Fare Embryolarının üzerinde Utero içi kardiyak Domates-lektin Enjeksiyonlar Renal Kan Akışı Ölçer için
Summary
This manuscript describes a technique for visualization of the developing vasculature. Here we utilized in utero intra-cardiac FITC-labeled tomato lectin microinjections on mouse embryos. Using this technique, we delineate the perfused and unperfused vessels throughout the embryonic kidney.
Abstract
oluşumu ve (dışında glomerüllerden) böbrek kan damarlarını geliştirme perfüzyon ölçüde understudied edilir. Damar gibi reçine atmalarını, in vivo ultrason görüntüleme ve mikro-diseksiyonu olarak perfüzyon haritalama teknikleri arasındaki yakın ilişkiyi gösteren sınırlı olan, (de novo damar oluşumu) ve vaskülogenez (büyük damarların kapalı dallanma olan) anjiyogenez yoluyla geliştikçe Embriyonun içinde bu iki süreç ve gelişmekte olan böbrek yapıları. Burada, biz böbrek perfüzyonunun ontogenezini ölçmek için fare embriyoları üzerinde utero içi kardiyak ultrason rehberliğinde FITC etiketli domates lektin mikroenjeksiyon içinde prosedürü tarif. Domates lektin (TL) hasat embriyo ve böbrekler boyunca perfüze edildi. Nefron atalarıdır, nefron yapıları, üreter epiteli ve damar: dokular dahil olmak üzere çeşitli böbrek yapılar için ortak boyandı. E13.5 büyük kalibreli damarları başlayan, ancak periferik perfüze edildigemi unperfused kalmıştır. E15.5 E17.5 ve tarafından, küçük periferik damarlar yanı sıra glomerüller perfüze hale başladı. Bu deneysel teknik, embriyonik gelişim sırasında damar kan akışının rolü üzerinde çalışılması için kritik önem taşır.
Introduction
Embriyonik gelişimi sırasında iki ayrı, ama aynı anda, vasküler işlemler gerçekleşir: anjiogenezisi, süreci bir gemi konut endotel atalarıdır 1,2 den gemilerin de novo oluşumu büyük bir önceden var olan damar, ve vaskülogenez, yetişen bu sayede. Ikinci büyük ölçüde o olmadan gerçekleşmesi düşünülmektedir ise sırasıyla, eski, kan akımı ile eş anlamlıdır.
Kan damarı oluşumu eş zamanlı, böbrek progenitör hücre sentezi, çoğalması ve farklılaşması bir döngüsel ve dinamik bir süreç embriyonik gün 9.5 (E9.5) açılmak başlar. Bu noktada üreter tomurcuğu (UB) metanefrik mezenşimi (MM) çevredeki içine dorsal işgal ve Doğum 3 kadar devam eder. Hızla metanefrik kap mezenşimi yoğuşmalı içine UB dallanma tekrarlanan böbrek fonksiyonel birimleri, nefron oluşumunu başlar. UB ve nef her yeni nesilron, eski kuşaklar daha sonra öncelikle damar-yoğun ortamlarda daha olgunlaşmasını ve farklılaşmasını geçiren iç kortikal ve medüller bölgeler, içine yerinden edilir. Dressler ve ark. 3 ile kanıtlandığı gibi, bu embriyolojik işlemi, UB ve MM, ve hücre dışı faktörler 3-6 sayısız arasında çapraz olarak, endüktif sinyal çökeltilir. İki yakın zamanda incelenen dışı gelişen pankreas içindeki faktörler ve böbrekler oksijen gerilimi ve kan akışını 7,8 bulunur. ikinci böbrek gelişimi ile ilişkili olarak aşağıda daha ayrıntılı olarak tarif edilecektir.
Kan akışı, potansiyel nefron progenitör hücre farklılaşması, hem de diğer organogenez süreçleri, embriyonik kan akımı haritalama hassas ve doğru bir yöntem oynadığı endüktif rolü ortaya koymak için de çok önemlidir.
Kan akışını ölçme alternatif yöntemler ul reçete dahiltrasound görüntüleme ve reçine 9,10 atmalarını. Sonuç, bu modlar doğal eş kan akımı arasındaki zamansal ve mekansal juxtapositions açıklayacak ve hücre farklılaşmasını kök onların kapasite eksik gösterilmiştir. Reçine kalıplar, örneğin, ancak bu tür oluşum safhasındaki zaman noktalarında olduğu gibi olgun olmayan kaplar, içinde, yetişkin doku içindeki damar desenli geçerli bir model sağlayan, kaplar büyük ölçüde az gelişmiş ve sızan bulunmaktadır. Bu nedenle, reçine, çoğu zaman gözenekli, küçük damarlarda içinde tutmak için başarısız atmalarını.
Bu belirgin engeller için, diğerleri arasında, biz ultrason rehberliğinde böbrek gelişimi bizim soruşturma içine in vivo içi kardiyak embriyonik domates lektin (TL) mikroenjeksiyon dahil etmek seçti. Bu prosedürde, biz zaman uyumlu E11.5, 13.5, E15.5 ve E17.5 zaman noktalarında fare embriyoları sol ventrikül içine TP çözeltisi 2.5 ul ile dolu bir monte mikropipet iğne kılavuz için, bir ultrason probu kullanmaktadır. E17Iğneler daha gelişmiş embriyo nüfuz için yeterince güçlü değil gibi .5 son gelişimsel yaş.
Bu mikroenjeksiyon yönteminin avantajları bol miktarda bulunmaktadır. Ultrason eşliğinde mikroenjeksiyon kesin embriyonik sol ventrikül içinde bir enjeksiyon iğnesinin konumlandırma, hayvan, kalp minimal hasar ve çevreleyen dokuların atan kalbine çözümün pasif ve kontrollü atılmasına, ve ani kalp yetmezliği kaçınma ve ölüm veriyor embriyo tam vücut perfüzyon önce. FITC-işaretli TL kullanımı ile, herhangi bir perfüze damar da endotel apikal zar boyunca işaretleyici koruyacaktır. Immunohistokimyasal ile birlikte, PECAM (CD31, Trombosit endotel hücre adezyon molekülü) ve diğer çeşitli vasküler belirteçleri kullanarak, açıkça edebiliyoruz perfüze ve un-perfüze gemilerin arasında ayrım yanı sıra çevre dokulara herhangi bir anormal boyama karakterize.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mikroenjeksiyon anestezi ve zaman çerçevesi
Annenin anesthetization ile ilgili olarak, bu hava akımı sabit (2-3 L / dk) ve düşük PSI'de tutmak esastır. sedatif akışı / dak yaklaşık 1,75-2 L tutulmalıdır. Aynı anda, enjeksiyonlar yer aldığı zaman dilimleri yakından takip ve her çöp için kontrol edilmelidir. Her çöp için enjeksiyon prosedürü 45 dakika altında tutulmalıdır. Her embriyo gövdesi ve ilgi organı boyunca kontrollü ve değişmez perfüzyon kolayl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Dr. George Gittes for advice and expertise throughout this study. SSL was supported by an American Heart Association fellowship (11POST7330002). Further to this SSL and this study was supported by an NIDDK Mentored Research Scientist Development Award (DK096996) and by the Children’s Hospital of Pittsburgh.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| DAPI | Sigma Aldrich | 022M4004V | concentration 1:5000 |
| Pecam | BD Biosciences | 553370 | concentration 1:100 |
| FITC-Tomato Lectin | Vector Laboratories | FL-1321 | concentration 2.5µL / embryo |
| Alexa Fluor-594 (Donkey Anti-Rat ) | Jackson Immunoresearch | 712-585-150 | concentration 1:200 |
| Microinjection Needle | Origio Mid Atlantic Devices | C060609 | |
| Mineral Oil | Fisher Scientific | BP26291 | |
| mL syringe | Fisher Scientific | 03-377-20 | |
| Clay Blocks | Fisher Scientific | HR4-326 | |
| Surgical Tape | Fisher Scientific | 18-999-380 | |
| PBS | Fisher Scientific | NC9763655 | |
| Hair Removal Product | Fisher Scientific | NC0132811 | |
| Surgical Scissors | Fine Science tools | 14084-08 | |
| Fine Forceps | Fine Science tools | 11064-07 | |
| Surgical Marking Pen | Fine Science tools | 18000-30 | |
| Right angle forceps (for hysterectomy) | Fine Science tools | 11151-10 |
References
- Abrahamson, D. R., Robert, B., Hyink, D. P., St John, P. L., Daniel, O. P. Origins and formation of microvasculature in the developing kidney. Kidney international. Supplement. 67, S7-S11 (1998).
- Sims-Lucas, S., et al. Endothelial Progenitors Exist within the Kidney and Lung Mesenchyme. PloS one. 8 (6), e65993 (2013).
- Dressler, G. R. Advances in early kidney specification, development and patterning. Development. 136 (23), 3863-3874 (2009).
- Costantini, F. Genetic controls and cellular behaviors in branching morphogenesis of the renal collecting system. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1 (5), 693-713 (2012).
- Costantini, F., Kopan , R. Patterning a complex organ: branching morphogenesis and nephron segmentation in kidney development. Dev Cell. 18 (5), 698-712 (2010).
- Das, A., et al. Stromal-epithelial crosstalk regulates kidney progenitor cell differentiation. Nat Cell Biol. 15 (9), 1035-1044 (2013).
- Rymer, C., et al. Renal blood flow and oxygenation drive nephron progenitor differentiation. Am J Physiol Renal Physiol. , (2014).
- Shah, S. R., et al. Embryonic mouse blood flow and oxygen correlate with early pancreatic differentiation. Developmental biology. 349 (2), 342-349 (2011).
- Andres, A. C., et al. EphB4 receptor tyrosine kinase transgenic mice develop glomerulopathies reminiscent of aglomerular vascular shunts. Mech Dev. 120 (4), 511-516 (2003).
- Wagner, R., et al. High-resolution imaging of kidney vascular corrosion casts with Nano-CT. Microsc Microanal. 17 (2), 215-219 (2011).
