Abstract
ودراسة سلوكه إلى حد كبير في تشكيل ونضح تطوير الأوعية الدموية الكلوية (بصرف النظر عن الكبيبات). ومع تطور الأوعية الدموية عبر الأوعية الدموية (والذي هو المتفرعة الخروج من السفن الكبرى) وتكون الأوعية (دي نوفو تشكيل السفينة)، تم تقنيات رسم الخرائط نضح مثل يلقي الراتنج، في الجسم الحي التصوير بالموجات فوق الصوتية، والصغرى تشريح محدودة في مما يدل على العلاقات الحميمة بين هاتين العمليتين والهياكل الكلى النامية في الجنين. هنا، نحن تصف إجراءات في الرحم داخل القلب الموجهة بالأمواج فوق الصوتية-FITC المسمى الطماطم إبر دقيقة جدا كتين على أجنة الفئران لقياس مدى تطور الجنين من نضح الكلوي. تم perfused لكتين الطماطم (TL) في جميع أنحاء الجنين والكلى المقطوع. وقد شارك في الأنسجة الملون لمختلف الهياكل الكلى بما في ذلك: الأسلاف نفرون، والهياكل كليون، الحالبي ظهارة، والأوعية الدموية. ابتداء من الساعة E13.5 السفن ذات عيار كبير وperfused ل، ومع ذلك المحيطيوظلت السفن unperfused. قبل E15.5 وE17.5، بدأت السفن المحيطية الصغيرة وكذلك الكبيبات لتصبح perfused ل. هذه التقنية التجريبية أمر بالغ الأهمية لدراسة دور الأوعية الدموية وتدفق الدم أثناء التطور الجنيني.
Introduction
أثناء التطور الجنيني تأخذ اثنين منفصلة، ولكن في وقت واحد، وعمليات الأوعية الدموية المكان: الأوعية الدموية، العملية التي تنمو سفينة من رئيسي موجودة من قبل السفينة، وتكون الأوعية، وهو تشكيل من جديد من السفن من الأسلاف البطانية السكنية 1،2. على التوالي، والسابق هو مرادف مع تدفق الدم، في حين يعتقد هذا الأخير أن يأخذ مكان إلى حد كبير في غياب ذلك.
في وقت واحد لتشكيل الأوعية الدموية، عملية دورية وديناميكية من التوليف السلف الكلى خلية، والانتشار، والتمايز تبدأ تتكشف في يوم الجنينية 9.5 (E9.5). في هذه المرحلة مهدها الحالبي (UB) يغزو ظهريا إلى المحيطة اللحمة المتوسطة الكلوة التالية (MM)، ويستمر حتى الولادة 3. كرر المتفرعة من UB إلى التكثيف بسرعة الكلوة التالية سقف اللحمة المتوسطة يبدأ تشكيل وحدات وظيفية في الكلى، وكليون. مع كل جيل جديد من UB وnephرون، وتشرد الأجيال الأكبر سنا في المناطق القشرية والنخاعية الداخلية، حيث ثم الخضوع لمزيد من النضج والتمايز داخل البيئات في المقام الأول الأوعية الدموية-الكثيفة. كما يتضح من دريسلر وآخرون. 3، وعجلت هذه العملية الجنينية التي كتبها إشارات الاستقرائي، مثل الحديث المتبادل بين UB وMM، وعدد لا يحصى من العوامل خارج الخلية 3-6. عاملين خارج الخلية التحقيق مؤخرا داخل البنكرياس النامية والكلى وتشمل توتر الأكسجين وتدفق الدم 7،8. وسيتم مناقشة هذا الأخير في مزيد من التفاصيل أدناه مع يتعلق بالتنمية الكلى.
من أجل فضح دور الاستقرائي أن تدفق الدم يلعب يحتمل أن تكون في كليون السلف تمايز الخلايا، وكذلك في عمليات توالد الأعضاء الأخرى، وأساليب محددة ودقيقة لرسم الخرائط الجنينية تدفق الدم أمر حتمي.
طرق بديلة لقياس تدفق الدم وتشمل وصفة طبية من المجاهدينالتصوير trasound والراتنج يلقي 9،10. قاطع، وقد ثبت هذه الأوضاع أن هناك نقصا بطبيعتها في قدرتها على كشف بالتزامن تجاورات الزمانية والمكانية بين تدفق الدم وتمايز الخلايا الجذعية. يلقي الراتنج، وعلى سبيل المثال، تقدم نموذجا صالحا من الزخرفة سفينة داخل أنسجة البالغين، ولكن في السفن غير الناضجة، مثل مع النقاط الزمنية الجنينية، والسفن هي تعاني من التخلف الشديد وتتسرب منها المياه. ولذلك، الراتنج يلقي تفشل في عقد داخل الأوعية الصغيرة، التي يسهل اختراقها في كثير من الأحيان.
لهذه العقبات واضحة، من بين أمور أخرى، اخترنا أن تدرج في الجسم الحي داخل القلب الجنينية كتين الطماطم (TL) إبر دقيقة جدا في تحقيقاتنا التنمية الكلى الموجهة بالأمواج فوق الصوتية. في هذا الإجراء نستخدم مسبار الموجات فوق الصوتية لتوجيه متزامن إبرة ممص مكروى شنت مليئة 2.5 ميكرولتر من حل TL إلى البطين الأيسر من أجنة الفئران في نقاط E11.5، E13.5، E15.5، والوقت E17.5. E17.5 هو أحدث سن التنموي مثل الإبر ليست قوية بما فيه الكفاية لاختراق الجنين أكثر تطورا.
مزايا هذه الطريقة حقن مكروي وفيرة. الموجهة بالأمواج فوق الصوتية حقن مكروي يسمح تحديد المواقع بدقة من إبرة الحقن داخل البطين الأيسر الجنينية، طرد السلبي ورقابة من حل في القلب النابض للحيوان، والضرر الحد الأدنى من القلب والأنسجة المحيطة بها، وتجنب الفشل القلبي المفاجئ وفاة الجنين قبل التروية كامل الجسم. مع استخدام TL FITC المسمى، فإن أي الأوعية الدموية perfused لتحافظ على علامة على طول الغشاء القمي البطانية. في تركيبة مع المناعية، وذلك باستخدام PECAM (CD31، صفائح الدم البطانية جزيء التصاق الخلية) ومختلف علامات الأوعية الدموية الأخرى، ونحن قادرون على التمييز بوضوح بين السفن perfused لوالامم المتحدة وperfused ل، فضلا عن تميز أي تلطيخ الشاذة من الأنسجة المحيطة بها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: جامعة بيتسبرغ المؤسسي رعاية الحيوان واستخدام اللجنة وافقت جميع التجارب.
1. إعداد الأدوات الموجات فوق الصوتية-حقن مكروي والأجنة
- انشاء المرحلة، جبل، والتحقيق (الشكل 1)، وكذلك الأدوات الجراحية (الشكل 2). مكان الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) حل (pH7.4) في 37 ° C حمام الاحترار. ملء حقن مكروي إبرة تماما مع الزيوت المعدنية، وذلك باستخدام 1 مل حقنة تعلق على الثانية مرن 25 G إبرة، من خلال قاعدته.
- إصلاح إبرة على دوران جبل الذراع، وإبرة فارغة من حل الزيوت المعدنية. إعادة ملء مع 2.5 ميكرولتر من حل TL. ضمان عدم وجود فقاعات الهواء موجودة داخل إبرة الحقن. تدوير الذراع الإبرة نحو الجدار، بعيدا عن خشبة المسرح.
- تخدير الأم الحامل في غرفة التخدير عن طريق الحقن المستمر للالأيزوفلورين. عندما يتم تقديم الأم فاقد الوعي، ونقل التخدير لأنبوب الأنف المتمركزة على جالجانب audal من المسرح، والأم في مكان موقف ضعيف مع خطم في أنبوب الأنف للسماح استمرار حالة تخدير كامل.
- أطرافه الشريط في 45 ° الزوايا، أو مع اليدين والقدمين راحة وضعه فاق ECG علامات التبويب / رصد درجة الحرارة. من المهم أن السد حامل يتم رصد مستمر لضمان التخدير غير كافية وأن مرهم في تطبيقها على العيون للحد من التجفيف.
- تطبيق لإزالة الشعر المنتج في جميع أنحاء البطن السفلي من الأم، ويمسح برفق باتجاه آخر مع قطعة قطن جافة، وبعد ذلك مرة أخرى مع 70٪ مسحات القطن المشبعة الإيثانول لإزالة أي منتج الزائدة والشعر. ضمان لتنظيف الجلد في منطقة البطن الخروج من كل الشعر في موقع شق (الشكل 3).
- إجراء عملية فتح البطن على الأم الحامل باستخدام ملقط ومقص جراحي غرامة. الحرص على تجنب قطع أي الأوعية الكبرى أو الأعضاء الحشوية. تأكد أولا، شق التوالي من البشرة 1.5-2 سم فوق المهبل وواصل قطع نحو الأضلاع لapproximatاعل 2-3 سم. فضح الغشاء تحت الجلد، حدد موقع ألبا الخط ("الخط الأبيض") (الشكل 3)، وقطع بالتوازي مع شق الأولي، وعلى طول طول نفس، لفضح الداخلية الأجهزة الحشوية والكييسات الرحم.
2. استخراج الأجنة
- استخدام 6 بوصة تطبيقها القطن ذات الرؤوس للمناورة الأم والأجنة. دفع بلطف (لا قوة) على الجلد مع قضيب للتلاعب الجنين الأول من افتتاح شق. بعد استخراج أول كيس الجنين، برفق وببطء سحب ما تبقى من قرن الرحم من خلال والخارج على الأم. تجنب سحب الأمعاء أو غيرها من الأجهزة من خلال شق في هذه المرحلة.
- تحديد الأجنة ووضع بلطف غادر قرن الرحم مرة أخرى إلى الأم. ثم يبدأ وضع الحق في الرحم القرن مرة أخرى إلى الأم بدءا من أبعد الجنين كيس من المهبل على قرن والتحرك نحو الانخفاض. يستمر هذا حتى تبقى سوى اثنين من الأجنة تتعرض (فايجوري 4). وأخيرا، الأجنة الموقف في عمود أعلاه وبالتوازي مع شق خط، ويجري تدرك لا لقطع الدورة الدموية في الرحم.
- وضع كتل من الطين وموقف بين الأسلحة والجسم، وكذلك الساقين والذيل. تأكد من أن الأسطح الطينية هي المستوى تقريبا مع شق البطن. الرطب طبق بيتري منوفذة مع 37 ° C PBS.
- فهم توسيع ملقط مع اليد اليمنى وطبق بيتري منوفذة مع اليد اليسرى (نوفذة بالتوازي مع الأجنة) وجلب ملقط مغلقة ~ 5 سم، من خلال نوفذة، من أعلى طبق بيتري. ملقط مفتوحة تماما دون تمزق شبكة نوفذة.
- مناورة أيدي فوق الأجنة وتركز الأنظار على اثنين من الكييسات الجنين. دون (أو خفيفة) لمس الكييسات مع الربط بين نوفذة أو ملقط، مرر لهم من خلال شق ووضع طبق بتري على البطن الأم. مع ملقط لا يزال تمديد، والتلاعب شبكة منوفذة لمقعد على جانبي وعلى قاعدة من كل جنين (الشكل 5
- وبعد ذلك، وضع المطاط الأزرق تحتوي على الجدار في طبق بتري، من دون معسر أو إصابة الأجنة (الشكل 6). جعل كتل من الطين والتأكد من تحقيق التوازن بحزم طبق بيتري، الجنين، والتي تحتوي على المطاط الجدار. وأخيرا، وملء طبق بيتري مع 37 ° C PBS حتى يتم المغمورة أجنة تماما (الشكل 6)، في حين تسيطر من وجود تسرب في الربط بين منوفذ.
3. إجراء حقن
- أقل مرحلة الحقن مع الأم والأجنة أسفل باستخدام مقبض تعديل مستوى Z (الشكل 1)، ثم تناوب حقن الإبرة وجبل الذراع ويصطف مباشرة مع مسبار الموجات فوق الصوتية، مع ½ سم الإبرة إلى اليسار وتحت تلميح التحقيق (الشكل 7) . دفع إبرة الذراع (لا إبرة) 45 درجة بعيدا عن التحقيق. يجب الحرص على عدم ضرب رأس الإبرة مع الطبق أو الموجات فوق الصوتية التحقيق.
- رفع مرحلة الحقن يعود إلى الارتفاع الأصلي، مع الموجات فوق الصوتية صرداء مباشرة فوق الأجنة التحقيق يجب أن غمرت قليلا وضمن 3-4 ملم من الأنسجة الجنينية. استخدام X & Y المقابض التكيف المرحلة (الشكل 8) لتعديل الجنين / الأم / مرحلة يمكنها من تحديد موقع منهجي قلب الجنين الضرب.
- مباشرة من مركز الشاشة الموجات فوق الصوتية مراقبة سوداء علامة المستهدفة مركز الانتباه (*). تحديد موقع البطين الأيسر (الأفضل) أو الأذين باستخدام المقابض التكيف مرحلة X & Y (الشكل 8)، ثم رفع أو خفض مرحلة باستخدام مقبض دوار على المسرح لوضع هدف حقن بالضبط على مركز علامة سوداء على الشاشة الموجات فوق الصوتية.
- استخدام X التعديل مرحلة مقبض الباب لتحرك الجنين إلى اليمين، الخروج من الشاشة الموجات فوق الصوتية. إعادة حقن مكروي إبرة وتسليح العودة الى المكان، ½ سم بعيدا عن و90 درجة إلى مسبار الموجات فوق الصوتية (الشكل 7).
- عن طريق حقن مكروي جبل المقابض التكيف (الشكل 9C-G)، موقف إبرة مع طرف بوضوح آلigned مع علامة المركز. ضبط زاوية حقن (باستخدام المقابض في الشكل 9C وEG)، وX، Y، Z وناقلات الإبرة الدقيقة لضمان ركز طرف الإبرة في الطائرة الصحيحة. التراجع عن حقن مكروي إبرة باستخدام فقط على "حقن" مقبض الباب (الشكل 9F)، الحرص على عدم ضبط أبعاد أخرى.
- مرة أخرى، وذلك باستخدام فقط على X غرامة التكيف مرحلة مقبض الباب الخطوة الجنين مرة أخرى تحت التحقيق، مع الهدف بالضبط على العلامة مركز على الشاشة الموجات فوق الصوتية. تأكد من أن البطين الأيسر هو الآن بالضبط على نفس X، Y، Z والطائرة.
- وبعد ذلك، مع مجرد "حقن" مقبض الباب على حقن مكروي جبل، ثقب ببطء الجنين مع إبرة حقن مكروي وتقديم معلومات سرية تدريجيا إلى البطين الأيسر. ضخ 2.5 ميكرولتر كاملة من حل TL إلى البطين الأيسر أو حتى فارغة أصوات تحذير صفير، من خلال عقد "فارغة" والتنصت "ملء" مرة واحدة (أرقام 2A & B). في هذا الوقتالحقن مراقبة الظل المنبثقة من رأس الإبرة وهو TL الدخول في غرفة القلب (الشكل 10). في الاتجاه المعاكس، يتراجع بسرعة حقن مكروي إبرة الدورية لل"حقن" مقبض الباب (الشكل 9F) على حقن مكروي جبل عندما حقن كاملة.
- تستمر إلى الجنين القادم، وكرر هذا الإجراء الأجنة المتبقية بعد هذه السلسلة من الخطوات ووضع أخيرا الأجنة النهائية مرة أخرى في البطن السد. التبديل التخدير إلى صندوق الغرفة وتحرك بلطف الأم هنا لمدة 15 دقيقة من وقت لآخر حقنة.
4. حصاد الأجنة وتحليل
- تضحية السد عبر خلع عنق الرحم. توسيع شق البطن لإزالة قرون الرحم بسهولة من الأم. الحفاظ على الأجنة داخل الرحم الكيس. وضع الأجنة في برنامج تلفزيوني مبردة.
- تشريح الأجنة من الرحم كيس (إذا جمع الأنسجة اللازمة لالتنميط الجيني) ووضع الجنين كله أنان 4٪ لامتصاص العرق (PFA) بين عشية وضحاها، ثم إلى 30٪ سكروز بين عشية وضحاها، وتجميد ناظم البرد في باجتزاء المتوسطة. ثم قطع cryosection ووضعه على الشرائح للتحليل المناعى. اختياريا، واستخدام الأنسجة لكله يشن من قبل التجفيف في الميثانول بنسبة 100٪، بعد التثبيت في 4٪ PFA.
- لتحليل المناعى وضع cryosections في برنامج تلفزيوني لإزالة أكتوبر ثم منع المقاطع مع 10٪ مصل حمار عادي لمدة 30 دقيقة. ثم إضافة PECAM الأجسام المضادة الأولية في 1: 100 التخفيف بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. في اليوم التالي، وغسل الشرائح في PBT 3 مرات لمدة 10 دقيقة لكل وإضافة حمار لمكافحة الجرذان 594 الثانوي واحتضان لمدة 1 ساعة على RT.
ملاحظة: هذا هو أسلوب تطالب غاية تتطلب التحسين وتنسيق الموجات فوق الصوتية وحقن مكروي. هناك منحنى التعلم حاد جدا تتعلق هذه التقنية ويتطلب أربعة إلى ستة أسابيع من الحقن إرشادهم قبل واحد يصبح بارعا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تشكيل الأوعية الدموية تسبق تدفق في تطوير الكلى
أغلبية من الأنسجة الجنينية (بما في الكلى) تحتوي على الأوعية الدموية الكثيفة (سواء unperfused وperfused ل)، وحتى في وقت مبكر نقطة زمنية الجنينية. لأفضل مقياس وتحليل تدفق الدم داخل الكلى تطوير علينا الاستفادة من وسائل في الرحم إبر دقيقة جدا داخل القلب الجنينية. مع استخدام عالية الدقة الموجات فوق الصوتية لتحديد قلب الجنين في E11.5 من خلال E17.5، وبعد استخراج والتعرض لكيس الرحم واحد عن طريق فتح البطن، كنا قادرين على ضخ 2.5 ميكرولتر من TL (ثيوسيانات فلوريسئين (FITC) -conjugated).
لقد وجدنا أعظم نجاح حقن E13.5 وE15.5 نقاط زمنية الجنينية، مع نسبة نجاح حوالي ~ 80٪ إلى 90٪، على التوالي. بسبب وجود القلب غير ناضجة نسبيا في E11.5 وجود الغضروف كثيفة وتشكيل العظام في E17.5، ومنظمة الشفافية الدولية النائيةلي نقطة صعبة نسبيا لحقن، مع وجود احتمال أقل بكثير من النجاح بالمقارنة مع نقطة وسطى الوقت الجنينية. يمكن للمرء أن يتوقع ما لا يقل عن 50٪ ~ و ~ معدلات النجاح 30٪ مع E11.5 والوقت E17.5 نقطة على التوالي.
التي شارك في وضع العلامات الأنسجة مع PECAM (CD31)، علامة البطانية العالمية، ونحن قادرون على تصنيف نوعي الأوعية والأنسجة الفلورسنت إلى ثلاث مجموعات: الأوعية الدموية perfused ل(PECAM إيجابية وTL إيجابي)، الأوعية الدموية unperfused (PECAM إيجابي)، وperfused لaberrantly هياكل (TL إيجابي). هذا النمط تلطيخ معين يسمح لنا أن نميز بين مكانيا بين مناطق نضح والامم المتحدة ونضح (الشكل 11).
في E11.5، اكتشفنا أن السفن perfused لتلخص الكلى النامية في نمط يشبه الويب دون اختراق فعلا في الجهاز (الشكل 12B). قبل E13.5، تم perfused لسفن كبيرة مع عدد قليل من أصغرسفن التبعي تلطيخ مع TL (الشكل 12C). ويمكن أيضا أن ينظر في جميع أنحاء تلطيخ بعض ظهارة الحالبي، وهذا قد يكون إما من الكبيبات التي و perfused بالفعل أو بسبب التسرب المتأصل في الأوعية الجنينية المبكرة. التي تم perfused لE15.5 السفن الكبرى، ويمكن أيضا أن يلاحظ مع ذلك عدد كبير من الكبيبات عقد وصمة عار TL، مما يوحي بأن تصفية كبيرة يحدث (الشكل 12D). أيضا في هذا الوقت تشير عدد من السفن عيار أصغر تظهر perfused ل، على الرغم من أن نسبة كبيرة من منطقة كلوي الخارجي يبدو أن تخلو من تدفق الدم. وأخيرا، ومع ذلك، من خلال E17.5 كان perfused لأغلبية الكلى باستثناء الأوعية الدموية للمنطقة كلوي، الذي يخلو في الغالب من نضح (ولكن الكثيفة في الأوعية إيجابية PECAM) مما يدل على عدم وجود الأوعية الدموية في المناطق الطرفية. سفن عيار أصغر تحتوي على TL ومتوسط عدد الكبيبات perfused لديه بشكل كبير فيمجعدة بالمقارنة مع نقطة زمنية سابقة (الشكل 12E).
الشكل (1). الموجات فوق الصوتية التحقيق، مرحلة الجراحية، ونظام حقن مكروي، ونظام السكك الحديدية، وECG / رصد درجة الحرارة مجموعة أساسية تصل.
الشكل 2. المعدات اللازمة الجراحية، والحلول، والأجهزة. (A) تطبيقها ذات الرؤوس القطن. (ب) توسيع (الدائري) ملقط. (C) مقص جراحي. (D) ملقط بلانت ذات الرؤوس. (E) الملقط الجميلة. (F) حقن مكروي إبرة (Origio، # C060609). (H) حقن / ملء تحكم. (I) الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). (J) الزيوت المعدنية (سيغما الدريتش).
الشكل (3). يتم تنفيذ A 2 سم البطن على الأم تخدير، وتعريض طبقة تحت الجلد (جدار البطن) أعلاه الرحم. الاستفادة من مقص جراحي وملقط غرامة، فضح ألبا الخط وجعل شق مواز لخفض البشرة. الرجاء النقر هنا ل عرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل (4). 1-2 E15.5 الكييسات الرحم المستخرجة من خلال شق البطن وكشفت. الرجاء انقر هنا لعرض أكبرنسخة من هذا الرقم.
الرقم 5. مكشوف الكييسات الرحم تسترشد من خلال شق في طبق بتري منوفذ باستخدام ملقط تمتد. منوفذة الربط بين المقاعد سنججلي في قاعدة الكييسات.
الرقم 6. الأزرق تحتوي على الحائط وضعت على يمين الكييسات الرحم. طبق بتري مليئة 37 ° C PBS حتى الأجنة والتي تحتوي على الجدار وغرقت تماما. كتل من الطين وضعت بشكل آمن تحت بيتري طبق / جنين بين الأسلحة والجسم والساقين والذيل.
الرقم 7. positio نظام حقن نيد ½ سم إلى اليسار وأدناه، و 90 درجة لمسبار الموجات فوق الصوتية.
الرقم 8. المرحلة X وآليات التكيف Y.
الرقم 9. الخالي / ملء الجهاز، نظام حقن مكروي، ومرحلة جبل. (A) زر تعبئة. (B) زر حقن. (C) الإبرة الدائرية مقبض تعديل زاوية. تعديل مقبض الباب (E) X الجميلة. (F) "حقن" مقبض الباب. تعديل مقبض الباب (G) دورة X. (H) المرحلة تدور مقبض الباب الارتفاع التعديل.
98fig10.jpg "/>
يتم وضع الرقم 10. الموجات فوق الصوتية صورة E15.5-داخل القلب TL حقن مكروي. غيض إبرة داخل غرفة القلب، ويشار إلى حل TL بواسطة الظل الأسود داخل مجلسين. يتم التمييز التامور والتامور تجويف بسهولة.
الرقم 11. المناطق بين التروية، unperfusion، وتلطيخ الشاذة تمييزها. وتبين الفريق الأول وصمة عار PECAM. تعرض لوحة المتوسطة وصمة عار على TL بالضبط نفس المنطقة من الأنسجة. الحالبي برعم اتسخت aberrantly. والمغطى السفن الكبرى بواسطة خطوط بيضاء منقطة. لوحة الأخيرة هي الدمج. السهام البيضاء تشير إلى تسرب السفينة، وتظهر السهام الرمادية التحول نحو سفينة تصبح perfused ل. هياكل الصفراء تمثل الأوعية الدموية perfused لبالكامل.OAD / 52398 / 52398fig11large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
والتحقيق في الشكل 12. الأجنة ونضح الكلى تطور الجنين. وperfused ل(A) كامل E11.5 الجنين، مع الأوعية الطرفية للغاية داخل المناطق الرأس والذيل عقد TL. وشوهدت (B) السفن perfused لالمحيطة بها ولكن لم تدمج في الكلى تطوير في E11.5 في نمط يشبه شبكة الإنترنت، وهناك أيضا تماما كمية كبيرة من تلطيخ منتشر في هذه المرحلة. (C) E13.5 الكلى يظهر و perfused، والسفن ذات عيار كبير الكبرى في جميع أنحاء الكلى (السهم الأبيض والأصفر)، مع نضح غائبة داخل منطقة كلوي (خط منقط أبيض). (D) E15.5 الكلى يظهر نضح في جميع أنحاء عيار صغير والأوعية الطرفية (الأسهم الصفراء)،في بعض الكبيبات (السهام البيضاء)، ومرة أخرى غياب نضح في الطرفية رف الكلى. (E) E17.5 الكلى يظهر نضح واسعة في جميع أنحاء الكبيبات (السهام البيضاء) وسفن العيار الصغير (الأسهم الصفراء). منطقة كلوي لا يمكن تمييزه عن بقية الكلى في هذا التكبير. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
التخدير حقن مكروي والإطار الزمني
وفيما يتعلق تخدير الأم، فمن الضروري للحفاظ على ثبات تدفق الهواء (2-3 لتر / دقيقة) وعند انخفاض PSI. يجب أن تعقد تدفق مهدئ في حوالي الساعة 1،75 حتي 2 لتر / دقيقة. في وقت واحد والأطر الزمنية التي الحقن تتم يجب أن تراقب عن كثب والخاضعة للرقابة لمع كل بطن. لكل القمامة يجب أن تبقى إجراء الحقن تحت 45 دقيقة. أهمية هذه المهلة أمر بالغ الأهمية لهذه التجربة، كما يجب الحفاظ على كل جنين داخل، المعدل الطبيعي معدل ضربات القلب المستمر من أجل تسهيل رقابة وثابت نضح في جميع أنحاء الجسم والأعضاء في المصالح. لقد وجدنا أن إطالة النتائج الحقن في النتائج وتقلبات مشبوهة في أنماط نضح بين الأجنة ويخفض معدلات الحقن الناجحة (أي بطء معدل ضربات القلب، والموت القلبي). وأخيرا، وبعد حقن النهائي في القمامة، فمن الضروريالسماح حوالي 15 دقيقة قبل أن يتم حصاد الأجنة لتسهيل السليم، ونضح الكامل داخل كل الجنين.
العلاج الإجرائية ورعاية الأجنة
خلال استخراج الأجنة، وجدنا معدلات أكبر للنجاح مع الحقن التي يتم إنجازها من خلال حضور باستمرار إلى الصحة العامة وسلامة بطانة الرحم والأجنة أثناء استخراج الجنين. باستخدام أدوات تطبيقها القطن ذات الرؤوس الدقيقة (مشبعة PBS) لمعالجة والمناورة الكيس الرحم والكييسات أمر لا بد منه لضمان بقاء الأم والأجنة في جميع أنحاء الداخلي. أولا، من المهم للتأكد من أن السلامة الجسدية للالرحم والمشيمة يتم الحفاظ بشكل صحيح. تجنب اللوي والكييسات بطريقة من شأنها أن تعيق تدفق الدم إلى الجنين أو تسبب كسور كبيرة في الأوعية الدموية التي تغذي تدفق الدم إلى المشيمة. ويمكن تحقيق ذلك عن طريق استخراج اقصىم من 1-2 أجنة في وقت واحد (ما لم استخراج الكيس الرحم بأكمله لالفرز الاولي) وعن طريق وضع تطبيقها بعيدا عن الأوعية الدموية الرئيسية في قاعدة المشيمة.
موقع الجنينية حقن الموقع
توجيه إبرة حقن مكروي في المكان الصحيح مع جهاز الموجات فوق الصوتية هو أمر حاسم لكل محاولة حقن أيضا. ويجب إيلاء اهتمام دقيق لتحديد مكان وتمركز من البطين الأيسر على علامة المركز. وفي أعقاب ذلك، الإبرة يجب أن يكون موجودا وتركزت تحديدا على علامة مركز بالإضافة إلى محاذاة الإبرة وموقع الحقن على نفس X وخطة Y. مرة واحدة وهذا هو الكامل، ورسم ببطء غيض إبرة أقرب إلى موقع الحقن وتجنب تطبيق إجهاد لا مبرر له إلى كيس التامور والقلب. ويتم ذلك من خلال السماح للإبرة لتمرير تدريجيا من خلال طبقات الأنسجة، بدلا من إجبار مرور الإبرة من خلالهم. خلال الحقن، فمن المهم أيضا لاوك خارج لالظل الأسود المنبثقة من طرف الإبرة (الشكل 10). هذا يدل على حل TL ملء البطين. إذا كان رأس الإبرة في الموضع الصحيح، يجب أن تظهر باستمرار الظل وتختفي كما يتم إخراج TL في الشريان الأورطي. ومع ذلك، إذا يبدو أن جوف التامور إلى التهم، وهذا يدل أن الإبرة بعيدا عن المرمى من البطين الأيسر والحل TL هو ملء تجويف التامور الذي يحيط القلب. هذا هو الخطأ الشائع الذي تم تصحيحه بسهولة عن طريق تغيير موضع إبرة الحقن عن دورته X والطائرة Y، مع أي تعديلات طفيفة تحدث مع الإبرة لا يزال داخل الجنين. تجنب استخراج الإبرة من الجنين في هذه المرحلة.
الموجهة الموجات فوق الصوتية في القيود حقن مكروي الجسم الحي
بطبيعتها، وحقن مكروي الموجات فوق الصوتية يمتلك عددا من القيود التقنية الأساسية. أولا وقبل كل شيء، وحجم إبرة حقن مكرويالقدرة تقيد الفئة العمرية من الحقن لE17.5 في الماوس. وقد تبين 2.5 ميكرولتر من حل TL في دراساتنا ليروي تماما الأجنة حتى E15.5. ومع ذلك، فقط بعد هذه النقطة الوقت، وTL نسبة حجم الدم ليصبح لضئيلة والمخففة لوضع علامة على نحو فعال أغشية بطانة الأوعية الدموية الكلوية الطرفية. وهكذا، صورة تقلص تدفق الدم هي الحاضرة في وقت لاحق حقن نقطة زمنية. بالإضافة إلى ذلك، وتشكيل العظام والغضاريف في الجنين يخلق حاجزا طبيعيا لطرف الإبرة، مما يؤدي إلى العصور حقن تطول والشقوق متكررة في الرأس الإبرة. ويمكن التغلب على هذه القيود من خلال استخدام نظام الحقن جديدة مع زيادة قدرات القوة إبرة والحجم.
تقنيات رسم الخرائط تدفق الدم الجنيني البديلة
حتى الآن، طرق بديلة لرسم الخرائط الجنينية تدفق الدم الماوس وتشمل تنفيذ يلقي الراتنج، وتلطيخ المناعية، وresolut عالية أيون التصوير بالموجات فوق الصوتية. كما يلقي الراتنج (مع دمج تقنيات التصوير المتقدمة) هي حاليا البديل الأكثر شعبية، وهذا سيتم مناقشته بمزيد من التفصيل أدناه. يلقي الراتنج تسمح لخلق دقيقة تمثيل ثلاثة الأبعاد للتدفق داخل الأجهزة بعد الولادة. ومع ذلك، فقد كان نجاح يذكر مع أنسجة الكلى قبل الولادة التصوير بسبب يسهل اختراقها الأوعية الدموية الدم والقيود في القرار. في المقارنة، البقع TL مترافق تمكن الرابطة إلى البطانية مستضدات الغشاء مما يؤدي إلى درجة عالية من الدقة. وفي حالات أخرى، ويلقي الراتنج اللزوجة باقتطاع قبل الأوان التدفق إلى الأوعية الشعرية الكبيبات والأسرة الصغيرة، وخلق الحد إينفستيغأيشنل في تكبير أعلى. في تكبير السفلى، هذه التقنية قابلة للحياة بوضوح إلى إنشاء أنماط تدفق فيما يتعلق المناطق النامية. على العكس من ذلك، TL يسمح تحليل عالية الدقة من تدفق الدم مقارنة الهياكل التنموية على المستوى الخلوي.
والأنف والحنجرة "> تطبيق والاتجاهات المستقبليةوتشير البيانات المتوفرة لدينا أن تدفق الدم والأوكسجين هي عوامل حاسمة فيما يتعلق نفرون السلف التمايز. لمزيد من توضيح دورهم في تنمية الكلى، يجب أن التحقيقات في المستقبل ترسم آليات التشريحية الأساسية عجل هذه العملية الفسيولوجية وكذلك دراسة مسارات الإشارات النسخي التي تتوسط هذه الظاهرة أيضا. فرضية واحدة، فيما يتعلق سد الفجوة بين الظاهرة والآلية، هو أن الخلايا العضلية الملساء وخلية حوطية المجاميع تلعب أدوارا المساهمة في تنسيق اقتطاع عابرة من تدفق الدم إلى مناطق الخلايا الجذعية من أجهزة النامية. من أجل اختبار هذا، لا بد من إجراء المزيد من تلطيخ وتحليل مناعي مع التركيز على أنواع الخلايا في هذه المنطقة الحدودية كلوي. من حيث التحقيقات المستقبلية الكامنة مسارات الإشارات، نود أن استكشاف أدوار نقص الأكسجة عوامل محرض وفون Hippen لينداو مسارات الإشارات. إلى حد كبير تورط كل من هذه طوال الأدب كما لعب أدوار مهمة في الحفاظ على الاستقرائي ميتة وبيئات غنية بالأوكسجين داخل المناطق الخلايا الجذعية (ينظر إلى حد كبير أن يكون ميتة) ومجالات التمايز (المناطق في أمس الحاجة إلى الأوكسجين)، على التوالي. وعلاوة على ذلك، نود أن استجواب دور الإريثروبويتين (EPO) في التوسط في عمليات الأوعية الدموية وتكون الأوعية في جميع أنحاء تطوير الأوعية الدموية في الكلى. EPO هو بروتين سكري الكلوي التي تلعب أدوارا حاسمة في التمايز البطانية والصيانة. دورها في الدم بوساطة البطانية التمايز غير معروف إلى حد كبير. وأخيرا، نود أن إجراء التجارب في حقن مكروي الجسم الحي مع مركبات توسع الأوعية لزيادة تعزيز صحة هذه التحقيقات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DAPI | Sigma Aldrich | 022M4004V | concentration 1:5,000 |
| Pecam | BD Biosciences | 553370 | concentration 1:100 |
| FITC-Tomato Lectin | Vector Laboratories | FL-1321 | concentration 2.5 µl / embryo |
| Alexa Fluor-594 (Donkey Anti-Rat) | Jackson Immunoresearch | 712-585-150 | concentration 1:200 |
| Microinjection Needle | Origio Mid Atlantic Devices | C060609 | |
| Mineral Oil | Fisher Scientific | BP26291 | |
| 1 ml syringe | Fisher Scientific | 03-377-20 | |
| Clay Blocks | Fisher Scientific | HR4-326 | |
| Surgical Tape | Fisher Scientific | 18-999-380 | |
| PBS | Fisher Scientific | NC9763655 | |
| Hair Removal Product | Fisher Scientific | NC0132811 | |
| Surgical Scissors | Fine Science tools | 14084-08 | |
| Fine Forceps | Fine Science tools | 11064-07 | |
| Surgical Marking Pen | Fine Science tools | 18000-30 | |
| Right angle forceps (for hysterectomy) | Fine Science tools | 11151-10 |
References
- Abrahamson, D. R., Robert, B., Hyink, D. P., St John, P. L., Daniel, O. P. Origins and formation of microvasculature in the developing kidney. Kidney international. Supplement. 67, S7-S11 (1998).
- Sims-Lucas, S., et al. Endothelial Progenitors Exist within the Kidney and Lung Mesenchyme. PloS one. 8 (6), e65993 (2013).
- Dressler, G. R. Advances in early kidney specification, development and patterning. Development. 136 (23), 3863-3874 (2009).
- Costantini, F. Genetic controls and cellular behaviors in branching morphogenesis of the renal collecting system. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1 (5), 693-713 (2012).
- Costantini, F., Kopan , R. Patterning a complex organ: branching morphogenesis and nephron segmentation in kidney development. Dev Cell. 18 (5), 698-712 (2010).
- Das, A., et al. Stromal-epithelial crosstalk regulates kidney progenitor cell differentiation. Nat Cell Biol. 15 (9), 1035-1044 (2013).
- Rymer, C., et al. Renal blood flow and oxygenation drive nephron progenitor differentiation. Am J Physiol Renal Physiol. , (2014).
- Shah, S. R., et al. Embryonic mouse blood flow and oxygen correlate with early pancreatic differentiation. Developmental biology. 349 (2), 342-349 (2011).
- Andres, A. C., et al. EphB4 receptor tyrosine kinase transgenic mice develop glomerulopathies reminiscent of aglomerular vascular shunts. Mech Dev. 120 (4), 511-516 (2003).
- Wagner, R., et al. High-resolution imaging of kidney vascular corrosion casts with Nano-CT. Microsc Microanal. 17 (2), 215-219 (2011).
