A custom protocol is described to differentiate mouse ES cells into defined populations of highly pure neurons exhibiting functioning synapses and emergent network behavior. Electrophysiological analysis demonstrates the loss of synaptic transmission following exposure to botulinum neurotoxin serotypes /A-/G and tetanus neurotoxin.
Presynaptically लक्षित clostridial न्यूरोटोक्सिन (CNTs) के चिकित्सीय और यंत्रवत अध्ययनों से कार्य synapses के उत्पादन और नशा करने के लिए शारीरिक प्रतिक्रियाओं से होकर गुजरती है कि एक स्केलेबल, सेल आधारित मॉडल के लिए जरूरत से सीमित किया गया है। यहाँ हम कुशलतापूर्वक synaptically सक्रिय, नेटवर्क न्यूरॉन्स की परिभाषित प्रजातियों में murine भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (ESCs) को अलग करने के लिए एक सरल और मजबूत विधि का वर्णन। एक 8 दिन भेदभाव प्रोटोकॉल के बाद, माउस भ्रूणीय स्टेम सेल व्युत्पन्न न्यूरॉन्स (ESNs) तेजी, एक्सप्रेस और neurotypic प्रोटीन compartmentalize न्यूरोनल morphologies फार्म और आंतरिक विद्युत प्रतिक्रियाओं का विकास। निरोधात्मक संतुलन: भेदभाव के बाद 18 दिनों (DIV 18) करके, ESNs सक्रिय glutamatergic और γ aminobutyric एसिड (गाबा) ergic synapses और एक उत्तेजक द्वारा विशेषता आकस्मिक नेटवर्क व्यवहार दिखा रहे हैं। CNTs साथ नशा कार्यात्मक जिससे वें नकल, अन्तर्ग्रथनी neurotransmission antagonizes कि क्या यह निर्धारित करने के लिएई में बोटुलिज़्म या टिटनेस के नैदानिक अभिव्यक्तियाँ के लिए जिम्मेदार है कि pathophysiology, पूरे सेल पैच दबाना इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी टिटनेस न्यूरोटॉक्सिन (तम्बू) या बोटुलिनम न्यूरोटॉक्सिन से अवगत कराया ESNs में सहज लघु उत्तेजक बाद synaptic धाराओं (mEPSCs) (BoNT) यों के लिए इस्तेमाल किया गया था विवो सीरमप्रकारों / ए / जी। सभी मामलों में, ESNs 20 घंटा के भीतर synaptic गतिविधि के पास पूरा नुकसान का प्रदर्शन किया। अपरिवर्तित आराम झिल्ली क्षमता और आंतरिक विद्युत प्रतिक्रियाओं द्वारा प्रदर्शन के रूप में नशे में धुत्त न्यूरॉन्स, व्यवहार्य बने रहे। आगे इस दृष्टिकोण की संवेदनशीलता को चिह्नित करने के लिए, synaptic गतिविधि पर नशे की खुराक पर निर्भर प्रभाव BoNT / एक के बाद इसके अलावा 20 घंटा मापा गया। 0,005 बजे BoNT / ए के साथ नशा 0.013 प्रधानमंत्री के एक औसत निरोधात्मक एकाग्रता (आईसी 50) के साथ, mEPSCs में एक महत्वपूर्ण घटती में हुई। मंझला खुराक की तुलना अन्तर्ग्रथनी निषेध के कार्यात्मक माप तेज, और अधिक विशिष्ट और जाल की तुलना में अधिक संवेदनशील होते हैं कि संकेत मिलता हैदरार assays के या माउस मारक परख। इन आंकड़ों CNTs की अत्यधिक विशिष्ट और संवेदनशील पता लगाने के लिए synaptically युग्मित, स्टेम सेल व्युत्पन्न न्यूरॉन्स के उपयोग के लिए मान्य है।
इस विधि के समग्र लक्ष्य कार्यात्मक clostridial न्यूरोटोक्सिन उजागर करने के लिए स्टेम सेल व्युत्पन्न न्यूरॉन्स के नेटवर्क संस्कृतियों में synaptic गतिविधि का मूल्यांकन करने के लिए है। यह कार्यात्मक बोटुलिज़्म के नैदानिक अभिव्यक्तियाँ के लिए जिम्मेदार pathophysiologies replicates और CNTs, चिकित्सकीय जांच और यंत्रवत अध्ययनों का पता लगाने के लिए एक उपयुक्त मॉडल के रूप में ESNs पुष्टि की है कि इन विट्रो व्युत्पन्न मॉडल का पहला प्रदर्शन है।
BoNTs क्लोस्ट्रीडियम प्रजाति के सदस्यों द्वारा उत्पादित अत्यधिक घातक जीवाणु न्यूरोटोक्सिन हैं। हाल ही में प्रस्तावित BoNT / एच सहित आठ antigenically अलग BoNT सीरमप्रकारों (/ ए / एच) 1,2 वर्णित किया गया है। सभी सीरमप्रकारों हैं कि 150 केडीए पेप्टाइड्स के रूप में व्यक्त कर रहे हैं के बाद translationally एक डाइसल्फ़ाइड बंधन 3 से जुड़े एक 100 केडीए भारी श्रृंखला (एचसी) से बना एक dichain और एक 50 केडीए प्रकाश श्रृंखला (नियंत्रण रेखा) का उत्पादन करने के लिए nicked। कोर्ट प्रीसानेप्टिक रिसेप्टर्स और ईएनटी के लिए बाध्य mediatesअन्तर्ग्रथनी endocytosis के माध्यम से न्यूरॉन में विष की RY। Endosomal प्रसंस्करण के दौरान, कोर्ट प्रीसानेप्टिक साइटोसॉल में नियंत्रण रेखा के स्थानान्तरण की सुविधा पुटिका झिल्ली में एक ताकना फार्म करने के लिए संरचनात्मक पुनर्गठन आए। नियंत्रण रेखा तो विशेष रूप से लक्ष्य और प्रीसानेप्टिक डिब्बे में cleaves घुलनशील एन -ethylmaleimide के प्रति संवेदनशील संलयन लगाव प्रोटीन रिसेप्टर (जाल) प्रोटीन: स्नैप-25 (BoNT / ए, सी /, / ई), VAMP2 (BoNT / बी / डी, / एफ, / जी) या syntaxin (BoNT / सी) 1। इन जाल प्रोटीन में से किसी की दरार जिससे न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज अवरुद्ध, अन्तर्ग्रथनी एक्सोसाइटोसिस मशीनरी की विधानसभा से बचाता है। कुशल न्यूरोनल लक्ष्यीकरण और प्रीसानेप्टिक स्थानीयकरण के इस संयोजन का सबसे खतरनाक जहर 0.1 के रूप में के रूप में कम अनुमानित मानव घातक खुराक के साथ, ज्ञात BoNTs renders – 1 एनजी / 1 किलो।
जैव रासायनिक assays उच्च संवेदनशीलता के साथ CNT के साख पत्र की उपस्थिति या गतिविधि का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि, इन तरीकों मैं करने में विफल, बाँध दर्ज करने के लिए विष की क्षमता nterrogate, सक्रिय करने और न्यूरॉन्स के भीतर समारोह है, और इसलिए सक्रिय विष की उपस्थिति के अप्रत्यक्ष और संभवतः गुमराह करने के उपाय कर रहे हैं। इसके विपरीत, इस तरह के माउस मारक परख (विधायक) के रूप में नशे की कार्यात्मक assays के व्यापक विष गतिविधि के अधिक प्रासंगिक और विशिष्ट आकलन उपलब्ध कराने, सफलतापूर्वक तेज और सक्रियण के सभी चरणों के लिए बातचीत करने के लिए CNTs की क्षमता का मूल्यांकन। विधायक BoNT का पता लगाने के सोने के मानक है, यह एक अंत बिंदु के रूप में मौत का उपयोग करता है कि एक Vivo में विधि है और इसलिए एक अनुसंधान मंच के रूप में सीमित उपयोगिता है। यंत्रवत अध्ययन और चिकित्सकीय जांच के लिए उपयुक्त CNT के नशे की सेल आधारित मॉडल को विकसित करने के प्रयास भी महत्वपूर्ण सीमाओं का सामना करना पड़ा है। प्राथमिक न्यूरॉन संस्कृतियों शारीरिक प्रासंगिकता के एक उच्च डिग्री प्रदान करते हैं, वहीं उनके उपयोग उच्च संसाधन लागत अपेक्षाकृत कम उपज, कई न्यूरोनल उप की उपस्थिति सहित कारकों की एक संख्या से जटिल हैप्रकार और पशु उपयोग के साथ शामिल व्यापक विनियामक और प्रशासनिक निरीक्षण। प्राथमिक न्यूरॉन्स के लिए एक विकल्प के रूप में, इस तरह के neuroblastomas और अधिवृक्क क्रोमाफिन कोशिकाओं के रूप में (रासायनिक उत्तेजना से न्यूरॉन-जैसे गुणों को अपनाने के लिए प्रेरित किया जा सकता है) तंत्रिकाजन्य सेल लाइनों नशे की इन विट्रो मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया गया है। इन कोशिकाओं प्रेरण करने से पहले लगातार सुसंस्कृत हैं, वे उच्च स्केलेबल और मध्यम throughput के दृष्टिकोण के लिए इसलिए अच्छी तरह से अनुकूल है। प्रेरित phenotypes, आम तौर पर विषम हैं CNTs को खराब प्रति संवेदनशील हैं और कामकाज synapses के चार में इकट्ठा कि पूर्व और बाद synaptic डिब्बों के लिए फार्म असमर्थता सहित महत्वपूर्ण न्यूरोनल व्यवहार, प्रदर्शन करने में विफल रहता है के बाद से हालांकि, उनकी प्रासंगिकता संदिग्ध है। Physiologically बरकरार प्रीसानेप्टिक डिब्बों के अभाव में विष की पूरी रेंज: न्यूरॉन बातचीत नहीं दोहराया जा सकता है और नशे की इसलिए कार्यात्मक माप 5 संभव नहीं हैं। नाटी हैरत की बात है, यंत्रवत पढ़ाई या प्रेरित तंत्रिकाजन्य सेल लाइनों का उपयोग BoNTs के लिए दवा स्क्रीनिंग में विवो और प्राथमिक न्यूरॉन पढ़ाई 6 के साथ असंगत हैं कि निष्कर्षों में हुई है संचालन करने के लिए प्रयास करता है।
यह सेल व्युत्पन्न केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) न्यूरॉन्स सुसंस्कृत सेल लाइनों 7-10 के लचीलेपन के साथ प्राथमिक न्यूरॉन्स की प्रासंगिकता को जोड़ती है कि BoNT अनुसंधान के लिए एक अगली पीढ़ी के सेल आधारित मंच प्रदान कर सकता है कि स्टेम प्रस्ताव किया गया है। विशेष रूप से, माउस स्टेम सेल व्युत्पन्न न्यूरॉन्स (ESNs) BoNT / ए / जी के शारीरिक खुराक के लिए अत्यधिक संवेदनशील होने के लिए और अंतर persistences, गतिविधि-बढ़ाया नशा है, और सीरोटाइप सहित नशा करने विवो प्रतिक्रियाओं में कई दोहराने के लिए पाया गया है -specific potencies 5,8,11। इन कार्यों BoNT तेज, प्रसंस्करण, तस्करी और गतिविधि की विवो तंत्र में ESNs में संरक्षित कर रहे हैं कि सुझाव देते हैं। अन्तर्ग्रथनी activit का हालांकि, निषेधY बोटुलिज़्म के हस्ताक्षर अभिव्यक्ति है, और इसलिए CNTs द्वारा नशा निम्नलिखित synaptic गतिविधि का एक नुकसान का प्रदर्शन ESNs CNT के अध्ययन के लिए इन विट्रो व्युत्पन्न सेल आधारित मॉडल में एक उपयुक्त हैं कि समापन करने से पहले आवश्यक है।
Synaptic गतिविधि पर CNTs के साथ नशे के प्रभाव को मापने के लिए, पूरे सेल पैच दबाना इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी वाहन का इलाज या CNT के इलाज DIV के 21 + ESNs में monosynaptic धाराओं यों के लिए इस्तेमाल किया गया था। हम BoNT / ए / जी या तम्बू के साथ ESNs की है कि नशे के सभी मामलों में 20 घंटा के भीतर synaptic गतिविधि के> 95% नुकसान का कारण बना पाया। BoNT / ए 0,005 बजे से नीचे का पता लगाने की एक सीमा होती है और 0.013 बजे एक आईसी 50 मूल्य के साथ, synaptic गतिविधि पर एक खुराक पर निर्भर प्रभाव से पता चला है के साथ आगे लक्षण वर्णन नशा के बाद 20 घंटा का आयोजन किया। इन निष्कर्षों को नशे की electrophysiological पता लगाने की संवेदनशीलता और समय सीमा के काफी तुलनीय immunoblot आधारित एना अधिक सुधार कर रहे हैं संकेत मिलता है किsynaptically सक्रिय न्यूरॉन संस्कृतियों में नशे की कार्यात्मक माप अधिक संवेदनशील, विशिष्ट और तेजी से तरीकों को सुविधा हो सकती है कि प्रदर्शन तस्वीर 25 दरार की और इन विवो माउस मारक assays में lyses, BoNT के लिए सेलुलर प्रतिक्रिया चिह्नित करने के लिए।
CNT का पता लगाने, सीरोटाइप दृढ़ संकल्प और quantitation के लिए वर्तमान सोने के मानक के विधायक है। विधायक मेजबान की संपूर्ण रेंज पूछताछ: सब्सट्रेट के vivo में घटित करने के लिए नशा के लिए आवश्यक विष बातचीत (जैसे, विष, एक कोशिका की सतह रिसेप्टर के लिए कोशिका द्रव्य में विष-रिसेप्टर जटिल, नियंत्रण रेखा स्थानान्तरण के internalization बाध्यकारी, नियंत्रण रेखा की मध्यस्थता दरार और अन्तर्ग्रथनी neurotransmission की निषेध) 18। विधायक नशे की physiologically प्रासंगिक मॉडल प्रदान करता है हालांकि, हालांकि, यह contaminants से चकित किया जा सकता है, गहन संसाधन है और एक समापन बिंदु के रूप में मौत के साथ चूहों की बड़ी संख्या शामिल है। वैकल्पिक रूप से, BoNT का पता लगाने और quantitation के लिए सेल आधारित assays भी जानवर का उपयोग करें, या synapses के लिए फार्म और आम तौर पर न्यूरोटोक्सिन से 8 गरीब संवेदनशीलता का प्रदर्शन करने में विफल जो neuroblastoma सेल लाइनों, करने के लिए आवश्यकता होती है जो प्राथमिक न्यूरॉन संस्कृतियों, तक ही सीमित कर दिया गया है। वें में नशे की तिथि करने के लिए, सबसे मापESE सेल आधारित प्लेटफार्मों तस्वीर-25, VAMP1 / 2 या syntaxin-1 11 के proteolytic दरार का पता लगाने पर भरोसा किया है। जाल प्रोटीन दरार सही रूप में नशा 19,20 से नशा या वसूली का प्रतिनिधित्व नहीं हो सकता है इसलिए गैर रैखिक विवो में synaptic निषेध के साथ जुड़ा होना दिखाया गया है और इस वजह से समस्याग्रस्त है।
CNT का पता लगाने के लिए एक आदर्श सेल आधारित मॉडल प्रणाली (मैं) न्यूरॉन आधारित हो सकता है; (Ii) के synaptically neurotypic बिजली प्रतिक्रियाओं के साथ मिलकर किया जा; (Iii) सभी CNT के सीरमप्रकारों या उपप्रकार को अत्यधिक संवेदनशील हो; और (iv) विधायक से अधिक, कम कीमत पर, और पशुओं के उपयोग की आवश्यकता के बिना के बराबर या सुधार कर रहे हैं कि प्रस्ताव Scalability, throughput और परख बार। इन आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए, हम व्यावसायिक रूप से उपलब्ध माउस ईएससी लाइनों से अत्यधिक संवर्धित, नेटवर्क glutamatergic की संस्कृतियों और GABAergic न्यूरॉन्स की बड़ी मात्रा में उत्पादन करने के लिए एक विधि विकसित की है। हम तो यों तो धुंध परख विकसितप्रतिक्रिया में synaptic निषेध तम्बू और BoNT / ए / जी के साथ नशा करने के लिए। धुंध परख किसी भी synaptically सक्रिय न्यूरॉन आबादी (जैसे, प्राथमिक न्यूरॉन्स या मस्तिष्क स्लाइस) पर आयोजित किया जा सकता है, जबकि वर्तमान में ESNs reproducibly आकस्मिक नेटवर्क व्यवहार विकसित करता है और इसलिए धुंध परख के लिए उपयुक्त है कि केवल इन विट्रो व्युत्पन्न न्यूरॉन मॉडल हैं।
ईएससी संस्कृति और भेदभाव में कई नवाचारों CNT के अध्ययन के लिए परिभाषित वंश के न्यूरॉन्स के लिए पर्याप्त मात्रा में आवश्यक निर्माण किया। सबसे पहले, के लिए चयन और निलंबन-अनुकूलन जीवित रह सकते हैं कि ESCs संवर्धन द्वारा, हम फीडर कोशिकाओं और भेदभाव के शुरू में ESCs से फीडर कोशिकाओं को शुद्ध करने के लिए जरूरत से संदूषण के लिए संभावित सफाया कर दिया। निलंबन-अनुकूलन अंतर्निहित आणविक तंत्र अज्ञात हैं, निलंबन अनुकूलित ESCs mitotically सक्रिय रहते हैं, Oct3 / 4 अभिव्यक्ति को बनाए रखने और तंत्रिकाजन्य होना जारी है। इस विधि का प्रयोग, ~ 1.5 10 x 7 ईअनुसूचित जातियों आम तौर पर हर बीतने बरामद कर रहे हैं। दूसरा, NPCs के उत्पादन जाहिरा तौर पर समुच्चय के अंदरूनी हिस्सों को पोषक तत्व पहुंच बढ़ाने, भेदभाव के दौरान ढेर को रोकने के लिए यांत्रिक आंदोलन को शामिल करके ~ 300% की वृद्धि हुई थी। प्रक्रिया के दौरान, हम ईएससी संस्कृति और neuronal भेदभाव के लिए इस्तेमाल किया सीरम तंत्रिकाजन्य ESCs बनाए रखने में सबसे महत्वपूर्ण घटक है कि पाया। सबसे अच्छी सफलता के लिए, हम निलंबन सीरम से प्रत्येक बहुत कुछ करने के लिए ES कोशिकाओं अनुकूल और समाप्ति तिथि के माध्यम से ईएससी संस्कृति और neuronal भेदभाव का समर्थन करने के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर सीरम एकत्रीकरण की सलाह देते हैं।
सबसे synaptically सक्रिय संस्कृतियों के साथ के रूप में, DIV के 14 + ESNs दो सांद्रता 24 घंटे के भीतर न्यूरोटॉक्सिटी में परिणाम कर सकते हैं पीएच में अचानक परिवर्तन, और वायुमंडलीय सीओ को भी एक संक्षिप्त प्रदर्शन करने के लिए अत्यधिक अतिसंवेदनशील होते हैं। हे / एन या उससे अधिक समय, न्यूरॉन्स सीधे इलाज किया जाना चाहिए स्थायी incubations के द्वारा पीछा संस्कृतियों के उपचार की आवश्यकता होती है प्रयोगों के लिए मैंइनक्यूबेटर या प्रयोग करने से पहले एक निरंतर सीओ 2 चैम्बर को हस्तांतरित एन।
तकनीक की एक किस्म आईसीसी, ट्रांसक्रिप्शनल रूपरेखा और पूरे सेल पैच दबाना इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी सहित न्यूरोजेनेसिस और neuronal परिपक्वता, की पुष्टि की। जीन की अभिव्यक्ति और न्यूरॉन आकृति विज्ञान में अस्थायी परिवर्तन न्यूरोजेनेसिस के विकास के चरणों के माध्यम से एक तेजी से प्रगति के साथ संगत कर रहे थे, और div 16 से, ESNs उत्तेजक और आकस्मिक नेटवर्क के साथ निरोधात्मक लघु बाद synaptic धाराओं 16 व्यवहार प्रदर्शित की। अन्तर्ग्रथनी गतिविधि का सबूत ESNs बोटुलिज़्म और टिटनेस के नैदानिक अभिव्यक्तियाँ के लिए जिम्मेदार pathophysiologies दोहराने सकता है कि सुझाव दिया। इस BoNT / ए / जी या वाहन का इलाज या अनुपचारित न्यूरॉन्स की तुलना में> 95% से तम्बू बिगड़ा mEPSC आवृत्तियों के साथ कि नशा दिखाने के लिए धुंध का उपयोग करके इस बात की पुष्टि की गई थी।
BoNT / A के लिए धुंध की संवेदनशीलता का माप एक मंझला निरोधात्मक संकेत दियाएकाग्रता .013 (0.5 माउस घातक इकाइयों / मिलीलीटर के बराबर) प्रधानमंत्री और एक सीमा-की-खोज 0,005 बजे से नीचे के (आईसी 50), स्नान के बाद इसके अलावा 20 घंटा में मापा जाता है। 4 गुना तेजी से विधायक की तुलना में और cleaved तस्वीर-25 के immunoblot आधारित पता लगाने की तुलना में अधिक संवेदनशील 30 गुना – इन मूल्यों के आधार पर, धुंध के रूप में 2 लगभग दो बार के रूप में संवेदनशील है और।
सामूहिक रूप से, इन आंकड़ों स्टेम सेल व्युत्पन्न न्यूरॉन्स के नेटवर्क आबादी नशे की physiologically प्रासंगिक, सेल आधारित मॉडल का प्रस्ताव है कि सलाह देते हैं। का एक और अधिक तेजी से, संवेदनशील और विशिष्ट उपाय प्रदान करते हुए निलंबन अनुकूलित ESCs से नेटवर्क ESN संस्कृतियों प्राप्त करने के तरीकों में सुधार के साथ संयोजन में, धुंध का उपयोग पशु परीक्षण और जुड़े नुकसान, लागत और विधायक की नैतिक चिंताओं के लिए की जरूरत को कम करना चाहिए नशा। पूरे सेल पैच दबाना इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी सक्रिय न्यूरोटोक्सिन की उपस्थिति की पहचान करने के लिए एक कम throughput विधि है, यद्यपि यह एक संकल्प और spe प्रदान करता हैआणविक विधियों के प्रयोग से पहुंच से बाहर है कि एड। इन निष्कर्षों को भी गतिविधि पर निर्भर तरीकों के आवेदन synaptic गतिविधि मूल्यांकन करने के लिए और नेटवर्क व्यवहार न्यूरोटोक्सिन का तेजी से और विशिष्ट पहचान सक्षम हो सकता है कि सबूत प्रदान करते हैं। इस तरह के उच्च throughput के दृष्टिकोण CNTs सहित neuromodulatory एजेंटों की एक विस्तृत सरणी के लिए संभव यंत्रवत अध्ययन, चिकित्सीय स्क्रीनिंग या नैदानिक assays के लिए करना होगा।
The authors have nothing to disclose.
संयुक्त विज्ञान और प्रौद्योगिकी कार्यालय, चिकित्सा विज्ञान और प्रौद्योगिकी प्रभाग (अनुदान संख्या CBM.THRTOX.01.10 – इस काम के स्वास्थ्य के राष्ट्रीय एलर्जी के संस्थान और संक्रामक रोगों (आई ए ए संख्या AOD12058-0001-0000) और डिफेंस थ्रेट रिडक्शन एजेंसी के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा वित्त पोषित किया गया .RC.023 और CBM.THRTOX.01.RC.014)। पंजाब एक डिफेंस थ्रेट रिडक्शन एजेंसी-राष्ट्रीय अनुसंधान परिषद रिसर्च एसोसिएटशिप अवार्ड का आयोजन किया और के.एच. एक राष्ट्रीय अनुसंधान परिषद रिसर्च एसोसिएटशिप अवार्ड का आयोजन किया है, जबकि इस शोध किया गया था। हम एंजेला Adkins और तकनीकी सहायता के लिए Kaylie Tuznik (USAMRICD) धन्यवाद; और संपादकीय सहायता के लिए सिंडी Kronman (USAMRICD)। इस लेख में व्यक्त विचार लेखक के हैं और सेना के विभाग, रक्षा विभाग, या अमेरिकी सरकार की आधिकारिक नीति को प्रतिबिंबित नहीं करते।
Table 1. ESC and ESN | ||||
Knockout DMEM | Life Technologies | 10829-018 | Media: ESC culture medium Formulation and notes: 500 mL |
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100x MEM NEAA | Life Technologies | 11140-050 | Media: store at 4 °C for up to 1 month Formulation and notes: 6 mL |
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200 mM L-Alanyl-L-Glutamine | ATCC | 30-2115 | 6 mL | |
ES qualified FBS | Applied Stem Cell | ASM-5007 | 90 mL | |
100x antibiotics | Sigma-Aldrich | A5955 | 3 mL | |
55 mM 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | 1.1 mL | |
107 Units/mL LIF | Millipore | ESG1107 | 60 μL | |
Knockout DMEM | Life Technologies | 10829-018 | Media: ESC differentiation medium Formulation and notes: 436.6 mL |
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100x MEM NEAA | Life Technologies | 11140-050 | Media: store at 4 °C for up to 1 month Formulation and notes: 5 mL |
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200 mM L-Alanyl-L-Glutamine | ATCC | 30-2115 | 5 mL | |
ESC-qualified serum | Applied Stem Cell | ASM-5007 | 50 mL | |
100x antibiotics | Sigma-Aldrich | A5955 | 2.5 mL | |
55 mM 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | 0.9 mL | |
Dulbecco's PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | Media: NPC trypsinization medium Formulation and notes: 100 mL |
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0.5 M EDTA (18.3%) | Sigma-Aldrich | 3690 | Media: freeze in 5 mL aliquote Formulation and notes: 0.266 mL |
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Trypsin | Sigma-Aldrich | T8802 | 50 mg | |
Polyethyleneimine (PEI) | Sigma-Aldrich | P3143 | Media: Surface coating solutions Formulation and notes: 2.5 µg/mL in H20 |
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Poly-D-lysine (PDL) | Sigma-Aldrich | P7280 | Media: use within 1 wk Formulation and notes: 100 µg/mL in H20 |
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Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | 5 µg/mL in H20 | |
DMEM/F12 + GlutaMAX | Life Technologies | 10565-018 | Media: NPC culture medium Formulation and notes: 492.5 mL |
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100x N2 vitamins | Life Technologies | 17502-048 | Media: store at 4 °C for up to 1 month Formulation and notes: 5 mL |
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100x antibiotics | Sigma-Aldrich | A5955 | 2.5 mL | |
Neurobasal A | Life Technologies | 10888-022 | Media: ESN culture medium Formulation and notes: 482.5 mL |
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50x B27 vitamins | Life Technologies | 17504-044 | Media: store at 4 °C for up 1 month Formulation and notes: 10 mL |
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200 mM L-Alanyl-L-Glutamine | ATCC | 30-2115 | 5 mL | |
100x antibiotics | Sigma-Aldrich | A5955 | 2.5 mL | |
5-fluoro-2'-deoxyuridine (5FDU) | Sigma-Aldrich | F0503 | Media: 2000x Mitotic inhibitors aliquot and store at -20 °C Formulation and notes: dd 150 mg 5FDU and 350 mg uridine to 10 mL Neurobasal A. Sterile filter, aliquot and freeze. Use 2000x in ESN culture medium. |
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Uridine | Sigma-Aldrich | U3003 | ||
TrypLE Express Trypsin | Life Technologies | 12605-010 | Media: Miscellaneous Formulation and notes: store at RT |
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DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | store at RT | |
soybean trypsin inhibitor (STI) | Sigma-Aldrich | T6414 | store at -20 °C | |
ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | store at RT | |
ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4403 | Prepare 100 mM stock by dissolving 100 mg ascorbic acid in 5.7 mL of 50:50 DMSO/ethanol mix. | |
retinoic acid (RA) | Sigma-Aldrich | R2625 | Resuspend 15 mg RA in 9 mL 50:50 DMSO/ethanol. Supplement with 1 mL of 100 mM ascorbic acid stock. Aliquot and stored at -80 °C. Stable for 6 mos. | |
Table 2. MIST | ||||
NaCl | Sigma-Aldrich | 71386 | Media: Extracellular Recording Buffer Final Concentration (mM): 58.44 MW: 140 |
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KCl | Sigma-Aldrich | 60135 | Media: (ERB; pH = 7.3, 315 mO) Final Concentration (mM): 74.56 MW: 3.5 |
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NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S3139 | Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo. Final Concentration (mM): 119.98 MW: 1.25 |
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CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21115 | Final Concentration (mM): 110.98 MW: 2 |
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MgCl2 | Sigma-Aldrich | 63069 | Final Concentration (mM): 95.21 MW: 1 |
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D-glucose | Sigma-Aldrich | G8644 | Final Concentration (mM): 180.16 MW: 10 |
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HEPES | Sigma-Aldrich | H0887 | Final Concentration (mM): 238.3 MW: 10 |
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K-gluconate | Sigma-Aldrich | P1847 | Media: Intracellular Recording Buffer Final Concentration (mM): 234.5 MW: 140 |
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NaCl | Sigma-Aldrich | 71386 | Media: (IRB; pH = 7.3, 320 mO) Final Concentration (mM): 58.44 MW: 5 |
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Mg-ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo. Final Concentration (mM): 507.18 MW: 2 |
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Li-GTP | Sigma-Aldrich | G5884 | Final Concentration (mM): 523.18 MW: 0.5 |
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CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21115 | Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo. Final Concentration (mM): 110.98 MW: 0.1 |
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MgCl2 | Sigma-Aldrich | 63069 | Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo. Final Concentration (mM): 95.21 MW: 1 |
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EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | 380.35 | Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo. Final Concentration (mM): 380.35 MW: 1 |
HEPES | Sigma-Aldrich | H0887 | Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo. Final Concentration (mM): 238.3 MW: 10 |
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bicuculline | Tocris | 131 | Media: Miscellaneous Final Concentration (mM): 0.01 MW: 417.85 |
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CNQX | Sigma-Aldrich | C239 | Final Concentration (mM): 0.01 MW: 276.12 |
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Tetrodotoxin | Sigma-Aldrich | A8001 | Final Concentration (mM): 0.005 MW: 645.74 |
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BoNT/A-/G | Metabiologics | N/A | Media: Final Concentration (mM): TBD MW: 150,000 |
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Tetanus toxin | Sigma-Aldrich | T3194 | Final Concentration (mM): TBD MW: 150,000 |
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Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL-2 | Final Concentration (mM): N/A MW: N/A |
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Table 3. Equipment and Software | ||||
MiniAnalysis (version 6.0.7) | Synaptosoft, Inc. | N/A | Event detection software | |
Igor Pro (version 6.22A) | WaveMetrics | N/A | Software for visualization of recordings | |
Patchmaster | Heka | N/A | Data acquisition software | |
Olympus IX51 inverted microscope | Olympus | N/A | ||
micromanipulator | Sutter Instrument | MPC-365 | ||
patch-clamp amplifier | Heka | ECB10USB | ||
micropipette puller | Sutter Instrument | P-1000 | ||
borosilicate capillary tubes | Sutter Instrument | B150-86-10 | Corning 7740 | |
18 mm glass coverslips | Fisher | 12-545-84 | ||
plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | ||
cell strainer (40 µm) | Fisher | 08-771-1 | ||
Stovall Belly Dancer Shaker | Fisher | 15-453-211 | ||
low adhesion dishes | Fisher | 05-539-101 | Corning 3262 | |
bacterial dishes | VWR | 25384-302 | 100 x 15 mm |