Summary
Werk met besmettelijke virussen Ebola is beperkt tot de bioveiligheid niveau 4 laboratoria. Tetracistronic-minigenoom met replicatie en transcriptie-bevoegde virusachtige deeltjes (trVLPs) vertegenwoordigen een levenscyclus modeling systeem dat ons in staat stelt om veilig te modelleren meerdere besmettelijke cycli onder bioveiligheid niveau 2 voorwaarden, die uitsluitend op Ebola-virus componenten.
Abstract
Ebola-virus veroorzaakt ernstige hemorragische koorts bij mensen en niet-menselijke primaten, met letaliteit zo hoog als 90%. Er zijn geen goedgekeurde vaccins of specifieke behandelingen voor de ziekte veroorzaakt door deze virussen, en met infectieuze Ebola virussen is beperkt tot bioveiligheidsniveau 4 laboratoria aanzienlijk beperken het onderzoek naar deze virussen. Lifecycle modellering systemen model van het virus levenscyclus onder bioveiligheid niveau 2 voorwaarden; Tot voor kort dergelijke systemen zijn beperkt hetzij afzonderlijke aspecten van de levenscyclus virus of een infectieuze cyclus. Tetracistronic minigenomen, bestaande uit Ebola-virus niet-coderende gebieden, een reportergen, en drie Ebola virus genen betrokken bij morfogenese, ontluikende en invoer (VP40, GP 1,2 en VP24), kan worden gebruikt voor replicatie en transcriptie produceren -competent virusachtige deeltjes (trVLPs) die deze minigenomen. Deze trVLPs kan continu infecteren cellen die het Ebolavirus eiwitten die verantwoordelijk zijn voor het genoom replicatie en transcriptie, waardoor wij veilig modelleren meerdere besmettelijke cycli onder bioveiligheid niveau 2 voorwaarden. Belangrijk zijn de virale componenten van deze systemen uitsluitend afkomstig van Ebola-virus en niet van andere virussen (zo is bijvoorbeeld het geval in systemen met pseudo-virussen) en VP40, VP24 GP 1,2 en niet overexpressie in dit systeem , waardoor het uitermate geschikt voor het bestuderen morfogenese, ontluikende en toegang, hoewel andere aspecten van het virus levenscyclus zoals genoom replicatie en transcriptie kunnen ook worden gemodelleerd met dit systeem. Daarom is de tetracistronic trVLP test vertegenwoordigt de meest uitgebreide levenscyclus modelleren systeem beschikbaar voor Ebola virus, en heeft een enorm potentieel voor gebruik in het onderzoek naar de biologie van Ebola-virus in de toekomst. Hier geven we informatie over het gebruik van dit systeem, en op verwachte resultaten.
Introduction
Ebola-virussen zijn de verwekker van een ernstige hemorragische koorts bij mensen en niet-menselijke primaten met een case fatality van maximaal 90% in de menselijke uitbraken 1. Hoewel er aanzienlijke vooruitgang is geboekt in de afgelopen jaren in het ontwikkelen van vaccins en specifieke behandelingen (beoordeeld in 2,3), deze zijn niet goedgekeurd voor menselijk gebruik. Ebola virus deeltjes een karakteristieke draderige uiterlijk met een lengte van ongeveer 1 urn en een diameter van 96-98 nm 4. Een nucleocapside vormt de kern van de virale deeltjes en bestaat uit 1) de niet-gesegmenteerde enkelstrengs negatieve-sense RNA-genoom, waarbij de 7 ebolavirus genen codeert (figuur 1), 2) het nucleoproteïne NP, waarbij het genoom encapsidates, 3 ) het virale polymerase complex bestaande uit het polymerase L en de cofactor VP35, en 4) de transcriptionele activator VP30. Bovendien is recent aangetoond dat het eiwit VP24 ook geassocieerd met nucleocapsides 4. De nucleocapside omgeven door de matrix ruimte waarin de matrix eiwit VP40, dat verantwoordelijk is voor morfogenese en ontluiken van virions ligt. Virus deeltjes verder omhuld en ingebed in die enveloppe is het enige oppervlakte-eiwit GP 1,2, die verantwoordelijk is voor virion hechting en binnenkomst.
Werken met besmettelijke Ebola virus heeft een maximale containment laboratorium onder bioveiligheidsniveau (BSL) 4 voorwaarden die dit werk een aantal faciliteiten wereldwijd beperkt te voeren. Om de biologie van deze virussen te bestuderen of om nieuwe therapieën onder BSL2 omstandigheden ontwikkelen onderzoekers beroepen op recombinante overexpressie van Ebola-virus eiwitten, of levenscyclus modelleringssystemen, die beide gewerkt kan worden in afwezigheid van besmettelijke Ebola virus. Recombinante expressie van Ebola-virus eiwitten ofwel verkregen uit expressie plasmiden of virale vectoren. Een speciaal geval van deze strategie is devorming van virionen of virusachtige deeltjes op basis van andere virussen dan Ebola-virussen (meestal retrovirussen of vesiculair stomatitis virus) in de aanwezigheid van recombinant tot expressie GP 1,2, leidt tot de vorming van pseudo-deeltjes die kunnen worden gebruikt om te bestuderen proces voor het invoeren van filovirussen en het scherm voor invoer remmers 5. Als alternatief kunnen recombinante virussen (bijvoorbeeld, vesiculaire stomatitis virus) dat het Ebola-virus GP 1,2 coderen in plaats van hun eigen glycoproteïne worden gegenereerd en gebruikt om virus entry onder bioveiligheid niveau 2 voorwaarden 6 bestuderen.
Lifecycle modellering systemen zijn vormen van reverse genetics systemen met het gebruik van afgekapt Ebola-virus genoom analogen (minigenomen), die in eerste instantie worden geproduceerd uit cDNA en vervolgens gerepliceerd en getranscribeerd door Ebola-virus eiwitten in trans. De eerste minigenoom systeem voor Ebola virus werd meer dan 15 jaar geleden 7 ontwikkeld, En is sindsdien gebruikt om Ebola-virus genoom replicatie en transcriptie (beoordeeld in 8,9) te bestuderen. In dit systeem een monocistronisch minigenoom bestaande uit een reporter gen geflankeerd door de terminal niet-coderende gebieden van het Ebola-virus genoom (de leader en trailer) (Figuur 1) tot expressie wordt gebracht in zoogdiercellen (gewoonlijk door transcriptie met T7 RNA polymerase) samen met de virale proteïnen L, VP35, VP30 en NP. De minigenoom wordt ingekapseld door NP en daarna gerepliceerd en getranscribeerd door de andere nucleocapside eiwitten onder toepassing van cis-werkende signalen gelokaliseerd in de leader en trailer, waardoor reporter activiteit die deze twee aspecten van het virus levenscyclus (figuur 2) weerspiegelt.
Om modelleren extra stappen van de virale levenscyclus, transcriptie en replicatie-competent virus-achtige deeltjes hebben (trVLP) systemen ontwikkeld die zijn gebaseerd op klassieke minigenoom systemen, maar hebben het eenvullende uitdrukking van de andere virale eiwitten VP24, VP40 en GP 1,2 uit expressieplasmiden 10,11. De aanwezigheid van VP40 leidt tot de vorming van trVLPs die GP 1,2 oefenen op hun oppervlak dragen en een minigenoom met nucleocapside aan de binnenkant. Deze trVLPs kunnen worden gebruikt om doelwitcellen die ofwel zijn pretransfected met expressieplasmiden voor L, VP35, VP30 en NP, infecteren replicatie en transcriptie van minigenomen gebracht in de doelcellen binnen trVLPs 11 vergemakkelijken, of naïeve doelcellen (dwz zonder-plasmide gedreven uitdrukking van Ebola-virus eiwitten) 10. Dit resulteert in reporter activiteit in target cellen, die de replicatie van het minigenomen in de producerende cellen, morfogenese en ontluiken van trVLPs, hun intrede in doelcellen weerspiegelt, en 1) in het geval van pretransfected doelcellen ook genoomreplicatie en secundaire transcriptie ( dwz transcriptie door virale eiwitten prodptie in target cellen) in target cellen, of 2) in het geval van naïeve doelcellen ook primaire transcriptie (dwz transcriptie door virale eiwitten in doelcellen gebracht binnen trVLPs) (figuur 3). Belangrijk, zijn deze systemen alleen gebruikt om het model een infectieuze cyclus, en vertrouwen op overexpressie van alle virale eiwitten, die in het geval van VP24 en VP40 is bijzonder problematisch, omdat deze eiwitten is aangetoond dat sterke negatieve regulatoren van genoomreplicatie en uitgeschreven bij overexpressie van plasmiden 12,13. Verder trVLP preparaten die in deze systemen bevatten een hoog aandeel niet-infectieuze deeltjes, poseren uitdagingen voor de biochemische analyse van besmettelijke trVLPs 14.
Om deze problemen te overwinnen, hebben we onlangs een tetracistronic minigenoom systeem dat, naast een reportergen, bevat ook de genen die coderen voor VP40, GP 1,2 en ontwikkeldVP24 (figuur 1). Vergelijkbaar met de klassieke monocistronisch minigenoom systeem, dit systeem leidt tot de productie van trVLPs die doelcellen kunnen infecteren (figuur 4) 15. In tegenstelling tot de klassieke minigenoom systeem, VP40, GP 1,2 en VP24 geproduceerd na virale genoom transcriptie plaats van overexpressie van plasmiden. Dientengevolge, de kinetiek en expressieniveaus van deze eiwitten veel beter nabootsen die gevonden in de virale levenscyclus, en daarmee de verhouding van infectueuze tot niet-infectieuze trVLPs verhoogd ongeveer 500-voudig in dit systeem 15. Verder gebruik van dit systeem was het mogelijk om continu passage tetracistronic-minigenoom bevattende trVLPs, modelleren meerdere infectieuze cycli. Als zodanig tetracistronic trVLPs zijn momenteel de meest uitgebreide levenscyclus modeling systeem beschikbaar voor Ebola virus biologie studeren onder BSL2 voorwaarden. Hier bieden we gedetailleerde informatie over het gebruik of dit systeem, alsook op de verwachte resultaten.
Protocol
1 Splitsing van productiecellen voor Initial Production van trVLPs
- Verwijder medium 80-90% confluente 293 cellen gekweekt in 75 cm2 kolven in hoog glucosegehalte gemodificeerd Eagle's medium van Dulbecco (DMEM) met 10% foetaal bovine serum (FBS), 2 mM L-glutamine en 1 x pen / strep (DMEM10 ). Was de cellen tweemaal met 10 ml fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS), voorzichtig de cellen niet te verjagen, en voeg 2 ml trypsine-EDTA op de cellen.
- Incubeer de cellen bij kamertemperatuur totdat cellen vertonen aanzienlijke afronding indien waargenomen onder een microscoop (ongeveer 30 seconden). Verjagen cellen door te tikken op fles, en voeg 8 ml DMEM10. Grondig resuspendeer de cellen door voorzichtig pipetteren en omlaag tot een enkele celsuspensie wordt waargenomen wanneer bekeken onder de microscoop.
- Tel de cellen met behulp van een geautomatiseerde celteller. Verdun cellen 2 x 10 5 cellen per ml in DMEM10. Pipetteer 2 ml celsuspensie per well in 6-well platen (4 x 105 cellen per putje).
- Incubeer de platen in een bevochtigde weefselcultuur incubator bij 37 ° C met 5% CO2.
2 Transfectie van productiecellen voor Initial Production van trVLPs
- 24 uur na de splitsing van de cellen (zie figuur 5 voor een overzicht van het experiment timing), pipet plasmide DNA 15 (bedragen zie tabel 1) in een steriele 2 ml cryovial middels gefiltreerd tips. Voeg 100 ul per putje OptiMEM het DNA. Vortex het mengsel kort en voorzichtig spin down de buizen met behulp van een microfugebuis. Indien meerdere putten worden getransfecteerd met identieke plasmiden kan een mastermix meerdere putjes worden.
- Kort vortex de flacon met Transit LT1 voor gebruik. Voeg 7.5 ul Transit LT1 per putje om de verdunde DNA. Voorzichtig vortex het mengsel, zorg ervoor dat u vloeistof op te vangen in het deksel van de cryovial, en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
- Meng de transfectiecomplex door en neer te pipetteren. Voeg 100 ul van de transfectie complexen druppelsgewijs aan elk putje. Rock de plaat naar voren / achteren en van links naar rechts om de transfectie complexen verdelen. Niet zwenk de plaat, omdat dit zal leiden tot ongelijke spreiding van de transfectie complexen.
- Zet de cellen naar de incubator.
- Na 24 uur, de bovenstaande vloeistof van de cellen. Voeg 4 ml DMEM met 5% FBS, 2 mM L-glutamine, 1x pen / strep (DMEM5) aan de cellen. Deze stap kan tot 3 putjes tegelijk zonder drogen van de putjes, uitgaande van de putjes bevatten identieke monsters (anders door de zichzelf versterkende karakter van de trVLPs in dit systeem kruisbesmetting kan een probleem worden en Deze stap moet men goed gedaan tegelijk).
- Zet de cellen naar de incubator.
3 Voorbereiding van de doelcellen
- Gesplitst 293 cellen zoals beschreven in paragraaf 1, zaaien 4 x 10 5 cellen in 2 ml DMEM10 per putje van een6-well plaat.
- 24 uur na de splitsing van de doelcellen en 24 uur vóór infectie, transfecteren doelcellen zoals beschreven in paragraaf 2 met behulp van de DNA-bedragen in tabel 1, en 4,5 pl Transit LT1 per well.
4 Infectie van doelcellen en Oogst van producerende cellen
- Breng de supernatanten van de producerende cellen 15 ml buizen. Verwijder eventuele resterende bovenstaande vloeistof met behulp van een vacuüm slang. Voeg 250 ul lysis buffer Glo aan de cellen.
- Centrifugeer supernatant gedurende 5 min bij 800 xg en kamertemperatuur om de monsters van cellulair afval te verwijderen.
- Verwijder het supernatant van een putje van de doelcellen. Voeg voorzichtig 3 ml ontruimd producent celsupernatant om cellen met behulp van de langzaamste pipet snelheid richten. Niet direct pipetteren op de cellen om te verstoren de cel monolaag. Deze stap heeft een goed worden gedaan tegelijk.
- Wanneer alle monsters trans geweestovergedragen, terug de doelcellen aan de incubator om sedimentatie van trVLPs en infectie van doelcellen toe te staan.
- Na 15 min incubatie bij kamertemperatuur in het Glo lysis buffer, resuspendeer de productiecellen in de lysisbuffer met een micropipet op 150 pl, en breng het monster in een 2 ml cryovial. Op dit punt, kan lysaten bij -80 ° C worden ingevroren, of rechtstreeks gemeten zoals beschreven in hoofdstuk 6.
- 24 uur na infectie, de bovenstaande vloeistof uit de doelcellen. Voeg 4 ml DMEM5 per putje om de cellen. Deze stap kan tot drie putjes tegelijk, als de putjes bevatten identieke monsters (anders door de zichzelf versterkende karakter van de trVLPs in dit systeem kan kruisbesmetting worden een probleem en deze stap moet een goed gedaan op een moment).
5 Oogst van Target Cellen voor een Single Cycle Infectie
- Als slechts een enkele besmettelijke cyclus moet worden beoordeeld, op 72 uur na de infectie te verwijderen thij supernatant van de doelcellen met een vacuümslang.
- Oogst de cellen in 250 ul Glo lyseerbuffer zoals beschreven in paragraaf 4 voor de producerende cellen.
6 Oogst van Target Cellen en continue passage van de trVLPs
- Als trVLPs moeten continu worden gepasseerd, stelt een nieuwe reeks doelcellen zoals beschreven in hoofdstuk 3, zodat ze klaar zijn voor infectie 72 uur na infectie van de eerste set doelcellen (zie figuur 5).
- Infect de nieuwe reeks doelcellen zoals beschreven in punt 4 (de eerste set doelcellen in plaats van de producerende cellen).
- Herhaal deze stappen om de 72 uur.
7 Analyse van Reporter activiteit
- Als cellysaten werden bevroren, ontdooien bij kamertemperatuur. Ervoor dat de monsters kamertemperatuur voorafgaand aan de meting hebben bereikt.
- Ontdooi de benodigde hoeveelheid (40 ul per monster) van Renilla Glo assay buffer (idealiter bevroren in monsters) bij kamertemperatuur. Zorg ervoor dat de buffer kamertemperatuur voorafgaand aan de meting heeft bereikt.
- Voeg 1/100 ste volume van Renilla Glo substraat aan de Renilla Glo assay buffer om Renilla Glo reagens te verkrijgen, en door vortexen gemengd. Pipetteer 40 ul van de Renilla Glo reagens in een witte plaat met 96 putjes.
- Voeg 40 ul van het monster op de Renilla-Glo reagens. Wacht 10 minuten en meet de monsters in een luminometer met een integratietijd van 1 seconde.
Representative Results
Transfectie van 293 producerende cellen met expressie plasmiden die coderen voor het Ebola-virus nucleocapside eiwitten NP, VP35, VP30, en L, een tetracistronic minigenoom en de accessoire T7 polymerase resultaten in minigenoom replicatie en transcriptie en reporter activiteit die gemakkelijk waarneembaar bij 72 uur (Figuur 6 ). Belangrijk is dat de waargenomen reporter activiteit (10 5.6 relatieve luminescentie-eenheden (RLU)) dat van een negatieve controle waarin de expressie plasmide codeert L werd weggelaten uit de transfectie (10 3 RLU) met meer dan 2 logs. De geringe activiteit waargenomen ook in afwezigheid van L is waarschijnlijk te wijten aan een cryptische promoter in de minigenoom plasmide. Target cellen geïnfecteerd met trVLPs van de supernatant van productiecellen blijkt zelfs enigszins verhoogde niveaus van reportergen-activiteit in vergelijking met producerende cellen en waarden bereikt tussen 10 en 10 6 7 RLE's, afhankelijk van de passage. Daarentegen wanneer de supernatant van -L control producerende cellen gepasseerd op doelcellen (expressie alle nucleocapside eiwitten, waaronder L), ofwel reporter activiteit niet hoger dan de achtergrondruis van de luminometer (ongeveer 10 2 RLU).
De tetracistronic trVLP test kan worden gebruikt om de levenscyclus van Ebola virussen bestuderen. Bijvoorbeeld, infectie van 293-cellen met trVLPs is afhankelijk van de aanwezigheid van hechting factoren zoals Tim-1 16, die moet in trans worden verstrekt in deze cellen. Dientengevolge, in een tetracistronic trVLP assay een daling van reporter-activiteit in doelwitcellen van ongeveer 100-voudig wordt waargenomen in de afwezigheid van Tim-1 (Figuur 7A). De rol van specifieke (virale of cellulaire) eiwitten in het virus levenscyclus kan ook worden beoordeeld met behulp van RNAi-technologie in combinatie met deze aanpak. Als voorbeeld, RNAi-gemedieerde down-regulatie van L resulteert in een daling reporter activiteit van ongeveer 100-voudig, die de centrale rol van L inreplicatie en transcriptie (figuur 7B) 7. Verder is het mogelijk om direct manipuleren van de minigenoom om het effect van mutaties van het virus levenscyclus beoordelen. Als voorbeeld, wanneer VP24 expressie van het minigenoom wordt opgeheven door inbrengen van 3 stopcodons onmiddellijk stroomafwaarts van het startcodon, reporter activiteit producerende cellen niet wezenlijk veranderd; echter reporter-activiteit in doelwitcellen met ongeveer 20-voudig na een passage, en 400-voudig na twee passages, hetgeen een rol van VP24 bij de productie van infectieuze trVLPs (figuur 7C) 15.
Figuur 1 Structuur van het Ebola-virus genoom evenals monocistronische en tetracistronic minigenomen. Coderende gebieden voor het Ebola-virus eiwit als rode (NP,VP35, VP30, en L), geel (VP40 en VP24) of blauw (GP 1,2) dozen. Niet-coderende gebieden (NCR) worden in het groen, met de leider en trailer gebieden aangegeven. Het subscript geeft aan welke virale NCR werd gebruikt voor het samenvoegen van de coderende gebieden. Het coderende gebied voor de reporter (rep) wordt in paars.
Figuur 2 monocistronisch minigenoom assay. Cellen worden getransfecteerd met expressieplasmiden voor het Ebola-virus nucleocapside eiwitten (NP, VP35, VP30, L), een monocistronisch minigenoom (mg) en de T7 polymerase. De minigenoom wordt aanvankelijk getranscribeerd door T7 polymerase (a) in een unencapsidated minigenoom RNA in dezelfde oriëntatie als het virale genoom (vRNA), die vervolgens wordt ingekapseld door NP (b). Dit ingekapseld vRNA gerepliceerd via een minigenoom complementair RNA (cRNA) tussenproductediate (c), en vervolgens omgezet in reporter mRNA (d) die worden vertaald in reporter proteïne (e).
Figuur 3 trVLP assay met een monocistronisch minigenoom. Worden cellen getransfecteerd met expressieplasmiden voor de minigenoom testcomponenten (het Ebola-virus nucleocapside eiwitten NP, VP35, VP30, L, een monocistronisch minigenoom en de T7 polymerase) en VP40, GP 1 , 2 en VP24. Dit leidt tot de vorming van trVLPs dat minigenoom-bevattende nucleocapsiden (f) bevatten. Deze trVLPs kunnen vervolgens infecteren doelcellen (g), die ofwel pretransfected met expressieplasmiden voor NP, VP35, VP30 en L (bovenaan), waardoor replicatie en secundaire transcriptie (d) leidt tot reporterexpressie (e) of naïeve doelcellen (onder), waardoor transcriptie van het primaire minigenomes (h), leidt ook tot expressie reporter (e).
Figuur 4 trVLP assay met een tetracistronic minigenoom. Cellen worden getransfecteerd met expressieplasmiden voor het Ebola-virus nucleocapside eiwitten (NP, VP35, VP30, L), een tetracistronic minigenoom (mg) en de T7 polymerase. Eerste transcriptie (a), inkapseling (b), genoom replicatie (c) en transcriptie (d) alsmede vertaling (e) voorkomen als een monocistronisch minigenoom assay. Echter naast reporter mRNA, mRNA voor VP40, VP24 GP 1,2 en ook getranscribeerd vanaf de tetracistronic minigenoom, resulterend in de vorming van trVLPs (f). Deze trVLPs infecteren doelcellen die zijn pretransfected met expressieplasmiden voor de nucleocapside eiwitten NP, VP35, VP30 en L, alsook de cellulaire Ebola virusattachment factor Tim-1, waardoor genoom replicatie en transcriptie en de productie van trVLPs die kunnen worden gebruikt om nieuwe doelcellen infecteren.
Figuur 5 timing van een tetracistronic trVLP assay gedurende 3 opeenvolgende passages. De dagen zaaien cellen (s), het transfecteren cellen (t), infecteren cellen (i), mediumverversing (c) en oogsten van cellen en trVLPs (h) zijn dienen drie opeenvolgende passages (aangegeven door pijlen).
Figuur 6 Typische niveaus van reporter-activiteit waargenomen in een tetracistronic trVLP assay. A tetracistronic trVLP test werd uitgevoerd op 5 passages na het protocolol die in dit manuscript. Als een negatieve controle het expressieplasmide dat codeert L weggelaten (-L) van transfectie van de p0 producerende cellen. Doelcellen passages P1 p5 werden getransfecteerd met expressieplasmiden voor alle nucleocapside eiwitten, waaronder L. De achtergrondruis van de luminometer wordt aangeduid als een stippellijn. Gemiddelden en standaarddeviaties van 4 biologische replicaten van 3 onafhankelijke experimenten zijn getoond.
Figuur 7 Beoordeling van het effect van de verschillende virale en cellulaire factoren op de virale levenscyclus behulp tetracistronic trVLPs. (A) Tim-1 als bijlage factor. Doelwitcellen die werden pretransfected met expressieplasmiden die coderen voor het nucleocapside eiwitten en met of zonder een plasmide dat codeert voor Tim-1 (beschreven in 15) werden geïnfecteerd met tetracistronic trVLPs. 72 uur na infectie reporter-activiteit in p1 doelcellen werd bepaald. Gemiddelden en standaarddeviaties van 4 biologische herhalingen van 4 onafhankelijke experimenten zijn getoond. (B) Effect van RNAi knockdown van L op genoom replicatie en transcriptie. Doelwitcellen die werden pretransfected met expressieplasmiden voor de nucleocapside componenten, Tim-1 en miRNAs tegen L (anti-L) of een niet verwant eiwit (anti-GFP) (in 15 beschreven) werden geïnfecteerd met tetracistronic trVLPs. 72 uur na infectie reporter-activiteit in p1 doelcellen werd bepaald. Gemiddelden en standaarddeviaties van 5 biologische replicaten van 2 onafhankelijke experimenten zijn getoond. (C) Effect van mutaties in het minigenoom op trVLP infectiviteit. Een tetracistronic trVLP assay werd uitgevoerd met behulp van een wildtype minigenoom (4cis-WT) of minigenoom in die 3 stopcodons had onmiddellijk geïntroduceerd na de start codon van VP24, afschaffen uiten of dit eiwit, maar de invoering slechts minimale wijzigingen aan de minigenoom met betrekking tot de lengte, nucleïnezuursamenstelling, secundaire structuren etc. Reporter activiteit in p0, p1 en p2 werd gemeten 72 uur na transfectie / infectie. Gemiddelden en standaardafwijkingen van 3 biologische replicaten van 3 onafhankelijke experimenten zijn getoond.
| Producerende cellen (p0) | Target Cells (p1 en hoger) | |
| pCAGGS-NP | 125 | 125 |
| pCAGGS-VP35 | 125 | 125 |
| pCAGGS-VP30 | 75 | 75 |
| 1.000 | 1.000 | |
| p4cis-vRNA-RLuc | 250 | - |
| pCAGGS-T7 | 250 | - |
| pCAGGS-TIM1 | - | 250 |
Tabel 1 bedraagt DNA voor transfectie. De hoeveelheid van elk plasmide nodig voor de transfectie van producent doelcellen weergegeven in ng per putje van een 6-wells plaat. Alle plasmiden zijn beschreven in Watt et al 15.
Discussion
De tetracistronic trVLP assay in dit manuscript beschreven maakt modellering van het Ebola-virus levenscyclus over meerdere besmettelijke cycli. Belangrijk is, kan de tot dit systeem trVLPs niet de genetische informatie voor het nucleocapside eiwitten NP, VP35, VP30, en L, die samen bijna 60% van het Ebola-virus genoom en zijn essentieel voor virale replicatie bevatten. Integendeel, deze eiwitten hebben in doelwitcellen worden in trans van expressieplasmiden en aandoeningen van cellen niet tot expressie alle 4 van deze eiwitten mislukte. Belangrijk is er geen bewijs van genetische recombinatie voor filovirussen, en er geen gedeelde homologe gebieden tussen de tetracistronic minigenoom en expressieplasmiden voor de nucleocapside eiwitten. Daarom is er geen praktische aanwijzingen noch theoretische basis die kunnen voorzien in de mogelijkheid scheppen van volledige lengte Ebola virus genomen die vervolgens zouden kunnen leidende productie van infectieuze Ebola virussen beter systeem veilig voor gebruik onder omstandigheden BSL2.
Er zijn twee belangrijke stappen in de tetracistronic trVLP assay die worden beïnvloed door de experimentele omstandigheden, dat wil zeggen de productie van trVLPs, en de infectie van doelcellen met deze trVLPs. Productie van trVLPs is afhankelijk hoge minigenoom replicatie en transcriptie, die op zijn beurt afhankelijk is van een hoge transfectie efficiëntie. Transfectie werkzaamheid kan gemakkelijk worden beoordeeld door opname van een -L control, waarbij het expressieplasmide voor L verwisseld met een expressieplasmide coderend eGFP. Transfectie tarieven onder deze omstandigheden hoger mag zijn dan 50% door de inspectie met een fluorescentiemicroscoop 24 uur na transfectie. Verder cellen hebben vrij van mycoplasma te zijn, omdat in onze ervaring mycoplasmabesmetting drastisch verslechtert minigenoom replicatie en transcriptie (ongepubliceerde gegevens). Vanwege hun hoge transfecteerbaarheid 293 cells zijn de cellijn keuze trVLP assays; nochtans zijn deze cellen relatief slecht gevoelig (hoewel niet volledig refractieve) infectie met Ebola virus 16. Expressie van een bijlage factor zoals Tim-1 verhoogt infectie van 293-cellen met trVLPs ongeveer 100-voudig, en is cruciaal voor het succes van dit systeem over verschillende passages.
Terwijl tetracistronic trVLPs niet zelfreplicerend op hun eigen, ze zijn zelfreplicerend in cellen die de nucleocapside eiwitten tot expressie. Als zodanig voorzorgsmaatregelen worden getroffen om kruisbesmetting tussen putjes die verschillende trVLPs (bijvoorbeeld met verschillende mutaties in het minigenoom) voorkomen. Vanuit een technisch oogpunt, vanwege het grote verschil tussen positieve en negatieve signalen bij deze assay (ongeveer 4 blokken), cross-talk tussen monsters voor het meten luciferaseactiviteit kan een probleem zijn; maar dit kan gemakkelijk worden vermeden door het verlaten van een lege vormt elk monster in de96-well plaat gebruikt voor het meten van luciferase-activiteit.
Er zijn een groot aantal mogelijke toepassingen voor tetracistronic trVLPs. Uiteraard zijn zij geschikt voor onderzoek naar de invoer van filovirus deeltjes infectieuze trVLPs de typische draadvormige structuur van infectieuze filoviruses 14 en bevatten dezelfde virale componenten filovirus deeltjes. Belangrijk zij geen componenten van andere virussen, zoals het geval is bij gebruik van pseudo-virions of virusachtige deeltjes, zoals retrovirus deeltjes richting GP 1,2 of recombinante virussen, zoals recombinant vesiculaire stomatitis virus dat GP 1,2 . De vereiste bevestiging factoren bij gebruik 293-cellen als doelcellen in dit systeem kan worden benut voor het screenen op en onderzoeken de rol van dergelijke hechting factoren, terwijl de rol van andere cellulaire factoren, zoals die betrokken bij genoom replicatie en transcriptie alsook morfogenese en budding, kan worden onderzocht met behulp van RNAi-technologie. Het effect van mutaties in virale proteïnen het virus levenscyclus kunnen worden bestudeerd, hoewel men in gedachten houden dat tijdens VP40, GP 1,2 en VP24 expressie na virale transcriptie, wordt de expressie van andere virale eiwitten bereikt expression plasmiden, zodat de effecten door de overexpressie van deze eiwitten moet rekening worden gehouden. Ook moet erop worden gelet dat mutaties in het minigenoom niet fundamenteel aan de lengte van de minigenoom, aangezien reporter activiteit rechtstreeks beïnvloed door minigenoom lengte 15. Tenslotte, aangezien tetracistronic minigenomen virale genoom analogen die virale genen dragen, en worden gerepliceerd door het virale polymerase complex, moet het ook mogelijk zijn de evolutie van deze genen in reactie op mutaties onder BSL2 omstandigheden. Dus, terwijl verdere studies nog vereist richting, moet het mogelijk zijn, bijvoorbeeld, de invoering suboptimalemutaties in genen binnen de minigenoom en vervolgens passage trVLPs tot gratis mutaties ontstaan.
Een beperking van de tetracistronic trVLP test die moet in gedachten worden gehouden, is het feit dat terwijl deze modellen de meeste van het virus levenscyclus, primaire transcriptie in target cellen wordt niet gemodelleerd door dit systeem, omdat doelcellen moeten de nucleocapside eiwitten in trans te uiten zodat de trVLPs te repliceren. Als primaire transcriptie moet worden beoordeeld, is het mogelijk om naïeve doelcellen 10 te gebruiken; echter hier geen genoom replicatie plaatsvindt in doelcellen, en geen verdere infectieuze trVLPs geproduceerd, afbreken de infectie. Dit is een van de belangrijkste probleem dat niet kan worden opgelost zonder dat de betrokken trVLPs volledig zelfreplicerende, door op de genen voor de nucleocapside-eiwitten in de minigenoom, hetgeen de facto ze tot infectieus recombinant Ebola virussen. In feite, Eboleen luciferase expressie virussen of andere reporters zijn gegenereerd en kunnen worden gebruikt om te beoordelen en studie genoom replicatie en transcriptie 17,18; echter, is het gebruik ervan beperkt tot BSL4 laboratoria. Ook heeft het in gedachten dat terwijl VP40, GP 1,2 en VP24 worden uitgedrukt uit een viraal genoom analoog, hun positie in de minigenoom te worden bewaard (2 e, 3 e en 4 e transcriptie-eenheid) is niet identiek aan hun positie in het virale genoom (3e, 4e en 6e transcriptionele eenheid), die de absolute expressieniveaus, evenals hun relatieve expressieniveaus met gebied kan beïnvloeden elkaar.
Kortom, de tetracistronic trVLP test is de meest levensduurbeheer modelsysteem voor Ebola virussen tot op heden beschikbare en maakt de modellering van genoom replicatie en transcriptie, deeltjes morfogenese en ontluikende alsmede gehechtheid en nlProbeer in doelcellen over meerdere infectieuze cycli. Als zodanig, het heeft een enorm potentieel voor gebruik in het onderzoek naar de biologie van Ebola virus onder BSL2 voorwaarden.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
De auteurs zijn erg dankbaar voor Bob Fischer (LV, DIR, NIAID, NIH), die als verteller optrad, evenals Austin Athman (RTB, DIR, NIAID, NIH) en Megan Morgan (DOHS, ORS, OD, NIH) voor hun hulp bij het maken van de film bij dit manuscript. Verder willen we Allison Groseth (LV, DIR, NIAID, NIH) bedanken voor het kritisch lezen van het manuscript. Dit onderzoek werd gesteund door de Intramurale Research Program van de NIH, NIAID.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 75 cm2 Cell culture flask | Corning | 430641 | |
| DMEM | Sigma | D6546 | preheat to 37 °C prior to use |
| FBS | Life Technologies | 26140-079 | heat inactivate 30 min @ 56 °C |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030-081 | 100x |
| Pen/strep | Life Technologies | 15070-063 | 100x |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200-056 | |
| PBS | 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4, H2O add 1 L; autoclave and store at room temperature | ||
| 6-well Plates | Costar | 3516 | |
| Opti-MEM I | Life Technologies | 31985-070 | |
| Transit LT1 | Mirus | MIR 2300 | |
| Glo lysis buffer | Promega | E2661 | |
| Renilla Glo luciferase assay system | Promega | E2720 | |
| 96-well Assay plate (white) | Costar | 3912 | |
| Modulus microplate luminometer | Turner Microsystems | 998-9300 |
References
- Kuhn, J. H., et al. Evaluation of perceived threat differences posed by filovirus variants. Biosecurity and bioterrorism : biodefense strategy, practice, and science. 9, 361-371 (2011).
- Falzarano, D., Feldmann, H. Possible leap ahead in filovirus therapeutics. Cell research. , (2014).
- Hoenen, T., Groseth, A., Feldmann, H. Current ebola vaccines. Expert opinion on biological therapy. 12, 859-872 (2012).
- Beniac, D. R., et al. The organisation of ebola virus reveals a capacity for extensive, modular polyploidy. PloS one. 7, e29608 (2012).
- Basu, A., Mills, D. M., Bowlin, T. L. Chapter 13, Unit 13B 13, High-throughput screening of viral entry inhibitors using pseudotyped virus. Current protocols in pharmacology. Enna, S. J. , (2010).
- Wong, A. C., Sandesara, R. G., Mulherkar, N., Whelan, S. P., Chandran, K. A forward genetic strategy reveals destabilizing mutations in the Ebolavirus glycoprotein that alter its protease dependence during cell entry. J Virol. 84, 163-175 (2010).
- Muhlberger, E., Weik, M., Volchkov, V. E., Klenk, H. D., Becker, S. Comparison of the transcription and replication strategies of marburg virus and Ebola virus by using artificial replication systems. J Virol. 73, 2333-2342 (1999).
- Hoenen, T., Groseth, A., de Kok-Mercado, F., Kuhn, J. H., Wahl-Jensen, V. Minigenomes, transcription and replication competent virus-like particles and beyond: reverse genetics systems for filoviruses and other negative stranded hemorrhagic fever viruses. Antiviral Res. 91, 195-208 (2011).
- Hoenen, T., Feldmann, H. Reverse genetics systems as tools for the development of novel therapies against filoviruses. Expert Rev Anti Inf Ther. , 1253-1263 (2014).
- Hoenen, T., et al. Infection of naive target cells with virus-like particles: implications for the function of ebola virus VP24. J Virol. 80, 7260-7264 (2006).
- Watanabe, S., et al. Production of novel ebola virus-like particles from cDNAs: an alternative to ebola virus generation by reverse genetics. J Virol. 78, 999-1005 (2004).
- Hoenen, T., Jung, S., Herwig, A., Groseth, A., Becker, S. Both matrix proteins of Ebola virus contribute to the regulation of viral genome replication and transcription. Virology. 403, 56-66 (2010).
- Watanabe, S., Noda, T., Halfmann, P., Jasenosky, L., Kawaoka, Y. Ebola virus (EBOV) VP24 inhibits transcription and replication of the EBOV genome. J Infect Dis. 2 (196 Suppl 2), S284-S290 (2007).
- Spiegelberg, L., et al. Genus-specific recruitment of filovirus ribonucleoprotein complexes into budding particles. J Gen Virol. 92, 2900-2905 (2011).
- Watt, A., et al. A novel lifecycle modeling system for Ebola virus shows a genome length-dependent role of VP24 on virus infectivity. J Virol. , (2014).
- Kondratowicz, A. S., et al. T-cell immunoglobulin and mucin domain 1 (TIM-1) is a receptor for Zaire Ebolavirus and Lake Victoria Marburgvirus. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 8426-8431 (2011).
- Hoenen, T., Groseth, A., Callison, J., Takada, A., Feldmann, H. A novel Ebola virus expressing luciferase allows for rapid and quantitative testing of antivirals. Antiviral Res. 99, 207-213 (2013).
- Hoenen, T., et al. Inclusion bodies are a site of ebolavirus replication. J Virol. 86, 11779-11788 (2012).
