A custom protocol is described to differentiate mouse ES cells into defined populations of highly pure neurons exhibiting functioning synapses and emergent network behavior. Electrophysiological analysis demonstrates the loss of synaptic transmission following exposure to botulinum neurotoxin serotypes /A-/G and tetanus neurotoxin.
Terapeutiska och mekanistiska studier av presynaptiskt riktade klostridie neurotoxiner (cnts) har begränsats av behovet av en skalbar, cellbaserad modell som producerar fungerande synapser och genomgår fysiologiska reaktioner på berusning. Här beskriver vi en enkel och robust metod för att effektivt skilja murina embryonala stamceller (EKSG) till definierade härstamningar av synaptically aktiva, nätverks nervceller. Efter en 8 dagars differentiering protokoll, mus embryonala stamcells-härledda neuron (ESNs) snabbt uttrycka och compartmentalize neurotypic proteiner, bildar neuronala morfologier och utveckla inneboende elektriska svar. Genom 18 dagar efter differentiering (DIV 18), ESNs uppvisar aktiv glutamaterg och γ-aminosmörsyra (GABA) erga synapser och framväxande nätverks beteenden som kännetecknas av en excitatorisk: inhiberande balans. För att avgöra om förgiftning med cnts motverkar funktionellt synaptiska neurotransmission och därmed replikerar the in vivo patofysiologi som ansvarar för kliniska manifestationer av botulism eller stelkramp, var helcells-patch clamp elektrofysiologi används för att kvantifiera spontana miniatyr excitatoriska postsynaptiska strömmar (mEPSCs) i ESNs exponerats för tetanus neurotoxin (tält) eller botulinum-neurotoxin (BoNT) serotyper / A- / G. I samtliga fall ESNs uppvisade nästan fullständig förlust av synaptisk aktivitet inom 20 timmar. Berusade nervceller förblev livskraftig, vilket framgår av oförändrade vilande membranpotentialer och inneboende elektriska svar. För att ytterligare karakterisera känsligheten hos denna metod, var dosberoende effekter berusning på synaptisk aktivitet uppmätt 20 timmar efter tillsats av BoNT / A. Berusning med 0,005 pM BoNT / A resulterade i en signifikant minskning i mEPSCs, med en median hämmande koncentration (IC 50) av 0,013 pM. Jämförelser av median doser indikerar att funktionella mätningar av synaptiska inhibition är snabbare, mer specifika och känsligare än SNAREspalt analyser eller analys musen dödlighet. Dessa data validera användningen av synaptically kopplade, stamcellsderiverade neuroner för mycket specifika och känslig detektion av cnts.
Det övergripande målet med denna metod är att funktionellt utvärdera synaptisk aktivitet i nätverkskulturer av stamcellsderiverade neuroner utsätts för klostridie nervgifter. Detta är den första demonstrationen av en in vitro härledd modell som funktionellt replikerar pathophysiologies ansvarar för kliniska manifestationer av botulism och validerar ESNs som en lämplig modell för detektering av cnts, terapeutisk screening och mekanistiska studier.
BoNTs är mycket dödliga bakterieneurotoxiner producerade av medlemmar av Clostridium arter. Inklusive den nyligen föreslagna BoNT / H, har åtta antigen distinkta BoNT serotyper beskrivits (/ A- / H) 1,2. Alla serotyper är uttryckta som 150 kDa peptider som är post-translation nicked att producera en dichain sammansatt av en 100 kDa tung kedja (HC) och en 50 kDa lätt kedja (LC) förenade genom en disulfidbindning 3. HC medierar bindning till presynaptiska receptorer och entry av toxinet in i neuron via synaptiska endocytos. Under endosomal bearbetning, HC genomgår strukturella omorganisation för att bilda en por i vesikelmembranet, lätta sloka av LC i presynaptiska cytosolen. LC då specifikt riktar och klyver lösliga N -ethylmaleimide känsliga fusionsfästproteinreceptor (Snare) proteiner i presynaptiska facket: SNAP-25 (BoNT / A, / C, / E), VAMP2 (BoNT / B, / D, / F, / G) eller syntaxin (BoNT / C) 1. Klyvning av något av dessa SNARE proteiner förhindrar montering av den synaptiska exocytos maskiner, och därigenom blockera neurotransmittorfrisättning. Denna kombination av effektiv neuronal inriktning och presynaptiska lokalisering gör BoNTs de mest potenta gifter kända, med beräknade mänskliga dödliga doser så låga som 0,1-1 ng / kg 1.
Biokemiska analyser kan användas för att detektera närvaron av eller aktiviteten hos CNT LCs med hög känslighet. Men dessa metoder misslyckas till Interrogate förmåga toxinet att binda, ange, aktivera och funktion inom nervceller, och därför är indirekta och eventuellt vilseledande mått på förekomst av aktiva toxin. Däremot funktionella analyser av berusning såsom analys musen dödlighet (MLA) utvärdera övergripande förmåga cnts att framgångsrikt förhandla om alla faser av upptag och aktivering, vilket ger mer relevanta och specifika bedömningar av toxinaktivitet. Medan MLA är guldstandarden BoNT upptäckt, det är en in vivo-metod som använder döden som en slutpunkt och har därför begränsad användbarhet som forskningsplattform. Försök att utveckla cellbaserade modeller av CNT berusning lämplig för mekanistiska studier och terapeutiskt screening har också drabbats betydande begränsningar. Medan primära neuron kulturer erbjuder en hög grad av fysiologisk relevans, är deras användning kompliceras av ett antal faktorer, inklusive höga resurskostnaden, relativt låg avkastning, förekomsten av flera neuronala subtyper och omfattande tillsyn rättsliga och administrativa involverad med djuranvändning. Som ett alternativ till primära neuroner, har neurogena cellinjer (som kan induceras att anta neuron liknande egenskaper genom kemisk stimulering) såsom neuroblastom och adrenal kromaffinceller använts som in vitro-modeller av berusning. Eftersom dessa celler är ständigt odlade före induktion, de är mycket skalbar och därför väl lämpad för måttlig genomströmning tillvägagångssätt. Dock är deras relevans ifrågasättas eftersom inducerade fenotyper är typiskt heterogena, är dåligt känsliga för cnts och misslyckas med att uppvisa kritiska neuronala beteenden, inklusive oförmåga att bilda pre- och postsynaptiska fack som monterar in fungerande synapser 4. I avsaknad av fysiologiskt intakta presynaptiska fack, hela skalan av toxin: kan neuron interaktioner inte replikeras och därför funktionella mätningar av berusning är inte möjliga 5. Ingent överraskande, försök att genomföra mekanistiska studier eller drogscreening för BoNTs använder inducerade neurogena cellinjer har resulterat i fynd som är oförenliga med in vivo och primära neuron studier 6.
Det har föreslagits att stamcells härrörande centrala nervsystemet (CNS) nervceller kan ge en nästa generations cellbaserad plattform för BoNT forskning som kombinerar relevansen av primära nervceller med flexibiliteten hos odlade cellinjer 7-10. I synnerhet har mus stamceller härrörande neuron (ESNs) visat sig vara mycket känslig för fysiologiska doser av BoNT / A- / G och att replikera många in vivo svar på berusning, inklusive differential persistences, förbättrad aktivitet berusning och serotyp -specifika potenser 5,8,11. Dessa beteenden tyder på att in vivo mekanismer BoNT upptag, bearbetning, handel och aktivitet är bevarade i ESNs. Emellertid hämning av synaptisk Activity är signaturen manifestation av botulism, och därmed visar en förlust av synaptisk aktivitet efter förgiftning av cnts är nödvändig innan den drog slutsatsen att ESNs är en lämplig in vitro härrör cellbaserad modell för CNT studier.
För att mäta effekterna av förgiftning med cnts på synaptisk aktivitet, var hel-cell patch-clamp elektrofysiologi används för att kvantifiera monosynaptic strömmar i vehikelbehandlade eller CNT-behandlad DIV 21 + ESNs. Vi fann att förgiftning av ESNs med BoNT / A / G eller tält orsakade> 95% förlust av synaptisk aktivitet inom 20 h i samtliga fall. Ytterligare karakterisering genomfört 20 timmar efter intoxikation med BoNT / A avslöjade en dosberoende effekt på synaptisk aktivitet, med en detektionsgräns under 0,005 pM och ett IC50 värde på 0,013 pM. Dessa fynd tyder på att känsligheten och tidsramen för elektro upptäckt av berusning är avsevärt förbättrats under jämförbara immunoblot baserade analyserar av SNAP-25 klyvning och i analyser vivo musen dödlighet, som visar att funktionella mätningar av berusning i synaptically aktiva neuron kulturer kan underlätta mer känsliga, specifika och snabba metoder för att karakterisera cellulära svaret på BoNT.
Den nuvarande standarden för CNT detektion, serotyp beslutsamhet och kvantifiering är MLA. Den MLA förfrågar hela intervallet av värden: toxin interaktioner krävs för berusning att ske in vivo (t ex toxin bindning till en cellytreceptor, internalisering av toxin-receptorkomplexet, LC sloka in i cytoplasman, LC-medierad klyvning av substrat och hämning av synaptisk neurotransmission) 18. Men även om MLA erbjuder ett fysiologiskt relevant modell av berusning, är det resurskrävande, kan komma på skam med föroreningar och innebär ett stort antal möss med döden som slutpunkt. Alternativt har cellbaserade analyser för BoNT detektion och kvantifiering begränsats till primära neuron kulturer, vilket också kräver användning av djur, eller till neuroblastom cellinjer, som inte bildar synapser och typiskt uppvisar dålig känslighet för nervgifter 8. Hittills har de flesta mätningar av berusning i thESE cellbaserade plattformar har förlitat sig på detektion av proteolytisk klyvning av SNAP-25, VAMP1 / 2 eller syntaxin-en 11. Detta är problematiskt eftersom SNARE protein klyvning har visat sig vara icke-linjärt samband med synaptisk inhibition in vivo och därför kanske inte korrekt representera berusning eller återhämtning från berusning 19,20.
En idealisk cellbaserade modellsystem för CNT detektion skulle (i) vara neuron-baserade; (Ii) vara synaptically kombination med neurotypic elektriska svar; (Iii) vara mycket känsliga för alla serotyper CNT eller subtyper; och (iv) erbjudande skalbarhet, genomströmning och analystider som motsvarar eller förbättrats under det MLA, till lägre kostnad, och utan att kräva användning av djur. För att möta dessa krav har vi utvecklat en metod för att producera stora mängder av höganrikat, nätverkskulturer av glutamaterga och GABAerga nervceller från kommersiellt tillgängliga mus ESC linjer. Vi utvecklade sedan MIST analys för att kvantifierasynaptiska inhibition som svar på intoxikation med tält och BoNT / A- / G. Medan MIST analysen kan utföras på något synaptically aktiva neuron befolkningen (t.ex. primära nervceller eller hjärnan skivor), för närvarande ESNs är de enda in vitro härrör neuron modell som reproducerbart utvecklar framväxande nätverksbeteenden och är därför lämpligt för MIST analysen.
Producera tillräckliga mängder nervceller i definierade härstamning för CNT studier krävs flera innovationer i ESC kultur och differentiering. Först, genom att selektera för och odling ESCs som kan överleva suspension-anpassning, eliminerade vi risken för förorening av matarceller och behovet att rena matarceller från ESC vid starten av differentiering. Även de molekylära mekanismerna bakom fjädring-anpassning är okända, fjädring anpassade ekonomiska och sociala råd förblir mitotiskt aktiva, behålla Oct3 / 4 uttryck och fortsätter att vara neurogen. Med användning av denna metod, ~ 1,5 x 10 7 ESCS typiskt återvinns varje passage. För det andra, var produktionen av NPCs ökade ~ 300% genom att införliva mekanisk omrörning för att förhindra agglomerering under differentiering, skenbart öka närings tillgängligheten till inredningen av aggregaten. Under processen, fann vi att serum som används för ESC kultur och neuronal differentiering är den mest kritiska komponenten för att upprätthålla neurogena ekonomiska och sociala råd. För bästa framgång, rekommenderar vi fjädring anpassar ES-celler till varje parti av serum och lagring serum vid -20 ° C för att stödja ESC kultur och neuronal differentiering genom utgångsdatum.
Som med de flesta synaptically aktiv kulturer, DIV 14 + ESNs är mycket mottagliga för plötsliga förändringar i pH, och även en kortvarig exponering för atmosfärisk CO2 koncentrationer kan leda till neurotoxicitet inom 24 timmar. För experiment som kräver behandling av kulturer följt av inkubationer bestående O / N eller längre, nervceller bör behandlas direkt in inkubatorn eller överföras till en konstant CO2 kammaren före experiment.
Ett flertal tekniker bekräftade neurogenes och neuronal mognad, inklusive ICC, transkriptionell profilering och hel-cell patch-clamp elektrofysiologi. Tidsmässiga förändringar i genuttryck och neuron morfologi överensstämde med en snabb progression genom de utvecklingsstadier av neurogenes och genom DIV 16, ESNs uppvisade retande och hämmande miniatyr postsynaptiska strömmar med emergent nätverk beteenden 16. Bevis på synaptisk aktivitet föreslog att ESNs kan replikera pathophysiologies ansvariga för de kliniska manifestationer av botulism och stelkramp. Detta bekräftades genom att använda MIST för att visa att intoxikation med BoNT / A- / G eller tält nedsatt mEPSC frekvenser med> 95% jämfört med vehikelbehandlade eller obehandlade neuroner.
Mätningar av känslighet MIST för BoNT / A indikerade en median hämmandekoncentration (IC 50) av 0,013 pM (motsvarande 0,5 mus dödliga enheter / ml) och en gräns-of-detektion under 0,005 pM, mätt vid 20 timmar efter badet tillsats. Utifrån dessa värden, är MIST ungefär dubbelt så känsliga som och 2 – 4 gånger snabbare än MLA och 30 gånger mer känsliga än immunoblot baserad detektion av kluvna SNAP-25.
Tillsammans står dessa data tyder på att nätverks populationer av stamcells-härledda neuron erbjuder ett fysiologiskt relevant, cellbaserad modell för berusning. I kombination med förbättrade metoder för att härleda nätverks ESN kulturer från upphängningsanpassade ekonomiska och sociala råd, bör användningen av MIST minska behovet av djurförsök och de tillhörande nackdelar, kostnader och etisk fråga MLA samtidigt som en snabbare, känslig och specifik åtgärd berusning. Även hel-cell patch-clamp elektrofysiologi är en låg genomströmning metod för att identifiera förekomst av aktiva nervgifter och erbjuder en upplösning och speed som är ouppnåeligt använder molekylära metoder. Dessa resultat ger också belägg för att tillämpningen av aktivitetsberoende metoder för att utvärdera synaptisk aktivitet och nätverksbeteende kan möjliggöra snabb och specifikt påvisande av nervgifter. Sådana högre genomströmning tillvägagångssätt skulle göra mekanistiska studier, terapeutisk screening eller diagnostiska analyser genomförbart för ett brett spektrum av neuromodulatory medel, inklusive cnts.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete har finansierats av National Institutes of Health National Institute of Allergy och infektionssjukdomar (IAA nummer AOD12058-0001-0000) och Reduction Agency Defense Threat – Gemensamt Science and Technology Office, medicinsk vetenskap och division (siffror bidrags CBM.THRTOX.01.10 .RC.023 och CBM.THRTOX.01.RC.014). Denna forskning utfördes medan PB höll en Defense Threat Reduction Agency-National Research Council Research Associateship Award och KH höll en National Research Council Research Associateship Award. Vi tackar Angela Adkins och Kaylie Tuznik (USAMRICD) för tekniskt stöd; och Cindy Kronman (USAMRICD) för redaktionell hjälp. De åsikter som uttrycks i artikeln är författarnas och återspeglar inte den officiella politiken av avdelningen av armén, försvarsdepartementet, eller den amerikanska regeringen.
Table 1. ESC and ESN | ||||
Knockout DMEM | Life Technologies | 10829-018 | Media: ESC culture medium Formulation and notes: 500 mL |
|
100x MEM NEAA | Life Technologies | 11140-050 | Media: store at 4 °C for up to 1 month Formulation and notes: 6 mL |
|
200 mM L-Alanyl-L-Glutamine | ATCC | 30-2115 | 6 mL | |
ES qualified FBS | Applied Stem Cell | ASM-5007 | 90 mL | |
100x antibiotics | Sigma-Aldrich | A5955 | 3 mL | |
55 mM 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | 1.1 mL | |
107 Units/mL LIF | Millipore | ESG1107 | 60 μL | |
Knockout DMEM | Life Technologies | 10829-018 | Media: ESC differentiation medium Formulation and notes: 436.6 mL |
|
100x MEM NEAA | Life Technologies | 11140-050 | Media: store at 4 °C for up to 1 month Formulation and notes: 5 mL |
|
200 mM L-Alanyl-L-Glutamine | ATCC | 30-2115 | 5 mL | |
ESC-qualified serum | Applied Stem Cell | ASM-5007 | 50 mL | |
100x antibiotics | Sigma-Aldrich | A5955 | 2.5 mL | |
55 mM 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | 0.9 mL | |
Dulbecco's PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | Media: NPC trypsinization medium Formulation and notes: 100 mL |
|
0.5 M EDTA (18.3%) | Sigma-Aldrich | 3690 | Media: freeze in 5 mL aliquote Formulation and notes: 0.266 mL |
|
Trypsin | Sigma-Aldrich | T8802 | 50 mg | |
Polyethyleneimine (PEI) | Sigma-Aldrich | P3143 | Media: Surface coating solutions Formulation and notes: 2.5 µg/mL in H20 |
|
Poly-D-lysine (PDL) | Sigma-Aldrich | P7280 | Media: use within 1 wk Formulation and notes: 100 µg/mL in H20 |
|
Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | 5 µg/mL in H20 | |
DMEM/F12 + GlutaMAX | Life Technologies | 10565-018 | Media: NPC culture medium Formulation and notes: 492.5 mL |
|
100x N2 vitamins | Life Technologies | 17502-048 | Media: store at 4 °C for up to 1 month Formulation and notes: 5 mL |
|
100x antibiotics | Sigma-Aldrich | A5955 | 2.5 mL | |
Neurobasal A | Life Technologies | 10888-022 | Media: ESN culture medium Formulation and notes: 482.5 mL |
|
50x B27 vitamins | Life Technologies | 17504-044 | Media: store at 4 °C for up 1 month Formulation and notes: 10 mL |
|
200 mM L-Alanyl-L-Glutamine | ATCC | 30-2115 | 5 mL | |
100x antibiotics | Sigma-Aldrich | A5955 | 2.5 mL | |
5-fluoro-2'-deoxyuridine (5FDU) | Sigma-Aldrich | F0503 | Media: 2000x Mitotic inhibitors aliquot and store at -20 °C Formulation and notes: dd 150 mg 5FDU and 350 mg uridine to 10 mL Neurobasal A. Sterile filter, aliquot and freeze. Use 2000x in ESN culture medium. |
|
Uridine | Sigma-Aldrich | U3003 | ||
TrypLE Express Trypsin | Life Technologies | 12605-010 | Media: Miscellaneous Formulation and notes: store at RT |
|
DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | store at RT | |
soybean trypsin inhibitor (STI) | Sigma-Aldrich | T6414 | store at -20 °C | |
ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | store at RT | |
ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4403 | Prepare 100 mM stock by dissolving 100 mg ascorbic acid in 5.7 mL of 50:50 DMSO/ethanol mix. | |
retinoic acid (RA) | Sigma-Aldrich | R2625 | Resuspend 15 mg RA in 9 mL 50:50 DMSO/ethanol. Supplement with 1 mL of 100 mM ascorbic acid stock. Aliquot and stored at -80 °C. Stable for 6 mos. | |
Table 2. MIST | ||||
NaCl | Sigma-Aldrich | 71386 | Media: Extracellular Recording Buffer Final Concentration (mM): 58.44 MW: 140 |
|
KCl | Sigma-Aldrich | 60135 | Media: (ERB; pH = 7.3, 315 mO) Final Concentration (mM): 74.56 MW: 3.5 |
|
NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S3139 | Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo. Final Concentration (mM): 119.98 MW: 1.25 |
|
CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21115 | Final Concentration (mM): 110.98 MW: 2 |
|
MgCl2 | Sigma-Aldrich | 63069 | Final Concentration (mM): 95.21 MW: 1 |
|
D-glucose | Sigma-Aldrich | G8644 | Final Concentration (mM): 180.16 MW: 10 |
|
HEPES | Sigma-Aldrich | H0887 | Final Concentration (mM): 238.3 MW: 10 |
|
K-gluconate | Sigma-Aldrich | P1847 | Media: Intracellular Recording Buffer Final Concentration (mM): 234.5 MW: 140 |
|
NaCl | Sigma-Aldrich | 71386 | Media: (IRB; pH = 7.3, 320 mO) Final Concentration (mM): 58.44 MW: 5 |
|
Mg-ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo. Final Concentration (mM): 507.18 MW: 2 |
|
Li-GTP | Sigma-Aldrich | G5884 | Final Concentration (mM): 523.18 MW: 0.5 |
|
CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21115 | Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo. Final Concentration (mM): 110.98 MW: 0.1 |
|
MgCl2 | Sigma-Aldrich | 63069 | Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo. Final Concentration (mM): 95.21 MW: 1 |
|
EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | 380.35 | Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo. Final Concentration (mM): 380.35 MW: 1 |
HEPES | Sigma-Aldrich | H0887 | Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo. Final Concentration (mM): 238.3 MW: 10 |
|
bicuculline | Tocris | 131 | Media: Miscellaneous Final Concentration (mM): 0.01 MW: 417.85 |
|
CNQX | Sigma-Aldrich | C239 | Final Concentration (mM): 0.01 MW: 276.12 |
|
Tetrodotoxin | Sigma-Aldrich | A8001 | Final Concentration (mM): 0.005 MW: 645.74 |
|
BoNT/A-/G | Metabiologics | N/A | Media: Final Concentration (mM): TBD MW: 150,000 |
|
Tetanus toxin | Sigma-Aldrich | T3194 | Final Concentration (mM): TBD MW: 150,000 |
|
Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL-2 | Final Concentration (mM): N/A MW: N/A |
|
Table 3. Equipment and Software | ||||
MiniAnalysis (version 6.0.7) | Synaptosoft, Inc. | N/A | Event detection software | |
Igor Pro (version 6.22A) | WaveMetrics | N/A | Software for visualization of recordings | |
Patchmaster | Heka | N/A | Data acquisition software | |
Olympus IX51 inverted microscope | Olympus | N/A | ||
micromanipulator | Sutter Instrument | MPC-365 | ||
patch-clamp amplifier | Heka | ECB10USB | ||
micropipette puller | Sutter Instrument | P-1000 | ||
borosilicate capillary tubes | Sutter Instrument | B150-86-10 | Corning 7740 | |
18 mm glass coverslips | Fisher | 12-545-84 | ||
plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | ||
cell strainer (40 µm) | Fisher | 08-771-1 | ||
Stovall Belly Dancer Shaker | Fisher | 15-453-211 | ||
low adhesion dishes | Fisher | 05-539-101 | Corning 3262 | |
bacterial dishes | VWR | 25384-302 | 100 x 15 mm |