Summary

Dans injections intra-cardiaque Utero tomate-lectine sur les embryons de souris pour évaluer le flux sanguin rénal

Published: February 04, 2015
doi:

Summary

This manuscript describes a technique for visualization of the developing vasculature. Here we utilized in utero intra-cardiac FITC-labeled tomato lectin microinjections on mouse embryos. Using this technique, we delineate the perfused and unperfused vessels throughout the embryonic kidney.

Abstract

La formation et la perfusion de développer des vaisseaux sanguins rénaux (en dehors de glomérules) sont grandement sous-étudiées. Comme vasculaire développe via l'angiogenèse (qui est l'embranchement des gros vaisseaux) et la vasculogenèse (formation de novo de la cuve), des techniques de cartographie de perfusion telles que des moulages en résine, l'imagerie in vivo de l'échographie, et les micro-dissection ont été limitées à démontrer les relations intimes entre ces deux processus et les structures rénales en développement au sein de l'embryon. Ici, nous décrivons la procédure in utero intra-cardiaques marqués au FITC tomates microinjections de lectine ultrasons guidées sur des embryons de souris pour mesurer l'ontogenèse de la perfusion rénale. Tomate lectine (TL) a été perfusé dans tout l'embryon et les reins récoltés. Les tissus ont été co-colorées pour diverses structures rénaux y compris: progéniteurs néphron, les structures de néphrons, urétéral épithélium, et la vascularisation. À partir de E13.5 grands navires de gros calibre ont été perfusé, cependant périphériqueles navires sont restés unperfused. Par E15.5 et E17.5, petits vaisseaux périphériques ainsi que glomérules a commencé à devenir perfusé. Cette technique expérimentale est essentielle pour l'étude du rôle du système vasculaire et la circulation sanguine au cours du développement embryonnaire.

Introduction

Pendant le développement embryonnaire, deux processus vasculaires discrets, mais simultanées ont lieu: l'angiogenèse, le processus par lequel un navire se développe à partir d'un grand navire et vasculogenèse pré-existante, qui est une formation de novo de vaisseaux de progéniteurs endothéliaux résidentiels 1,2. Respectivement, le premier est synonyme de flux sanguin, tandis que le second est pensé à prendre largement en l'absence de celui-ci.

Simultanée à la formation des vaisseaux sanguins, un processus cyclique et dynamique de la synthèse rénale des cellules progénitrices, la prolifération et la différenciation commence à se dérouler le jour embryonnaire 9,5 (de E9.5). À ce stade, le bourgeon urétéral (UB) envahit le dos en entourant mésenchyme métanéphrique (MM), et se poursuit jusqu'à la naissance 3. Répétées ramification de la condensation dans UB rapidement métanéphrique bouchon mésenchyme commence la formation des unités fonctionnelles du rein, néphron. Avec chaque nouvelle génération de UB et nephron, les générations plus âgées sont déplacés dans des régions intérieures corticales et médullaires, où ils subissent ensuite encore maturation et la différenciation dans des environnements essentiellement vasculaire denses. Comme le montre Dressler et al., 3, ce procédé est précipité par embryologique signalisation inductive, telle que la diaphonie entre UB et MM, et une myriade de facteurs extracellulaires 6.3. Deux facteurs extracellulaires récemment étudiés dans le pancréas et les reins en développement comprennent la tension d'oxygène et la circulation sanguine 7,8. Ce dernier sera discuté plus en détail ci-dessous en relation avec le développement du rein.

Afin d'exposer le rôle inductive que le flux sanguin peut jouer dans la différenciation néphrons des cellules progénitrices, ainsi que dans d'autres processus d'organogenèse, méthodes précises et exactes de cartographie de flux sanguin embryonnaire est impératif.

D'autres méthodes de mesurer le flux sanguin comprennent la prescription de ulimagerie trasound et de résine jette 9,10. En conclusion, ces modes ont été montré à faire défaut en soi dans leur capacité à dévoiler simultanément juxtapositions temporelles et spatiales entre la circulation sanguine et différenciation des cellules souches. moulages en résine, par exemple, offrent un modèle valide de formation de motifs de navire dans les tissus adultes, mais dans des vaisseaux immatures, tels que les points de temps avec embryonnaires, les navires sont nettement sous-développé et qui fuit. Par conséquent, la résine jette ne parviennent pas à tenir dans les petits vaisseaux, souvent poreuse,.

Pour ces obstacles apparents, entre autres, nous avons choisi d'intégrer guidée par échographie in vivo intra-cardiaques lectine de tomate embryonnaire (TL) en micro-injections dans nos enquêtes de développement du rein. Dans cette procédure, nous utilisons une sonde à ultrasons pour guider l'aiguille d'une manière synchrone monté micropipette remplie de 2,5 pi de solution de TL dans le ventricule gauche d'embryons de souris E11.5 en des points, E13.5, E15.5 et E17.5 temps. E170,5 est le stade de développement plus tard que les aiguilles ne sont pas assez fort pour pénétrer l'embryon plus développé.

Les avantages de ce procédé de micro-injection sont abondants. microinjection guidée par échographie permet un positionnement précis d'une aiguille d'injection dans le ventricule embryonnaire gauche, l'expulsion passif et contrôlée de solution dans le cœur battant de l'animal, un minimum de dommages à cœur et les tissus environnants, et la prévention de l'insuffisance cardiaque soudaine et la mort du embryon avant la perfusion de plein-corps. Avec l'utilisation d'un TL marqué au FITC, ne importe quel système vasculaire perfusé maintiendra le marqueur le long de sa membrane apicale endothéliale. En combinaison avec l'immunohistochimie, en utilisant Pecam (CD31, plaquettes endothéliale molécule d'adhésion cellulaire) et divers autres marqueurs vasculaires, nous sommes en mesure de distinguer clairement entre les navires perfusés et ONU-perfusé, ainsi que de caractériser toute coloration anormale de tissus environnants.

Protocol

NOTE: L'Université de Pittsburgh institutionnel de protection des animaux et l'utilisation Comité a approuvé toutes les expériences. 1. Préparation des instruments échographie microinjection et d'embryons Mettre en place scène, montage, et la sonde (Figure 1) ainsi que les instruments chirurgicaux (figure 2). Lieu tampon phosphate salin (PBS) (pH 7,4) dans un bain C de réchauffement de 37 °. Remplir entièrement l'aiguille de micro-injection d…

Representative Results

Formation vasculaire précède flux dans le développement de reins Une majorité de tissu embryonnaire (y compris le rein) contient une vascularisation dense (deux unperfused et perfusé), même au début des points de temps embryonnaires. Pour mieux mesurer et analyser le flux sanguin dans le rein en développement, nous avons utilisé une méthode in utero embryonnaires micro-injections intracardiaques. Avec l'utilisation d'une haute résolution ultrasons pour identifier le coeur …

Discussion

Microinjection anesthésie et délais

En ce qui concerne l'anesthésie de la mère, il est essentiel de maintenir constant d'air (2-3 L / min) et à faible PSI. Le débit de la sédatif doit être maintenue à environ 1,75 à 2 L / min. Simultanément, les délais dans lesquels les injections ont lieu doivent être étroitement surveillés et contrôlés pour chaque portée. Pour chaque portée de la procédure d'injection doit être maintenu sous 45 min. L'importance de ce d…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors would like to thank Dr. George Gittes for advice and expertise throughout this study. SSL was supported by an American Heart Association fellowship (11POST7330002). Further to this SSL and this study was supported by an NIDDK Mentored Research Scientist Development Award (DK096996) and by the Children’s Hospital of Pittsburgh.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
DAPI Sigma Aldrich 022M4004V concentration 1:5000
Pecam BD Biosciences 553370 concentration 1:100
FITC-Tomato Lectin Vector Laboratories FL-1321 concentration 2.5µL / embryo
Alexa Fluor-594 (Donkey Anti-Rat ) Jackson Immunoresearch 712-585-150 concentration 1:200
Microinjection Needle Origio Mid Atlantic Devices C060609
Mineral Oil Fisher Scientific BP26291
mL syringe Fisher Scientific 03-377-20
 Clay Blocks Fisher Scientific HR4-326
Surgical Tape Fisher Scientific 18-999-380
PBS Fisher Scientific NC9763655
Hair Removal Product Fisher Scientific NC0132811
Surgical Scissors Fine Science tools 14084-08
Fine Forceps Fine Science tools 11064-07
 Surgical Marking Pen Fine Science tools 18000-30
 Right angle forceps (for hysterectomy) Fine Science tools 11151-10

References

  1. Abrahamson, D. R., Robert, B., Hyink, D. P., St John, P. L., Daniel, O. P. Origins and formation of microvasculature in the developing kidney. Kidney international. Supplement. 67, S7-S11 (1998).
  2. Sims-Lucas, S., et al. Endothelial Progenitors Exist within the Kidney and Lung Mesenchyme. PloS one. 8 (6), e65993 (2013).
  3. Dressler, G. R. Advances in early kidney specification, development and patterning. Development. 136 (23), 3863-3874 (2009).
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Cite This Article
Rymer, C. C., Sims-Lucas, S. In Utero Intra-cardiac Tomato-lectin Injections on Mouse Embryos to Gauge Renal Blood Flow. J. Vis. Exp. (96), e52398, doi:10.3791/52398 (2015).

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