Abstract
Nedeniyle heterojenite ve aynı yolu hedef insan kanserlerinin, tek ajan tedavileri, ya da kombinasyon rejimlerinde doğasında mutasyonların yüksek düzeyde, başarısız olma ihtimali vardır. Terapi için, doğuştan ve / veya edinilmiş direnç için sorumlu olan yollarının engellenmesi üzerine yerleştirilmelidir. Soruşturmanın aktif saha geliştirme ve yaygın olarak kemoterapi ve radyoterapi kullanılan, eylem teşvik ve direnç önlemek DNA onarım inhibitörlerinin test ediyor. Biz DNA hasar ilaç sisplatin tümör hücrelerini duyarlı bir araç olarak BRCA2 inhibisyonu etkinliğini değerlendirmek için yeni bir protokol kullanılır. Tümör hücrelerinin metabolizma (asitlenme ve solunum) dakika bazında bir dakika tedavi etkinliğini tanımlamak için 72 saat süreyle gerçek zamanlı olarak izlendi. Birlikte, bir tavuk embriyo koryoallantoik membran (CAM) ekstravazasyon ve işgali modeli kullanılarak metastatik frekansta bir değerlendirme yapılır. BuProtokol yeni kanser tedavi rejimleri değerlendirilmesi için in vitro ve in vivo yöntemlerinde kullanılan yaygın bir zayıf bazı problemlere yanıt vermektedir. Bu tür hücre çoğalma tahlilleri, hücre ölümü deneyleri gibi ortak yöntemlere ek olarak kullanılabilir ve in vivo murin ksenograft çalışmaları, daha yakından Aday hedeflerin ve maddeler arasında ayırım yapmak ve daha da geliştirilmesi için, sadece en ümit verici adaylar seçmek için kullanılır.
Introduction
Sitotoksik kanser tedavisi tedavisi başarısızlığı, nüks yol açabilir önemli bir klinik sorundur hedeflenen ve / veya karşı direnç kazanmış ve hasta mortalite 1 arttı. En tümörlerde farklılığının yüksek düzeyi dikkate alındığında, yeterince yüksek hücre sayısının bir tümör bu hücrelerin hayatta kalma 2,3 için bağlı olduğu moleküler yolları hedef tek veya kombine tedavilere dirençli hücrelerin bir alt kümesini içerecek bir matematiksel kesinlik. Bu tümör hücreleri pozitif olarak hastalığın tekrarlama yol, tedavi sırasında için seçilebilir. Aynı anda önce veya tedavi aracılı seçimden sonra ya farklı kanser hücresi hayatta kalma mekanizmalarını hedef yeni tedavilerin geliştirilmesi, böylece klinik açıdan önemlidir.
Tümör genomları genom istikrarsızlık ve mutasyon yüksek düzeyde olmayan tümör konakçı hücrelerden 4 kanser hücrelerini ayıran temel özelliktir. Sonuç olarak, bir usefuDNA hasar, kemoterapinin etkisini arttırmak ve direnç gelişmesini önlemek için l stratejisi aktif tümör hücreleri 5 DNA onarımını inhibe edilmesidir. Bu, bir ön-klinik ortamda araştırılmaktadır soruşturma ve yeni DNA tamir hedeflerin çeşitli aktif bir alandır. Küçük molekül ya da bu hedeflerin antisens bazlı inhibitörlerin bazıları geliştirildi ve 6-8 test geçmektedir. objektif klinik çalışmalarda kendi güvenliğini ve etkinliğini en umut verici klinik öncesi adayları belirlemek ve değerlendirmektir.
Klinik çalışmalarda yüksek maliyeti ve (sub-optimal klinik öncesi değerlendirme de dahil olmak üzere çeşitli nedenlerle için) başarısızlık riski, yeni tedavilerin 9 gelişiminde ilerleme zorlu engeller vardır. yeterince tedavi hedefleri ve aday ilaçlar yeni değerlendirmek için uygun ve klinik öncesi titiz modellerin kullanımı klinik çalışmalarda 10 yüksek başarısızlık oranı düşebilir
In vitro (hücre çoğalma tahlilleri), tümör hücrelerinin kapasitesi için, b) terapiyle-uyarılmış azalma, tümör hücre proliferasyonunu azaltmak için kapasite) ölçüm Bazı yaygın olarak kullanılan, klinik öncesi yöntem yeni anti-kanser rejimleri etkinliğini değerlendirmek üzere bir şekilde doku kültürü koloniler (koloni oluşum analizleri), in vitro (redoks-boya dönüşüm), in vitro tümör hücre ölümü, d) terapiyle-uyarılmış indüksiyonu (apoptoz, nekrotik, otofajik ilişkili olarak tümör hücresi, metabolik etkinlikteki c) terapiyle-uyarılmış indirgeme in vivo olarak, mitoz ve diğerleri) 11 ve e) insan ve fare ksenograftları 12-14 büyümesi ya da ablasyon azalma tedavisi kaynaklı.
Listelenen in vitro yöntemlerin önemli bir zayıflığı bunların hiçbiri aday tedavilerinin etkisi sürekli gerçek zamanlı değerlendirme sağlamak olduğunu. Daha ziyade, sadece seçilen, yaygın olarak ayrılmış zaman noktalarında bilgiTedavi sırasında. Bu ölçümler, kesin olarak, tümör hücre yanıtlarının büyüklüğünü ve zamanlamasını yansıtma kapasitesinin azalmıştır. İn vivo fare ksenograft modelleri aynı zamanda yüksek maliyet tamamlamak için zaman süresi ve alt-optimal dozaj ve tedavi zamanlaması (zamanlama) riski ile sınırlıdır. Buna ek olarak, kemirgen ksenograft modelleri primer insan tümör hücrelerinin yanıtların in vitro olarak değerlendirilmesi ile karşılaştırıldığında insanlarda klinik etkinliği sınırlı belirleyicileri ve aday terapötik müdahalelerin 15,16 belirlenen insan tümör hücre hatları olduğuna dair kanıtlar vardır.
Biz yukarıda listelenen daha yaygın prosedürlerin zayıf yönlerini ele alan bir şekilde, ön-klinik yeni ilaç kombinasyonları değerlendirmek için yeni bir kombinasyon protokolü tasarladı. Çoğalma, koloni oluşumu, veya redoks-boya dönüştürme deneylerinde yerine, gerçek zamanlı olarak, hücre yapışmasını, solunum ve asitleştirmeyi analiz etmek için bir metabolizma ölçüm birimini kullanılanTüm tedavi dönemi boyunca 17. Aynı zamanda, bir tavuk embriyo istilası ve metastaz 18,19 koriyoallantoik membran (CAM) modeli kullanılarak in vivo tedavi kombinasyonunun etkileri araştırıldı. Bu yaygın olarak kullanılan kemoterapötik ilaç sisplatin etkinliğini güçlendirmek için BRCA2 hedefleyen bir antisens oligonükleotid (ASO) yeteneğinin değerlendirilmesi için bu yöntemleri kullanılır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Not: Aşağıdaki protokol yapışık hücreler ile birlikte kullanılmak üzere tasarlanmıştır. Değişiklikler süspansiyon içinde yetiştirilmiş yapışmayan hücreler yöntemin uygulanması gerekmektedir. Protokolde tarif edilen TAT deneyleri, bir flüoresan işaretleyici (örn, GFP, TTT, vs.) ifade eden hücreler ile birlikte kullanılmak üzere tasarlanmıştır. Dokuz gün eski tavuk embriyoları CAM deneyleri için deney protokolünde 2 gününde gereklidir.
1. Hazırlık ve antisens oligonükleotidler ile tümör hücrelerinin transfeksiyonu (ASO'lar)
- Çevrede hücreleri ihtiva eden T75 şişesinin (ler) aspire ortamı 1XPBS ile yıkayın ve% 0.25 tripsin / EDTA 2 ilave edin. Her bir şişeye, tam büyüme ortamında 10 ml ilave edilir ve 50 ml'lik bir tüp çözelti içinde hücreleri aktarın. Hücreleri saymak ve nihai konsantrasyon ml başına 5 hücreleri 1.0x10 böylece ses düzeyini ayarlamak.
- T25 şişe etiketi iki grup: bir grup 1-8 etiketli sekiz şişeler, içerecektir ve u olacakGerçek zamanlı metabolizması ölçüm deney için sed; ve ikinci grup da 8 şişeler içerecektir ve tavuk embriyo CAM deney için kullanılır. Inkübatör her şişeye ve yeri (37 ° C,% 5 CO2 O / N) çözelti içinde hücre 2 ml ilave edilir.
- Ertesi sabah (Gün 0, gün 0), etiket üç adet 5 ml'lik tüp şunlardır: kontrol (hedefleme ASO veya siRNA), "ilgi konusu hedef '(yani, hedef ASO veya siRNA) ve Lipofektamin 2000 (ya da benzer bir transfeksiyon tepkin maddesi). Uygun bir tüp içinde, serum içermeyen ortam ile uygun konsantrasyona hazır ASO çözüm seyreltin.
- Uygun bir tüpe, transfeksiyon tepkin maddesi gerekli miktarda ilave edilir ve 5 dakika boyunca, serum-içermeyen ortam içinde inkübe edilir. ASO tüplerine transfeksiyon reaktifi çözeltisi ilave edin ve 20 dakika boyunca inkübe edin.
- Her iki grupta da şişeler 1-4 her bir kontrol ASO transfeksiyon reaktifi çözeltisi 250 ul ekleyin ve 250Her gruptaki matara 5-8 her birine 'hedef ilgi' ASO transfeksiyon reaktif çözeltisi ul. 4 saat (37 ᵒC,% 5 CO2) inkübe edin.
- İnkübasyon sırasında, bölüm 2.1'de anlatılan adımları yürütmek. İnkübasyondan sonra, CAM deney grubunda, her şişeye tam ortam 3 ml ekleyin ve inkübatör O dönmek / K (37 ᵒC,% 5 CO2). Bölüm 2.2 açıklamaya göre metabolizma deney grubu işleyin. Bölüm 4 açıklamaya göre ayarlanır CAM deneyi işleyin.
2. Biosensor Chip Hazırlama ve Hücre Tohumculuk
- Steril bir ortamda, dikkatli bir şekilde, PBS içinde 400 ul altı biyosensör çipleri yıkayın. 20 dakika boyunca% 70 etanol içinde 400 ul fiş ile sterilize edin. PBS içinde 400 ul ile üç kez yıkanır.
- Steril doku Kültür içindeki cips yerleştirinE yemekleri kontaminasyonu önlemek için. 'Kontrol' etiketli bir tabak üç fiş yerleştirin ve 'ilgi hedef' etiketli bir tabak üç.
- 'Kontrol' ve 'ilgi hedef' olarak iki 50 ml'lik tüpler etiketleyin. Hücrelerin PBS ile yıkayın ve% 0.25 tripsin / EDTA, uygun bir hacim kazandırmak. Tek tabakalı ayrılana kadar bekleyin ve her şişeden hücreleri toplamak. Uygun tüpe çözüm yatırın.
- Hücreleri saymak ve nihai konsantrasyon 6.0x10 5 hücre / ml olacak şekilde ses seviyesini ayarlayın. Başlangıç konsantrasyonu çok düşükse Santrifüj hücreleri tekrar süspansiyon ve.
- (Çip başına 1.25x10 5 hücre toplam), uygun grup, her biyo-algılayıcı çip, hücre çözeltisinin 250 ul ekle. Cips kafa karıştırıcı riskini en aza indirmek için bir defada bu görevi bir grup gerçekleştirin. Buharlaşmayı önlemek için bir nem odası içinde fiş içeren steril yemekler yerleştirin ve nem cha yermber inkübatör O / N (37 ᵒC,% 5 CO2).
- Ertesi sabah (Gün 1), dikkatli bir şekilde her bir yonga için ortamın aspire ve% 0.2 fetal sığır serumu (FBS) ve 1 x penisilin ve streptomisin (P / S) ile desteklenmiş büyüme ortamında 250 ul ile değiştirin. 4 saat (37 ᵒC,% 5 CO2) inkübe edin.
3. Metabolizma Ölçüm Sistemi Hazırlama ve Çözüm Hazırlık
- İnkübasyon sırasında, gerekli ilaç çözümleri ve gelecek tahlil için metabolizma ölçüm sistemini hazırlamak.
NOT: metabolizma ölçüm sistemi, altı modülden toplam içerir. Her modül deney başına bir çip barındırmaktadır.- Aşağıdaki deneysel gruba tahlil bölmek: bir çip 'kontrol' ve tahlil süresince araç almak için gruplar 'ilgi hedefin' her birinden; Her grup, iki fiş a esnasında belirli bir zaman dönemi için ilaç tedavisi almakssay, arınma döneminde araç tarafından izledi.
- İlaç sensitizasyon çalışmaları için, söz konusu özel bir ilaç uygun ilaç tedavisinin süresi, zamanlama ve konsantrasyon değiştirin.
Not: Sisplatin için aşağıdaki adımları A549 hücreleri ile deneysel olarak tespit edildi ve hücre serisine bağlı olarak değişiklik gösterebilir. 4 ul / dakika, varsayılan akış oranı ile tüm aşamaları gerçekleştirir.
Büyüme ortamı +% 0.2 FBS ve 1 x S / S, 6 saat
Orta 6 mcM sisplatin 24 saat + 0.2% FBS 1x P / S
Büyüme ortamı +% 0.2 FBS ve 1 x S / S, 24 saat
Büyüme ortamı +% 0.2 FBS ve 1 x S / S 18 saat
% 0.1 Triton-X 4 saat
NOT: Bu adımları sapmalar istenilen debi ve deney süresine göre orta ve uyuşturucu çözümleri gerekli hacmi belirlemek için hesaplama gerektirir. Aşağıdaki bölümlerde, yukarıda tarif edilen adımlar dayanmaktadır.
- Etiket ve büyüme ortamı +% 0.2 FBS An 50 ml ondört 50 ml tüpler dolgud 1x P / S. Bir metabolizma ölçüm sistemi tüplü bir raf içerisindeki altı, başka altı ve ayrıca cisplatin ile tüpler içeren üçüncü bir tüplü bir raf içerisindeki kalan iki yerleştirin. Buharlaşmayı önlemek için hava geçirgen bir zar ile, ilk iki raf kapatın.
- 1x P / S ortamı +% 0.2 FBS içinde (uygun hacim) 6 uM sisplatin içeren bir çözelti hazırlayın. Dört etiketli 50 ml tüpler içinde sisplatin çözeltisi gerekli hacmi koyun.
- Üçüncü metabolizma ölçüm tüpü rafta kalan dört yuvalarına tüpleri yerleştirin. Tüpler istenen biomodules karşılık uygun yuvalara yerleştirilir emin olun. Hava geçirgen bir zar ile tüpleri Seal.
- Hazırlama altı 50 ml tüpler etiket ve 20 ml ortam içinde% 0.1 Triton-X-çözeltisi ile doldurun. Triton-X çözümü kalan hücrelerin lize ve her çip için bir 'sıfır' değer sağlayacaktır. Dördüncü metabolizma ölçüm birimi tüp rafa tüpleri yerleştirin ve zekâ mühürh aşırı buharlaşmasının engellenmesi için bir hava permable zar.
- Biomodules içine cips yükleyin ve deney başlatmak.
4. CAM Deney İlaç Tedavisi ve Enjeksiyon
NOT: Bir CAM deney için tavuk embriyo hazırlamak için adımlar ve prosedür başka 19 tarif edilmiştir
- CAM deneyi 48 saat sonrası transfeksiyon (Gün 2) işleme başlayın. İki araç için matara ve sisplatin ikiye 'kontrol' ve grupların 'ilgi hedef' Alt-bölün. Şişelerinden orta aspire ve 3 ml taze ortam veya 6 uM sisplatin ya doldurun. 6 saat (37 ᵒC,% 5 CO2) inkübe edin.
- Yıkama, daha sonra orta aspire ve hücreleri trypsinize; Dört uygun şekilde etiketlenmiş 15 ml tüpler içinde çözelti içinde tripsinize hücreleri toplamak.
- Santrifüj ve PBS ile hücreler üç kez yıkayın. PBS, bir 5 ml hücre pelletini yeniden askıyahücreleri saymak d.
- Nihai hücre konsantrasyonu 1.0x10 6 hücre / ml olacak şekilde ses seviyesini ayarlayın. Enjeksiyon için etiketli 5 ml tüpler içinde hücre çözeltisini, ve buz üzerine yerleştirin. Hücreler de karışık olmasını sağlamak için enjeksiyon yavaşça önce tüpleri ters çevirin.
- Enjeksiyon için (9 gün) 24 tavuk embriyo (grup başına 6) toplam koyun. 1 ml şırınga bağlanan esnek bir tüpe bağlı bir cam iğne kullanılarak enjeksiyon yapın. enjeksiyon yapılan bireysel tedavi grubu için kör olmaları gerekmektedir.
- Stereo mikroskop kullanılarak, CAM venöz dolaşıma 1.0x10 100 ul bir hacim içinde 5 hücre enjekte edilir. Hücrelerin tam hacmini enjekte etmek için yavaş, titreşimli tekniği kullanın. Yumuşak kan akışını kök ve herhangi bir sızıntıyı absorbe silin ile yavaşça enjeksiyon sitesini hafifçe sürün. Uygun her enjeksiyonu takiben her embriyo kabı etiketleyin.
- Varlığı ve distri OnayCAM damar flöresanlı hücre Katkı floresan mikroskop kullanarak görüntülenmesi ile enjeksiyonu takiben. Tümör hücrelerinin sayısı düşük görünüyor veya dağıtım zayıf olduğu herhangi embriyoların not alın.
- Bir nemlilik bölmesi içinde tavuk embriyo yerleştirilir ve bir kuluçka makinesine (37 ° C,% 60 nem) muhafaza edin. Metastatik odaklar numaralandırma önce 7-9 gün bekleyin.
5. Metastatik Odak Sayım
- 7-9 günlük kuluçka döneminde, embriyoların izlemek ve herhangi bir ölü olanları atın. Nem odası kuluçka döneminde her zaman nemli kalmasını sağlayın.
- 20X büyütmede bir floresan stereo mikroskop kullanarak, düzenli, ızgara gibi desen embriyo CAM tüm üst yüzeyini tarayın.
- Sonra embriyo başına bir nihai toplam sayısını taksitli, görüş her alanda metastatik odaklarının sayısını. Her grupta altı embriyolar için bunu yaparken ortalama bir sayı o sağlayacakTedavi başına f metastatik odaklar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sonuçlar ve rakamlar yayınlanan iş 22 izni ile uyarlanmıştır.
BRCA2 inhibisyonu karşılık cisplatin ile tedavi, tümör hücrelerinde solunum azalması yaratmaktadır
ASO BRCA2 hedefleme ve sisplatin, tek başına kontrol ASO ve sisplatin hücreleri ile karşılaştırıldığında, solunum erken ve geri dönüşü olmayan bir düşüş sergiledi ile muamele edilmiş insan A549 akciğer kanseri hücreleri; işlenen hücrelerde sisplatin tedavisinin 24 saat BRCA2 ASO ve kontrol ASO arasındaki solunum farkı sonra% 39 (Şekil 1A) idi. Önemli olarak, solunum bu düşüş, bu hücre sayısı değişikliklerden bağımsız meydana geldiğini göstermektedir, hücre yapışması bir tespit damla önce başlamıştır. Solunum solunum Bir damla hücre ölümünü (Şekil 1B) öncesinde bir biçimlendirici bir olay olabileceğini düşündüren, yapışma ilk gözlemlenebilir düşüşe önce yaklaşık 10 saat düşmeye başladı. Ac fark yokidification BRCA2 ASO ve sisplatin tedavisi glukoz metabolizması (Şekil 1C) üzerinde hiçbir etkisi çok az olduğunu düşündüren, 72 saat deneme zaman çerçevesi içinde gözlenmiştir.
Sisplatin tedavisi ile kombine BRCA2 önleme metastaz sıklığını azaltır
İnsan A549 akciğer kanseri hücreleri, sisplatin varlığında veya yokluğunda kontrol ASO veya BRCA2 ASO ile muamele edilmiş CAM (Şekil 2A) ve damar dolaşım içine enjekte edildi. Enjeksiyonu takip eden dokuz gün BRCA2 ASO ve sisplatin ile tedavi edilen hücreler, tek başına kontrol ASO ve cisplatin, veya BRCA2 ASO (Şekil 2B) ile muamele edilmiş hücreler ile karşılaştırıldığında metastaz odakları% 77 daha düşük bir frekans sergilemiştir. Bu BRCA2 ASO ve sisplatin tedavisi azaltmak veya katı tümörlü hastalarda metastatik yükünü önlemek için bir potansiyele sahip olduğunu göstermektedir.
Tümör hücre yapışması, solunum ve asidifikasyon. A549 hücrelerinin Şekil 1. gerçek zamanlı izleme biyosensör çipleri üzerine kaplandı BRCA2 ASO ile transfekte edilmiştir ve Bionas Keşif Sistemi kullanılarak 24 saat için sisplatin ile tedavi edildi. (A), solunum, (B) yapışma, ve (C) asitleştirme ölçümleri 72 saat arasında bir süre boyunca, her 4 dakikada yapıldı. Pembe = mavi ASO, = BRCA2 ASO kontrol yeşil = ASO + cisplatin, kırmızı = BRCA2 ASO + sisplatin kontrol. Izni 22 ile yayınlanan eserinden uyarlanan Şekil. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2. numaralandırma metastatik frefrekans tavuk embriyo CAM modeli kullanılmıştır. BRCA2 ASO transfekte A549 hücreleri 6 saat sisplatin ile muamele edilmiş ve daha sonra bir 9 günlük piliç embriyo (A) damarlara bağlı dolaşım içine enjekte edildi. Metastatik odakları (B), (40x objektif ile bir konfokal mikroskop kullanılarak görselleştirilmiştir) enjeksiyonundan (C) bileşeni aşağıdaki dokuz gün sayıldı. Izni 22 ile yayınlanan eserinden uyarlanan Şekil. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nedeniyle klinik deneylerle ilgili doğal maliyet ve risk, daha iyi ve uygun yeni anti-kanser tedavi rejimleri değerlendirmek için klinik öncesi test yöntemine daha sıkı geliştirmek için bir ihtiyaç vardır. Güncel sık kullanılan teknikler daha az etkili olabilir tüm sergi potansiyel umut verici tedavi hedefleri / ajanlar arasında ayrım kapasitelerini sınırlandırabilir zayıflıklar, ve bu. Biz geleneksel yöntemlerin eksiklikleri birçok adresleri yeni anti-kanser yaklaşımları değerlendirmek için bir protokol geliştirmiştir.
Tarif edilen protokol için özellikle önemli bir özelliği, gerçek zamanlı olarak hücre tepkilerini ölçmek ve dakika metabolizması ve yapışma dakika değişiklikleri izlemek için yeteneğidir. Bu maksimum nokta, ilaç etkileri, en uygun dozun belirlenmesi ve ilaç kombinasyonu tedavi bileşenleri arasındaki etkileşimin daha ayrıntılı bir anlaşılmasına olanak vermektedir. Aynı zamanda, bu discre içgörü sağlarHücre sayımı, apoptoz ya da boya-dönüştürme deneyleri tarafından sağlanan bilgilerin kanser hücreleri, te metabolik değişiklikler. Bu deneyde bir sınırlama doğru ilaç tedavisi sırasında ortaya çıkan hücre ölümü türünü belirlemek için yetersizlik. Canlılığı değişiklikler biyo-algılayıcı çipe uyması değişikliklerle yansıtıldığı, ancak bu hücre ölümünün bir şekilde ilgili bilgi sağlamaz. Ayrıca, benzer bir metabolik verileri belirlemek için floresan mikroskobu kullanımı ve hücre görüntüleme tekniklerini canlı mümkündür ve bu protokol 20,21 tarif edilen deneylerde ilave olarak kullanılabilir.
Ayrıca, tavuk embriyo CAM modelinin kullanılması tedaviyi takiben metastatik frekansı incelemek için yeni bir hedef, ilaç veya ilaç kombinasyonunun damar dışına ve / veya çevre dokulara işgal kanser hücrelerinin sıklığını azaltır belirlemek için etkili bir yoldur. Bu avant bir özellikle ilgili sorunical bakış açısı, metastatik hastalık kanser hastalar arasında mortalite yüksek oranda neden çünkü. Olası bir sınırlayıcı faktör, gerçek ilaç tedavisi CAM oluşmaz olmasıdır. Bunun yerine, ex vivo olarak meydana gelir ve ön-muamele edilmiş hücreler daha sonra CAM enjekte edilir. Bu nedenle, bu deney, in vivo olarak ilaç alımı veya dağıtım ile ilgili bilgi sağlamaz. Buna ek olarak, intravenöz CAM enjeksiyonları teknik zorlu ve önemli uygulama / deneyim gerektirir.
Biz DNA'ya zarar veren ilaç sisplatin tümör hücrelerini duyarlı bir BRCA2 hedefleme ASO yeteneğini değerlendirmek için bu protokolü kullanılır. deneylerin sonuçları terapötik saldırı için umut verici bir hedef olarak BRCA2 tanımlanan ve aynı zamanda bir aday ilaç olarak BRCA2 ASO başka ön-klinik geliştirme mantığını sağladı. Biz özellikle DN filizlenen alanında, kombinasyon tedavisi için yeni hedefler belirlemek için kullanılan bu protokolü öngörülüyorBir onarım engelleme. Biz bu protokol iyi daha sıkı yeni anti-kanser yaklaşımlarını değerlendirmek için bir çaba, kanser biyolojisinde daha yaygın tekniklere ek olarak kullanılacaktır hissediyorum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Mükemmeliyet Merkezleri Ontario ve Ontario Araştırma Fonundan JK hibe ile mümkün olmuştur.
Biz çekimler sırasında teknik yardım için Sıddıka Pardhan Dr. Peter Ferguson teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A549 cells | ATCC | CCL-185 | http://www.atcc.org/products/all/CCL-185.aspx |
| AeraSeal film | Carl Roth GmbH | ||
| AMEM | Wisent Bioproducts | 210-011-QK | |
| Antisense oligodeoxynucleotides | Avecia | BRCA2 target sequence: 5' - UAAGGAACGUCAAGAGAUAC - 3' (bases 7241-7259 ) | |
| Axio Zoom V16 Microscope | Carl Zeiss | http://www.zeiss.ca/microscopy/en_ca/products/stereo-zoom-microscopes/axio-zoom-v16.html | |
| Bionas Biosensor Chips | Bionas GmbH and Micronas GmbH | BIS8001D | |
| Bionas Discovery 2500 System | Bionas GmbH | http://www.bionas-discovery.com/prodservices/instruments/system2500/ | |
| Cisplatin | Sigma Aldrich | 479306 | |
| Fertilized chicken eggs | Sourced locally | ||
| Fetal bovine serum | Gibco - Life Technologies | ||
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen - Life Technologies | 12566014 | http://www.lifetechnologies.com/ca/en/home/life-science/protein-expression-and-analysis/transfection-selection/lipofectamine-2000.html |
| PBS | Wisent Bioproducts | 311-010-CL | |
| Trypsin (0.25%)/EDTA | Wisent Bioproducts | 325-043-CL |
References
- Bouwman, P., Jonkers, J. The effects of deregulated DNA damage signalling on cancer chemotherapy response and resistance. Nat Rev Cancer. 12, 587-598 (2012).
- Bozic, I., et al. Evolutionary dynamics of cancer in response to targeted combination therapy. Elife. 2, e00747 (2013).
- Diaz, L. A., et al. The molecular evolution of acquired resistance to targeted EGFR blockade in colorectal cancers. Nature. 486, 537-540 (2012).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
- Rytelewski, M., et al. Inhibition of BRCA2 and Thymidylate Synthase Creates Multidrug Sensitive Tumor Cells via the Induction of Combined 'Complementary Lethality'. Mol Ther Nucleic Acids. 2, e78 (2013).
- Lord, C. J., Ashworth, A. The DNA damage response and cancer therapy. Nature. 481, 287-294 (2012).
- Helleday, T., Petermann, E., Lundin, C., Hodgson, B., Sharma, R. A. DNA repair pathways as targets for cancer therapy. Nat Rev Cancer. 8, 193-204 (2008).
- Shaheen, M., Allen, C., Nickoloff, J. A., Hromas, R. Synthetic lethality: exploiting the addiction of cancer to DNA repair. Blood. 117, 6074-6082 (2011).
- Green, S., Benedetti, J., Smith, A., Crowley, J. Clinical trials in oncology. 28, CRC press. (2012).
- Begley, C. G., Ellis, L. M. Drug development: Raise standards for preclinical cancer research. Nature. 483, 531-533 (2012).
- Galluzzi, L., et al. Molecular definitions of cell death subroutines: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2012. Cell Death Differ. 19, 531-533 (2012).
- Ruggeri, B. A., Camp, F., Miknyoczki, S. Animal models of disease: pre-clinical animal models of cancer and their applications and utility in drug discovery. Biochem Pharmacol. 87, 150-161 (2014).
- Kwon, M. C., Berns, A. Mouse models for lung cancer. Mol Oncol. 7, 165-177 (2013).
- Young, M., Ordonez, L., Clarke, A. R. What are the best routes to effectively model human colorectal cancer. Mol Oncol. 7, 178-189 (2013).
- Sharma, S. V., Haber, D. A., Settleman, J. Cell line-based platforms to evaluate the therapeutic efficacy of candidate anticancer agents. Nat Rev Cancer. 10, 241-253 (2010).
- Garnett, M. J., et al. Systematic identification of genomic markers of drug sensitivity in cancer cells. Nature. 483, 570-575 (2012).
- Alborzinia, H., et al. Real-time monitoring of cisplatin-induced cell death. PLoS One. 6, e19714 (2011).
- Cvetkovic, D., et al. KISS1R induces invasiveness of estrogen receptor-negative human mammary epithelial and breast cancer cells. Endocrinology. 154, 1999-2014 (2013).
- Leong, H. S., Chambers, A. F., Lewis, J. D. Assessing cancer cell migration and metastatic growth in vivo in the chick embryo using fluorescence intravital imaging. Methods Mol Biol. 872, 1-14 (2012).
- Hung, Y. P., Albeck, J. G., Tantama, M., Yellen, G. Imaging cytosolic NADH-NAD(+) redox state with a genetically encoded fluorescent biosensor. Cell Metab. 14, 545-554 (2011).
- Tantama, M., Hung, Y. P., Yellen, G. Imaging intracellular pH in live cells with a genetically encoded red fluorescent protein sensor. J Am Chem Soc. 133, 10034-10037 (2011).
- Rytelewski, M., et al. BRCA2 inhibition enhances cisplatin-mediated alterations in tumor cell proliferation, metabolism, and metastasis. Mol. Onc. 8 (8), 1429-1440 (2014).
