studier.
For at måle effekten af forgiftning med CNTs på synaptisk aktivitet, blev hel-celle patch-clamp elektrofysiologi anvendes til at kvantificere monosynaptiske strømninger i bærerbehandlede eller CNT-behandlede DIV 21 + ESNs. Vi fandt, at forgiftning af ESNs med BoNT / A- / G eller telt forårsagede> 95% tab af synaptisk aktivitet inden 20 timer i alle tilfælde. Yderligere karakterisering udført 20 timer efter forgiftning med BoNT / A viste en dosisafhængig effekt på synaptisk aktivitet, med en detektionsgrænse under 0,005 pM og en IC50 værdi på 0,013 pM. Disse resultater viser, at følsomheden og tidsramme for elektrofysiologisk påvisning af forgiftning betydeligt forbedres i løbet af sammenlignelig immunoblot-baserede anaaf re- duktion af SNAP-25 spaltning og in vivo mus letalitet assays, der viser, at funktionelle målinger af forgiftning i synaptisk aktive neuron kulturer kan fremme mere følsomme, specifikke og hurtige metoder til at karakterisere den cellulære respons på BoNT.
Den nuværende gold standard for CNT afsløring, serotype beslutsomhed og kvantificering er MLA. MLA forespørger hele spektret af vært: toksin interaktioner er nødvendige for forgiftning at forekomme in vivo (fx toksin binding til en celleoverfladereceptor, internalisering af toxin-receptor-komplekset, LC translokation til cytoplasmaet, LC-medieret spaltning af substrat og inhibering af synaptisk neurotransmission) 18. Selv om MLA tilbyder en fysiologisk relevant model for forgiftning, er det imidlertid ressourcekrævende, kan blive beskæmmet af forurenende stoffer og involverer et stort antal mus med døden som et slutpunkt. Alternativt er cellebaserede assays for BoNT detektion og kvantificering været begrænset til primære neuron kulturer, som også kræver brug af dyr, eller neuroblastom-cellelinier, som ikke danner synapser og typisk udviser ringe følsomhed for neurotoksiner 8. Hidtil har de fleste målinger af forgiftning i thESE cellebaserede platforme har påberåbt sig påvisning af den proteolytiske spaltning af SNAP-25, VAMP1 / 2 eller syntaxin-1 11. Dette er problematisk, fordi SNARE protein spaltning har vist sig at være ikke-lineært forbundet med synaptisk hæmning in vivo og kan derfor ikke præcist repræsentere beruselse eller nyttiggørelse fra forgiftning 19,20.
En ideel cellebaseret modelsystem for CNT detektion ville (I) neuron-baserede; (Ii) være synaptisk kombineret med neurotypic elektriske reaktioner; (Iii) være meget følsomme over for alle CNT serotyper eller subtyper; og (iv) tilbyde skalerbarhed, gennemløb og assay gange, der svarer til eller forbedret i løbet af MLA, til en lavere pris, og uden at kræve anvendelsen af dyr. For at opfylde disse krav, har vi udviklet en metode til at producere store mængder af højt beriget, netværksbaserede kulturer af glutamaterge og GABAerge neuroner fra kommercielt tilgængelige mus ØSU linjer. Vi derefter udviklede tågen assay at kvantificeresynaptisk hæmning som reaktion på forgiftning med telt og BoNT / A- / G. Mens kan gennemføres dug analysen på en synaptisk aktiv neuron befolkning (fx primære neuroner eller hjerneskiver), i øjeblikket ESNs er de eneste in vitro afledt neuron model, reproducerbart udvikler emergente netværk adfærd og er derfor hensigtsmæssigt, at tågen analysen.
Producerer tilstrækkelige mængder af neuroner i definerede afstamning for CNT undersøgelser krævede flere nyskabelser i ESC kultur og differentiering. Først ved at selektere for og dyrkning ESC, der kan overleve suspension-tilpasning, vi eliminerede muligheden for forurening med fødeceller og behovet for at oprense fødeceller fra ESC i starten af differentiering. Selvom de molekylære mekanismer bag suspension-tilpasning er ukendte, suspension-tilpassede økonomiske og sociale råd forbliver mitotisk aktive, bevarer Oct3 / 4-ekspression og fortsat være neurogen. Ved hjælp af denne metode, ~ 1,5 x 10 7 ESC'er typisk udvindes hver passage. For det andet blev produktionen af NPC'ere steg ~ 300% ved at indarbejde mekanisk omrøring for at forhindre agglomerering under differentiering, angiveligt stigende næringsstof tilgængelighed til det indvendige af aggregater. Under processen, fandt vi, at serum anvendes til ESC kultur og neuronal differentiering er den mest kritiske komponent i at bevare neurogene økonomiske og sociale råd. For bedst succes, anbefaler vi suspension tilpasning ES-celler til hvert parti af serum og lageropbygning serum ved -20 ° C for at støtte ESC kultur og neuronal differentiering gennem udløbsdatoen.
Som med de fleste synaptisk aktive kulturer, DIV 14 + ESNs er meget modtagelige for pludselige ændringer i pH, og endda en kort udsættelse for atmosfærisk CO 2 koncentrationer kan medføre neurotoksicitet indenfor 24 timer. For eksperimenter, der kræver behandling af kulturer efterfulgt af inkubationer varige O / N eller længere, neuroner bør behandles direkte in inkubatoren eller overføres til en konstant CO 2 kammer før eksperimenteren.
En række teknikker bekræftet neurogenese og neuronal modning, herunder ICC, transkriptionel profilering og helcelle-patch-clamp elektrofysiologi. Permanente ændringer i genekspression og neuron morfologi var i overensstemmelse med en hurtig progression gennem de udviklingsmæssige stadier af neurogenese og ved DIV 16, ESNs udstillede stimulerende og hæmmende miniature postsynaptiske strømninger med emergent netværk adfærd i 16. Bevis for synaptisk aktivitet foreslået, at ESNs kan kopiere patofysiologier ansvarlige for de kliniske manifestationer af botulisme og stivkrampe. Dette blev bekræftet ved hjælp af MIST at vise, at forgiftning med BoNT / A- / G eller telt forringet mEPSC frekvenser> 95% i forhold til bærerbehandlede eller ubehandlede neuroner.
Målinger af følsomhed MIST for BoNT / A viste en median hæmmendekoncentration (IC 50) af 0,013 pM (svarende til 0,5 muse dødbringende enheder / ml) og en grænse-of-detektion under 0,005 pM, målt ved 20 timer efter bad tilsætning. Baseret på disse værdier, Dis er omtrent dobbelt så følsom som og 2 – 4 gange hurtigere end MLA og 30-fold mere følsom end immunoblot-baserede påvisning af spaltet SNAP-25.
Kollektivt antyder disse data, at netværksforbundne populationer af stamceller celleafledte neuroner tilbyder en fysiologisk relevant, celle-baserede model for forgiftning. I kombination med forbedrede metoder til at udlede netværksbaserede ESN kulturer fra suspension-tilpassede økonomiske og sociale råd bør anvendelsen af tåge reducere behovet for dyreforsøg og de dermed forbundne ulemper, omkostninger og etiske bekymringer MLA samtidig give en mere hurtig, følsom og specifik foranstaltning af forgiftning. Selvom hel-celle patch-clamp elektrofysiologi er en low-throughput metode til at identificere tilstedeværelsen af aktive nervegifte, det giver en opløsning og speed, der er uopnåeligt med molekylære metoder. Disse resultater også dokumentere, at anvendelsen af aktivitet-afhængige metoder til at evaluere synaptisk aktivitet og netværk adfærd kan gøre det muligt hurtigt og specifik påvisning af nervegifte. Sådanne højere throughput metoder ville gøre mekanistiske undersøgelser, terapeutisk screening eller diagnostiske analyser muligt for en bred vifte af neuromodulatory midler, herunder CNTs.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev finansieret af National Institutes of Health National Institute of Allergy og infektionssygdomme (IAA nummer AOD12058-0001-0000) og Defense Threat Reduction Agency – Fælles for Videnskab og Teknologi Office, Medicinsk S & T Division (tal tilskud CBM.THRTOX.01.10 .RC.023 og CBM.THRTOX.01.RC.014). Denne forskning blev udført, mens PB holdt et Defense Threat Reduction Agency-National Research Council Research Associateship Award og KH afholdt en National Research Council Research Associateship Award. Vi takker Angela Adkins og Kaylie Tuznik (USAMRICD) til teknisk bistand; og Cindy Kronman (USAMRICD) til redaktionel assistance. Synspunkterne i denne artikel er forfatternes og afspejler ikke den officielle politik for Institut for hæren, Department of Defense, eller den amerikanske regering.
Table 1. ESC and ESN | ||||
Knockout DMEM | Life Technologies | 10829-018 | Media: ESC culture medium Formulation and notes: 500 mL |
|
100x MEM NEAA | Life Technologies | 11140-050 | Media: store at 4 °C for up to 1 month Formulation and notes: 6 mL |
|
200 mM L-Alanyl-L-Glutamine | ATCC | 30-2115 | 6 mL | |
ES qualified FBS | Applied Stem Cell | ASM-5007 | 90 mL | |
100x antibiotics | Sigma-Aldrich | A5955 | 3 mL | |
55 mM 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | 1.1 mL | |
107 Units/mL LIF | Millipore | ESG1107 | 60 μL | |
Knockout DMEM | Life Technologies | 10829-018 | Media: ESC differentiation medium Formulation and notes: 436.6 mL |
|
100x MEM NEAA | Life Technologies | 11140-050 | Media: store at 4 °C for up to 1 month Formulation and notes: 5 mL |
|
200 mM L-Alanyl-L-Glutamine | ATCC | 30-2115 | 5 mL | |
ESC-qualified serum | Applied Stem Cell | ASM-5007 | 50 mL | |
100x antibiotics | Sigma-Aldrich | A5955 | 2.5 mL | |
55 mM 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | 0.9 mL | |
Dulbecco's PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | Media: NPC trypsinization medium Formulation and notes: 100 mL |
|
0.5 M EDTA (18.3%) | Sigma-Aldrich | 3690 | Media: freeze in 5 mL aliquote Formulation and notes: 0.266 mL |
|
Trypsin | Sigma-Aldrich | T8802 | 50 mg | |
Polyethyleneimine (PEI) | Sigma-Aldrich | P3143 | Media: Surface coating solutions Formulation and notes: 2.5 µg/mL in H20 |
|
Poly-D-lysine (PDL) | Sigma-Aldrich | P7280 | Media: use within 1 wk Formulation and notes: 100 µg/mL in H20 |
|
Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | 5 µg/mL in H20 | |
DMEM/F12 + GlutaMAX | Life Technologies | 10565-018 | Media: NPC culture medium Formulation and notes: 492.5 mL |
|
100x N2 vitamins | Life Technologies | 17502-048 | Media: store at 4 °C for up to 1 month Formulation and notes: 5 mL |
|
100x antibiotics | Sigma-Aldrich | A5955 | 2.5 mL | |
Neurobasal A | Life Technologies | 10888-022 | Media: ESN culture medium Formulation and notes: 482.5 mL |
|
50x B27 vitamins | Life Technologies | 17504-044 | Media: store at 4 °C for up 1 month Formulation and notes: 10 mL |
|
200 mM L-Alanyl-L-Glutamine | ATCC | 30-2115 | 5 mL | |
100x antibiotics | Sigma-Aldrich | A5955 | 2.5 mL | |
5-fluoro-2'-deoxyuridine (5FDU) | Sigma-Aldrich | F0503 | Media: 2000x Mitotic inhibitors aliquot and store at -20 °C Formulation and notes: dd 150 mg 5FDU and 350 mg uridine to 10 mL Neurobasal A. Sterile filter, aliquot and freeze. Use 2000x in ESN culture medium. |
|
Uridine | Sigma-Aldrich | U3003 | ||
TrypLE Express Trypsin | Life Technologies | 12605-010 | Media: Miscellaneous Formulation and notes: store at RT |
|
DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | store at RT | |
soybean trypsin inhibitor (STI) | Sigma-Aldrich | T6414 | store at -20 °C | |
ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | store at RT | |
ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4403 | Prepare 100 mM stock by dissolving 100 mg ascorbic acid in 5.7 mL of 50:50 DMSO/ethanol mix. | |
retinoic acid (RA) | Sigma-Aldrich | R2625 | Resuspend 15 mg RA in 9 mL 50:50 DMSO/ethanol. Supplement with 1 mL of 100 mM ascorbic acid stock. Aliquot and stored at -80 °C. Stable for 6 mos. | |
Table 2. MIST | ||||
NaCl | Sigma-Aldrich | 71386 | Media: Extracellular Recording Buffer Final Concentration (mM): 58.44 MW: 140 |
|
KCl | Sigma-Aldrich | 60135 | Media: (ERB; pH = 7.3, 315 mO) Final Concentration (mM): 74.56 MW: 3.5 |
|
NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S3139 | Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo. Final Concentration (mM): 119.98 MW: 1.25 |
|
CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21115 | Final Concentration (mM): 110.98 MW: 2 |
|
MgCl2 | Sigma-Aldrich | 63069 | Final Concentration (mM): 95.21 MW: 1 |
|
D-glucose | Sigma-Aldrich | G8644 | Final Concentration (mM): 180.16 MW: 10 |
|
HEPES | Sigma-Aldrich | H0887 | Final Concentration (mM): 238.3 MW: 10 |
|
K-gluconate | Sigma-Aldrich | P1847 | Media: Intracellular Recording Buffer Final Concentration (mM): 234.5 MW: 140 |
|
NaCl | Sigma-Aldrich | 71386 | Media: (IRB; pH = 7.3, 320 mO) Final Concentration (mM): 58.44 MW: 5 |
|
Mg-ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo. Final Concentration (mM): 507.18 MW: 2 |
|
Li-GTP | Sigma-Aldrich | G5884 | Final Concentration (mM): 523.18 MW: 0.5 |
|
CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21115 | Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo. Final Concentration (mM): 110.98 MW: 0.1 |
|
MgCl2 | Sigma-Aldrich | 63069 | Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo. Final Concentration (mM): 95.21 MW: 1 |
|
EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | 380.35 | Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo. Final Concentration (mM): 380.35 MW: 1 |
HEPES | Sigma-Aldrich | H0887 | Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo. Final Concentration (mM): 238.3 MW: 10 |
|
bicuculline | Tocris | 131 | Media: Miscellaneous Final Concentration (mM): 0.01 MW: 417.85 |
|
CNQX | Sigma-Aldrich | C239 | Final Concentration (mM): 0.01 MW: 276.12 |
|
Tetrodotoxin | Sigma-Aldrich | A8001 | Final Concentration (mM): 0.005 MW: 645.74 |
|
BoNT/A-/G | Metabiologics | N/A | Media: Final Concentration (mM): TBD MW: 150,000 |
|
Tetanus toxin | Sigma-Aldrich | T3194 | Final Concentration (mM): TBD MW: 150,000 |
|
Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL-2 | Final Concentration (mM): N/A MW: N/A |
|
Table 3. Equipment and Software | ||||
MiniAnalysis (version 6.0.7) | Synaptosoft, Inc. | N/A | Event detection software | |
Igor Pro (version 6.22A) | WaveMetrics | N/A | Software for visualization of recordings | |
Patchmaster | Heka | N/A | Data acquisition software | |
Olympus IX51 inverted microscope | Olympus | N/A | ||
micromanipulator | Sutter Instrument | MPC-365 | ||
patch-clamp amplifier | Heka | ECB10USB | ||
micropipette puller | Sutter Instrument | P-1000 | ||
borosilicate capillary tubes | Sutter Instrument | B150-86-10 | Corning 7740 | |
18 mm glass coverslips | Fisher | 12-545-84 | ||
plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | ||
cell strainer (40 µm) | Fisher | 08-771-1 | ||
Stovall Belly Dancer Shaker | Fisher | 15-453-211 | ||
low adhesion dishes | Fisher | 05-539-101 | Corning 3262 | |
bacterial dishes | VWR | 25384-302 | 100 x 15 mm |