Introduction
Kolorektal cancer (CRC) är den 4: e vanligaste orsaken till malignitet i världen 1. Trots de betydande framsteg i vår förståelse av den familjära grund av denna sjukdom, genetiska anlag bidrar endast till ~ 20% av CRC fallen 2. Resten tillskrivs många yttre och miljöfaktorer, däribland kronisk inflammation. Hos människa är uppenbar i ulcerös kolit (UC) patienter, som har en större risk att utveckla kolit associerade tjocktarmscancer (CAC) sambandet mellan kronisk inflammation och tjocktarmscancer, beroende på längd, omfattning och svårighetsgrad av inflammatorisk sjukdom 3 -5. Följaktligen nya terapier är under utveckling för att styra immunsvaret och den tillhörande produktion av tillväxtbefrämjande faktorer genom den inflammatoriska tumörens mikro 6-8. Det finns ett ökande krav för lämpliga prekliniska djurmodeller för att karaktärisera den terapeutiska effekten avdessa läkemedel mot utveckling och progression av sjukdomen.
Musmodeller har entydigt visat att den inflammatoriska mikromiljön bidrar till CRC progression, även i frånvaro av uppenbar inflammation 9,10. Dessa modeller inkluderar användning av polysackarid dextransulfat natrium (DSS), förutsatt i dricksvattnet hos möss, att modellera epitelial skada och akut och kronisk inflammatorisk tarmsjukdom (IBD) 11,12. Även om den mekanism genom vilken DSS inducerar mucosal skador och kolit är inte helt klarlagda, vissa studier tyder på att DSS hämmar cellulära omvänt transkriptas och ribonukleas verksamhet inom celler, eller främjar bildningen av nano lipidkomplexen som smälter med kolon membranet leder till epitelskada 13,14. Ändringar av standard DSS modellen har också gett betydande insikt i de mekanismer genom vilka kolon epitelceller upprätthålla vävnads homeostas och förordsen mukosala immunsvar 15.
Intraperitoneal administrering av azoximetan (AOM) ensamt eller i kombination med DSS, ger en modell för att undersöka samspelet mellan somatiska mutationer i epitelial slemhinnan och den inflammatoriska och stromal mikromiljö 16,17. AOM är en metabolit av carcinogen 1,2-dimetylhydrazin (DMH) som inte direkt leder till DNA-mutationer. Istället är AOM hydrolyseras för methylazoxymethanol (MAM) av cytokrom isoformen CYP2E1 i levern, där MAM konjugeras med glukuronsyra och sedan transporteras till tarmen genom galla sekret 18. Man tror att den bakteriella β-glukuronidas bidrar till nedbrytningen av MAM vilket resulterar i DNA-alkylering och en ansamling av mutationer i epitelceller 19. De flesta AOM-inducerad colonic tumörer hysa missense mutationer i genen som kodar för β-katenin, vilket gör proteinet resistent mot proteasomal degradatipå, vilket resulterar i avvikande aktivering av den kanoniska Wnt-signalvägen 20. När aktiviteten av AOM kombineras med den mukosala skador som framkallats av DSS, den efterföljande sårläkande respons skapar en mikromiljö som är gynnsamma för tillväxten och expansionen av den mutageniserade epitelet. I en variation av denna modell kan repetitiv administrering av AOM ensam över en period av flera veckor användas för att modellera sporadisk kolorektal cancer, i frånvaro av DSS-inducerad kolit 10,17. Dessa två gratis modeller ger experimentella inställningar för att studera CAC och sporadisk CRC respektive, som båda är förknippade med en pro-inflammatoriska tumörmikromiljö 10.
Användningen av serie endoskopi i möss var uppfunnen av Becker och kollegor 21, och möjliggör longitudinell uppföljning av kolit och tumörprogression. Här ger vi tre pre-kliniska protokoll baserade på DSS-inducerad mucosal skador och / eller AOM-medierad tumor induktion att reproducerbart inducera specifika colonic patologier. Den första protokollet beskriver inducera akut slemhinneskada som svar på DSS administrationen att framkalla många av de histopatologiska egenskaper som förknippas med IBD. Den andra protokollet bygger på tre på varandra följande cykler av DSS administration för att efterlikna de facklor på inflammation som vanligen observerats i IBD-patienter, och kan utföras i samband med AOM-inducerade mutationer. Den slutliga Protokollet är baserat på AOM-inducerad sporadiska epiteliala mutationer. För vart och ett av dessa protokoll, vi expanderar på de relevanta standardprocedurer för att inkludera profylaktiska och terapeutiska interventionsmetoder som vi har utvecklat för att övervaka effektiviteten av nya läkemedel.
Protocol
Walter och Eliza Hall Institute of Medical Research djuretik kommitté godkände varje förfaranden som beskrivs i dessa protokoll.
1. Beredning av experimentell Möss
- Komponera experimentella kohorter av minst 4 könsmatchade 6-8 veckor gamla C57BL / 6 möss (M. musculus) som är uppfödda och inrymt i samma specifika patogenfria (SPF) djuranläggning / rum och försedda med autoklaveras mat och vatten. Användningen av honmöss tillåter samtidig bostäder av möss från olika linjer, gräns boxnummer, och minska bur till bur variation.
- Se till att möss är minst 6 veckors ålder för att möjliggöra endoskopi förfaranden som använder 3,0 mm endoskopi diameter slida.
- Använd möss av samma genetiska bakgrund, och om möjligt, från burar som lagras på samma rack för att minska variationer i samband med tarmfloran. Variationer i mikroflora mellan djuranläggningar bör beaktas when bestämma lämpliga kontrollmöss och genotyper för varje experiment 22.
- Mark möss genom örat / tå urklipp, tatueringar, eller liknande för att möjliggöra enkel identifiering.
- Väg möss på dag 0, för att bestämma baslinjen experimentella vikter.
- Utför endoskopi (se avsnitt 5) av möss på dag 0 att spela baslinjen kolon fenotyper.
2. Pre-klinisk prövning på ett Epithelial Skador och akut kolit Model
- Bered en lösning av det terapeutiska medlet som skall testas. För läkemedel som levereras av oral sondmatning (po), förbereda lösningar på en maximal volym på 100 l. För läkemedel som levereras av intraperitoneal (ip) injektion, förbereda lösningar på en maximal volym av 200 pl.
OBS: Upprepad ip eller po läkemedelsadministrering under längre perioder kan leda till förändrad mus beteende. Alternera ip injektionsstället för att undvika långvarig obehag. För po administrering ge möss med autoclaved solrosfrön, som en "behandla" att minimera de negativa association med sondmatning förfarandet. - Dag 1, administrera terapeutiska intresse (framställd i steg 2.1) och lämpliga kontroller fordons. I det visade exemplet (figur 6A), 5 | ig rekombinant humant (rh) iInterleukin (IL) -11-proteinet löstes i 200 | il fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och administrerades ip
- Bestämma tidpunkten och frekvensen av administrationer, som kommer att vara beroende av den farmakokinetiska profilen som fastställts för det terapeutiska reagenset som testas. Figur 1 skisserar profylaktisk behandling med användning av två gånger dagliga ip injektioner under loppet av experimentet.
- Övervaka, inklusive avföring konsekvens och förekomst av blod, och väga varje mus dagligen. På dagarna av behandling, att vägning bör sammanfalla med administrering av det terapeutiska läkemedlet minimera stress för mössen orsakas av upprepad hantering. På dag 3, förbereda 2,5% (2,5 g / 100 ml) DSS-lösning i dricksvattnet rutinmässigt ges till möss genom djurets anläggning. Ungefär 5 ml / mus / dag av DSS lösning krävs för experimentet. Förbrukningen av DSS vattnet kan förändras om den omgivande temperaturen i djuranläggningen fluktuerar.
OBS: DSS är irriterande och bör hanteras i enlighet med SDB instruktioner. - Frisk DSS till mössen ad libitum i rena vattenflaskor för fem sammanhängande dagar. På kvällen den dag 5, ger normalt dricksvatten utöver mosade mat pellets och ett proteintillskott ges i små petriskålar (100 g livsmedel pellets / 10 g protein shake / 10 ml vatten). Detta förhindrar uttorkning och hjälper till med att minimera kraftig viktminskning.
- Euthanize möss genom CO2 berusning och samla vävnad för efterföljande histologisk analys på morgonen dag 8, eller när mössen upplever ≥15% viktminskning i mer än tre consecutive dagar, beroende på vilket som inträffar först.
OBSERVERA: Justera DSS dosen mellan 1-4% (vikt / volym) beroende på mikrofloran i djurhuset och satsen av DSS. Utför, rutinpartiprovning för att fastställa lämpliga DSS doseringen och kringgå sats till sats variation. Den lämpliga dosen bör baseras på viktminskning (högst 15% av den ursprungliga vikten) och bekräftade kolit histopatologi.
3. Prekliniska Trial i en kronisk kolit eller kolit-associerad Cancer
- För kronisk kolit modellen börjar från steg 3.7.
- För kolit-förbunden cancer (CAC) modell, på dag 1, injicera varje mus med 10 mg / kg (vikt / vikt) azoximetan (AOM, 250 ul, ip).
OBS: AOM är cancerframkallande och bör hanteras i enlighet med SDB instruktioner. - Förrådslösningar av AOM framställs såsom 10 mg / ml-alikvoter och lagrades vid -20 ° C. På dagen för injektionen är AOM stamlösning tinades och späddes till 1 mg / ml i PBS. Upprepad frysning och upptining av AOM stamlösning bör undvikas.
- AOM dosen kan justeras mellan 8-12 mg / kg. Rutin batch tester krävs för att fastställa den lämpliga AOM doseringen för att kringgå toxicitet för möss pga sats till sats variation.
- Under dagar 1-7 efter AOM administrations vikter kommer att vara stabil och därför vikt övervakning kan utelämnas under Days 1-7 för att undvika hanterar djuren som kommer utsöndrar cytotoxiska metaboliter i deras avföring.
- Dag 7 alla sängkläder behöver ändras efter cytotoxiska förfaranden. När strö förändringen är klar, djuren inte längre kräva cytotoxiska hanteringsrutiner, eftersom de inte längre kommer att utsöndra cytotoxiska metaboliter.
- Dag 8, förbereder 2,5% (2,5 g / 100 ml) DSS-lösning (som beskrivs i steg 2,5) och lämna till mössen ad libitum.
- Väg möss dagligen under hela experimentet och övervaka tecken på sjukdom, inklusive volang fur, hunching, blodig avföring och minskad rörlighet.
- På dag 13, ta bort DSS-lösning och ge möss med normal dricksvatten tills Dag 28. Dagar 8-28 utgör en "cykel" av kronisk kolit / CAC-protokollet.
- På Days 13-28, när mössen ges normalt dricksvatten, ge mössen med mosade mat pellets och ett proteintillskott ges i små petriskålar (100 g livsmedel pellets / 10 g protein shake / 10 ml vatten). Detta förhindrar uttorkning och hjälper till med att minimera kraftig viktminskning.
OBS: De proteintillskott i mäsk bör inte lämnas när mössen får DSS innehåller dricksvatten för att säkerställa konsekvens i DSS konsumtionen. - På dag 20 utför den andra endoskopisk undersökning för att övervaka enskilda mus hälsa (se avsnitt 5).
- På dag 29 upprepa DSS cykeln (cykel 2: 2,5% (vikt / volym) DSS tillhandahålls under dagar 29-33 och normal dricksvatten under dagar 34-50).
- På dag 40 utför third endoskopisk undersökning för att övervaka enskilda mus hälsa och bestämma tumörbörda (se avsnitt 5).
- Om inga tumörer är synliga med endoskopi på dag 40, börjar en tredje DSS cykel på Days 50-72 (cykel 3: 2,5% (vikt / volym) DSS tillhandahålls under dagar 50-55 och normal dricksvatten under dagar 56-72). Generellt tumörer är synliga vid dag 40 och kan därför utelämnas den tredje cykeln av DSS.
- När tumörer blir synliga genom endoskopisk undersökning, tilldela varje mus en endoskopisk tumör poäng (se avsnitt 5) och tilldela individuella möss till kohorter med liknande utgångstumör bördor.
- På dag 42 (eller när tumörer är synliga), administrera terapeutiska föreningen eller relevanta fordonsstyrning (se avsnitt 2.2). Tidpunkten för doserna kommer att vara beroende av den farmakokinetiska profilen för den terapeutiska. Ett exempel på en interventionsbehandling injicerad ip tre gånger i veckan i möss med etablerade tumörer tillhandahålls (Figur 2).
- Utför endoscopic tentor gång per vecka under hela den terapeutiska behandlingen för att övervaka tumörbörda. Generellt är tillräckligt att konstatera en objektiv behandlingssvar fyra veckor av en terapeutisk behandling. Efter upphörande av behandlingen, kan en kohort av möss också övervakas med endoskopi för tumör återfall.
- Euthanize möss genom CO2 berusning och samla vävnader för biokemisk och / eller histologiska analysen på morgonen dag 72 eller när mössen upplever ≥15% viktminskning i mer än tre dagar i följd, beroende på vilket som inträffar först.
4. Prekliniska Trial i en sporadisk kolorektal cancer Model
- Dag 1, injicera varje mus ip med 10 mg / kg AOM (se steg 3.2). AOM dosen kan justeras mellan 8-12 mg / kg. Rutin batch tester krävs för att fastställa den lämpliga AOM doseringen för att kringgå toxicitet för möss pga sats till sats variation.
- Upprepa injektionen den första dagen i varje veckaför följande fem veckor (Figur 3). Mössen ska hanteras enligt cytotoxiska säkerhetsrutiner för hela 6 veckor.
- Väg varje mus på dagen för AOM injektion för att minimera obehag till mössen orsakas av upprepad hantering.
OBS: AOM är cancerframkallande och bör hanteras i enlighet med SDB instruktioner. - Alla djur bör hanteras enligt cytotoxiska säkerhetsrutiner för 6 veckor AOM ip injektioner som krävs för detta protokoll.
- Under vecka 8 utföra endoskopisk undersökning för att övervaka för nya tumörer (se avsnitt 5). Endoskopisk undersökning bör utföras varannan vecka tills tumörer blir synliga. Generellt vildtyp C57BL / 6 djur börjar utveckla tumörer genom ca 40 veckor efter den initiala administreringen av AOM.
- När tumörer blir synliga genom endoskopisk undersökning, tilldela varje mus en endoskopisk tumör poäng (se avsnitt 5) och tilldela individuella möss till en kohort med liknande tumör bördor före påbörjandet av terapeutisk behandling.
- Under vecka 40 (eller när tumörer är första synliga), administrera terapeutiska föreningen eller relevant fordonskontrollen.
- Tidpunkten för doserna kommer att vara beroende av den farmakokinetiska profilen för den terapeutiska (se steg 2.1). Ett exempel på en interventionsbehandling injicerad ip 3 gånger i veckan i möss med etablerade tumörer tillhandahålls (Figur 3).
- Utför endoskopisk undersökning varje vecka under hela den terapeutiska behandlingsperioder för att övervaka tumörbörda. Generellt är tillräcklig för en objektiv behandlingssvar fyra veckor av en terapeutisk behandling. Efter avslutad behandling, kan en kohort av möss också övervakas med endoskopi för tumör återfall.
- Euthanize möss genom CO2 berusning och samla vävnader för biokemisk och / eller histologiska analysen av tjocktarmen och tumörer under vecka 45, eller efter 4 veckors behandling.
- Den endoskopi utrustning bör monteras enligt gällande rutiner 16.
- Sterilisera och rengör endoskopet sond med 70% etanol eller en anti-bakteriell smörjmedel.
- Videoklipp kan spelas in med hjälp av en bärbar eller stationär dator och standard medier programvara, till exempel iMovie. En vanlig datorskärm, snarare än en medicinsk kvalitet bildskärm, är tillräcklig för att visualisera kolon under endoskopi förfarandet (figur 4).
- Bedöva grupper om 5-6 möss samtidigt i en kammare med 3% isofluran i 100% O2 med en hastighet av 0,2 till 0,4 l / min. När mössen bedövas, vilket bekräftas av tå nypa; isofluran nivåerna bör ändras till 0,5-2% för underhåll.
- Ta bort en enskild mus från kammaren, och placera den ventrala sidan upp med huvudet fast i en noskonen. Full anestesi bör övervakas och bakbenen bör justeras så att de är stretched ut bakom musen.
- Placera en veterinär salva på ögonen på mössen för att förhindra torrhet.
- Håll svansen på musen där den möter den nedre delen av ryggraden för att tydligt visa anus. Sätt den styva endoskop skidan i en bägare med vatten och justera luftflödet för att tillåta frisläppandet av en liten bubbla i taget.
- Luftflödet kommer att tillåta kolon att blåsa. Om luftflödet är för stark, kommer luft att pumpas in i magen av musen. Ingen ytterligare smörjning krävs.
- Försiktigt in den stela endoskop slida i ändtarmen. Generellt kan endoskopet infogas upp till 3 cm, vid vilken punkt kolon i möss kurvor och är inte tillgänglig för stela endoskop.
- En vanlig svårighet under endoskopi procedurer är blockering av tillgång till lumen i kolon grund av avföring. Undvik detta genom att försiktigt massera av magen av möss före ingreppet för att uppmuntra avföring, eller försiktigt manövrera endoskopet runt fecal fråga under förfarandet. Peristaltik kan också förekomma, under vilket endoskopet bör hållas på plats tills kolon muskulaturen slappnar av.
- Initiera videoinspelning i något skede av endoskopi förfarandet. Sjukdoms scoring kan registreras av en erfaren assistent under förfarandet, eller vid ett senare tidpunkt från videofiler.
- Efter endoskopisk examen, tillbaka mössen till deras bur och övervaka dem under återhämtning från anestesi. Djur är generellt vaken och mobil inom 2 min efter avlägsnande från isofluran administrerar noskon.
- Se till att dessa förfaranden utförs av en erfaren forskare. Varje endoskopi förfarande tar ca 2 min per mus.
6. Sjukdoms Scoring
- För övervakning kolit, score videoklipp för Murine Endoskopisk Index för Colitis Severity (MEICS) 16, vilken dokumenterar förändringar i (i) tjockleken på kolonväggen indikeras av öppenhet, (Ii) avföringskonsistens, (iii) blodkärlsintegritet och närvaro, (iv) sår och områden av regenere den närvarande i en granulär mode, (v) blödning indikeras av fibrinavsättningar (figur 5a).
- Att övervaka tumörbörda, poäng videoklipp för tumörincidens och storlek. Tumör storlek bestäms av diametern på kolon lumen upptas av tumören 16 (figur 5b). Det är vanligt att använda både kolit och tumör scoring parametrar för en enda mus. Använda endoskopi, enskilda tumörer och hälsa kolonmukosa kan följas över tid, vilket ger en avläsning för att lyckas med nya läkemedel hos ett enskilt djur.
- (Valfritt) Stillbilder kan extraheras från videorna för generering av representativa siffror (Figur 6).
Representative Results
Viktminskning används som en standardparameter som ska övervakas för sjukdom associerad med kolit, som rutinmässigt används för att övervaka den allmänna hälsan hos möss. Djur behålla allmänhet sin vikt medan DSS-innehållande vatten administreras, och endast börja lös vikt när de återvände till det normala dricksvatten. Godtagbara viktminskning parametrar bör fastställas i enlighet med institutionens djur etiska kommitté. För att förhindra uttorkning associerad med långvarig diarré, använd rutin tillhandahållande av mäsk (matpellets mosas och blandas med dricksvatten) kompletterat med ett proteinshake utöver det normala dricksvatten.
Som ett alternativ anestesi, ketamin / xylazin eller liknande medel kan användas, är inte tillgängligt om isofluran utrustning. På grund av den stela naturen av endoskopet, dessa förfaranden tillåter endast för visualisering av de mest distala 3 cm av musändtarm. Nyare endoskop med ytterligare funktioner (inklusive flexibilitet och fluorescens) finns tillgängliga beroende på behoven av försöket. Eftersom de skadliga effekterna av DSS är primärt begränsad till den distala tjocktarmen hos möss, med mildare patologi observer i mitten kolon, den styva endoskopet inte hindrar övervakning av den mukosala hälsa individuella möss. Även om vi beskriver ett protokoll för profylaktisk behandling av akut DSS-inducerad kolit, kan detta protokoll enkelt modifieras för att testa interventionsbehandlingsstrategier. Effekten av en drog som syftar till att lindra epitelskada och kolit kan övervakas på längden i enskilda möss och kvantifieras utifrån de poäng parametrar som beskrivs (Figur 5). Detta är fördelaktigt jämfört med traditionella experimentella konstruktioner, som kräver avlivning av mössen vid specifika tidpunkter under experimentprotokollet, och tillåter inte karakterisering av sjukdomen som svar på en behandling över tid.
t "> Kliniska studier på människa har markerat betydande variation i hur olika tumörer hos den enskilda patienten svarar på behandling. De förfaranden som beskrivs här är ett sätt att övervaka övergripande tumörbörda, samt behandlingssvar av individuella tumörer under loppet av ett experiment. Det är viktigt att tänka på att interventionsprotokoll som beskrivs för cancermodeller inte tar hänsyn till effekterna av en terapi på tumör initiering. Profylaktisk protokoll, med den behandling som före när tumörer blir synliga med endoskopi, krävs för att få denna information. De protokoll som beskrivs här ger information om terapeutiska effekter på på progression (mätt med tumörstorlek) av individuella tumörer. Tumör regression kan också indikeras av en minskning av antalet synliga tumörer.g "/>
Figur 1:. Övervakning av effekten av en profylaktisk behandling terapi i en modell av akut kolon skador Experimentprotokollet (a) kräver 8 dagar från start till färdigställande. Therapeutics administreras (b) från dag 1 för profylaktisk behandling. DSS är anordnad i dricksvatten (c) från dag 3 av det experimentella protokollet. Endoskopi utförs (d) för att övervaka sjukdomsförloppet i djuren. Föreslagna tidpunkter inkluderar Dag 0 (obehandlat) och dag 2 (hälsoövervakning), Dag 5 och 8 (för att bestämma sjukdomsbördan). Experimentet avslutas (e) morgonen dag 8. I en vild typ mus (f) utvecklingen av sjukdomen ökar med tiden.
Figur 2: Övervakning av effekten av interventionen terapi i en modell of kolit-associerad cancer. Det experimentella protokollet (a) kräver 72 dagar från start till färdigställande. Therapeutics (b) administreras till möss med etablerade tumörer från dag 46 för interventionsbehandlingar. AOM (c) injiceras på dag 1, och DSS finns i dricksvatten under loppet av tre cykler av den experimentella protokollet, som börjar den dag 8. endoskopi (d) utförs för att övervaka sjukdomsprogression i djuren. Föreslagna tidpunkter inkluderar Dag 0 (obehandlat), Dag 20 (hälsoövervakning) och Dag 40 (gruppera djur enligt tumörbörda). Endoskopi utförs varje vecka under loppet av den terapeutiska behandlingen för att övervaka sjukdomsutfall. Experimentet (e) avslutas morgonen dag 72. I en vild typ mus (f) tumörbörda ökar från dag 40 och framåt.
Figur 3:. Övervakning effekten av interventionsterapi i en modell för spontan kolorektalcancer Experimentprotokollet (a) kräver> 50 veckor från start till slutförande. Therapeutics (b) administreras till möss med etablerade tumörer för interventionsbehandlingar. AOM (c) injiceras på dag 1, och därefter varje vecka under 6 på varandra följande injektioner under loppet av det experimentella protokollet. Endoskopi (d) utförs för att övervaka sjukdomsprogression i djuren. Föreslagna tidpunkter inkluderar Dag 0 (obehandlat) och vecka 8 (tumör övervakning) och varannan vecka där efter (för att fastställa tumörbörda). Endoskopi utförs varje vecka under loppet av behandlingen för att övervaka terapeutiska resultat. Experimentet (e) avslutas i vecka 50. I en vild typ mus (f) tumörbörda ökar från vecka 40 och framåt. p>
Figur 4:. Utrustning set-up Den experimentella uppställningen (a) för den endoskopiska enheten, med individuella delar av utrustning anges. Den stela endoskop (b), med enskilda komponenter anges. Skala bar = 2,5 cm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5:. Sjukdomsparametrar Scoring efter endoskopi En skiss (a) i Murine Endoskopisk Index för Colitis Severity (MEICS). En skiss (b) av de enskilda tumör scoring parametrar.es / ftp_upload / 52.383 / 52383fig5highres.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Representativa terapeutiska behandlingar representant viktminskning, endoskopiska bilder och poängen för:. (A) Akut DSS-inducerad mucosal skador (b) tumörer som utvecklades efter det AOM / DSS-protokollet (c) Tumörer som utvecklades efter det sekventiella.. AOM-protokollet. N = 3 möss per grupp. * P <0,05, *** P <0,001 (T-test). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
De tre protokoll som beskrivs konturmetoder tillförlitligt och reproducerbart induktion av kolon sjukdom patologi i möss. I kombination med rutin endoskopisk övervakning och interventionsstrategier som beskrivs här, kommer dessa protokoll ger kraftfull preklinisk insikt i effekten av läkemedel. Våra laboratorier använder rutinmässigt alla dessa protokoll för att övervaka framgången för nya behandlingar 10,23,24.
Det finns ett antal överväganden när man väljer en preklinisk djurmodell för att testa nya läkemedel. Dessa innefattar relevans av modellen till den humana sjukdomen, och bidraget från tumörens mikromiljö till den föreslagna åtgärden av det terapeutiska målet. Här ger vi tre protokoll för terapeutisk intervention i etablerade tarmsjukdomsmodeller. Dessa modeller är reproducerbara och leverans av reagens för att framkalla sjukdom är lätt att hantera. Viktigt modellerna är mycket relevantatill flera aspekter och stadier av kolit debut, och tumör initiering och progression. Forskare bör ta hänsyn till den genetiska bakgrunden till musstammar användas vid konstruktionen experiment som mottaglighet för sjukdomen induceras av DSS och / eller AOM kan variera avsevärt 25. Dessutom kan olika mikrobiella samhällen har olika kapacitet metaboliska i samband med AOM, som metaboliseras av bakterier. Vi varnar för att använda olika kohorter av möss som är födda i olika djuranläggningar (inklusive kommersiella försäljare) i ett enda experiment. På samma sätt kan de olika mikrofloran hos möss användas från olika anläggningar framkallar olika värd svar på DSS-inducerad epitelbarriär skador 11. Dessutom bör också övervägas lämplig analys av vävnad (t.ex. RNA rening), eftersom förmågan hos DSS att hämma omvänt transkriptas kommer att påverka efterföljande molekylär analys 26,27.
Som vår förståelse av inflammatorisk tarmsjukdom och kolorektal cancer förskott, kommer nya mål för terapin identifieras. Lämpliga djurmodeller kommer att vara en integrerad del av att se till att de mest lovande nya terapier flyttas mot kliniska prövningar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dextran sulfate sodium (MW 36,000-50,000) | MP Biochemicals | 160110 | Requires batch testing. |
| Azoxymethane | Sigma | A5486-100MG | Requires batch testing. |
| Vanilla protein shake | N/A | N/A | Available from hospital pharmacies. |
| Isoflurane | PPC | M60303 | This is a restricted reagent, which should be stored under lock and key. |
| 70% ethanol | N/A | N/A | Standard lab reagent. |
| Coloview miniendoscopic system | |||
| Endovision Tricam | Karl Storz | 20212001-020 | |
| Xenon 175 light source with anti-fog pump | Karl Storz | 20134001 | |
| HOPKINS straight Forward Telescope | Karl Storz | 64301AA | |
| Endoscopic sheath (total diameter 3 mm) | Kalr Stroz | 61029C | |
| Fiber optic light cable | Kalr Stroz | 69495ND | |
| Computer and media player software | Apple | iMovie | |
| Scale | Any | Any scale suitable for weighing mice. |
References
- Tenesa, A., Dunlop, M. G. New insights into the aetiology of colorectal cancer from genome-wide association studies. Nat Rev Genet. 10, 353-358 (2009).
- Rustgi, A. K. The genetics of hereditary colon cancer. Genes Dev. 21, 2525-2538 (2007).
- Rutter, M., et al. Severity of inflammation is a risk factor for colorectal neoplasia in ulcerative colitis. Gastroenterology. 126, 451-459 (2004).
- Eaden, J. A., Abrams, K. R., Mayberry, J. F. The risk of colorectal cancer in ulcerative colitis: a meta-analysis. Gut. 48, 526-535 (2001).
- Lakatos, P. L., Lakatos, L. Risk for colorectal cancer in ulcerative colitis: changes, causes and management strategies. World J Gastroenterol. 14, 3937-3947 (2008).
- Xiang, B., Snook, A. E., Magee, M. S., Waldman, S. A. Colorectal cancer immunotherapy. Discov Med. 15, 301-308 (2013).
- Feng, Q. Y., et al. Anti-EGFR and anti-VEGF agents: Important targeted therapies of colorectal liver metastases. World J Gastroenterol. 20, 4263-4275 (2014).
- Dinarello, C. A. Anti-inflammatory Agents: Present and Future. Cell. 140, 935-950 (2010).
- Grivennikov, S. I., et al. Adenoma-linked barrier defects and microbial products drive IL-23/IL-17-mediated tumour growth. Nature. 491, 254-258 (2012).
- Putoczki, T., Thiem, S., Loving, A., Busuttil, R. A., Wilson, N. A., Ziegler, P., Nguyen, P., Preaudet, A., Farid, R., Edwards, K., Boglev, Y., Luwor, R. B., Jarnicki, A. J., Horst, D., Boussioutas, A., Heath, J., Sieber, O., Nash, A., Greten, F., McKenzie, B. S., Ernst, M. Interleukin-11 is the dominant IL-6 family cytokine during gastrointestinal tumorigenesis and can be targeted therapeutically. Cancer Cell. 24, 257-271 (2013).
- Perse, M., Cerar, A. Dextran sodium sulphate colitis mouse model: traps and tricks. J Biomed Biotechnol. 2012, 718617 (2012).
- Rose, W. A. 2nd, Sakamoto, K., Leifer, C. A. Multifunctional role of dextran sulfate sodium for in vivo modeling of intestinal diseases. BMC Immunol. 13, 41 (2012).
- Laroui, H., et al. Dextran sodium sulfate (DSS) induces colitis in mice by forming nano-lipocomplexes with medium-chain-length fatty acids in the colon. PLoS One. 7, e32084 (2012).
- Miyazawa, F., Olijnyk, O. R., Tilley, C. J., Tamaoki, T. Interactions between dextran sulfate and Escherichia coli ribosomes. Biochim Biophys Acta. 145, 96-104 (1967).
- Peterson, L. W., Artis, D. Intestinal epithelial cells: regulators of barrier function and immune homeostasis. Nat Rev Immunol. 14, 141-153 (2014).
- Neufert, C., Becker, C., Neurath, M. F. An inducible mouse model of colon carcinogenesis for the analysis of sporadic and inflammation-driven tumor progression. Nat Protoc. 2, 1998-2004 (2007).
- Schwitalla, S., et al. Loss of p53 in Enterocytes Generates an Inflammatory Microenvironment Enabling Invasion and Lymph Node Metastasis of Carcinogen-Induced Colorectal Tumors. Cancer Cell. 23, 93-106 (2013).
- Fiala, E. S. Investigations into the metabolism and mode of action of the colon carcinogens 1,2-dimethylhydrazine and azoxymethane. 40, 2436-2445 (1977).
- Chen, J., Huang, X. F. The signal pathways in azoxymethane-induced colon cancer and preventive implications. Cancer Biol Ther. 8, 1313-1317 (2009).
- Bollrath, J., et al. gp130-mediated Stat3 activation in enterocytes regulates cell survival and cell-cycle progression during colitis-associated tumorigenesis. Cancer Cell. 15, 91-102 (2009).
- Becker, C., Fantini, M. C., Neurath, M. F. High resolution colonoscopy in live mice. Nat Protoc. 1, 2900-2904 (2006).
- Ivanov, I. I., et al. Induction of intestinal Th17 cells by segmented filamentous bacteria. Cell. 139, 485-498 (2009).
- Thiem, S., et al. mTORC1 inhibition restricts inflammation-associated gastrointestinal tumorigenesis in mice. J Clin Invest. 123, 767-781 (2013).
- Stuart, E., et al. Therapeutic inhibition of Jak activity inhibits progression of gastrointestinal tumors in mice. Mol Cancer Ther. 13, 468-474 (2014).
- De Robertis, M., et al. The AOM/DSS murine model for the study of colon carcinogenesis: From pathways to diagnosis and therapy studies. J Carcinog. 10, 9 (2011).
- Viennois, E., Chen, F., Laroui, H., Baker, M. T., Merlin, D. Dextran sodium sulfate inhibits the activities of both polymerase and reverse transcriptase: lithium chloride purification, a rapid and efficient technique to purify RNA. BMC Res Notes. 6, 350 (2013).
- Kerr, T. A., et al. Dextran sodium sulfate inhibition of real-time polymerase chain reaction amplification: a poly-A purification solution. Inflamm Bowel Dis. 18, 344-348 (2012).
