Abstract
Раннее обнаружение является ключом к успешному лечению большинства заболеваний, а особенно важно для диагностики и лечения многих видов рака. Наиболее распространенные методы, используемые являются визуализации формы, такие как магнитно-резонансная томография (МРТ), позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ), и компьютерной топографии (КТ) и являются оптимальными для понимания физической структуры болезни, но может быть выполнена только один раз в четыре- шесть недель в связи с использованием визуализирующих агентов и общую стоимость. Имея это в виду, развитие "точки ухода" методов, таких как биосенсоры, которые оценивают стадию заболевания и / или эффективности лечения в кабинете клинициста и сделать это своевременно, будет революционизировать протоколов лечения. 1, в качестве средство для изучения ферроцена на основе биосенсоров для обнаружения биологически соответствующих молекул 2, были разработаны методы для получения ферроцена-биотин био-конъюгаты, описанные в данном документе, Этот доклад будет посвящен биотин-ферроцена-цистеин системы, которая может быть иммобилизованным на поверхности золота.
Introduction
Биосенсоры небольшие устройства, которые используют технологию биомолекулярной признание в качестве платформы для селективного анализа и используются для их специфичности, скорости и низкой стоимости. Электрохимические биосенсоры для выявления биомолекул находятся на переднем крае этой области из-за своей простоты, эффективности затрат и высокой чувствительностью. 1,3 общая анатомия этих датчиков является электрод оснащен молекулы распознавания специфичными для биологического маркера интерес , Связывание биомаркера молекулой распознавания приводит к локальному изменению потенциала или тока, который может быть обнаружен простым измерением. На сегодняшний день фрагмент распознавания может варьироваться от ферментов, 4-8 антитела, 9-12 целых клеток, 13-16 рецепторы, 17-20 пептиды 21-23 и ДНК 24 и сосредоточена, в основном на больших, биологических молекул. 25-28 Исследования усилия в этой области были сосредоточены в основном на иммуносенсоров WHERe иммуноглобулина иммобилизуют с окислительно-восстановительным активной зоны (например, ферроцен) и используется для обнаружения антитела интереса. Эти исследования были исключены из клинических приложений из-за низкой точности, так и времени, вытекающих из осложнений, связанных с использованием антигена / антител. 1,3 Растущее внимание было сосредоточено на выявлении небольших молекул (менее 1 кг / моль) биомедицинских , продовольственной и экологической интерес в дополнение к национальной безопасности. 29 Наиболее известные примеры биосенсоров устройств самопроверки мониторы глюкозы, которые имеют трафаретной печати ферментов электроды, соединенные с карманного размера амперометрического метр. Эти системы, как правило, используют метод кулонометрического где общее количество заряда генерируется за счет реакции окислени глюкозы, измеренный в течение определенного периода времени. Рыночные устройства должны быть портативными, надежный и ручной использовать легкое для населения в целом.
Окислительно-восстановительные теги, например ферроцена являются necessaры, чтобы обеспечить электрохимическую обнаружения биомаркеров или небольших молекул в растворе, как большинство биомаркеры по своей сути не электрохимически активным. 30-38 Ферроцен является Металлоорганический молекула, которая золотым стандартом для электрохимии, что делает его отличным выбором для интеграции в электрохимических биосенсоров. Ферроцен на основе окислительно-восстановительные активные частицы уже получила значительное внимание в связи с их небольшого размера, хорошей стабильностью, удобное синтетического доступа, легко химической модификации, относительной липофильности и простоты настройки окислительно-восстановительной. 3,30-42 малых молекул на основе ферроцена керна широко используется в качестве детекторов ионов металлов и малых молекул. 32-38,43 ориентации систем крупных видов, таких как биомолекул использовали вложение больших антител или иммуноглобулинов в производные ферроцена, которые были встраиваемых на электрохимической поверхности. 1,3,39 44 В каждом случае, потенциал и ток Intensiти окислительно-восстановительной пары Fe III / II Fe была изменена на молекулярной связью, таким образом, создавая новый спектроскопический дескриптор, указывающий присутствие молекулы аналита. Это изменение возникает из-за экстенсивного перекрытия, которое происходит между пи-систему циклопентадиенильных кольца и железа й-орбиталей. Если пи-система будет изменена, то есть, дериватизированы или отреагировали, то орбитальное взаимодействие, в свою очередь, изменение. Это будет влиять на ядро Fe и может наблюдаться как сдвиг в потенциале пары Fe III / Fe II. 40,45,46 Эти свойства делают такую систему привлекательной для использования в качестве количественного агентом в электрохимического иммуноанализа или биосенсора.
Для получения ферроцена, содержащих системы, специфичные для биосенсора мощностей оптимально, чтобы изменить один Cp кольцо с био-рецептора, специфического для молекулы-мишени и использовать другую Cp кольцо в качестве молекулярного троса к электрохимической считывания или Elecрастоптал (Рисунок 1). Синтез этих асимметричных производных ферроцена оспаривается побочных реакций и формирования димерных и полимерных частиц, образующихся при межмолекулярного сшивания. 47 Тем не менее, связь химия производства амидной связи является наиболее прямой путь, чтобы обеспечить простые производные ферроцена с использованием биологических компонентов, таких как пептиды и их метаболитов. Таким образом, методы твердой фазы впервые разработаны в 1950-х годах Merrifield для пептидного синтеза могут быть применены к металлоорганических соединений, содержащих ферроцена. Благодаря использованию в ортогонально замещенного молекулы 1'-Fmoc-амино-ферроцен-1-карбоновой кислоты, системы ферроцен, который может содержать фрагмент рецептора (биотин), электрохимический считывание (ферроцен) и иммобилизации-линкер компонент (цистеин) имеет были построены и подробно описано. Синтез этого био-конъюгата обсуждены также в качестве доказательства иммобилизации на поверхности золота. Эта работа представиTS первой презентации системы, состоящей из биотин, ферроцена и аминокислоты для иммобилизации на поверхности золота.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Синтез биотин-Fc-цистеина (1)
- Твердофазные методы, чтобы произвести смолой 1.
- Поместите биотин, загруженной смолы (250 мг, 0,145 ммоль) в дном шприца, и набухание смолы путем составления диметилформамиде (5 мл) и встряхивания шприца на лабораторном шейкере в течение 20 мин. Выгнать раствор и повторите диметилформамид отек еще раз.
- Удаления защитной группы Fmoc добавлением 4-6 мл 20% пиперидина в диметилформамиде в шприц, затем на 10-15 мин встряхивания. Повторите процесс снятия защиты с другими 4-6 мл пиперидина. Промыть смолу с последовательностью 3x диметилформамид, диметилформамид 3x: метанол (1: 1), 3x метанол: дихлорметан (1: 1), 3x дихлорметан, ~ 5 мл каждый. Делают нингидриновый тест (+) на небольшой выборке (~ 10) из шариков, чтобы подтвердить успешное удаление защитных групп в присутствии голубого при нагревании.
- Смешайте раствор, содержащий 1'-Fmoc-амино-ферроцен-1-карбоновой кислоты(203,3 мг, 0,4350 ммоль), 1-гидроксибензотриазол гидрат (58,8 мг, 0,413 ммоль), диизопропилкарбодиимид (0,0673 мл, 0,435 ммоль), диизопропилэтиламин (0,0757 мл, 0,435 ммоль) и 4: 1 смеси дихлорметана и диметилформамид. Draw этом в дном шприца и аккуратно встряхнуть на лабораторном шейкере в течение 6 ч. Тогда изгнать раствора из шприца и мыть, как описано выше.
- Выполнение нингидриновый тест (-), как описано выше, чтобы подтвердить соединение. Нингидриновый тест-прежнему могут быть полезны для подтверждения связи, несмотря на оранжевый цвет борта, полученного из прикрепления железа, содержащего фрагмент.
- Затем удалить группу Fmoc добавлением 20% пиперидином в диметилформамиде и промывают, как описано выше. Нингидриновый тест (+) должен быть использован, чтобы подтвердить удаление Fmoc.
- Готовят раствор, состоящий из Fmoc-Cys (Trt) -OH (254,8 мг, 0,4350 ммоль), 1-гидроксибензотриазол гидрат (58,8 мг, 0,4125 ммоль), диизопропилкарбодиимид (0,0673 мл, 0,4350ммоль), диизопропилэтиламин (0,0757 мл, 0,4350 ммоль) и 4: 1 смеси дихлорметана и диметилформамида. Добавить эту цистеин муфтовой коктейль фриттованной шприц и встряхните в течение 6 ч. Промыть с использованием протокола, описанного ранее.
- Подтверждение связывания с использованием нингидринового теста (-), с последующим удалением компонента Fmoc с помощью 20% пиперидина и промывки. Проверка свободного амина с помощью терминала нингидриновый тест (+).
- Расщепление 1 из смолы.
- Сделать раствор TFA (9,45 мл), водой (0,25 мл), 1,2-этандитиола (0,25 мл), и триизопропил силан (0,1 мл), добавить его в шприц и встряхивают осторожно в течение 4 ч.
- Собирают полученное красно-коричневый раствор в пробирку Эппендорфа и выпаривают TFA медленно с помощью потока воздуха.
- Добавить холодного диэтилового эфира (~ 15 мл), в пробирку Эппендорфа, чтобы осадить 1, которые образуют осторожном встряхивании. Выделения продукта с помощью центрифугирования (1 г, 5 мин). Tкурица повторные циклы промывкой диэтиловым эфиром (~ 60 мл) и общее центрифуги для получения 1 в виде красного / коричневого твердого вещества.
2. Характеристика и анализ 1
- Убедитесь, что идентификатор соответствует подключение и состав, показанный на рисунке 2, с использованием 1 H (16 сканов) и 13 C ЯМР (512 сканирование), в дейтерированном метаноле (300 мкл) и анализа ESI-MS.
Ожидайте следующие результаты:
1 H ЯМР спектр (CD 3 OD) δ / м.д. 1.407-1.684 (м, 6Н), 2,245 (т, 2H), 2.665-3.150 (м, 12Н), 4,015 (т, 1H), 4,104 (д, 2H ), 4,274 (д, 1H), 4,426 (д, 2H), 4,479 (д, 1H), 4,595 (т, 1H) и 13 C-ЯМР-спектр (CD 3 OD) δ / м.д.: 24,644 (CH 2), 25,472 (СН 2), 28,051 (CH 2), 28,300 (CH 2), 35,474 (CH 2), 38,698 (CH 2), 39,241 (CH 2), 39,717 (CH 2), 55,340 / 55,538 (Ср-кольцо), 60,286 (CH), 61,964 (CH), 62,521 / 62,821 (CP-кольцо), 66,038 / 66,170 (CP-кольцо), 69,153 / 69,328 (CP-Ring), 71,468 / 71,593 (CP-кольцо), 76,466 (СН), 171,770 (С = O), 175,361 (C = O).
ESI-МС (м / з): Найдено: 639,00 [1 + Na] +, Теоретически: 639,1 [1 + Na] +, и HR-МС (м / з): Найдено: 617,2049 [1 + Н] +, теоретической: 617.1622 [1 + Н] +. - Выполнение ВЭЖХ, элементный анализ, чтобы подтвердить состав изолированной 1.
Провести ВЭЖХ-хроматограммы с использованием обращенно-фазовой С8 колонку с 100% MeOH при скорости потока 0,5 мл / мин. Примечание: время удерживания ВЭЖХ: 3.198-4.674 мин.
3. Иммобилизация 1 на поверхности золота
- Cut полимер поддержке золотые горки на квадраты ~ 0,25 в 2.
- Заполните 50-мл химический стакан с дистиллированной водой раствора 1 (~ 1 мм).
- Добавить золотую слайд в стакан и накрыть часовым стеклом. Всеой предметное стекло для инкубации O / N при комнатной температуре без перемешивания.
- Удалить золотую слайд из раствора и позволяют ему высохнуть на воздухе.
- Получить сканирующей электронной микроскопии изображений с помощью сканирующего электронного микроскопа (или эквивалент) соблюдать иммобилизованного 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Смола связаны форма 1 показана на фиг.2. Ковалентное присоединение компонента ферроцена приводит к оранжевый оттенок гранул смолы, которая является стойким при непрерывной промывки и свидетельствует о иммобилизованной железа, содержащего комплекс, в отличие от абсорбции железа путем ПЭГ компонент смолы шарик. Смолу свободной форме 1 идентичен по цвету к гранул смолы. После удаления соединения из полимерных бусинок, чистота и выход (68%) в результате методов, намного превосходит типичной методике раствор. Элементный анализ продукта показал, что один был выделен в виде соли ТФУ: вычислено (найдено) для С 26 H 36 O 6 Fen 4 S 2 4TFA: C, 38,07 (38,90); Н, 3,76 (4,20); N, 7,83 (7,70). Полученный выход (105,1 мг, 68%) в типичной реакции по результатам элементного анализа. ЯМР-анализ в дейтерированном метаноле провided 1 H ЯМР спектр (CD 3 OD) δ / м.д. 1.407-1.684 (м, 6Н), 2,245 (т, 2H), 2.665-3.150 (м, 12Н), 4,015 (т, 1H), 4,104 (д, 2Н), 4,274 (д, 1H), 4,426 (д, 2H), 4,479 (д, 1H), 4,595 (т, 1H) и 13 C-ЯМР-спектр (CD 3 OD) δ / м.д.: 24,644 (CH 2), 25,472 (CH 2), 28,051 (CH 2), 28,300 (CH 2), 35,474 (CH 2), 38,698 (CH 2), 39,241 (CH 2), 39,717 (CH 2), 55,340 / 55,538 (Ср-кольцо) , 60,286 (CH), 61,964 (CH), 62,521 / 62,821 (Ср-кольцо), 66,038 / 66,170 (Ср-кольцо), 69,153 / 69,328 (Ср-кольцо), 71,468 / 71,593 (Ср-кольцо), 76,466 (CH ), 171,770 (C = O), 175,361 (C = O). ВЭЖХ время удерживания были: 3.198-4.674 мин. Множественные пики, наблюдаемые в анализе ВЭЖХ было подтверждено, что соли трифторуксусной кислоты 1, как описано выше, с использованием элементного анализа. Масс-спектрометрия коррелирует со структурой показано на рисунке 2: ESI-МС (м / з): Найдено: 639,00 [1 + Na] +,Теоретически: 639,1 [1 + Na] +, и HR-МС (м / з): Найдено: 617,2049 [1 + Н] +, Теоретически: 617,1622 [1 + Н] +. Электронные спектры поглощения были получены в воде и показал λ макс (ε, M -1 см -1) 268 (4,779.8), 434 (324,26).
Методы, используемые для инкубации малую золотую слайд в растворе биоконъюгата 1 представлены в схематическом чертеже на фиг.3. Тонкий слой золота обратно с полимерным материалом был добавлен к раствору 1 и инкубировали O / N. Золото слайд промывали деионизированной водой и дают высохнуть. Одновременно, золота предметное стекло совместно инкубируют в деионизированной воде и промывают в том же порядке. СЭМ изображения двух образцов, показанных на фиг.4, показали, что поверхность золота скольжения совместно инкубируют с 1 был изменен. Это указывает на то, чтотиолата взаимодействия 1 обеспечить фиксацию крепления к поверхности золота.
Рисунок 1. Основы биосенсора. Конкретный пример электрохимического биосенсора непосредственно обнаружить целевой в растворе.
Рисунок 2. Синтетические способы, используемые для получения 1. методы, используемые для инкубации малую золотую слайд в растворе биоконъюгата 1 представлены в схематическом чертеже на фиг.3. Тонкий слой золота обратно с полимерным материалом был добавлен к раствору 1 и инкубировали O / N. Золото слайд промывали деионизированной водой и дают высохнуть. Одновременно, золота предметное стекло совместно инкубируют в деионизированной воде и промывают в том же порядке. СЭМ изображения двух образцов, Как показано на рисунке 4, показывают, что поверхность золота скольжения совместно инкубируют с 1 был изменен. Это означает, что тиолата взаимодействия 1 обеспечить фиксацию привязанности к золотой поверхности.
Рисунок 3. Схематическое изображение, представляющее иммобилизации 1 на с золотой горкой. Процесс включает растворение биоконъюгата в воде и добавлением золотой слайд. Инкубация O / N в последующей промывкой ползуна. Анализ дл успешного иммобилизации осуществляется с помощью сканирующей электронной микроскопии, показанного на фиг.4.
Рисунок 4. СЭМ изображения золота слоистой на пластиковой полимерной пленки. (А) инкубацию Sans 1 и (б) FOllowing инкубации с 1 в воде O / N и промывки водой.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Синтез асимметричных производных ферроцена является сложной задачей в растворе. Например, попытки произвести 1 в раствор в результате низких выходов целевого продукта (менее 20%). Кроме того, реакции, использующие 1'-амино-ферроцена карбоновой кислоты (без Fmoc) и смолой биотин в результате нерастворимый продукт в соответствии с полимеризованном продукта, сообщенные Baristic и др. и минимальный продукт. 47 Это осложняется еще и ферроцена и его производных быть чувствительны к свету, и что эти родственные аминокислоты склонны к димеризации в растворе. Эти вопросы широко реакции и workups сложной задачей. Тем не менее в этом реакционная можно обойти с помощью методов твердофазного впервые разработана Merrifield для синтеза пептидов. Синтез ферроцена-пептид систем привлекло внимание несколькими группами и привело к библиотеке асимметричных пептид-ферроцен систем. 46,48-52 работыописаны детали синтеза первой асимметричной ферроцена био-конъюгатов, содержащих биотин-ферроцен-цистеин. Это соединение служит моделью, через который другие мелкие рецепторы молекул могут быть рассмотрены для обнаружения биологически соответствующих молекул. В этой работе был использован в качестве иммобилизации троса к золотой поверхности.
Первый этап синтеза было получение иммобилизованного биотина сердечник к твердотельного смолы с использованием линкера на основе амина. -Fmoc-Этилендиамин смола п -Biotin- N 'могут быть приобретены коммерчески как биотин NovaTag Ресин и был использован в качестве основы для био-сопряженного 1. Fmoc-амино-защитную группу удаляют с помощью 20% раствора пиперидина в диметилформамиде и положительный (синий) нингидрина испытаний подтвердили успешное удаление защитных групп. Свободный амин связанного со смолой биотина затем использовали для закрепления ферроцена с использованием коктейль муфты, состоящей из диизопропилэтиламина,диизопропилкарбодиимид и 1-гидроксибензотриазол гидрат. 40,46 выбор ферроцена предшественников доступны для таких целей, и включают в себя ферроцен карбоновой кислоты и 1'-Fmoc-амино-ферроцен карбоновой кислоты. Использование бывших выходом системы однослойного замещен био-конъюгаты, имеющие только один из циклопентадиенильных колец, модифицированных биотином придаток. Последнее ферроцен производное состоит из ортогональных замещения циклопентадиенильных колец с карбоновой кислотой и Fmoc-защищенной аминогруппы. Такое замещение позволяет в течение длительного асимметричного модификации ядра ферроцена, позволяющей отдельной модификации циклопентадиенильных колец для получения био-конъюгаты, такие как 1. Светло-желтый гранулы превратились в ярко-оранжевый оттенок при успешной связи с ферроцена в сердцевине биотин-смолы, как показано на фиг.2.
На следующем этапе синтеза различные линкеры могут быть присоединеныв свободный амин из связанного со смолой ферроцена конгенера. Для целей этой системы, цистеин был использован, так как это тиолят содержащий аминокислоту. Тиолят компонент позволяет для прикрепления био-сопряженной с поверхностью золота, как описано ниже. Модификация с цистеином протекала по реакции со смолой системы с Fmoc-Cys (ММТ) -ОН. Удаление группы Fmoc с помощью 20% пиперидина в диметилформамиде дает смолой формы 1. Смолой Bio-конъюгат был удален из твердой подложке путем расщепления био-металлоорганическое систем с использованием раствора трифторуксусной кислоты (TFA), воды и триизопропил силана. Выпаривание раствора кислоты и добавлением холодного диэтилового эфира получали био-конъюгат 1 в виде твердого определено, что соль трифторуксусной кислоты красно-оранжевого 1, как подтверждено ЯМР и элементного анализа. Чистота была подтверждена анализом ВЭЖХ.
Чтобы показать доказательство принципа дляцистеин компонент обеспечивая троса крепления для био-сопряженного 1, осаждения 1 на поверхности золота была изучена. Известный Au-S сродства позволяет легкому иммобилизации 1 на полимерной поверхности золота резервное. В этом эксперименте золото поверхность была очищена и осторожно полируют. Слайд, затем погружают в ~ 1 мМ водного раствора 1 и позволило установить O / N. Поверхность Au затем промывали дистиллированной водой и сушили с Kimwipe. Золотые стекла затем оценивали на модификации помощью сканирующего электронного микроскопа. Изображения, показанные на рисунке 4 являются репрезентативными монослоя 1 образовав на поверхности золота. Недостатки в поверхности постулируется результат «дырок» в монослой 1 и при дальнейшем исследовании нашей группы.
В целом, способы синтеза для получения ферроцена биоконъюгатов, что можноиммобилизовать на поверхности золота сообщается. Работа является новым в этом синтезе асимметричных соединений ферроцена стоит задача массивом побочных реакций, ведущих к низким выходам и чистоте. Как ферроцена Биоконъюгаты похожие на 1 имеют приложения в качестве потенциальных биосенсоров, преодолевая эти синтетические трудности имеет первостепенное значение. Использование методов твердофазного пептидного сродни твердофазного синтеза, хорошо охарактеризованы Bioconjugate 1, который содержит биотин-ферроцен-цистеин был получен. Кроме того, СЭМ был использован, чтобы показать, что эта система способна прилипать к поверхности золота благодаря тиолатного фрагмента компонента цистеина. В целом, просто синтетическая методология представлено здесь можно легко модифицировать для пептидных последовательностей и био-сопряженных систем для различных областей применения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
KG была поддержана Уэлч фонда РА гранта P-1760, TCU Эндрюс Институт математики и естественно-научного образования (в кг), ГТС исследований и творчества активность Грант (в кг) и TCU SERC Грант (для JHS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biotin Novatag Resin | NovaBiochem | 8550510001 | |
| TORVIQ 10 ml Luer Lock Fritted Syringe | Fisher | NC9299151 | |
| piperidine | Acros | P/3520/PB05 | |
| ninhydrin test | Sigma-Aldrich | 60017-1ea | |
| 1’-Fmoc-amino-ferrocene-1-carboxylic acid | Omm Scientific | Special Order | |
| N,N′-Diisopropylcarbodiimide | Sigma-Aldrich | D125407-5G | |
| Fmoc-Cys(Trt)-OH | Novabiochem | 8520080025 | |
| trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | T5408 | |
| 1,2-ethanedithiol | Sigma-Aldrich | 2930 | |
| triisopropyl silane | Sigma-Aldrich | 233781 | |
| Eppendorf tubes (20 ml) | any source | ||
| methanol | any source | dry with molecular sieves prior to use & store in 100 ml media bottle for easy usage | |
| dichloromethane | any source | dry with molecular sieves prior to use & store in 100 ml media bottle for easy usage | |
| dimethylformamide | any source | dry with molecular sieves prior to use & store in 100 ml media bottle for easy usage | |
| centrifuge | any source |
References
- Wang, J. Electrochemical biosensors: towards point-of-care cancer diagnostics. Biosens Bioelectron. 21 (10), 1887-1892 (2006).
- Scarborough, J. H., Brusoski, K., Brewer, S., Green, K. N. Solid phase synthesis of ferrocene-biotin bioconjugates and reactivity with avidin. A paradigm for development of electrochemical biosensors. , Texas Christian University. Fort Worth, Texas. (2014).
- Zhang, S., Zheng, F., Wu, Z., Shen, G., Yu, R. Highly sensitive electrochemical detection of immunospecies based on combination of Fc label and PPD film/gold nanoparticle amplification. Biosens Bioelectron. 24 (1), 129-135 (2008).
- Gobi, K. V., Mizutani, F. Layer-by-layer construction of an active multilayer enzyme electrode applicable for direct amperometric determination of cholesterol. Sensors and Actuators. 80 (3), 272-277 (2001).
- Gobi, K. V., Mizutani, F. Amperometric detection of superoxide dismutase at cytochrome c-immobilized electrodes: Xanthine oxidase and ascorbate oxidase incorporated biopolymer membrane for in-vivo analysis. Analytical Sciences. 17 (1), 11-15 (2001).
- Gobi, K. V., Sato, Y., Mizutani, F. Mediatorless superoxide dismutase sensors using cytochrome c-modified electrodes: Xanthine oxidase incorporated polyion complex membrane for enhanced activity and in vivo analysis. Electroanalysis. 13 (5), 397-403 (2001).
- Shankaran, D. R., Uehara, N., Kato, T. A metal dispersed sol-gel biocomposite amperometric glucose biosensor. Biosensor.., & Bioelectronics. 18 (5-6), 721-728 (2003).
- Yamamoto, K., Xu, F., Shi, G. Y., Kato, T. On-line biosensor for detection of glucose, choline and glutamate simultaneously integrated with microseparation system. Journal of Pharmacological Sciences. 91, 211p-211 (2003).
- Luppa, P. B., Kaiser, T., Cuilleron, C. Y. Ligand-binding studies of sex hormone-binding globulin with 17alpha-dihydrotestosterone derivatives as ligands using a surface plasmon resonance biosensor. Clinical Chemistry. 47 (6), A9-A9 (2001).
- Luppa, P. B., Sokoll, L. J., Chan, D. W. Immunosensors - principles and applications to clinical chemistry. Clinica Chimica Acta. 314 (1-2), 1-26 (2001).
- Mallat, E., Barcelo, D., Barzen, C., Gauglitz, G., Abuknesha, R. Immunosensors for pesticide determination in natural waters. Trac-Trends in Analytical Chemistry. 20 (3), 124-132 (2001).
- Pemberton, R. M., Hart, J. P., Mottram, T. T. An electrochemical immunosensor for milk progesterone using a continuous flow system. Biosensor.., & Bioelectronics. 16 (9-12), 715-723 (2001).
- Pancrazio, J. J., Whelan, J. P., Borkholder, D. A., Ma, W., Stenger, D. A. Development and application of cell-based biosensors. Annals of Biomedical Engineering. 27 (6), 697-711 (1999).
- May, K. M. L., Wang, Y., Bachas, L. G., Anderson, K. W. Development of a whole-cell-based biosensor for detecting histamine as a model toxin. Analytical Chemistry. 76 (14), 4156-4161 (2004).
- Taylor, C. J., Bain, L. A., Richardson, D. J., Spiro, S., Russell, D. A. Construction of a whole-cell gene reporter for the fluorescent bioassay of nitrate. Analytical Biochemistry. 328 (1), 60-66 (2004).
- Philp, J. C., et al. Whole cell immobilised biosensors for toxicity assessment of a wastewater treatment plant treating phenolics-containing waste. Analytica Chimica Acta. 487 (1), 61-74 (2003).
- Subrahmanyam, S., Piletsky, S. A., Turner, A. P. F. Application of natural receptors in sensors and assays. Analytical Chemistry. 74 (16), 3942-3951 (2002).
- Ryberg, E., et al. Identification and characterisation of a novel splice variant of the human CB1 receptor. Febs Letters. 579 (1), 259-264 (2005).
- Cooper, M. A. Advances in membrane receptor screening and analysis. Journal of Molecular Recognition. 17 (4), 286-315 (2004).
- Kumbhat, S., et al. A novel receptor-based surface-plasmon-resonance affinity biosensor for highly sensitive and selective detection of dopamine. Chemistry Letters. 35 (6), 678-679 (1246).
- Yemini, M., Reches, M., Gazit, E., Rishpon, J. Peptide nanotube-modified electrodes for enzyme-biosensor applications. Analytical Chemistry. 77 (16), 5155-5159 (2005).
- Endo, T., Kerman, K., Nagatani, N., Takamura, Y., Tamiya, E. Label-free detection of peptide nucleic acid-DNA hybridization using localized surface plasmon resonance based optical biosensor. Analytical Chemistry. 77 (21), 6976-6984 (2005).
- Drummond, T. G., Hill, M. G., Barton, J. K. Electrochemical DNA sensors. Nature Biotechnology. 21 (10), 1192-1199 (2003).
- Piunno, P. A. E., Krull, U. J. Trends in the development of nucleic acid biosensors for medical diagnostics. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 381 (5), 1004-1011 (2005).
- Dechtrirat, D., et al. Electrochemical displacement sensor based on ferrocene boronic acid tracer and immobilized glycan for saccharide binding proteins and E. coli. Biosensor.., & Bioelectronics. 58, 1-8 (2014).
- Lacina, K., et al. Combining ferrocene, thiophene and a boronic acid: a hybrid ligand for reagentless electrochemical sensing of cis-diols. Tetrahedron Letters. 55 (21), 3235-3238 (2014).
- Takahashi, S., Anzai, J. Recent Progress in Ferrocene-Modified Thin Films and Nanoparticles for Biosensors. Materials. 6 (12), 5742-5762 (2013).
- Liu, L., et al. Amplified voltammetric detection of dopamine using ferrocene-capped gold nanoparticle/streptavidin conjugates. Biosensor.., & Bioelectronics. 41, 730-735 (2013).
- Shankaran, D. R., Gobi, K. V. A., Miura, N. Recent advancements in surface plasmon resonance immunosensors for detection of small molecules of biomedical, food and environmental interest. Sensors and Actuators B-Chemical. 121 (1), 158-177 (2007).
- Szarka, Z., Kuik, Á, Skoda-Földes, R., Kollár, L. Aminocarbonylation of 1,1′-diiodoferrocene, two-step synthesis of heterodisubstituted ferrocene derivatives via homogeneous catalytic carbonylation/coupling reactions. Journal of Organometallic Chemistry. 689 (17), 2770-2775 (2004).
- Niu, H. T., et al. Imidazolium-based macrocycles as multisignaling chemosensors for anions. Dalton Trans. (28), 3694-3700 (2008).
- Qing, G. -Y., Sun, T. -L., Wang, F., He, Y. -B., Yang, X. Chromogenic Chemosensors forN-Acetylaspartate Based on Chiral Ferrocene-Bearing Thiourea Derivatives. European Journal of Organic Chemistry. (6), 841-849 (2009).
- Romero, T., Caballero, A., Espinosa, A., Tarraga, A., Molina, P. A multiresponsive two-arm ferrocene-based chemosensor molecule for selective detection of mercury. Dalton Trans. (12), 2121-2129 (2009).
- Zapata, F., Caballero, A., Espinosa, A., Tarraga, A., Molina, P. A selective redox and chromogenic probe for Hg(II) in aqueous environment based on a ferrocene-azaquinoxaline dyad. Inorg Chem. 48 (24), 11566-11575 (2009).
- Alfonso, M., Tarraga, A., Molina, P. Ferrocene-based multichannel molecular chemosensors with high selectivity and sensitivity for Pb(II) and Hg(II) metal cations. Dalton Trans. 39 (37), 8637-8645 (2010).
- Zapata, F., Caballero, A., Molina, P., Tarraga, A. A ferrocene-quinoxaline derivative as a highly selective probe for colorimetric and redox sensing of toxic mercury(II) cations. Sensors (Basel). 10 (12), 11311-11321 (2010).
- Thakur, A., Sardar, S., Ghosh, S. A highly selective redox, chromogenic, and fluorescent chemosensor for Hg2+ in aqueous solution based on ferrocene-glycine bioconjugates). Inorg Chem. 50 (15), 7066-7073 (2011).
- Sathyaraj, G., Muthamilselvan, D., Kiruthika, M., Weyhermüller, T., Nair, B. U. Ferrocene conjugated imidazolephenols as multichannel ditopic chemosensor for biologically active cations and anions. Journal of Organometallic Chemistry. 716, 150-158 (2012).
- Kwon, S. J., Kim, E., Yang, H., Kwak, J. An electrochemical immunosensor using ferrocenyl-tethered dendrimer. Analyst. 131 (3), 402-406 (2006).
- Pinto, A., Hoffmanns, U., Ott, M., Fricker, G., Metzler-Nolte, N. Modification with Organometallic Compounds Improves Crossing of the Blood-Brain Barrier of [Leu(5)]-Enkephalin Derivatives in an In Vitro Model System. Chembiochem. 10 (11), 1852-1860 (2009).
- Barisic, L., et al. The first ferrocene analogues of muramyldipeptide. Carbohydr Res. 346 (5), 678-684 (2011).
- Brusoski, K., Green, K. N. Novel click derivatives of ferrocene and their applications toward construction of electrochemical biosensors. Abstracts of Papers, 243rd ACS National Meetin.., & Exposition. 2012 Mar 25-29, San Diego, CA, United States, , BIOL-28. (2012).
- Bucher, C., Devillers, C. H., Moutet, J. -C., Royal, G., Saint-Aman, E. Anion recognition and redox sensing by a metalloporphyrin–ferrocene–alkylammonium conjugate. New Journal of Chemistry. 28, 1584-1589 (2004).
- Tanaka, S., Yoshida, K., Kuramitz, H., Sugawara, K., Nakamura, H. Electrochemical detection of biotin using an interaction between avidin and biotin labeled with ferrocene at a perfluorosulfonated ionomer modified electrode. Analytical Sciences. 15 (9), 863-866 (1999).
- Real-Fernandez, F., et al. Ferrocenyl glycopeptides as electrochemical probes to detect autoantibodies in multiple sclerosis patients' sera. Biopolymers. 90 (4), 488-495 (2008).
- Husken, N., Gasser, G., Koster, S. D., Metzler-Nolte, N. Four-potential' ferrocene labeling of PNA oligomers via click chemistry. Bioconjug Chem. 20 (8), 1578-1586 (2009).
- Barisic, L. Croatica Chemica Acta. 75, 199-210 (2002).
- Kirin, S. I., Noor, F., Metzler-Nolte, N. Manual Solid-Phase Peptide Synthesis of Metallocene–Peptide Bioconjugates. Journal of Chemical Education. 84 (1), 108-111 (2007).
- Barisic, L., et al. Helically chiral ferrocene peptides containing 1 '-aminoferrocene-1-carboxylic acid subunits as turn inducers. Chemistry-a European Journal. 12 (19), 4965-4980 (2006).
- Mahmoud, K., Long, Y. -T., Schatte, G., Kraatz, H. -B. Electronic communication through the ureylene bridge: spectroscopy, structure and electrochemistry of dimethyl 1′,1′-ureylenedi(1-ferrocenecarboxylate). Journal of Organometallic Chemistry. 689 (13), 2250-2255 (2004).
- Mahmoud, K. A., Kraatz, H. B. Synthesis and electrochemical investigation of oligomeric ferrocene amides: Towards ferrocene polyamides. Journal of Inorganic and Organometallic Polymers and Materials. 16 (3), 201-210 (2006).
- Mahmoud, K. A., Kraatz, H. B. A bioorganometallic approach for the electrochemical detection of proteins: A study on the interaction of ferrocene-peptide conjugates with papain in solution and on au surfaces. Chemistry-a European Journal. 13 (20), 5885-5895 (2007).
