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Medicine

Axotomia do nervo facial em ratos: um modelo para estudo de resposta motoneuron para Injury

Published: February 23, 2015 doi: 10.3791/52382
Automatic Translation
1,2, 3, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Anatomy and Cell Biology, Indiana University School of Medicine, 2Research and Development Services, Richard L. Roudebush VA Medical Center, 3Department of Anatomy and Cell Biology, University of Illinois, Chicago

Abstract

O objetivo deste protocolo cirúrgico é expor o nervo facial, que inerva a musculatura facial, em sua saída do forame estilomastóideo e cortar ou esmagá-lo para induzir lesões de nervos periféricos. As vantagens desta cirurgia são sua simplicidade, alta reprodutibilidade, bem como a falta de efeito sobre as funções vitais ou mobilidade da conseqüente paralisia facial, resultando assim em um resultado cirúrgico relativamente leves em comparação com outros modelos de lesão do nervo. Uma importante vantagem da utilização de um modelo de lesão de nervo craniano é que os motoneurónios residir numa população relativamente homogénea no núcleo motor facial na ponte, simplificar o estudo dos corpos celulares de motoneurónios. Devido à natureza simétrica da inervação do nervo facial e a ausência de interferência entre os núcleos motores faciais, a operação pode ser realizada de forma uni com o lado unaxotomized servindo como um controlo interno emparelhado. Uma variedade de análises pode ser realizada no pós-operatório para avaliaré a resposta fisiológica, cujos detalhes estão fora do escopo deste artigo. Por exemplo, a recuperação da função muscular pode servir como um marcador para Reinervação comportamental, ou os neurónios motores podem ser quantificados para medir a sobrevivência das células. Além disso, os neurónios motores podem ser capturadas com precisão usando microdissecação laser para análise molecular. Porque a axotomia do nervo facial é minimamente invasiva e bem tolerada, pode ser utilizada numa ampla variedade de ratinhos geneticamente modificados. Além disso, este modelo de cirurgia pode ser utilizado para analisar a eficácia dos tratamentos de lesão do nervo periférico. A lesão do nervo facial proporciona um meio para investigar não apenas neurónios motores, mas também as respostas do microambiente central e periférica da glia, o sistema imunológico, e musculatura alvo. O modelo de lesão do nervo facial é um modelo de lesão de nervo periférico amplamente aceite que serve como uma ferramenta poderosa para o estudo da lesão e da regeneração do nervo.

Introduction

Existem muitos modelos de lesão de nervos periféricos, mas uma que se destaca para o estudo da motoneurons é o modelo de axotomia do nervo facial. O nervo facial, também conhecido como nervo craniano VII, se origina na ponte e inerva os músculos da expressão facial 1,2. Neste protocolo cirúrgico, o nervo facial é exposto na sua saída do forame estilomastóideo e cortados ou triturados. A gravidade da lesão do nervo pode ser classificado de acordo com as Sunderland 3 classificações, o que diferencia o prejuízo com base na intactness do axônios, endoneuro, perineuro e epineuro, que são camadas de tecido conjuntivo que sequencialmente envolver em torno dos feixes de axônios. Na lesão por esmagamento (axonotmesis), os axônios são cortados, mas o perineuro e epineuro são preservados. Recuperação funcional completa de esmagamento do nervo facial ocorre em cerca de 11 dias, porque a bainha do nervo intacta serve como um canal dentro do qual os axônios crescerem 4,5. NoPor outro lado, na lesão de corte (neurotmesis), os axônios e todos os 3 camadas de tecido conjuntivo são cortados, e todo o nervo distal deve regredir para restaurar a musculatura inervação. Reconexão cirúrgica do epineuro é freqüentemente realizado em pacientes humanos com lesões na secção do nervo, no entanto os resultados de recuperação são raramente ideal. Mais estudos são necessários para entender por que o nervo não regredir ao seu alvo e quais as terapias podem ser empregadas para melhorar e acelerar o processo regenerativo.

Há muitas vantagens em estudar a lesão do nervo utilizando o modelo de axotomia do nervo facial. Primeiro, o procedimento axotomia do nervo facial é rápido, fácil e altamente reprodutível; e a paralisia resultante dos músculos faciais não tem impacto sobre as funções vitais e é bem tolerado pelos animais. Porque este é um modelo de lesão de nervos cranianos, estudando os corpos celulares motoneuron é simplificada porque os neurónios motores residem em uma população relativamente homogênea em the núcleo motor facial na ponte. A população não diferem com base no padrão subnuclear dentro do núcleo motor facial, pois há sete subnúcleos cada um específico para que inervam um grupo específico de músculos, de modo diferenças subnucleares em resposta a axotomia pode influir no resultado 2,6,7.

Uma grande vantagem do modelo de lesão do nervo facial é que o lado unaxotomized pode servir como um controlo interno emparelhado porque a inervação do nervo é altamente simétrico e não há interferência entre os núcleos motores faciais 8. Outra vantagem da utilização deste método cirúrgico é a ausência de trauma directo para o SNC ou o rompimento da barreira hematoencefálica 9. Complicações como sangramento excessivo e infecção são raras com este procedimento.

Uma variedade de análises podem ser realizadas para avaliar a resposta fisiológica à lesão do nervo. A recuperação do reflexo de pestanejo ocular e actividade suiça pode ser usado como um comportamentalmedida de funcional 10,11 recuperação. A gravação de vídeo de atividade vibrissae é atualmente o método mais poderoso para a detecção de recuperação de inervação do nervo facial 12,13. Após a eutanásia, análise histológica do tronco cerebral pode ser realizada sobre os corpos de células de motoneurónios no núcleo motor facial. O núcleo motor facial é subdividida em sete subnúcleos, cada uma específica para certos músculos faciais, permitindo a análise diferencial de respostas a lesão 2,6. Motoneurónios faciais podem ser contadas para quantificar a sobrevivência de células, ou imuno-histoquímica pode ser usada para identificar biomarcadores e populações de células específicas 14. O núcleo motor facial pode ser microdissecadas de captura com precisão usando a laser para a análise molecular da resposta celular a lesão do nervo 15,16. Impactos da axotomia do nervo facial podem ser analisados ​​no córtex motor 17,18. Além disso, o nervo pode ser dissecado para estudar a degeneração Walleriana 19 ouregeneração axonal 20, e os músculos pode ser removido para estudar junções neuromusculares 21. A axotomia do nervo facial também pode ser usado para estudar as células gliais centrais e periféricos anexos 22, 21 musculatura alvo, e a resposta do sistema imunitário 23. Embora muito tenha sido feito em estudar o modelo de axotomia do nervo facial 24, um estudo mais aprofundado de lesão do nervo periférico é necessária porque dano do nervo é um problema significativo para os pacientes e os tratamentos atuais não conseguem produzir os melhores resultados. Este modelo é uma ferramenta poderosa para a análise da resposta fisiológica à lesão do nervo e analisar a eficácia das terapias de regeneração do nervo.

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Protocol

Todos os procedimentos executados são aprovados pela Escola de Medicina da Institutional Animal Care e do Comitê Use Universidade de Indiana e siga Instituto Nacional de diretrizes de saúde.

1. Técnica Cirúrgica

  1. Manter a técnica asséptica durante esse procedimento usando luvas estéreis, instrumentos e um campo cirúrgico estéril acordo com as diretrizes do NIH 25. Esterilizar ferramentas antes de iniciar a cirurgia por autoclavagem-los (ver Tabela de Specific Reagentes / Equipamentos para a lista completa). Use um esterilizador de contas de vidro para esterilizar instrumentos durante a operação.

2. Anestesia e Preparação

  1. Anestesiar o rato em uma caixa de anestesia com uma mistura de 0,9 L / min de oxigénio e 2,5% de isoflurano utilizando um sistema de isoflurano vaporizador veterinária. Certifique-se de que o mouse não responder às mudanças na posição do corpo antes de removê-lo da caixa.
  2. Aplicar pomada oftálmica para o mouOs olhos de si para protegê-los de secar.
  3. Desligue o fluxo de gás a partir da caixa para o cone do nariz. Posicione o mouse diretamente em seu lado esquerdo em uma almofada aquecida coberta com um bloco cirúrgico e papel absorvente banco com o seu nariz e boca dentro do cone. Monitorar continuamente o ritmo de respiração do mouse e taxa e ajustar os níveis de isoflurano, conforme necessário (entre 2,5-3% de isoflurano) para manter um nível adequado de anestesia, e usar o aperto reflexo toe para confirmar sedação total.

3. Abordagem Cirúrgica

  1. Harmonizar e concentrar o estereoscópio com o campo cirúrgico. Ajustar o cone do nariz e fita-lo para baixo de modo que ele está posicionado ao longo da borda do campo visual.
  2. Com o rato encontra-se no seu lado esquerdo, fixe a ponta da orelha direita para o cone de nariz, expondo a área atrás da orelha, onde a incisão será feita. Certifique-se de que a veia auricular posterior viaja horizontalmente através da orelha. Note-se que o posicionamento correto de tele animal ea gravação do ouvido são cruciais, a fim de encontrar rapidamente o nervo facial.
  3. Molhar a pele em e atrás da orelha com 70% de etanol e raspar o local da cirurgia usando uma lâmina de barbear ou bisturi. Pré-molhar a pele torna a depilação mais fácil nesta localização anatômica.
  4. Limpar a pele com uma solução de iodo, tais como Betadine limpeza cirúrgica (7,5% de povidona-iodo), seguido de etanol a 70%. Repetir esta lavagem mais duas vezes para desinfectar completamente a área.
  5. Para determinar onde fazer a incisão, rastrear a veia auricular posterior da orelha caudalmente para a área posterior à protuberância orelha. Com uma tesoura primavera, fazer uma incisão 4 milímetros 2 - 3 mm posterior à protuberância.
  6. Dissecar através da gordura subcutânea e fáscia usando dissecção romba. Evitar corte directo com as tesouras pois os vasos ou o tecido muscular pode ser facilmente danificado.
  7. Se ocorrer sangramento, faça pressão no local da cirurgia com um cotonete estérildurante pelo menos 30 seg. Se ocorrer perda de líquido significativo, injetar o mouse por via intraperitoneal com até 0,5 ml de solução salina estéril 0,9% usando uma agulha G 25 ou 27.
  8. Use vários marcos importantes, o nervo acessório espinhal, canal auditivo, e anterior do músculo digástrico (descrito abaixo), para localizar o nervo facial. Dissecar em torno destes pontos de referência até os ramos do nervo facial são visualizados. O nervo aparece como uma estrutura sólido branco significativo quando se revela e uma camada de fáscia adere a ele as estruturas subjacentes.
    1. Encontre o nervo acessório espinhal, que viaja a partir da porção caudal do crânio na inervação do músculo trapézio, uma vez que a gordura subcutânea e fáscia foram dissecados. O nervo facial é profundo do nervo acessório espinhal.
    2. Encontre o canal auditivo cartilaginoso que parece branco perolado e pode ser visto rostral ao nervo facial.
    3. Encontre o ventre muscular do músculo digástrico anterior, que se situa no topo de e caudal ao nervo facial.
  9. Quando os principais ramos do nervo facial são visualizados, rastreá-las dorsal para encontrar sua origem a partir do forame estilomastóideo. Usando uma pinça de ponta fina Dumont # 5/45 para manter o local da cirurgia aberta, avançar as dicas de tesoura primavera seguinte caminho do nervo, em seguida, passar a pinça dorsal para manter a área recém-avançado aberto.
  10. Visualize o tronco do nervo facial com o zigomático, bucal e ramos mandibulares marginais neste momento.
    NOTA: O ramo temporal será encontrado mais perto do forame. Os ramos do nervo mandibular marginais nas suas partes superior e inferior mais perto da maxila, assim os ramos do nervo não será visível a este nível.
    1. Se a execução de uma secção do nervo, estabilizar o nervo suavemente com a pinça de ponta fina e cortar o nervo com a tesoura primavera. Evite aplicar muita tração para o nervo com a pinça para evitar avulsing o nervo do tronco cerebral. Empurreos tocos de distância um do outro, ou cortar e remover uma porção do nervo distal para assegurar que não pode ocorrer a reconexão.
    2. Se a execução de uma lesão por esmagamento, utilize Dumont # 5/45 fórceps para comprimir o nervo por 30 segundos usando constante pressão para cortar todos os axônios, em seguida, repita esta paixão com um segundo ângulo perpendicular ao primeiro local do esmagamento. Evite aplicar quantidades variáveis ​​de pressão durante a 30 seg esmagamento, caso contrário, o prejuízo será inconsistente entre animais.

4. Encerramento e Recuperação

  1. Reposicionar a gordura e músculos sobre as estruturas subjacentes.
  2. Harmoniza as bordas da incisão e fechar a ferida utilizando um grampo de feridas 7,5 milímetros. Suturas ou cola também são aceitáveis ​​para o fechamento da ferida. Analgésicos pós-cirúrgicas podem ser fornecidos no momento.
  3. Remova a fita da orelha do mouse. Desligue o fluxo de isoflurano e permitir que o mouse para respirar oxigênio puro por 30 segundos a 1 minuto. Place o rato em uma gaiola vazia, sem roupa de cama para se recuperar da anestesia.
  4. Quando o mouse é recuperado, analisar seu comportamento em busca de sinais de confirmação de paralisia facial. Os bigodes será paralisado e em ângulo de volta para o rosto, o nariz será desviado, eo olho não piscará em resposta a um sopro de ar.
  5. Animais Casa conjuntamente após a cirurgia se eles são do sexo feminino. Evite alojar ratos machos, em conjunto, porque eles são mais agressivos e tendem a remover forçosamente clips ferida do seu cagemate, o que leva à infecção. Fornecer analgésicos pós-cirúrgicas, neste momento, se necessário.
  6. Monitorar os ratos uma vez por dia durante vários dias após a operação para garantir que nenhuma infecção ou outra complicação ocorre no pós-operatório. Remover agrafos 7-10 dias após a cirurgia, caso não tenham caído por conta própria.
  7. Aplicar lubrificante pomada no olho afectado diariamente para evitar complicações na córnea, ou até que o reflexo de piscar de olhos é rerecobertos ou até que a eutanásia.

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Representative Results

Após a axotomia do nervo facial é realizada, perda de motoneurónios ocorre como um resultado da lesão. Sobrevivência motoneuron após a lesão depende de muitas variáveis, como sexo, idade do animal no momento da cirurgia, e o ponto de tempo em que as contagens de neurónios motores são feitas, eo Moran e Graeber avaliação 24 e Jinno e Yamada avaliação 22 tanto resumir dados de sobrevivência motoneuron. Normalmente, cerca de 86% dos neurónios motores sobreviver aos 28 dias pós-axotomia 14,15,26. Cinética da perda de motoneurónios são descritos em Serpe et al. 2000. A Figura 1 ilustra a variação na sobrevivência de motoneurónios em vários ratinhos geneticamente modificados. Não houve diferenças significativas são observadas nas contagens de neurónios motores faciais do lado de controlo, indicando que as alterações genéticas não têm impacto contagens basais. Em comparação com a sobrevivência de motoneurónios em ratinhos de tipo selvagem (84% ± 2.0; Figura 1A, D), é observada uma perda significativa de células em um modelo de ratinhoda esclerose lateral amiotrófica (SOD1 G93A; 68% ± 1; Figura 1B, E), bem como o imunodeficientes-activação de recombinação genética-2 nocaute rato (RAG-2 - / -; 57% ± 2.5; Figura 1C, F) 27 .

A Figura 2 demonstra a técnica de captura de microdissecação de laser aplicada ao núcleo motor facial. Todo o núcleo motor facial pode ser capturado (Figura 2A-C), ou subnúcleos pode ser recolhido separadamente (Figura 2D-F). Para uma maior precisão, pode ser capturado motoneurónios individualmente, e o restante neur�ilo pode ser recolhida para análise (Figura 2G-I). A Figura 3 ilustra os resultados de qPCR de o material de RNA extraído de amostras subnucleares comparando o ventromedial e ventrolateral subnúcleos. Os quatro genes testados, β II tubulina, crescimento associated protein-43 (GAP-43), hemopoietic- e manifestou-neurológico seqüência-1 (HN1), e fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) são todos associados com a resposta a regeneração do nervo e que existem diferenças interessantes entre os dois subnúcleos e seus perfis de expressão gênica após axotomia 16.

Figura 1
Figura 1. secções coronais representativos núcleo motor facial coradas com tionina e quantificada 28 dias após o corte transversal do nervo facial. Núcleos motores faciais são mostradas a partir de (A, D) WT, (B, E) SOD1 G93A, e (C, F) RAG- 2 - / - ratos (lado de controle, o lado lesado). Barras de escala = 120 pm. Esta figura foi modificada a partir de 27. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior do thé figura.

Figura 2
Figura 2. Laser microdissection do núcleo motor facial. (A) seção Tionina manchadas de núcleo axotomizados facial, (B) com microdissecção a laser parcial do núcleo facial axotomizados, e (C) coleção de laser de microdissectados tecido. Um modelo (D) do subnúcleos foi exibido no ecrã do computador para identificar a ventromedial e ventrolateral subnúcleos facial para microdissecção a laser (E, F). Motoneurónios faciais foram microdissecadas a laser com base na sua morfologia com um núcleo e o nucléolo visível (* indica motoneurónios, G, H), e os fragmentos de célula do corpo FMN, indicadas pelas setas (G), foram microdissecadas a laser e eliminados separadamente para eliminar FMN ARNm na s neur�iloamples. Depois de todos os fragmentos de FMN e corpos celulares foram recolhidas, o tecido facial núcleo restante do laser foi microdissecado como a amostra neur�ilo (I). Barras de escala = 100 pm. Esta figura foi modificada a partir de 16. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3. Pro-regeneração e expressão de mRNA pró-sobrevivência no ventromedial (VM) e ventrolateral (VL) regiões subnucleares motor do facial seguintes axotomia do nervo facial. Cento média de expressão do mRNA ± SEM no seccionado VM e VL subnúcleos facial em relação ao subnúcleos controle unoperated (AD). Curso de tempo da expressão de mRNA inclui nenhuma lesão (0), 3, 7, 14 e 28 dpo para βII tubulin (A (B), HN1 (C), e BDNF (D). # Representa diferenças significativas em comparação com VL de VM, para p <0,05. Esta figura foi modificada a partir de 16.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Stereo microscope Leica M60
Labeling tape Fisher Scientific 15-952
Vannas-Tübingen spring scissors - straight/sharp/8.5 cm/5 mm cutting edge Fine Science Tools 15003-08 Sterilize before use
Dumont #5/45 forceps - standard tips/angled 45°/Dumoxel/11 cm Fine Science Tools 11251-35 Sterilize before use
Michel suture clips - 7.5 mm x 1.75 mm Fine Science Tools 12040-01 Described as "wound clip" in protocol, sterilize before use
Hagenbarth cross action wound clip applier 5" George Tiemann & Co 160-910 Used to apply wound clip, sterilize before use
Michel suture clip applicator & remover - For 7.5 mm clips Fine Science Tools 12029-12 Used to remove wound clip
0.9% Sodium chloride injection, USP Hospira 0409-4888-10
Betadine, 16 oz, with dispenser Fisher Scientific 19-027132
70% Ethanol
Glass bead sterilizer

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