Arbeid med smittsomme Ebola virus er begrenset til biosikkerhet nivå fire laboratorier. Tetracistronic minigenome holdig replikasjon og transkripsjon kompetente virus lignende partikler (trVLPs) representerer en livssyklus modellering system som tillater oss å trygt modellere flere smittsomme sykluser i henhold biosikkerhet nivå to forhold, stole utelukkende på Ebola-viruset komponenter.
Ebola virus forårsaker alvorlig hemoragisk feber hos mennesker og ikke-menneskelige primater, med case-dødsfall priser så høyt som 90%. Det finnes ingen godkjente vaksiner eller spesifikke behandlinger for sykdom forårsaket av disse virusene, og arbeide med smittsomme Ebola virus er begrenset til biosikkerhet nivå fire laboratorier, betydelig begrense forskning på disse virusene. Livssyklus modellering systemer modell viruset livssyklus henhold biosikkerhet nivå to forhold; imidlertid inntil nylig slike systemer har vært begrenset til enten individuelle aspekter av viruset livssyklus, eller en enkelt infeksiøs syklus. Tetracistronic minigenomes, som består av Ebola virus-koding ikke regioner, en reporter gen, og tre Ebola-viruset gener involvert i morphogenesis, spirende, og oppføring (VP40, GP 1,2, og VP24), kan brukes til å produsere replikasjon og transkripsjon -competent viruslignende partikler (trVLPs) som inneholder disse minigenomes. Disse trVLPs kontinuerlig kan infisere celler uttrykker Ebolavirus proteiner ansvarlig for genom replikering og transkripsjon, slik at vi kan trygt modellere flere smittsomme sykluser i henhold biosikkerhet nivå to forhold. Viktigere er de virale komponenter av dette systemer utelukkende avledet fra Ebola viruset, og ikke fra andre virus (som for eksempel er tilfellet i systemer som bruker pseudotyped virus), og VP40, GP 1,2 og VP24 ikke er overuttrykt i dette systemet , noe som gjør det ideelt egnet for å studere morfogenese, spirende og inngang, selv om andre aspekter av viruset livssyklusen for eksempel genom-replikasjon og transkripsjon kan også bli modellert med dette systemet. Derfor representerer tetracistronic trVLP analysen den mest omfattende livssyklus modellering systemet tilgjengelig for Ebola virus, og har et enormt potensial for bruk i å undersøke biologi Ebola virus i fremtiden. Her vi gi detaljert informasjon om bruk av dette systemet, så vel som den forventede resultater.
Ebola virus er den utløsende agent for en alvorlig hemoragisk feber hos mennesker og ikke-menneskelige primater med tilfelle dødsfall priser på opptil 90% i menneskelige utbrudd en. Mens det har vært en betydelig utvikling de siste årene på å utvikle vaksiner samt spesifikke behandlinger (anmeldt i 2,3), disse er ikke godkjent for bruk på mennesker. Ebola viruspartikler har en karakteristisk tråd-lignende utseende med en lengde på omtrent 1 mikrometer og en diameter på 96-98 nm 4. A nukleo danner kjernen av de virale partikler og består av 1) den ikke-segmenterte enkelt-trådet negativ-sense RNA-genom, som koder for de syv ebolavirus gener (figur 1), 2) nukleoprotein NP, som encapsidates genomet, 3 ) den virale polymerase kompleks bestående av polymerase l og dets kofaktor VP35, og 4) den transkripsjonelle aktivator VP30. I tillegg har det nylig vært vist at proteinet VP24 er også forbundet med nukleokapsids 4. Den nukleokapsid er omgitt av matrisen plass der matrisen protein VP40, som er ansvarlig for morfogenese og spirende av virioner, er plassert. Viruspartikler er videre innhyllet, og innebygd i den konvolutten er den eneste overflateprotein GP 1,2, som er ansvarlig for virion vedlegg og oppføring.
Arbeid med smittsomme Ebola virus må utføres i en maksimal containment laboratorium under biosikkerhetsnivå (BSL) fire forhold, som begrenser dette arbeidet til noen få anlegg over hele verden. For å studere biologien til disse virusene eller for å utvikle nye terapeutiske midler i henhold til BSL2 betingelser, er avhengige forskere enten på overekspresjon av rekombinant Ebola virusproteiner, eller på livssyklusmodellsystemer, som begge kan bearbeides med i fravær av smittsomme Ebola virus. Rekombinant uttrykk av Ebola-viruset proteiner er enten oppnås fra ekspresjonsplasmider eller virale vektorer. Et spesialtilfelle av denne strategien ergenerering av virioner eller viruslignende partikler basert på andre virus enn Ebola virus (oftest retrovira eller vesikulært stomatitis virus) i nærvær av rekombinant uttrykte gp 1,2, som fører til genereringen av pseudotyped partikler, noe som kan brukes til å studere prosessen med filoviruses og skjermen oppføring for inntrengningsinhibitorer fem. Alternativt kan rekombinante virus (f.eks, vesikulær stomatitt virus) som koder Ebola-viruset GP 1,2 i stedet for sin egen glykoprotein genereres og brukes til å studere virus oppføring under biosikkerhetsnivå 2 forhold seks.
Lifecycle modellering systemer er former for revers genetikk systemer med bruk av avstumpede Ebola-viruset genom analoger (minigenomes), som opprinnelig produsert fra cDNA og deretter kopiert og transkribert av Ebola-viruset proteiner gitt i trans. Den første minigenome system for Ebola-viruset ble utviklet mer enn 15 år siden 7, Og har siden blitt brukt til å studere Ebola-viruset genom replikering og transkripsjon (anmeldt i 8,9). I dette systemet en monocistronic minigenome som består av en enkelt reporter-genet flankert av de terminale ikke-kodende regioner av Ebola virusgenomet (kalt leder og tilhenger) (figur 1) blir uttrykt i pattedyrceller (vanligvis ved hjelp av T7 RNA-transkripsjon-polymerase) sammen med de virusproteiner L, VP35, VP30 og NP. Den minigenome er encapsidated av NP, og deretter replikert og transkribert av de andre nukleo-proteiner ved å bruke cis-virkende signaler lokalisert i leder og tilhenger, som fører til rapportøraktivitet, som gjenspeiler disse to sider av viruset livssyklus (figur 2).
For å modellere flere trinn av viral livssyklus, transkripsjon og replikering-kompetent viruslignende partikler (trVLP) systemer har blitt utviklet, som er basert på klassiske minigenome systemer, men har den endditional uttrykk for de andre virusproteiner VP24, VP40 og GP 1,2 fra ekspresjonsplasmider 10,11. Tilstedeværelsen av VP40 fører til dannelse av trVLPs, som bærer GP 1,2 på deres overflate, og bærer en minigenome holdig nukleokapsid på innsiden. Disse trVLPs kan brukes til å infisere målceller, som enten har blitt pretransfected med ekspresjonsplasmider for L, VP35, VP30 og NP, for å legge til rette for replikasjon og transkripsjon av minigenomes bringes inn i målcellene i trVLPs 11, eller er naive målceller (f.eks uten plasmid-drevet uttrykk for Ebola-viruset proteiner) 10. Dette resulterer i rapportøraktivitet i målceller, noe som gjenspeiler replikering av minigenomes i produsentceller, morfogenese og spirende trVLPs, deres inntreden i målceller, og 1) i tilfelle av pretransfected målceller også genom replikasjon og transkripsjon sekundær ( dvs. transkripsjon av viral proteiner produced i målcellene) i målcellene, eller 2) i tilfelle av naive målceller også primære transkripsjon (dvs. transkripsjonen av virusproteiner brakt inn i målceller i trVLPs) (figur 3). Viktigere, har disse systemene bare blitt brukt til å modellere en enkelt infeksiøs syklus, og stole på overekspresjon av alle virale proteiner, som i tilfelle av VP24 VP40 og er spesielt problematisk, siden disse proteinene har vist seg å være sterke negative regulatorer av genomreplikasjon og transkripsjon når overuttrykkes fra plasmider 12,13. Videre trVLP preparater fremstilt på disse systemer inneholder en høy andel av ikke-infeksiøse partikler, noe som medfører utfordringer for biokjemisk analyse av smittsomme trVLPs 14.
For å overvinne disse problemene, har vi nylig utviklet en tetracistronic minigenome system som, i tillegg til en reporter-genet, også inneholder gener som koder for VP40, GP 1,2 ogVP24 (figur 1). I likhet med den klassiske monocistronic minigenome system, fører dette system til fremstilling av trVLPs som kan infisere målceller (figur 4) 15. Imidlertid, i motsetning til den klassiske minigenome system, VP40, GP 1,2, og VP24 produseres etter at virusgenomet transkripsjon stedet for å være overuttrykt fra plasmider. Som et resultat av de kinetikk og uttrykk nivåer av disse proteinene mye nærmere etterligne de som finnes under den virale livssyklus, og dermed forholdet mellom smittsomme til ikke-infeksiøse trVLPs økes omtrent 500-fold i dette systemet 15.. Videre, ved hjelp av dette systemet var det mulig å kontinuerlig passasje tetracistronic minigenome holdige trVLPs, modellering flere smittsomme sykluser. Som sådan, tetracistronic trVLPs er for øyeblikket den mest omfattende livssyklus modellering system tilgjengelig for å studere Ebola-viruset biologi henhold BSL2 forhold. Her gir vi detaljert informasjon om bruken of dette systemet, så vel som den forventede resultater.
Den tetracistronic trVLP analysen beskrevet i dette manuskriptet tillater modellering av Ebola-viruset livssyklus over flere smittsomme sykluser. Viktigere, gjør trVLPs produsert i dette systemet ikke inneholder genetisk informasjon for nukleocapsidproteiner NP, VP35, VP30, og L, som til sammen utgjør nesten 60% av Ebola-viruset genomet og er avgjørende for virusreplikasjon. Snarere er disse proteinene må være anordnet i målceller i trans fra ekspresjonsplasmider, og en hvilken som helst infeksjon av celler som uttrykker ikke alle fire av disse proteiner er mislykket. Viktigere er det ingen bevis for genetisk rekombinasjon for filoviruses, og det er ingen homologe regioner delt mellom tetracistronic minigenome og ekspresjonsplasmider for nukleocapsidproteiner. Derfor finnes det heller ikke noen praktisk bevis heller ikke noen teoretisk grunn for at kunne sørge for muligheten for å skape full lengde Ebola virusgenomer som dermed potensielt føreproduksjon av infeksiøse Ebola virus, noe som gjør dette systemet sikker for bruk under BSL2 betingelser.
Det er to viktige skritt i tetracistronic trVLP analysen som er påvirket av eksperimentelle forhold, dvs. produksjon av trVLPs, og infeksjon av målceller med disse trVLPs. Produksjon av trVLPs er avhengig av høye nivåer av minigenome replikasjon og transkripsjon, som i sin tur er avhengig av en høy transfeksjon effekt. Transfeksjon effekt kan lett bedømmes ved å inkludere en -L kontroll, hvor ekspresjonsplasmid for L er byttet ut med et ekspresjonsplasmid som koder for EGFP. Transfeksjon priser under disse forholdene bør overskride 50% av inspeksjon med en fluorescens mikroskop 24 timer etter transfeksjon. Videre celler må være fri for mycoplasma, siden i vår erfaring mycoplasma forurensning dramatisk svekker minigenome replikering og transkripsjon (upublisert data). På grunn av sin høye transfectability 293 ceLLS er cellelinjen av valg for trVLP analyser; Men disse cellene er relativt dårlig utsatt (om enn ikke helt refraktiv) til infeksjon med Ebola-viruset 16. Uttrykk for et vedlegg faktor som Tim-1 forbedrer infeksjon av 293 celler med trVLPs ca 100-fold, og er avgjørende for å lykkes med dette systemet over flere passasjer.
Mens tetracistronic trVLPs er ikke selvreplikerende på egen hånd, er de selvreplikerende i celler som uttrykker de nukleocapsidproteiner. Som sådan, forholdsregler må gjøres for å unngå kryss forurensninger mellom brønner som inneholder forskjellige trVLPs (f.eks med ulike mutasjoner i minigenome). Fra en mer teknisk synspunkt, på grunn av den store forskjellen mellom positive og negative signaler i denne analysen (ca 4 logger), krysstale mellom prøvene ved å måle luciferase-aktivitet kan være et problem; Imidlertid kan dette lett unngås ved å la en tom godt mellom hver prøve i96-brønns plate som brukes for å måle luciferase-aktivitet.
Det finnes en rekke mulige bruksområder for tetracistronic trVLPs. Tydeligvis er de godt egnet til å studere oppføring av filovirus partikler, siden infeksiøse trVLPs har typisk tråd-lignende struktur av infeksiøse filoviruses 14, og inneholder de samme virale komponenter som filovirus partikler. Viktigere, har de ikke inneholder komponenter av andre virus, slik tilfellet er ved bruk av pseudotyped virioner eller viruslignende partikler, for eksempel retrovirus partikler som bærer GP 1,2, eller rekombinante virus, så som rekombinant vesikulær stomatitt-virus som uttrykker gp 1,2 . Kravet til festefaktorer ved bruk av 293 celler som målceller i dette systemet kan utnyttes til skjermen i og undersøke rollen til slike festefaktorer, mens rollene til andre cellulære faktorer, slik som de som er involvert i genomreplikasjon og transkripsjon, samt morphogenesis og knoppding, kan undersøkes ved hjelp av RNAi teknologi. Effekten av mutasjoner i virusproteiner på viruset livssyklusen kan også bli studert, men man må huske på at mens VP40, GP 1,2, og VP24 er uttrykt etter viral transkripsjon, er uttrykk for de andre virusproteiner oppnådd fra uttrykket plasmider, slik at effekter på grunn av overekspresjon av disse proteinene må tas i betraktning. I tillegg bør man sørge for at mutasjoner i minigenome ikke vesentlig endre lengden på minigenome, siden reporter aktivitet er direkte berørt av minigenome lengde 15. Til slutt, siden tetracistronic minigenomes er virale genom analoger som bærer virale gener, og blir kopiert av den virale polymerase komplekset, bør det også være mulig å studere utviklingen av disse gener i respons til mutasjoner i henhold BSL2 betingelser. Således, mens videre studier er fremdeles nødvendig i denne retning, skal det være mulig, for eksempel for å innføre suboptimalmutasjoner i gener innenfor minigenome og deretter passasje trVLPs til gratis mutasjoner dukke opp.
En begrensning av den tetracistronic trVLP analysen som må holdes i bakhodet er det faktum at mens det modeller meste av virus livssyklus, primær transkripsjon i målceller er ikke modellert av dette systemet, siden målceller har til å uttrykke de nukleocapsidproteiner i trans for at trVLPs å gjenskape. Hvis primære transkripsjon må vurderes, er det mulig å bruke naive målceller 10; Imidlertid, i dette tilfellet ingen genom-replikasjon foregår i målceller, og ingen flere infeksiøse trVLPs produseres, avbrytes infeksjon. Dette er et prinsipp problem som ikke kan løses uten å gjengi de trVLPs helt selvreplikerende, ved å inkludere genene for de nukleocapsidproteiner inn i minigenome, som ville de facto slå dem i smittsomme rekombinante Ebola virus. Faktisk, EbolA-virus som uttrykker luciferase, eller andre reportere er blitt generert, og kan bli anvendt for å vurdere og studere genom replikasjon og transkripsjon 17,18; Imidlertid er deres anvendelse begrenset til BSL4 laboratorier. Dessuten har det å være oppmerksom på at mens VP40, GP 1,2, og VP24 er uttrykt fra en viral genom analog, deres posisjon i minigenome (2., 3., og 4. transcriptional enhet) er ikke identisk med deres posisjon i det virale genomet (3., 4. og 6. transcriptional unit), som kan påvirke deres absolutte ekspresjonsnivåer, så vel som deres relative ekspresjonsnivåer i forhold til hverandre.
Samlet sett representerer den tetracistronic trVLP analysen den mest omfattende livssyklus modellering system for Ebola virus tilgjengelige per i dag, og gjør at modellering av genom replikering og transkripsjon, partikkel morphogenesis og spirende, samt vedlegg og noprøve inn i målceller over flere infeksjonssykluser. Som sådan, har det stort potensial for bruk i å undersøke biologi Ebola virus henhold BSL2 forhold.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne er svært takknemlig til Bob Fischer (LV, DIR, NIAID, NIH), som fungerte som fortelleren, samt Austin Athman (RTB, DIR, NIAID, NIH) og Megan Morgan (DOHS, ORS, OD, NIH) for deres hjelp med å lage filmen følger dette manuskriptet. Videre ønsker vi å takke Allison Groseth (LV, DIR, NIAID, NIH) for kritisk lesing av manuskriptet. Denne forskningen ble støttet av egenutført Research Program av NIH, NIAID.
75cm2 cell culture flask | Corning | 430641 | |
DMEM | Sigma | D6546 | preheat to 37°C prior to use |
FBS | Life Technologies | 26140-079 | heat inactivate 30 min @ 56°C |
L-Glutamine | Life Technologies | 25030-081 | 100X |
Pen Strep | Life Technologies | 15070-063 | 100X |
0.25% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200-056 | |
PBS | 8 g NaCl, 0.2g KCl, 1.44g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4, H2O ad 1 liter; autoclave and store at room temperature | ||
6-well plates | Costar | 3516 | |
Opti-MEM I | Life Technologies | 31985-070 | |
Transit LT1 | Mirus | MIR 2300 | |
Glo lysis buffer | Promega | E2661 | |
Renilla Glo luciferase assay system | Promega | E2720 | |
96-well assay plate (white) | Costar | 3912 | |
Modulus microplate luminometer | Turner Microsystems | 998-9300 |