Arbetet med smitt Ebola-virus är begränsad på biosäkerhet nivå fyra laboratorier. Tetracistronic minigenome innehållande replikation och transkription kompetenta viruslika partiklar (trVLPs) utgör ett livscykelmodelleringssystem som tillåter oss att på ett säkert sätt modellera flera infektionscykler under skyddsnivå 2 villkor, att förlita sig enbart på Ebola viruskomponenter.
Ebola-virus orsaka allvarliga hemorragiska febrar hos människor och andra primater, med dödligheten så hög som 90%. Det finns inga godkända vacciner eller specifika behandlingar för sjukdomen som orsakas av dessa virus, och arbeta med smitt Ebola-virus är begränsad på biosäkerhet nivå fyra laboratorier, kraftigt begränsar forskningen om dessa virus. Lifecycle modellsystem modell viruset livscykel enligt skyddsnivå 2 villkor; Men fram till nyligen sådana system har begränsats till antingen enskilda aspekter av viruset livscykel, eller en enda smittcykel. Tetracistronic minigenomes, som består av Ebola-virus icke-kodande regioner, en reporter gen och tre ebolavirus gener involverade i morfogenes, spirande, och inträde (VP40, GP 1,2, och VP24), kan användas för att producera replikation och transkription -competent virusliknande partiklar (trVLPs) innehåller dessa minigenomes. Dessa trVLPs kan kontinuerligt infektera celler som uttrycker Ebolavirusproteiner som ansvarar för genomet replikering och transkription, vilket tillåter oss att på ett säkert sätt modellera flera infektionscykler under skyddsnivå 2 villkor. Viktigt är de virala komponenterna i dessa system enbart härrör från Ebola-virus och inte från andra virus (som är till exempel fallet i system som använder pseudotypade virus) och VP40, GP 1,2 och VP24 inte är överuttryckt i detta system , vilket gör den idealiskt lämpad för att studera morfogenes, knoppning och inträde, även om andra aspekter av virusets livscykel, såsom genomreplikation och transkription kan också modelleras med detta system. Därför representerar tetracistronic trVLP analysen den mest omfattande livscykelmodelleringssystem för Ebola-virus, och har en enorm potential för användning vid undersökning biologi Ebola-virus i framtiden. Här ger vi detaljerad information om användningen av detta system, liksom på förväntade resultat.
Ebola-virus är den orsakande agent för en allvarlig hemorragisk feber hos människor och icke-mänskliga primater med dödligheten med upp till 90% i mänskliga utbrott 1. Även om det har skett betydande framsteg under de senaste åren för att utveckla vacciner samt särskilda behandlingar (över 2,3), är dessa inte godkända för humant bruk. Ebola-viruspartiklar har en karakteristisk trådliknande utseende med en längd av ca 1 ^ m och en diameter av 96 till 98 nm 4. En nukleokapsidproteiner utgör kärnan i de viruspartiklar och består av 1) den icke-segmenterad enkelsträngat negativ-sense RNA-genom, som kodar de 7 ebolavirus generna (Figur 1), 2) nukleoproteinet NP, vilket encapsidates genomet, 3 ) det virala polymeraskomplexet bestående av polymeraset L och dess kofaktor VP35, och 4) den transkriptionella aktivatorn VP30. Dessutom har det nyligen visats att proteinet VP24 är också associerat med nukleokapsids 4. Den nukleokapsid omgiven av matrisen utrymme i vilket matrisprotein VP40, som är ansvarig för morfogenes och knoppning av virioner, är belägen. Viruspartiklarna vidare insvept, och inbäddad i kuvertet är den enda ytan protein GP 1,2, som ansvarar för virion infästning och inträde.
Arbetet med smitt Ebola-virus måste utföras inom högst inneslutning laboratorium under biosäkerhetsnivå (BSL) 4 förhållanden, vilket begränsar arbetet till ett fåtal anläggningar i hela världen. För att studera biologi dessa virus eller för att utveckla nya läkemedel i BSL2 förhållanden, forskare förlitar antingen på rekombinant uttryck av Ebola virusproteiner, eller på livscykelmodelleringssystem, som båda kan arbetat med i frånvaro av smittebolavirus. Rekombinant expression av Ebola-virusproteiner är antingen uppnås från expressionsplasmider eller virala vektorer. Ett specialfall av denna strategi är denalstring av virioner eller virusliknande partiklar baserade på andra virus än Ebola virus (retrovirus vanligast eller vesikulärt stomatitvirus) i närvaro av rekombinant uttryckta GP 1,2, vilket leder till generering av pseudotypade partiklar, som kan användas för att studera ingångsprocessen filoviruses och skärm för inträdeshämmare 5. Alternativt kan genereras rekombinanta virus (t.ex. vesikulär stomatit virus) som kodar ebolaviruset GP 1,2 i stället för sin egen glykoprotein och används för att studera virus posten under skyddsnivå 2 villkor 6.
Livscykelmodellsystem är former av omvänd genetik system som presenterar användning av trunkerade ebolavirus genom analoger (minigenomes), som från början är framställda av cDNA och därefter replikerade och transkriberade av Ebola virusproteiner som i trans. Den första minigenome system för ebolaviruset utvecklades mer än 15 år sedan 7, Och har sedan dess använts för att studera ebolavirusgenom replikation och transkription (över 8,9). I detta system är en monocistroniska minigenome bestående av en enda reportergenen flankerad av de terminala icke-kodande regioner av ebolavirus-genomet (kallad ledare och släp) (Figur 1) uttrycks i däggdjursceller (vanligen genom transkription med användning av T7-RNA-polymeras) tillsammans med de virala proteinerna L, VP35, VP30 och NP. Den minigenome är inkapslade av NP och sedan replikeras och skrivs ut av de andra nukleokapsidproteiner hjälp cis-verkande signaler lokaliserade i ledare och släp, vilket leder till reporter aktivitet som speglar dessa två aspekter av virusets livscykel (Figur 2).
För att modellera ytterligare steg i den virala livscykeln, transkription och replikationskompetent virusliknande partikel (trVLP) system har utvecklats, vilka är baserade på klassiska minigenome system, men har i ettY tterligare expression av andra virusproteiner VP24, VP40 och GP 1,2 från expressionsplasmider 10,11. Närvaron av VP40 leder till bildandet av trVLPs, som bär GP 1,2 på sin yta, och bära en minigenome innehållande nukleokapsid på insidan. Dessa trVLPs kan användas för att infektera målceller, vilka antingen har pretransfected med expressionsplasmider för L, VP35, VP30 och NP, för att underlätta replikation och transkription av minigenomes bringas i målcellerna inom trVLPs 11, eller är naiva målceller (dvs. utan plasmid drivna uttryck av Ebola virusproteiner) 10. Detta resulterar i reporteraktivitet i målceller, som speglar replikering av minigenomes i producerande celler, morfogenes och knoppning av trVLPs, de träder i målceller, och 1) i fråga om pretransfected målceller också genomet replikering och sekundär transkription ( dvs transkription av virala proteiner produced i målceller) i målceller, eller 2) i fråga om naiva målceller även primär transkription (dvs transkription av virala proteiner förs in målceller inom trVLPs) (Figur 3). Viktigt är, har dessa system endast använts för att modellera en enda infektiös cykel, och förlita sig på överuttryck av alla virala proteiner, som i fallet med VP24 och VP40 är särskilt problematiskt, eftersom dessa proteiner har visat sig vara starka negativa regulatorer av genomreplikation och transkription när uttrycks från plasmider 12,13. Vidare trVLP beredningar som tillverkas i dessa system innehåller en hög andel icke-infektiösa partiklar, poserar utmaningar för biokemisk analys av smitt trVLPs 14.
För att övervinna dessa problem har vi nyligen utvecklat en tetracistronic minigenome system som, förutom att en reportergen, innehåller också de gener som kodar för VP40, GP 1,2 ochVP24 (Figur 1). I likhet med den klassiska monocistroniska minigenome systemet leder detta system till produktionen av trVLPs som kan infektera målceller (Figur 4) 15. Emellertid i motsats till den klassiska minigenome systemet, VP40, GP 1,2, och VP24 produceras efter viralt genom transkription snarare än att vara överuttryckt från plasmider. Som ett resultat, kinetiken och expressionsnivåerna av dessa proteiner likna mycket närmare de som påträffas under den virala livscykeln, och följaktligen förhållandet av smittsamma för icke-infektiösa trVLPs ökas omkring 500-faldigt i detta system 15. Vidare använder detta system var det möjligt att kontinuerligt passage tetracistronic minigenome innehållande trVLPs, modellering flera infektionscykler. Som sådan tetracistronic trVLPs är för närvarande den mest omfattande livscykelmodelleringssystem som finns att studera ebolavirus biologi enligt BSL2 förhållanden. Här ger vi detaljerad information om användningen of detta system, såväl som den förväntade resultaten.
Den tetracistronic trVLP analys som beskrivs i detta manuskript möjliggör modellering av ebolaviruset livscykel under flera infektionscykler. Viktigt är de trVLPs produceras i detta system inte innehåller den genetiska informationen för nukleokapsidproteiner NP, VP35, VP30, och L, som tillsammans utgör nästan 60% av ebolaviruset genomet och är nödvändiga för virusreplikation. Snarare dessa proteiner måste tillhandahållas i målceller i träns från expressionsplasmider, och någon infektion av celler som inte uttrycker alla 4 av dessa proteiner är förfelad. Viktigt, det finns inga tecken på genetisk rekombination för filoviruses, och det finns inga motsvarande regionerna delas mellan tetracistronic minigenome och uttrycksplasmiderna för nukleokapsidproteiner. Därför finns det inte heller någon praktisk bevisning eller någon teoretisk grund som kan ge en möjlighet att generera full längd Ebola virusgenom som kunde därefter eventuellt ledaproduktion av infektiösa Ebola-virus, vilket gör systemet säkert för användning under BSL2 förhållanden.
Det finns två viktiga steg i tetracistronic trVLP analysen som påverkas av experimentella förhållanden, det vill säga produktion av trVLPs samt infektion av målceller med dessa trVLPs. Produktion av trVLPs är beroende av höga nivåer av minigenome replikation och transkription, vilket i sin tur är beroende av en hög transfektion effektivitet. Transfektion effekt kan lätt bedömas genom att inkludera en -L kontroll, där uttrycket plasmid för L byts mot en expressionsplasmid som kodar eGFP. Transfektion priser under dessa förhållanden bör överstiga 50% genom inspektion med ett fluorescensmikroskop 24 timmar efter transfektion. Vidare celler måste vara fria från mykoplasma, eftersom i vår erfarenhet mykoplasma kontamination dramatiskt försämrar minigenome replikering och transkription (opublicerade data). På grund av deras höga transfectability 293 cells är cellinjen valt för trVLP analyser; Men dessa celler är relativt dåligt mottagliga (om än inte fullständigt brytnings) infektion med ebolaviruset 16. Uttryck av en bilaga faktor såsom Tim-1 förstärker infektion av 293 celler med trVLPs ca 100-faldig, och är avgörande för att lyckas med detta system under flera passager.
Medan tetracistronic trVLPs inte självreplikerande på egen hand, de är självreplikerande i celler som uttrycker de nukleokapsidproteiner. Som sådana försiktighetsåtgärder måste göras för att undvika korskontamination mellan brunnar innehållande olika trVLPs (t.ex. med olika mutationer i minigenome). Ur en mer teknisk synvinkel, på grund av den stora skillnaden mellan positiva och negativa signaler i denna analys (ca 4 stockar), överhörning mellan prover vid mätning luciferasaktivitet kan vara ett problem; Men kan detta lätt undvikas genom att lämna en tom väl mellan varje prov i96-brunnsplatta användes för att mäta luciferasaktivitet.
Det finns en mängd tänkbara applikationer för tetracistronic trVLPs. Självklart, de är väl lämpade för att studera inträde av filovirus partiklar, eftersom infektions trVLPs har den typiska trådliknande struktur av infektiösa filoviruses 14, och innehåller samma virala komponenter som filovirus partiklar. Viktigt är, att de inte innehålla komponenter av andra virus, såsom är fallet vid användning av pseudotypade virioner eller virusliknande partiklar, såsom retroviruspartiklar som bär GP 1,2, eller rekombinanta virus, såsom rekombinant vesikulärt stomatitvirus som uttrycker GP 1,2 . Kravet på fäst faktorer vid användning av 293-celler såsom målceller i detta system kan utnyttjas för att screena för och undersöka rollen av sådana fastsättnings faktorer, medan rollerna av andra cellulära faktorer, såsom de som är inblandade i genomreplikation och transkription, liksom morphogenesis och knoppding, kan undersökas med hjälp av RNAi-teknik. Effekten av mutationer i virusproteiner på viruset livscykel kan också studeras, även om man måste hålla i minnet att medan VP40, GP 1,2, och VP24 uttrycks efter viral transkription, är uttryck för de andra virala proteiner uppnås från uttrycket plasmider, så att effekter på grund av överuttryck av dessa proteiner måste beaktas. Dessutom bör försiktighet iakttas för att mutationer i minigenome inte signifikant förändrar längden av minigenome eftersom reporteraktivitet påverkas direkt av minigenome längd 15. Slutligen, eftersom tetracistronic minigenomes är viralt genom analogier som överför virusgener, och replikeras av den virala polymeraset komplexa, bör det också vara möjligt att studera utvecklingen av dessa gener som svar på mutationer i BSL2 förhållanden. Medan ytterligare studier behövs fortfarande i denna riktning, bör det vara möjligt, till exempel att införa suboptimalmutationer i gener inom minigenome och sedan passage trVLPs tills gratis mutationer uppstår.
En begränsning av tetracistronic trVLP analys som måste hållas i minnet är det faktum att när det modeller mesta av viruset livscykel, primär transkription i målceller inte modelleras med detta system, eftersom målceller måste uttrycka de nukleokapsidproteiner i trans För att de trVLPs att replikera. Om primär transkription måste bedömas, är det möjligt att använda naiva målceller 10; Men i det här fallet ingen genomet replikering sker i målceller, och inga ytterligare smitt trVLPs produceras, avbryter infektionen. Detta är ett huvudproblem som inte kan lösas utan att göra de trVLPs helt självreplikerande, genom att bland annat generna för de nukleokapsidproteiner till minigenome, vilket i praktiken gör dem till infektiösa rekombinanta Ebola-virus. Faktum Ebolett virus som uttrycker har genere luciferas eller andra reportrar och kan användas för att utvärdera och studera genomet replikering och transkription 17,18; dock användningen begränsad till BSL4 laboratorier. Dessutom, måste det hållas i minnet att medan VP40, GP 1,2, och VP24 uttrycks från ett viralt genom analog, deras position i minigenome (2: a, 3: e, och 4: e transkriptionsenhet) inte är identisk med deras position i virusgenomet (3: e, 4: e och 6: e transkriptionsenhet), som skulle kunna påverka deras absoluta uttrycksnivåer samt deras relativa uttryck nivåer i förhållande till varandra.
Totalt motsvarar den tetracistronic trVLP analysen den mest omfattande livscykelmodellsystemet för Ebola virus som finns hittills, och tillåter modellering av genomet replikering och transkription, partikel morfogenes och knoppning, samt bifogad fil och enFörsök i målceller över flera infektionscykler. Som sådan har den en enorm potential för användning vid undersökning biologi Ebola-virus enligt BSL2 förhållanden.
The authors have nothing to disclose.
Författarna är mycket tacksamma för Bob Fischer (LV, DIR, NIAID, NIH), som fungerade som berättare, och Austin Athman (RTB, DIR, NIAID, NIH) och Megan Morgan (DOHS, ORS, OD, NIH) för deras hjälp med att göra filmen som åtföljer detta manuskript. Vidare vill vi tacka Allison Groseth (LV, DIR, NIAID, NIH) för kritisk läsning av manuskriptet. Denna forskning stöds av Interna forskningsprogram NIH, NIAID.
75cm2 cell culture flask | Corning | 430641 | |
DMEM | Sigma | D6546 | preheat to 37°C prior to use |
FBS | Life Technologies | 26140-079 | heat inactivate 30 min @ 56°C |
L-Glutamine | Life Technologies | 25030-081 | 100X |
Pen Strep | Life Technologies | 15070-063 | 100X |
0.25% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200-056 | |
PBS | 8 g NaCl, 0.2g KCl, 1.44g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4, H2O ad 1 liter; autoclave and store at room temperature | ||
6-well plates | Costar | 3516 | |
Opti-MEM I | Life Technologies | 31985-070 | |
Transit LT1 | Mirus | MIR 2300 | |
Glo lysis buffer | Promega | E2661 | |
Renilla Glo luciferase assay system | Promega | E2720 | |
96-well assay plate (white) | Costar | 3912 | |
Modulus microplate luminometer | Turner Microsystems | 998-9300 |