Abstract
A detecção precoce é uma chave para o sucesso do tratamento da maioria das doenças, e é especialmente indispensável para o diagnóstico e tratamento de vários tipos de cancro. As técnicas mais comuns utilizados são métodos de imagem, como a ressonância magnética (MRI), Positron Emission Topografia (PET), e Topografia Computadorizada (CT) e são ideais para a compreensão da estrutura física da doença, mas só pode ser realizada uma vez a cada quatro a seis semanas, devido à utilização de agentes de imagiologia e de custo global. Com isto em mente, o desenvolvimento de "point of care" técnicas, como biossensores, que avaliam o estágio da doença e / ou a eficácia do tratamento no consultório do médico e fazê-lo em tempo hábil, iria revolucionar os protocolos de tratamento. 1 Como um meio para explorar biossensores ferroceno base para a detecção de moléculas biologicamente relevantes 2, foram desenvolvidos métodos para produzir conjugados de bio-ferroceno-biotina aqui descritos. Este relatório vai se concentrar em um sistema-biotina-ferrocene cisteína que pode ser imobilizada em uma superfície de ouro.
Introduction
Biossensores são pequenos dispositivos que utilizam a tecnologia de reconhecimento biomolecular como a plataforma para análise seletiva e são utilizados para a sua especificidade, velocidade e baixo custo. Os biossensores eletroquímicos para a detecção de biomoléculas estão na vanguarda deste campo, devido à sua simplicidade, custo-benefício, e alta sensibilidade. 1,3 A anatomia geral destes sensores é um eletrodo equipado com uma molécula de reconhecimento específico para o marcador biológico de interesse . A ligação do marcador por molécula de reconhecimento resulta de uma alteração local do potencial ou da corrente que pode ser detectada por uma simples medição. Até à data, a porção reconhecimento pode variar de enzimas, anticorpos, 4-8 9-12 células inteiras, 13-16, 17-20 receptores peptídeos 21-23 e 24 e de DNA em grande parte com foco em moléculas maiores, biológicos. 25-28 Research esforços nessa arena têm se concentrado principalmente na imunossensores where uma imunoglobulina é imobilizada com um núcleo activo redox (tais como ferroceno) e utilizados para detectar um anticorpo de interesse. Estes estudos foram excluídos aplicações clínicas devido à baixa precisão e tempo de consumo decorrentes das complicações decorrentes do uso de antígeno / anticorpos. 1,3 crescente atenção centrou-se na detecção de moléculas pequenas (menos de 1 kg / mol) de biomédica , alimentos e interesse ambiental, além de segurança nacional. 29 Os exemplos mais conhecidos de dispositivos biossensores são monitores de glicose de auto-teste, que têm tela impressa eletrodos enzimáticos acoplados a um metro amperometric bolso. Estes sistemas utilizam tipicamente um método coulométrico onde a quantidade total de carga gerada pela reacção de oxidação da glicose é medida ao longo de um período de tempo. Dispositivos mobiliários deve ser portátil, robusto e de mão de fazer uso fácil para a população em geral.
Tag Redox como ferrocene são necessry para proporcionar a detecção eletroquímica de biomarcadores ou pequenas moléculas em solução como a maioria dos biomarcadores não são intrinsecamente eletroquimicamente ativa. 30-38 Ferroceno é uma molécula organometallic que é um padrão-ouro para eletroquímica, o que o torna uma excelente opção para a integração em biossensores eletroquímicos. Espécies ativas redox à base Ferroceno já acumulou considerável atenção devido ao seu pequeno tamanho, boa estabilidade, acesso sintético conveniente, modificação química fácil, lipofilicidade relativa, e facilidade de ajuste redox. 3,30-42 Pequenas moléculas baseado no núcleo ferrocene tem sido amplamente utilizado como detectores de íons metálicos e pequenas moléculas. 32-38,43 Sistemas dirigidas a espécies maiores, como biomoléculas têm utilizado a ligação de anticorpos grandes ou imunoglobulinas para derivados do ferroceno que foram incorporados em uma superfície eletroquímica. 1,3,39 , 44 Em cada caso, o potencial de corrente e intensity do par redox Fe III / Fe II foi alterado por acoplamento molecular, produzindo, assim, um novo identificador espectroscópica indicando a presença da molécula de analito. Esta mudança surge a partir da sobreposição extensiva que ocorre entre o sistema-pi dos anéis ciclopentadienilo e os de ferro orbitais d. Se o sistema pi é modificado, ou seja, derivado ou reagir, em seguida, a interacção orbital, por sua vez, a mudança. Isto irá afectar o núcleo Fe e pode ser observada como uma mudança no potencial do par Fe III / Fe II. 40,45,46 Estas propriedades tornam um tal sistema atractivo para uso como um agente de quantificação em um imunoensaio electroquímico ou biossensor.
De modo a produzir sistemas de ferroceno contendo capacidades específicas para biossensores é óptima para modificar um anel de Cp com a bio-receptor específico para uma molécula alvo e utilizar o outro anel de Cp como uma amarra molecular para a leitura electroquímica ou electrode (Figura 1). Síntese destes derivados do ferroceno assimétricos é desafiado por reações colaterais e a formação de espécies diméricas e poliméricas formadas sobre intermolecular cross-linking. 47 No entanto, o acoplamento química produzindo uma ligação amida é o caminho mais direto para fornecer derivados simples de ferrocene envolvendo componentes biológicos tais como péptidos e seus metabolitos. Portanto, as técnicas de fase sólida primeiro desenvolvidos na década de 1950 por Merrifield de síntese de péptidos podem ser aplicados a compostos organometálicos contendo ferroceno. Através da utilização da molécula de ácido 1'-Fmoc-amino-ferroceno-1-carboxílico ortogonalmente substituído, um sistema de ferroceno, que pode incluir uma porção do receptor (biotina), leitura electroquímica (ferroceno), e o componente de imobilização-ligante (cisteína) possui Foram construídas aqui detalhado. A síntese deste bio-conjugado é discutido bem como prova para a imobilização sobre uma superfície de ouro. Este trabalho represenst a primeira apresentação de um sistema composto de biotina, ferroceno e um aminoácido para a imobilização sobre uma superfície de ouro.
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Protocol
1. Síntese de biotina-Fc-cisteína (1)
- Métodos em fase sólida para produzir resina-1 ligado.
- Coloque biotina resina carregada (250 mg, 0,145 mmol) para uma seringa de vidro sinterizado e inchar a resina através da elaboração de dimetilformamida (5 mL) e agitando a seringa num agitador de laboratório durante 20 min. Expelir a solução e repetir dimetilformamida inchaço mais uma vez.
- Remover o grupo protector Fmoc por adição de 4-6 ml de 20% de piperidina em dimetilformamida para a seringa, seguido por 10-15 min de agitação. Repetir o processo de desprotecção com mais de 4-6 ml de piperidina. Lava-se a resina com uma sequência de 3x dimetilformamida, 3x dimetilformamida: metanol (1: 1), metanol 3x: diclorometano (1: 1), diclorometano 3x, ~ 5 ml cada. Fazer um teste de ninidrina (+) sobre uma pequena amostra (~ 10) dos grânulos para confirmar a desprotecção bem sucedida pela presença de azul após aquecimento.
- Misturar uma solução contendo ácido 1'-Fmoc-amino-ferroceno-1-carboxílico(203,3 mg, 0,4350 mmol), hidrato de 1-hidroxibenzotriazole (58,8 mg, 0,413 mmol), carbodiimida de diisopropilo (0,0673 ml, 0,435 mmol), diisopropil etil amina (0,0757 ml, 0,435 mmol), e uma mistura 4: 1 de diclorometano e dimetilformamida. Desenhe esta dentro da seringa de frita e agitar suavemente num agitador de laboratório durante 6 horas. Em seguida expelir a solução a partir da seringa e lavagem conforme descrito anteriormente.
- Realizar o teste da ninidrina (-), tal como descrito acima para confirmar acoplamento. O teste de ninidrina ainda podem ser úteis na confirmação de acoplamento apesar de a cor laranja do cordão de derivados de a fixação da porção contendo ferro.
- Em seguida, remover o grupo Fmoc através da adição de 20% de piperidina em dimetilformamida e lavado como descrito acima. O teste de ninidrina (+) deve ser utilizado para confirmar a remoção do Fmoc.
- Prepara-se uma solução composta por Fmoc-Cys (Trt) -OH (254,8 mg, 0,4350 mmol), hidrato de 1-hidroxibenzotriazole (58,8 mg, 0,4125 mmol), carbodiimida de diisopropilo (0,0673 ml, 0,4350mmol), diisopropiletilamina (0,0757 mL, 0,4350 mmol), e uma mistura 4: 1 de diclorometano e dimetilformamida. Adicione este cocktail acoplamento cisteína a seringa frita e agitar suavemente durante 6 horas. Lavar utilizando o protocolo descrito anteriormente.
- Confirmar acoplamento utilizando o teste de ninidrina (-), seguida por remoção do componente de Fmoc com 20% de piperidina e lavagem. Verifique se o terminal de acesso gratuito amina usando o teste de ninidrina (+).
- A clivagem de um a partir da resina.
- Adicione uma solução de TFA (9,45 ml), água (0,25 ml), 1,2-etanoditiol (0,25 ml), e silano de triisopropilo (0,1 ml), adicioná-lo à seringa e agitar suavemente durante 4 h.
- Recolher a solução vermelha-castanha resultante num tubo de Eppendorf e evapora-se o TFA lentamente com uma corrente de ar.
- Adicionar éter dietílico frio (~ 15 ml) para o tubo de Eppendorf para precipitar 1, que irá formar uma ligeira agitação. Isolar o produto por meio de centrifugação (1 g, 5 min). Then ciclos repetidos de lavagens de éter etílico (~ 60 ml total) e centrífuga para obter 1 como um sólido vermelho / marrom.
2. Caracterização e Análise de 1
- Confirmar que a identidade corresponder a conectividade e composição mostrada na Figura 2, usando 1 H (16 varrimentos) e 13 C RMN (512 scans) em metanol deuterado (300 ul) e análise de ESI-MS.
Espere os seguintes resultados:
1 H RMN Espectro (CD 3 OD) δ / ppm: 1,407-1,684 (m, 6H), 2,245 (t, 2H), 2,665-3,150 (m, 12H), 4,015 (t, 1H), 4,104 (d, 2H ), 4,274 (q, 1H), 4.426 (d, 2H), 4,479 (q, 1H), 4,595 (t, 1H) e espectro de 13 C RMN (CD 3 OD) δ / ppm: 24,644 (CH2), 25,472 (CH 2), 28,051 (CH2), 28,300 (CH2), 35,474 (CH2), 38,698 (CH2), 39,241 (CH2), 39,717 (CH2), 55,340 / 55,538 (Cp-anel), 60,286 (CH), 61,964 (CH), 62,521 / 62,821 (Cp-ring), 66,038 / 66,170 (Cp-ring), 69,153 / 69,328 (Cp-ring), 71,468 / 71,593 (Cp-ring), 76,466 (CH), 171,770 (C = O), 175,361 (C = O).
ESI-MS (m / z): Encontrado: 639,00 [1 + Na] +, teórico: 639,1 [1 + Na] + e HR-MS (m / z): Encontrado: 617,2049 [1 + H] +, Teórico: 617.1622 [1 + H] +. - Realizar HPLC, análise elementar para confirmar a composição de um isolado.
Realizar cromatogramas de HPLC utilizando uma coluna de fase reversa C8 com MeOH a 100% a uma taxa de fluxo de 0,5 ml / min. Nota: tempos de retenção de HPLC foram: 3,198-4,674 min.
3. Imobilização de 1 sobre uma superfície de ouro
- Cut polímero apoiado lâminas de ouro em quadrados de ~ 0,25 em 2.
- Encher um copo de 50 ml com uma solução de água Dl de 1 (~ 1 mM).
- Adicionar a lâmina de ouro para o copo e cubra com um vidro de relógio. Tudoow da lâmina de vidro a incubar O / N à temperatura ambiente sem agitação.
- Remover o slide de ouro a partir da solução e permitir que ela seca ao ar.
- Obter imagens de microscopia eletrônica de varredura, utilizando um microscópio eletrônico de varredura (ou equivalente) para observar imobilizada 1.
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Representative Results
A forma ligada resina de 1 é mostrada na Figura 2. A ligação covalente do componente ferroceno dá origem a uma coloração laranja para as pérolas de resina que é persistente com lavagem contínua e indicativo de um complexo de ferro contendo imobilizada em oposição a absorção de ferro pela PEG componente da esfera de resina. A forma livre da resina-1 é idêntica em cor para as pérolas de resina. A seguir à remoção do composto a partir da resina-esferas, a pureza e o rendimento (68%) resultante dos métodos é muito superior a metodologia típica solução. A análise elementar do produto mostrou que 1 foi isolado como o sal de TFA: Calculado (Encontrado) para C 26 H 36 O 4 FeN 6 S 2 4TFA: C, 38,07 (38,90); H, 3,76 (4,20); N, 7,83 (7,70). O rendimento resultante (105,1 mg, 68%) a partir de uma reacção típica é baseado nos resultados da análise elementar. A análise de RMN em metanol deuterado provided espectro de 1H-NMR (CD3OD) δ / ppm: 1,407-1,684 (m, 6H), 2,245 (t, 2H), 2,665-3,150 (m, 12H), 4,015 (t, 1H), 4,104 (d, 2H), 4,274 (q, 1H), 4.426 (d, 2H), 4,479 (q, 1H), 4,595 (t, 1H) e espectro de 13 C RMN (CD 3 OD) δ / ppm: 24,644 (CH2), 25,472 (CH2), 28,051 (CH2), 28,300 (CH2), 35,474 (CH2), 38,698 (CH2), 39,241 (CH2), 39,717 (CH2), 55,340 / 55,538 (Cp-anel) , 60,286 (CH), 61,964 (CH), 62,521 / 62,821 (Cp-ring), 66,038 / 66,170 (Cp-ring), 69,153 / 69,328 (Cp-ring), 71,468 / 71,593 (Cp-ring), 76,466 (CH ), 171,770 (C = O), 175,361 (C = O). Tempos de retenção de HPLC foram: 3,198-4,674 min. Os múltiplos picos observados na análise por HPLC foram confirmadas como sais de TFA dos 1 como descrito acima, utilizando a análise elementar. A espectrometria de massa correlacionou com a estrutura mostrada na Figura 2: ESI-MS (m / z): Encontrado: 639,00 [1 + Na] +,Teórico: 639,1 [1 + Na] + e HR-MS (m / z): Encontrado: 617,2049 [1 + H] +, Teórico: 617,1622 [1 + H] +. Os espectros de absorção electrónicos foram obtidos em água e mostrou λ max (ε, M -1 cm -1) 268 (4,779.8), 434 (324,26).
Os métodos utilizados para incubar uma pequena lâmina de ouro em uma solução de um bioconjugado está representado no desenho esquemático da Figura 3. Uma camada fina de ouro para trás com o material polimérico foi adicionado a uma solução de 1 e deixou-se incubar S / N. A lâmina de ouro foi, em seguida, lavado com água DI e deixou-se secar. Concomitantemente, uma lâmina de ouro foi co-incubado em água Dl e lavado do mesmo modo. As imagens SEM das duas amostras, mostrado na Figura 4, demonstraram que a superfície da lâmina de ouro co-incubadas com 1 foi modificado. Isto indica que ointerações tiolato de 1 fornecer uma âncora de fixação à face de ouro.
Figura 1. Os princípios de um biossensor. Um exemplo específico de um biodetector electroquímico para detectar directamente um alvo em solução.
Figura 2. Os métodos de síntese utilizados para produzir 1. Os métodos utilizados para incubar uma pequena lâmina de ouro em uma solução de um bioconjugado está representado no desenho esquemático da Figura 3. Uma camada fina de ouro para trás com o material polimérico foi adicionado a uma solução de 1 e deixou-se incubar S / N. A lâmina de ouro foi, em seguida, lavado com água DI e deixou-se secar. Concomitantemente, uma lâmina de ouro foi co-incubado em água Dl e lavado do mesmo modo. MEV das duas amostras, Mostrado na Figura 4, demonstraram que a superfície da lâmina de ouro co-incubadas com 1 foi modificado. Isto indica que as interacções de tiolato de uma proporcionar uma âncora de fixação à superfície do ouro.
Figura 3. desenho esquemático que representa a imobilização de 1 para uma lâmina de ouro. O processo envolve a dissolução do bioconjugado em água e adicionando o slide de ouro. A incubação O / N é seguido por lavagem da lâmina. Análise para imobilização de sucesso é realizada através de microscopia eletrônica de varredura mostrado na Figura 4.
Figura 4. MEV de ouro em camadas sobre uma película de polímero de plástico. (A) sans incubação 1 e (B) following incubação com 1 em água S / N e a lavagem com água.
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Discussion
A síntese de derivados de ferroceno assimétricas é um desafio em solução. Por exemplo, as tentativas para produzir uma solução em resultou em baixos rendimentos do produto desejado (menos de 20%). Do mesmo modo, reacções que utilizam ácido carboxílico 1'-amino-ferroceno (sans Fmoc) e biotina ligada resina resultou em um produto insolúvel consistente com o produto polimerizado relatado por Baristic et al. e produto mínima. 47 Isto é ainda mais complicada pelo ferroceno e os seus derivados ser sensível à luz e que os congéneres de aminoácidos são propensos a formar dímeros em solução. Estas questões fazem reações extensas e workups desafiador. No entanto, esta reactividade pode ser contornada utilizando métodos de fase sólida inicialmente desenvolvidas por Merrifield de síntese de peptídeos. A síntese de sistemas de ferroceno-péptido tem atraído a atenção em vários grupos e levou a uma biblioteca de sistemas peptídicos-ferroceno assimétricos. 46,48-52 O trabalhoaqui descrita detalha a síntese das primeiras ferroceno assimétrica bio-conjugados contendo biotina-ferroceno-cisteína. Este composto serve como um modelo, através do qual outros receptores de molécula pequena pode ser considerado para a detecção de moléculas biologicamente relevantes. Neste trabalho foi utilizado como um tirante de imobilização a uma superfície de ouro.
A primeira fase da síntese foi o de obter um núcleo de biotina imobilizada sobre uma resina em estado sólido através de um ligante à base de amina. -Fmoc-Etilenodiamina A N -Biotin- N 'pode ser adquirido comercialmente como a biotina NovaTag resina e foi usado como a base de bio-1 conjugado. O grupo protector Fmoc-amino foi removido utilizando uma solução a 20% de piperidina em dimetilformamida e um positivo (azul) teste da ninidrina confirmada desprotecção bem sucedida. A amina livre da biotina ligado a resina foi então usada para ancorar ferroceno utilizando um cocktail de acoplamento composto de diisopropil-etil-amina,diisopropil carbodiimida, e hidrato de 1-hidroxibenzotriazole. 40,46 Uma variedade de precursores de ferroceno estão disponíveis para tais fins e incluem o ácido carboxílico e de ácido carboxílico ferroceno 1'-Fmoc-amino-ferroceno. Uso dos antigos sistema provoca o mono substituído bio-conjugados possuindo apenas um dos anéis ciclopentadienilo modificados com um apêndice biotina. O último derivado de ferroceno é constituído por substituição ortogonal dos anéis de ciclopentadienilo com um ácido carboxílico e um grupo amino protegido com Fmoc. Esta substituição permite a modificação assimétrica estendida do núcleo ferroceno permitindo a modificação separada de os anéis de ciclopentadienilo para produzir bio-conjugados, tais como 1. Os grânulos amarelos claros transformado num matiz laranja brilhante após acoplamento bem sucedido do ferroceno para o núcleo de resina-biotina, conforme mostrado na Figura 2.
Na fase seguinte da síntese pode ser ligada uma grande variedade de ligantesà amina livre do ferroceno congénere ligado à resina. Para os fins do presente sistema, cisteína foi utilizado, pois é um tiolato contendo aminoácidos. O componente tiolato permite a ligação do bio-conjugado a uma superfície de ouro, como discutido abaixo. Modificação com cisteína prosseguiu por reacção do sistema ligado à resina com Fmoc-Cys (Mmt) -OH. A remoção do grupo Fmoc com piperidina a 20% em dimetilformamida produz ligado à resina formas de 1. A bio-conjugado ligado a resina foi removido do suporte sólido por clivagem dos sistemas de bio-organometálico, utilizando uma solução de ácido trifluoroacético (TFA), de água e de triisopropilo silano. A evaporação da solução de ácido e adição de éter dietílico frio produziu bio-conjugado de 1 como um determinado a ser o sal de TFA sólido vermelho-laranja de 1 tal como confirmado pela análise elementar e RMN. A pureza foi confirmada por análise de HPLC.
Para mostrar a prova de princípio para acomponente cisteína proporcionando uma corda de fixação para bio-conjugado 1, a deposição de uma em uma superfície de ouro foi explorada. A afinidade de Au-S bem conhecido permite a imobilização fácil de um polímero sobre uma superfície de ouro apoiados. Neste experimento, a superfície de ouro foi limpo e suavemente polida. A lâmina foi então mergulhado numa solução de água ~ 1 mM de 1 e deixada a repousar S / N. O Au superfície foi então lavado com água destilada e seco com um Kimwipe. As lâminas de ouro foram então avaliados para modificação utilizando SEM. As imagens mostradas na Figura 4 são representativos de uma monocamada de um ter formado sobre a superfície de ouro. As imperfeições na superfície são postulada como sendo um resultado de "buracos" na monocamada de 1 e estão sob maior exploração pelo nosso grupo.
, Os métodos de síntese geral de produzir bioconjugates ferroceno que podeser imobilizada numa superfície de ouro são relatados. O trabalho é nova na medida em que a síntese de compostos assimétricos de ferroceno é desafiada por uma série de reacções secundárias que conduzem a baixos rendimentos e pureza. Como ferroceno-bioconjugates semelhantes a 1 têm aplicações como potenciais biossensores, superar essas dificuldades sintéticos é primordial. Usando métodos de fase sólida semelhante a síntese de péptidos em fase sólida, um bioconjugado bem caracterizada 1 que contém biotina-ferroceno-cisteína foi produzido. Além disso, SEM foi usado para mostrar que o sistema é capaz de aderir a uma superfície de ouro, graças à porção tiolato do componente cisteína. Em geral, a metodologia de síntese simples aqui proporcionada pode facilmente ser modificada para as sequências de péptidos e sistemas de bio-conjugado para uma variedade de aplicações.
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Acknowledgments
KG foi apoiada pela concessão P-1760 RA Fundação Welch, TCU Andrews Instituto de Matemática e Ciências da Educação (para KG), TCU pesquisa e criatividade Atividade Grant (a KG) e TCU SERC Grant (a JHS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biotin Novatag Resin | NovaBiochem | 8550510001 | |
| TORVIQ 10 ml Luer Lock Fritted Syringe | Fisher | NC9299151 | |
| piperidine | Acros | P/3520/PB05 | |
| ninhydrin test | Sigma-Aldrich | 60017-1ea | |
| 1’-Fmoc-amino-ferrocene-1-carboxylic acid | Omm Scientific | Special Order | |
| N,N′-Diisopropylcarbodiimide | Sigma-Aldrich | D125407-5G | |
| Fmoc-Cys(Trt)-OH | Novabiochem | 8520080025 | |
| trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | T5408 | |
| 1,2-ethanedithiol | Sigma-Aldrich | 2930 | |
| triisopropyl silane | Sigma-Aldrich | 233781 | |
| Eppendorf tubes (20 ml) | any source | ||
| methanol | any source | dry with molecular sieves prior to use & store in 100 ml media bottle for easy usage | |
| dichloromethane | any source | dry with molecular sieves prior to use & store in 100 ml media bottle for easy usage | |
| dimethylformamide | any source | dry with molecular sieves prior to use & store in 100 ml media bottle for easy usage | |
| centrifuge | any source |
References
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