Introduction
Kolorektal cancer (CRC) er den 4. mest almindelige årsag til malignitet verdensplan 1. Trods de betydelige fremskridt i vores forståelse af familiær baggrund af denne sygdom, genetisk disposition vedrører kun ~ 20% af CRC tilfælde 2. Resten tilskrives mange ydre og miljømæssige faktorer, herunder kronisk inflammation. Hos mennesker er tydeligt i colitis ulcerosa (UC) patienter, som har en større risiko for at udvikle colitis-associeret tyktarmskræft (CAC) forbindelsen mellem kronisk inflammation og tyktarmskræft, afhængig af varigheden, omfanget og alvoren af den inflammatoriske sygdomme 3 -5. Derfor nye terapier er under udvikling til at styre immunrespons og den tilhørende produktion af vækstfremmende faktorer ved den inflammatoriske tumormikromiljøet 6-8 den. Der er et stigende behov for hensigtsmæssige prækliniske dyremodeller til at karakterisere den terapeutiske effekt afdisse lægemidler mod udvikling og progression af sygdommen.
Musemodeller har entydigt vist, at den inflammatoriske mikromiljø bidrager til CRC progression, selv i fravær af åbenlys betændelse 9,10. Disse modeller indbefatter anvendelsen af polysaccharidet dextransulfat-natrium (DSS), forudsat i drikkevandet af mus, til at modellere epithelial skade og akut og kronisk inflammatorisk tarmsygdom (IBD) 11,12. Selvom den mekanisme, ved hvilken DSS inducerer slimhindeskade og colitis ikke er helt forstået, nogle undersøgelser tyder på, at DSS inhiberer cellulære revers transkriptase og ribonuklease aktiviteter i celler eller fremmer dannelsen af nano-lipid komplekser, der fusionerer med colon membran fører til epitelbeskadigelse 13,14. Ændringer af standard DSS modellen har også givet en betydelig indsigt i de mekanismer, som colon epitelceller opretholde vævshomeostase og formellesen mucosale immunresponser 15.
Intraperitoneal administration af azoxymethan (AOM) alene eller i kombination med DSS, indeholder en model for at undersøge samspillet mellem somatiske mutationer i epitel slimhinde og den inflammatoriske og stromale mikromiljø 16,17. AOM er en metabolit af det kræftfremkaldende stof 1,2-dimethylhydrazin (DMH), som ikke er knyttet direkte i DNA-mutationer. I stedet AOM hydrolyseres til methylazoxymethanol (MAM) af cytochrom isoform CYP2E1 i leveren, hvor MAM er konjugeret med glucuronsyre og derefter transporteres til tarmen via galde sekreter 18. Det menes, at det bakterielle β-glucuronidase bidrager til nedbrydningen af MAM resulterer i DNA alkylering og akkumuleringen af mutationer i epitelceller 19. De fleste AOM-inducerede colon tumorer harbor missense mutationer i genet, der koder β-catenin, hvilket gør proteinet resistent over proteasomalaktivitet degradatipå, hvilket resulterer i afvigende aktivering af den kanoniske Wnt-signalvejen 20. Når aktiviteten af AOM er kombineret med slimhindeskader fremkaldt af DSS, den efterfølgende sårheling reaktion skaber et mikromiljø, der fremmer vækst og ekspansion af det mutageniserede epitel. I en variation af denne model kan gentagne administration af AOM alene over en periode på flere uger bruges til at modellere sporadisk kolorektal cancer, i fravær af DSS-induceret colitis 10,17. Disse to gratis modeller giver forsøgsopstillingen at studere CAC og sporadisk CRC henholdsvis, som begge er forbundet med en pro-inflammatorisk tumormikromiljøet 10.
Anvendelsen af serielle endoskopi i mus blev udviklet af Becker og kolleger 21 og muliggør langsgående overvågning af colitis og tumorprogression. Her giver vi tre prækliniske protokoller baseret på DSS-induceret mucosal skader og / eller AOM-medieret tumor induktion til reproducerbart at inducere specifikke colon patologier. Den første protokol beskriver inducere akut slimhindeskade som reaktion på DSS administration at fremkalde mange af de histopatologiske træk forbundet med IBD. Den anden protokol er baseret på tre på hinanden følgende cyklusser af DSS administration at efterligne opblussen af inflammation ofte hos IBD patienter, og kan udføres i forbindelse med AOM-inducerede mutationer. Den endelige protokol er baseret på AOM-inducerede sporadiske epiteliale mutationer. For hver af disse protokoller, vi udvider på de relevante standardprocedurer til at omfatte profylaktisk og terapeutisk intervention metoder, som vi har udviklet for at overvåge effektiviteten af nye lægemidler.
Protocol
Den Walter og Eliza Hall Institute of Medical Research dyreetik Udvalget godkendte hver af procedurerne i disse protokoller.
1. Fremstilling af forsøgsmus
- Skriv eksperimentelle kohorter på mindst 4 køn matchede 6-8 uger gamle C57BL / 6 mus (M. musculus), der er opdrættet og opstaldet i samme SPF (SPF) dyr facilitet / værelse og leveres med autoklaveret mad og vand. Anvendelsen af hunmus vil tillade co-indkapsling af mus fra forskellige linjer, grænse rubrikker og reducere bur-til-bur variation.
- Sørg for, at mus er mindst 6 uger for at muliggøre endoskopi procedurer ved hjælp af 3,0 mm diameter endoskopi kappe.
- Brug mus af den samme genetiske baggrund, og hvor det er muligt, fra bure, der er gemt på den samme rack at reducere variationer forbundet med tarmens mikroflora. Bør tages i betragtning, whe Variationer i mikroflora mellem dyrefacilitetern at bestemme hvilke kontrol mus og genotyper for hvert forsøg 22.
- Mark mus ved øre / toe udklip, tatoveringer eller lignende for at tillade nem identifikation.
- Mus vejes på dag 0, for at bestemme baseline eksperimentelle vægte.
- Udfør endoskopi (se afsnit 5) af mus på dag 0 til optage baseline colon fænotyper.
2. Præ-klinisk forsøg på en epitelbeskadigelse og Akut Colitis Model
- Der fremstilles en opløsning af det terapeutiske middel, der skal testes. For lægemidler, der er leveret af oral sonde (po), udarbejde løsninger til en maksimal volumen på 100 pi. For lægemidler, der er leveret ved intraperitoneal (ip) injektion, forberede løsninger til en maksimal volumen på 200 pi.
BEMÆRK: Gentagen ip eller po administration lægemidlet over længere perioder kan resultere i ændret muse adfærd. Suppleant injektionsstedet ip at undgå langvarig ubehag. Til po administration give mus med AutoClaved solsikkefrø som "godbid" at gøre den negative association med sonde procedure. - På dag 1, administrere det terapeutiske af interesse (fremstillet i trin 2.1) og passende kontroller køretøjer. I eksemplet billede (figur 6A), 5 ug af rekombinant human (rh) iInterleukin (IL) -11-protein blev opløst i 200 pi phosphatpufret saltvand (PBS) og indgivet ip
- Bestem timingen og hyppigheden af administrationer, som vil være afhængig af den farmakokinetiske profil er fastsat for det terapeutiske reagens, der bliver testet. Figur 1 skitserer profylaktisk behandling under anvendelse to gange dagligt IP injektioner i løbet af eksperimentet.
- Monitor, herunder afføringskonsistens og tilstedeværelsen af blod, og vejer hver mus dagligt. På de dage af behandlingen, vejning bør falde sammen med administration af det terapeutiske lægemiddel minimere stress til musene som følge af gentagne håndtering. På dag 3, forberede 2,5% (2,5 g / 100 ml) DSS opløsning i drikkevandet rutinemæssigt til musene af dyret facilitet. Ca. 5 ml / mus / dag af DSS opløsning er nødvendig for forsøget. Forbruget af DSS vand kan ændres, hvis den omgivende temperatur dyreanlægget svinger.
BEMÆRK: DSS er irriterende og skal håndteres i overensstemmelse med MSDS instruktioner. - Giv frisk DSS til musene ad libitum i rent vand flasker til 5 sammenhængende dage. Om aftenen den Dag 5, giver normalt drikkevand ud over Mos foderpiller og proteintilskud tilvejebragt i små petriskåle (100 g foderpiller / 10 g protein shake / 10 ml vand). Dette forhindrer dehydrering og hjælper med at minimere alvorlige vægttab.
- Aflive mus ved CO 2 beruselse og indsamle væv til efterfølgende histologisk analyse om morgenen den dag 8 eller når musene oplever ≥15% vægttab i mere end tre consecutive dage, alt efter hvad der indtræffer først.
BEMÆRK: Juster DSS dosis på mellem 1-4% (w / v) afhængig af mikroflora dyreanlægget og batch af DSS. Udføre, rutinemæssig batch test for at indføre passende DSS dosering og omgå batch-til-batch variation. Den passende dosis bør baseres på vægttab (ikke mere end 15% af den oprindelige vægt) og bekræftet colitis histopatologi.
3. Pre-klinisk forsøg i en kronisk colitis eller Colitis-associeret Cancer Model
- For kronisk colitis model begynder fra trin 3.7.
- For colitis-associerede cancer (CAC) model på dag 1, injiceres hver mus med 10 mg / kg (w / w) azoxymethan (AOM, 250 pi, ip).
BEMÆRK: AOM er kræftfremkaldende og skal håndteres i overensstemmelse med MSDS instruktioner. - Stamopløsninger af AOM fremstilles som 10 mg / ml alikvoter og opbevaret ved -20 ° C. På dagen for injektion AOM stamopløsning optøet og fortyndet til 1 mg / ml i PBS. Gentagen nedfrysning og optøning af AOM stamopløsning bør undgås.
- Dosis AOM kan justeres mellem 8-12 mg / kg. Rutinemæssig batch test er forpligtet til at indføre passende AOM dosis for at omgå toksicitet for mus på grund af batch-til-batch variation.
- Under Days 1-7 efter AOM administration vægte vil være stabil og derfor vægt kontrollen kan udelades under Days 1-7 for at undgå håndtering dyr, vil udskille cytotoksiske metabolitter i deres afføring.
- På dag 7 brug for alle strøelse ændres efter cytotoksisk procedurer. Når strøelse ændring er færdig, dyrene ikke længere kræve cytotoksiske håndteringsprocedurer, da de ikke længere vil udskille cytotoksiske metabolitter.
- På dag 8 forberede 2,5% (2,5 g / 100 ml) DSS opløsning (som beskrevet i trin 2.5) og giver til musene ad libitum.
- Mus hele forsøget vejes dagligt og overvåge for tegn på sygdom, herunder pjusket fur, hunching, blodig afføring og nedsat bevægelse.
- På dag 13, skal du fjerne DSS løsning og give musene med normal drikkevand indtil dag 28. dage 8-28 udgør en "cyklus" af den kroniske colitis / CAC-protokollen.
- På dage 13-28, når musene gives normalt drikkevand, give musene med Mos foderpiller og proteintilskud tilvejebragt i små petriskåle (100 g foderpiller / 10 g protein shake / 10 ml vand). Dette forhindrer dehydrering og hjælper med at minimere alvorlige vægttab.
BEMÆRK: protein kosttilskud i mash bør ikke gives, når musene modtager DSS-holdige drikkevand for at sikre sammenhæng i DSS forbrug. - På dag 20 udfører den anden endoskopisk undersøgelse for at overvåge individuelle mus sundhed (se afsnit 5).
- På dag 29 Gentag DSS cyklus (cyklus 2: 2,5% (w / v) DSS leveres i løbet af dage 29-33 og normal drikkevand under dage 34-50).
- På dag 40 udfører third endoskopisk undersøgelse for at overvåge individuelle mus sundhed og bestemme tumorbyrde (se afsnit 5).
- Hvis der ikke tumorer er synlige ved endoskopi på dag 40, begynder en tredje DSS cyklus på dag 50-72 (cyklus 3: 2,5% (w / v) DSS leveres i løbet af dage 50-55 og normal drikkevand under dage 56-72). Generelt tumorer er synlige på dag 40 og derfor den tredje cyklus af DSS kan udelades.
- Når tumorer bliver synlige ved endoskopisk undersøgelse, tildele hver mus en endoskopisk tumor score (se afsnit 5) og tildele individuelle mus til kohorter med lignende baseline tumor byrder.
- På dag 42 (eller når tumorer er synlige), administrere den terapeutiske forbindelse eller relevant kontrol køretøj (se afsnit 2.2). Timingen af doserne vil være afhængig af den farmakokinetiske profil af det terapeutiske. Et eksempel på en intervention behandling injiceret ip tre gange om ugen i mus med etablerede tumorer leveres (figur 2).
- Udfør endoscopic eksamener gang om ugen over varigheden af den terapeutiske behandling til at overvåge tumor byrde. Generelt 4 ugers en terapeutisk behandling er tilstrækkelig til at overholde en objektiv behandling svar. Efter ophør af behandlingen, kan en kohorte af mus også overvåges ved endoskopi for tumor tilbagefald.
- Aflive mus ved CO 2 beruselse og indsamle væv til biokemiske og / eller histologisk analyse om morgenen den dag 72, eller når musene oplever ≥15% vægttab i mere end tre på hinanden følgende dage, alt efter hvad der indtræffer først.
4. Pre-klinisk forsøg i en sporadisk kolorektal cancer Model
- På dag 1, injicere hver mus ip med 10 mg / kg AOM (se trin 3.2). Dosis AOM kan justeres mellem 8-12 mg / kg. Rutinemæssig batch test er forpligtet til at indføre passende AOM dosis for at omgå toksicitet for mus på grund af batch-til-batch variation.
- Gentag injektionen på den første dag i hver ugefor de følgende 5 uger (figur 3). Musene skal håndteres i henhold til cytotoksiske sikkerhedsprocedurer for hele seks uger.
- Hver mus vejes på dagen for AOM injektion for at minimere belastning af musene som følge af gentagne håndtering.
BEMÆRK: AOM er kræftfremkaldende og skal håndteres i overensstemmelse med MSDS instruktioner. - Alle dyr skal håndteres i henhold til cytotoksiske sikkerhedsprocedurer for 6 ugers AOM ip injektioner, der kræves for denne protokol.
- I uge 8 udføre endoskopisk undersøgelse for at kontrollere for nye tumorer (se afsnit 5). Endoskopisk undersøgelse bør udføres hver anden uge, indtil tumorer bliver synlige. Generelt begynder vildtype C57BL / 6 dyr til at udvikle tumorer ved ca. 40 uger efter den første administration af AOM.
- Når tumorer bliver synlige ved endoskopisk undersøgelse, tildele hver mus en endoskopisk tumor score (se afsnit 5) og tildele individuelle mus til en kohorte med lignende tumorbelastninger før påbegyndelsen af terapeutisk behandling.
- I uge 40 (eller når tumorer er første synlige), administrere terapeutiske forbindelse eller den relevante kontrol køretøjet.
- Timingen af doserne vil være afhængig af den farmakokinetiske profil af den terapeutiske (se trin 2.1). Et eksempel på en intervention behandling injiceret ip 3 gange ugentligt i mus med etablerede tumorer leveres (Figur 3).
- Udfør endoskopisk undersøgelse ugentligt for varigheden af den terapeutiske behandling perioder at overvåge tumorbyrde. Generelt, 4 uger efter en terapeutisk behandling er tilstrækkelig til en objektiv behandlingsrespons. Efter behandling ophør, kan en kohorte af mus også overvåges ved endoskopi for tumor tilbagefald.
- Aflive mus ved CO 2 forgiftning og indsamle væv til biokemiske og / eller histologiske analyser af tyktarmen og tumorer i uge 45 eller efter 4 ugers behandling.
- Den endoskopi udstyr skal samles ifølge standardprocedurer 16.
- Steriliseres og rengør endoskopet probe med 70% ethanol eller en anti-bakteriel smøremiddel.
- Videoer kan optages ved hjælp af en bærbar eller stationær computer og standard media software, som iMovie. En standard computerskærm, snarere end en medicinsk kvalitet skærm, er tilstrækkelig til at visualisere tyktarmen under endoskopi procedure (figur 4).
- Bedøver grupper af 5-6 mus samtidigt i et kammer med 3% isofluran i 100% O 2 ved en hastighed på 0,2-0,4 l / min. Når musene bedøves, hvilket bekræftes af tå knivspids; de isofluran niveauer bør ændres til 0,5-2% for vedligeholdelse.
- Fjern en individuel mus fra kammeret, og læg den ventrale side op med hovedet fastgjort i en næse-kegle. Fuld bedøvelse bør overvåges og bagbenene skal justeres, så de er stretched ud bag musen.
- Placer en dyrlæge salve på øjne mus for at forhindre tørhed.
- Hold halen af musen, hvor den møder den nedre del af ryggen til klart afsløre anus. Indsæt den stive endoskop hylster i et bæger med vand og justere luftstrømmen for at tillade frigivelsen af en lille boble ad gangen.
- Luftstrømmen vil tillade kolon at puste. Hvis luftstrømmen er for stærk, vil luft pumpes ind i maven på musen. Ingen yderligere smøring er nødvendig.
- Sæt forsigtigt den stive endoskop hylster ind i endetarmen. Generelt kan endoskopet indsættes op til 3 cm, på hvilket tidspunkt tyktarmen hos mus kurver og er ikke tilgængelig for det stive endoskop.
- En fælles vanskelighed under endoskopi procedurer er blokering af adgangen til lumen af tyktarmen på grund af fækalt materiale. Undgå dette ved forsigtigt massere af maven af mus forud for proceduren for at fremme afføring, eller forsigtigt manøvrering endoskopet omkring fecal sag under proceduren. Peristaltikken kan også forekomme, hvor endoskopet skal holdes på plads, indtil tyktarmen muskulatur slapper af.
- Start videooptagelse på noget tidspunkt i endoskopi procedure. Sygdom scoring kan registreres af en erfaren assistent under proceduren, eller på et senere tidspunkt fra videofilerne.
- Efter endoskopisk eksamen, returnerer musene til deres bur og overvåge dem under restitution fra anæstesi. Dyr er generelt vågen og mobil indenfor 2 min efter fjernelse fra isofluran administrerer næse kegle.
- Sørg for, at disse procedurer udføres af en erfaren forsker. Hver endoskopi procedure vil tage ca. 2 min per mus.
6. Sygdom Scoring
- For at overvåge colitis, score videoer for den murine Endoskopisk indeks Colitis Severity (MEICS) 16, som dokumenterer ændringer i (i) tykkelsen af colonvæggen angivet ved gennemsigtighed(Ii) afføring konsistens, (iii) blodkar integritet og tilstedeværelse, (iv) sår og områder af regenerering, som udgør i granulær mode, (v) blødning angivet ved fibrinaflejringer (figur 5A).
- For at overvåge tumor byrde, score videoer for tumorforekomst og størrelse. Tumor størrelse bestemmes af diameteren af colon lumen besat af tumoren 16 (figur 5B). Det er almindeligt at bruge begge colitis og tumor scoring parametre for en enkelt mus. Ved hjælp af endoskopi, individuelle tumorer og sundhed tyktarmsslimhinden kan overvåges over tid, hvilket giver en udlæsning for succes i nye lægemidler i et enkelt dyr.
- (Valgfrit) Stillbilleder kan udvindes fra videoerne til generering af repræsentative tal (figur 6).
Representative Results
Vægttab anvendes som standard parameter at overvåge for sygdom forbundet med colitis, som rutinemæssigt anvendes til at overvåge den generelle sundhed i mus. Dyr generelt bevare deres vægt, mens DSS-holdige vand administreres, og kun begynde at løs vægt, når de sendes tilbage til normal drikkevand. Acceptable vægttab parametre bør fastlægges i overensstemmelse med institutionens dyreetik udvalg. For at forhindre dehydrering associeret med langvarig diarré, anvende rutinemæssig bestemmelse af mask (foderpiller mashed og blandes med drikkevand) suppleret med en protein shake foruden normale drikkevand.
Som det kan anvendes en alternativ anæstesi, ketamin / xylazin eller lignende midler, hvis isofluran udstyr er ikke tilgængelig. På grund af den stive natur af endoskopet kun disse procedurer tillader visualisering af de mest distale 3 cm af muse colon. Nyere endoskoper med ekstra kapacitet (herunder fleksibilitet og fluorescens), afhængigt af behovene i eksperimentet. Men da de skadelige virkninger af DSS primært er begrænset til den distale colon af mus med mildere patologi observeres i midten colon, den stive endoskop ikke hindrer overvågning af mucosale sundhed individuelle mus. Selvom vi beskriver en protokol til profylaktisk behandling af akut DSS-induceret colitis, kan denne protokol let modificeres til at teste interventions- behandlingsstrategier. Effektiviteten af et lægemiddel beregnet til at afhjælpe epitelbeskadigelse og colitis kan overvåges på langs i individuelle mus og kvantificeres baseret på scoring beskrevne parametre (figur 5). Dette er fordelagtigt i forhold til traditionelle eksperimentelle design, som kræver aflivning af mus på specifikke tidspunkter i løbet af den eksperimentelle protokol og ikke tillader karakterisering af sygdommen respons på en behandling over tid.
t "> Kliniske studier på mennesker har fremhævet betydelig variation i, hvordan forskellige tumorer i den enkelte patient reagere på behandlinger. De procedurer, der er beskrevet her, være et middel til at overvåge den samlede tumorbyrde, samt behandlingsrespons af individuelle tumorer i løbet af et eksperiment. Det er vigtigt at overveje, at interventionsorganerne protokoller, der er beskrevet for kræftmodeller ikke tager hensyn til virkningerne af en terapi på tumor initiering. Profylaktiske protokoller, med den behandling, før når tumorer bliver synlige ved endoskopi, er forpligtet til at indhente disse oplysninger. De protokoller, der er skitseret her giver oplysninger om terapeutiske virkninger på på progression (målt ved tumorstørrelse) af individuelle tumorer. Tumor regression kan også angives ved en reduktion i antallet af synlige tumorer.g "/>
Figur 1:. Overvågning af effektiviteten af en profylaktisk behandling terapi i en model for akut colon skade Den eksperimentelle protokol (a) kræver 8 dage fra start til afslutning. Therapeutics administreres (b) fra dag 1 til profylaktiske behandlinger. DSS findes i drikkevandet (c) fra dag 3 af forsøgsprotokollen. Endoskopi udføres (d) at overvåge sygdomsprogression i dyrene. Foreslåede tidspunkter omfatter dag 0 (ubehandlet) og Dag 2 (sundhedsovervågning), Dag 5 og 8 (til at bestemme sygdomsbyrde). Eksperimentet afsluttes (e) om morgenen på dag 8. I en vildtype-mus (f) progression stiger sygdom over tid.
Figur 2: Overvågning af virkningen af indgreb terapi i en model of colitis-associeret cancer. Den eksperimentelle protokol (a) kræver 72 dage fra start til afslutning. Therapeutics (B) administreres til mus med etablerede tumorer fra dag 46 til interventions- behandlinger. AOM (c) injiceres på dag 1, og DSS findes i drikkevandet i løbet af tre cykler af forsøgsprotokollen, der begynder på dag 8. Endoskopi (d) udføres for at overvåge sygdomsprogression i dyrene. Foreslåede tidspunkter omfatter dag 0 (ubehandlet), Dag 20 (sundhedsovervågning), og dag 40 (til gruppe af dyr ifølge tumorbyrde). Endoskopi udføres ugentligt i løbet af terapeutisk behandling for at overvåge sygdom resultater. Eksperimentet (e) opsiges morgenen dag 72. I en vildtype mus (f) tumorbyrde stiger fra dag 40 og frem.
Figur 3:. Overvågning af virkningen af indgreb terapi i en model af spontan colorectal cancer Den eksperimentelle protokol (a) kræver> 50 uger fra start til afslutning. Therapeutics (B) administreres til mus med etablerede tumorer til interven- behandlinger. AOM (c) injiceres på dag 1, og derefter ugentligt for 6 på hinanden følgende injektioner i løbet af den eksperimentelle protokol. Endoskopi (d) udføres for at overvåge sygdommens progression i dyrene. Foreslåede tidspunkter omfatter Dag 0 (ubehandlet) og uge 8 (tumor overvågning) og hver anden uge der efter (for at etablere tumorbyrde). Endoskopi udføres ugentligt i løbet af behandlingen for at overvåge terapeutiske resultater. Eksperimentet (e) afsluttes i uge 50. I en vildtype mus (f) tumorbyrde stiger fra uge 40 og frem. p>
Figur 4:. Udstyr opsætning Den eksperimentelle opstilling (a) for endoskopisk enhed, med individuelle stykker udstyr angivet. Den stive endoskop (b), med de enkelte komponenter er angivet. Scale bar = 2,5 cm. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 5:. Scoring parametre sygdom ved endoskopi En oversigt (a) af den murine Endoskopisk Indeks for Colitis Severity (MEICS). En oversigt (b) i de enkelte tumor scoring parametre.es / ftp_upload / 52383 / 52383fig5highres.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 6: Repræsentative terapeutiske behandlinger Repræsentant vægttab, endoskopiske billeder og scorer for:. (A) Akut DSS-induceret mucosal skade (b) tumorer, der er udviklet efter AOM / DSS-protokollen (c) Tumorer, der udviklede efter den sekventielle.. AOM protokol. N = 3 mus pr gruppe. * P <0,05, *** p <0,001 (Students t-test). Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Discussion
De tre protokoller, der er beskrevet skitsere metoder til pålidelig og reproducerbar induktion af colon sygdom patologi i mus. Når det kombineres med rutinemæssig endoskopisk kontrol og interventionsstrategier skitseret her, vil disse protokoller giver kraftig prækliniske indsigt i effekten af lægemidler. Vores laboratorier rutinemæssigt bruger alle disse protokoller til at overvåge succesen af nye lægemidler 10,23,24.
Der er en række overvejelser, når de vælger en præklinisk dyremodel til at teste nye lægemidler. Disse omfatter relevans af modellen til den menneskelige sygdom, og bidraget fra tumormikromiljøet til forslaget af det terapeutiske mål. Her giver vi tre protokoller for terapeutisk intervention i etablerede tarm sygdomsmodeller. Disse modeller er reproducerbare og levering af reagenser til at fremkalde sygdom er nem at administrere. Vigtigt er det, modellerne er meget relevantetil flere facetter og stadier af colitis debut, og tumor initiering og progression. Forskerne bør tage hensyn til den genetiske baggrund af musestammer anvendt ved konstruktionen eksperimenter, som modtagelighed for sygdom fremkaldt af DSS og / eller AOM kan variere betydeligt 25. Desuden kan forskellige mikrobielle samfund har forskellige metaboliske kapacitet i forbindelse med AOM, som metaboliseres af bakterierne. Vi advarer mod at bruge forskellige kohorter af mus, som blev født i forskellige dyr faciliteter (herunder kommercielle leverandører) i et enkelt forsøg. Tilsvarende kan forskellige mikroflora i mus anvendes fra forskellige faciliteter fremkalde forskellige værtsresponser til DSS-induceret epitelbarriere skade 11. Endvidere bør passende analyse af væv (for eksempel RNA oprensning) også tages i betragtning, da evnen til DSS til at inhibere revers transkriptase vil påvirke efterfølgende molekylær analyse 26,27.
Som vores forståelse af inflammatorisk tarmsygdom og kolorektal kræft forvejen, vil nye mål for behandling identificeres. Passende dyremodeller vil være integreret til at sikre, at de mest lovende nye behandlingsformer bevæges mod kliniske forsøg.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dextran sulfate sodium (MW 36,000-50,000) | MP Biochemicals | 160110 | Requires batch testing. |
| Azoxymethane | Sigma | A5486-100MG | Requires batch testing. |
| Vanilla protein shake | N/A | N/A | Available from hospital pharmacies. |
| Isoflurane | PPC | M60303 | This is a restricted reagent, which should be stored under lock and key. |
| 70% ethanol | N/A | N/A | Standard lab reagent. |
| Coloview miniendoscopic system | |||
| Endovision Tricam | Karl Storz | 20212001-020 | |
| Xenon 175 light source with anti-fog pump | Karl Storz | 20134001 | |
| HOPKINS straight Forward Telescope | Karl Storz | 64301AA | |
| Endoscopic sheath (total diameter 3 mm) | Kalr Stroz | 61029C | |
| Fiber optic light cable | Kalr Stroz | 69495ND | |
| Computer and media player software | Apple | iMovie | |
| Scale | Any | Any scale suitable for weighing mice. |
References
- Tenesa, A., Dunlop, M. G. New insights into the aetiology of colorectal cancer from genome-wide association studies. Nat Rev Genet. 10, 353-358 (2009).
- Rustgi, A. K. The genetics of hereditary colon cancer. Genes Dev. 21, 2525-2538 (2007).
- Rutter, M., et al. Severity of inflammation is a risk factor for colorectal neoplasia in ulcerative colitis. Gastroenterology. 126, 451-459 (2004).
- Eaden, J. A., Abrams, K. R., Mayberry, J. F. The risk of colorectal cancer in ulcerative colitis: a meta-analysis. Gut. 48, 526-535 (2001).
- Lakatos, P. L., Lakatos, L. Risk for colorectal cancer in ulcerative colitis: changes, causes and management strategies. World J Gastroenterol. 14, 3937-3947 (2008).
- Xiang, B., Snook, A. E., Magee, M. S., Waldman, S. A. Colorectal cancer immunotherapy. Discov Med. 15, 301-308 (2013).
- Feng, Q. Y., et al. Anti-EGFR and anti-VEGF agents: Important targeted therapies of colorectal liver metastases. World J Gastroenterol. 20, 4263-4275 (2014).
- Dinarello, C. A. Anti-inflammatory Agents: Present and Future. Cell. 140, 935-950 (2010).
- Grivennikov, S. I., et al. Adenoma-linked barrier defects and microbial products drive IL-23/IL-17-mediated tumour growth. Nature. 491, 254-258 (2012).
- Putoczki, T., Thiem, S., Loving, A., Busuttil, R. A., Wilson, N. A., Ziegler, P., Nguyen, P., Preaudet, A., Farid, R., Edwards, K., Boglev, Y., Luwor, R. B., Jarnicki, A. J., Horst, D., Boussioutas, A., Heath, J., Sieber, O., Nash, A., Greten, F., McKenzie, B. S., Ernst, M. Interleukin-11 is the dominant IL-6 family cytokine during gastrointestinal tumorigenesis and can be targeted therapeutically. Cancer Cell. 24, 257-271 (2013).
- Perse, M., Cerar, A. Dextran sodium sulphate colitis mouse model: traps and tricks. J Biomed Biotechnol. 2012, 718617 (2012).
- Rose, W. A. 2nd, Sakamoto, K., Leifer, C. A. Multifunctional role of dextran sulfate sodium for in vivo modeling of intestinal diseases. BMC Immunol. 13, 41 (2012).
- Laroui, H., et al. Dextran sodium sulfate (DSS) induces colitis in mice by forming nano-lipocomplexes with medium-chain-length fatty acids in the colon. PLoS One. 7, e32084 (2012).
- Miyazawa, F., Olijnyk, O. R., Tilley, C. J., Tamaoki, T. Interactions between dextran sulfate and Escherichia coli ribosomes. Biochim Biophys Acta. 145, 96-104 (1967).
- Peterson, L. W., Artis, D. Intestinal epithelial cells: regulators of barrier function and immune homeostasis. Nat Rev Immunol. 14, 141-153 (2014).
- Neufert, C., Becker, C., Neurath, M. F. An inducible mouse model of colon carcinogenesis for the analysis of sporadic and inflammation-driven tumor progression. Nat Protoc. 2, 1998-2004 (2007).
- Schwitalla, S., et al. Loss of p53 in Enterocytes Generates an Inflammatory Microenvironment Enabling Invasion and Lymph Node Metastasis of Carcinogen-Induced Colorectal Tumors. Cancer Cell. 23, 93-106 (2013).
- Fiala, E. S. Investigations into the metabolism and mode of action of the colon carcinogens 1,2-dimethylhydrazine and azoxymethane. 40, 2436-2445 (1977).
- Chen, J., Huang, X. F. The signal pathways in azoxymethane-induced colon cancer and preventive implications. Cancer Biol Ther. 8, 1313-1317 (2009).
- Bollrath, J., et al. gp130-mediated Stat3 activation in enterocytes regulates cell survival and cell-cycle progression during colitis-associated tumorigenesis. Cancer Cell. 15, 91-102 (2009).
- Becker, C., Fantini, M. C., Neurath, M. F. High resolution colonoscopy in live mice. Nat Protoc. 1, 2900-2904 (2006).
- Ivanov, I. I., et al. Induction of intestinal Th17 cells by segmented filamentous bacteria. Cell. 139, 485-498 (2009).
- Thiem, S., et al. mTORC1 inhibition restricts inflammation-associated gastrointestinal tumorigenesis in mice. J Clin Invest. 123, 767-781 (2013).
- Stuart, E., et al. Therapeutic inhibition of Jak activity inhibits progression of gastrointestinal tumors in mice. Mol Cancer Ther. 13, 468-474 (2014).
- De Robertis, M., et al. The AOM/DSS murine model for the study of colon carcinogenesis: From pathways to diagnosis and therapy studies. J Carcinog. 10, 9 (2011).
- Viennois, E., Chen, F., Laroui, H., Baker, M. T., Merlin, D. Dextran sodium sulfate inhibits the activities of both polymerase and reverse transcriptase: lithium chloride purification, a rapid and efficient technique to purify RNA. BMC Res Notes. 6, 350 (2013).
- Kerr, T. A., et al. Dextran sodium sulfate inhibition of real-time polymerase chain reaction amplification: a poly-A purification solution. Inflamm Bowel Dis. 18, 344-348 (2012).
