Introduction
Au cours des dernières années, notre compréhension des neurones et la fonction de circuit neuronal ont été révolutionné par plusieurs outils optogénétiques qui contrôlent l'excitabilité neuronale. Un tel outil est le canal de cations activé par la lumière, channelrhodopsin-2 (ChR2): neurones exprimant CHR2 potentiels d'action de feu en réponse à une stimulation lumineuse 1-3. Parce que les neurones ne sont pas habituellement sensible à la lumière, cette capacité remarquable ouvre de nouvelles voies pour le contrôle précis temporelle et spatiale de l'activité de populations génétiquement définies de neurones 4 et a des études de la fonction cérébrale grandement accéléré. ChR2 a été appliqué à les cellules souches à des fins différentes, de surveiller le développement neuronal 5 à réglementer l'activité des réseaux de neurones 6.
Ici, nous avons utilisé CHR2 pour augmenter l'utilité d'un système de co-culture neuronale. Systèmes de co-culture permettent l'évaluation des interactions entre les différents types de cellules.Co-cultures de neurones et cellules gliales, les principaux types de système nerveux cellulaires, sont couramment utilisées pour étudier la signalisation entre ces différents types de cellules, ainsi que d'évaluer l'importance de cette signalisation pour les réactions physiologiques, la propagation des dommages et d'examiner la mécanismes moléculaires qui sont potentiellement impliqués dans cette signalisation 7. Une étude antérieure a montré que iPSCs humains se différencient en neurones très rapidement en présence de culture contenant les neurones corticaux primaires de rat, les astrocytes, les oligodendrocytes, la microglie et 8.
Dans ce protocole, nous démontrons une méthode qui utilise CHR2 dans un système de co-culture pour interroger des connexions synaptiques entre les neurones corticaux de rat et les neurones dérivés de cellules souches pluripotentes humaines induites (CISP). Nous décrivons les étapes pour disséquer et les tissus du cerveau de récolte 9 ainsi que de maintenir et de différencier les cellules progénitrices neurales de souris (PNJ) dans les astrocytes et les PNJ humains Into neurones pour créer le système de co-culture. Pour établir ce système de co-culture, nous avons utilisé la méthode de reprogrammation sans intégration décrit par Okita et al. 10 à générer des CSPi humaines. Ces CSPi ont ensuite été efficacement différenciées en PNJ dans des conditions définies chimiquement en utilisant des inhibiteurs de petites molécules comme décrit par Li et al. 11
Dans les co-cultures, les différentes populations de neurones peuvent être identifiés par l'intermédiaire de détection de l'expression ChR2 dans les neurones corticaux et le marquage des neurones iPSC dérivés via la protéine fluorescente, tandem dimère tomate (tdTomato). Combinant des enregistrements électrophysiologiques des neurones iPSC dérivés avec photostimulation optogenetic des neurones corticaux évaluation de la capacité de ces deux types de neurones pour former des circuits avec l'autre permet. Plus précisément, photostimulation de ChR2 exprimant neurones corticaux évoquer les réponses synaptiques dans les neurones iPSC dérivés qui se sont formés des circuits synaptiquesavec le réseau de neurones corticaux photostimulée. Nous démontrons que l'augmentation des courants postsynaptiques sont en effet détectés dans les neurones iPSC dérivés dans de telles conditions. Ce protocole permet l'évaluation du circuit synaptique sous une variété de conditions expérimentales, y compris récapitulation des différents modèles de maladies neurologiques en utilisant CSPi dérivés à partir de fibroblastes de patients atteints de maladies.
Protocol
REMARQUE: Toutes les expériences sont réalisées protocoles approuvés par le soin et l'utilisation des animaux au Comité institutionnel SingHealth suivantes.
1. Brains récolte postnatale précoce souris
- Avant de dissection, de préparer la solution de digestion de tissu hippocampique: 10 ul de la papaïne par solution saline équilibrée de 1 ml 1x Earle (EBSS) (+ 1% de HEPES) avec la désoxyribonucléase I (DNase I) (250 U / ml) et de dispase II (1 U / ml). Ajouter environ 2,5 ml de la solution de digestion de tissu et un filtrage à l'aide d'une unité de filtre de 0,20 um. Conserver la solution chaude à 37 ° C jusqu'à utilisation.
- Anesthésier les postnatales jour 5 (P5) bébés souris en les mettant dans la glace pendant 5 min. Retirer de la glace et de test pour réflexe de la douleur via orteil ou pincement de la queue. Vaporiser les chiots avec 70% d'éthanol. Décapiter les chiots et placer les têtes dans une boîte de Pétri sur de la glace.
- Faire une incision dans la peau le long de la ligne médiane à partir de la base du crâne pour le nez, d'une paire de petits Ciseauxrs ou pince fine de dissection. Peel ouvrir la peau et faire une incision similaires à travers le crâne. Faites deux coupes horizontales supplémentaires de chaque côté du crâne, une rostrales (au bregma) et une caudale (au lambda).
- Peel ouvrir le crâne le long des lignes incisées pour exposer le cerveau sous-jacent. Utilisez une pince pour enlever le crâne recouvrant les bulbes olfactifs, et un os de la ligne médiane entre eux. Pour ce faire, tout en maintenant la tête stable avec une paire de pinces à la main non-dissection.
- Facilité la partie plate d'une spatule entre la partie ventrale du cerveau et de la base du crâne à l'extrémité caudale. Garder la spatule parallèle à la base du crâne sous le cerveau, le déplacer vers l'extrémité rostrale du crâne de rompre toutes les adhérences entre le cerveau et la base du crâne.
- Scoop le cerveau avec la spatule et le placer dans une boîte de Pétri contenant de la glace-froid 1x EBSS (+ 1% HEPES). Gardez tissus submergées en tout temps.
- Pour tousétapes de microdissection, le travail sous un microscope de dissection et d'utiliser une paire de pince fine de dissection dans chaque main, un pour couper le tissu, et l'autre pour maintenir le tissu stable.
- Faites une entaille juste en arrière vers le cortex cérébral de la séparer de le cerveau postérieur. Coupez le long de la ligne médiane pour séparer le cortex cérébral dans ses deux hémisphères. Retirez les méninges des hémisphères cérébraux.
- Placez un hémisphère côté médial et insérer la pince dans le ventricule latéral sous l'hippocampe. Coupez le mésencéphale.
- Faire des coupes au niveau des extrémités supérieure et inférieure de l'hippocampe, et à proximité du dentate / cortex entorhinal jonction pour isoler l'hippocampe du cortex. Recueillir l'hippocampe dans un plat contenant de la glace-froid 1x EBSS (+ 1% HEPES).
2. hippocampe dissociation tissulaire
- Transférer la hippocampes dans un plat contenant la solution de digestion de tissu hippocampique préchauffé. Mince til hippocampe tissus de la plus fine possible et incuber pendant 30 min à 37 ° C.
- Dissocier doucement tissus dans des cellules individuelles par des cellules de pipetage et de transfert mécaniques dans un tube de 15 ml centrifugeuse.
- Centrifuger à 200 g pendant 5 min et éliminer le surnageant.
- Resuspendre le culot cellulaire dans 20 ml égal à 0,5 fois la solution saline équilibrée de Hank (HBSS) contenant du saccharose (0,9 M) et centrifuger à 200 g pendant 10 min.
- Retirer le surnageant et remettre en suspension le culot dans la cellule 2 ml de milieu d'entretien NPC (tableau 1), placé au-dessus de 10 ml de 4% de sérumalbumine bovine (BSA) dans une solution EBSS 1X et centrifuger à 200 g pendant 5 min.
- Retirer le surnageant et ajouter un milieu d'entretien de NPC de souris (tableau 1) au culot cellulaire. Pipette doucement monter et descendre 5-10 fois pour assurer culot cellulaire est divisé en cellules individuelles.
- Transférer les cellules contenant moyennes dans des plaques de Matrigel pré-enduits et ajouter le facteur de croissance épidermique (EGF) et fibroblae le facteur de croissance 2 (FGF2) (tous deux 20 ng / ml) dans de l'héparine (5 mg / ml). Incuber les plaques à 37 ° C et 5% de CO 2.
3. Maintien des adhérentes souris hippocampe PNJ
- Préparer les plaques revêtues / flacons au moins une heure avant PNJ hippocampe passages de souris. Ajouter suffisamment Matrigel pour couvrir la surface de chaque plaque ou flacon et incuber à température ambiante pendant 1 h.
- Retirez le support de 90% des cultures de NPC confluence de souris et laver une fois avec 1x tampon phosphate salin (PBS), puis aspirer hors PBS.
- Ajouter suffisamment de solution de détachement cellulaire pour couvrir tous les puits / flacons et incuber pendant 5 min à 37 ° C.
- Veiller à ce que toutes les cellules ont détaché en regardant sous un champ microscope optique inversé au grossissement 10X. Se il ya encore des cellules fixées, incuber récipient de culture pour une nouvelle 1-2 min et vérifier à nouveau les cellules. Ajouter deux fois la quantité de modification F-12 Eagle éléments nutritifs Mélange moyen / Ham de Dulbecco (DMEM / F-12)que celle de la solution de détachement cellulaire dans les puits / une fois toutes les cellules des flacons ont détaché.
- Transfert du DMEM / F-12 contenant les cellules dans un tube de centrifugation et centrifuger 15 ml à 200 xg pendant 5 min.
- Retirer le surnageant et culot de cellules de remettre en suspension dans 5 ml de milieu d'entretien de NPC de souris (tableau 1). Pipette doucement monter et descendre pour briser culot cellulaire en cellules individuelles.
- Plate tiers du nombre total de cellules en culture de nouveaux puits / flacons et l'appoint de milieu de culture suffisante complétées avec de l'EGF et FGF2. Incuber des récipients de culture à 37 ° C et 5% de CO 2. Reconstituer moyenne tous les deux jours et diviser des cellules 1: 3 tous les 3 à 4 jours. Éviter la prolifération des cultures de l'APN de la souris pour empêcher l'agrégation et le détachement.
4. Différenciation des souris PNJ en astrocytes
- Préparer poly-L-lysine (PLL) / laminine enduit 12 mm couverture verres au moins un jour à l'avance avant de lancer la différenciation des PNJ de souris en astrocytes. Ajouter coverslips dans une plaque à 24 puits et couvre toute la surface du puits avec suffisamment PLL (1 mg / ml dans du tampon borate).
- Incuber la plaque pendant une nuit à 4 ° C. Le lendemain, retirez PLL et laver une fois avec PBS 1x.
- Ajouter laminine (1 mg / ml dans de la glace froide DMEM / F-12), couvrant à nouveau l'ensemble de la surface de chaque puits, puis incuber pendant au moins 4 heures à 37 ° C.
- Retirez le support à partir de cultures de NPC de souris et laver une fois avec 1x PBS, puis aspirer hors PBS.
- Ajouter suffisamment de solution de détachement cellulaire pour couvrir tous les puits / flacons et incuber pendant 5 min à 37 ° C.
- Veiller à ce que toutes les cellules ont détaché puis ajoutez deux fois la quantité de DMEM / F-12 comme celle de la solution de détachement cellulaire aux puits / flacons.
- Transfert du DMEM / F-12 contenant les cellules dans un tube de centrifugation et centrifuger 15 ml à 200 xg pendant 5 min.
- Éliminer les cellules du surnageant et remettre en suspension dans 5 ml de milieu de différenciation des astrocytes (tableau 1). Doucement suspensio cellulaire de pipetten haut et bas pour briser culot cellulaire en cellules individuelles. Comptez le nombre de cellules individuelles avec un hémocytomètre.
- des cellules de germes à 5 x 10 4 cellules / cm 2 dans 500 ul de milieu de chaque puits d'une plaque à 24 puits. Incuber les plaques à 37 ° C et 5% de CO 2. Remplacer la moitié du milieu par du milieu frais tous les deux jours. Souris PNJ différencier rapidement dans les astrocytes dans les 2 jours et sont différenciés pour une semaine avant de commencer de nouvelles expériences.
5. Brains récolte embryonnaire Rat et de dissociation de tissu cortical
- Retirer milieu de différenciation des astrocytes (tableau 1) à partir de cultures d'astrocytes et de remplacer par du milieu primaire de neurones (tableau 1) au moins 4 h avant le début de la récolte de cerveaux de rats embryonnaires.
- Avant de dissection, de préparer la solution de digestion de tissu cortical: 10 ul papaïne par 1 ml 1x EBSS (+ 1% de HEPES) à 12,1 mg / ml de L-cystéine. Faire environ 20,5 ml de la solution de digestion de tissu et un filtrage à l'aide d'une unité de filtre de 0,20 um. Conserver la solution chaude à 37 ° C jusqu'à utilisation.
- Euthanasier le barrage enceinte par asphyxie au dioxyde de carbone à l'aide de gaz comprimé. Test de réflexe de la douleur via orteil ou pincement de la queue.
- Poser le côté ventral animaux sur un tampon absorbant et laisser tremper sa zone abdominale avec 70% d'éthanol. Pincer la peau avec une paire de pinces et de faire une incision latérale d'une paire de ciseaux chirurgicaux, suffisamment large pour exposer l'abdomen. Saisissez le péritoine avec les pinces et couper ouvrir la cavité abdominale.
- Soulevez la corne utérine avec les pinces et couper gratuitement le long de la mésomètre. Placez l'utérus disséqué dans une boîte de Pétri sur de la glace. Séparer chaque embryon en coupant le tissu utérin entre eux.
- Faire une incision dans le sac embryonnaire. Shell doucement le fœtus à travers l'ouverture. Décapiter le fœtus et placer la tête dans une boîte de Pétri sur de la glace.
- Pour récolter embryoncerveaux de rats ic, suivent la description des étapes 1.3 à 1.5.
- Afin de disséquer les tissus corticaux, placez côté latéral jusqu'à un cerveau. Couper l'hémisphère en deux latéralement à partir du milieu. Jeter la moitié proche de la base du cerveau. Coupez le tissu excisé pour enlever le mésencéphale.
- Transférer les tissus corticaux dans un plat contenant la solution de digestion de tissu cortical préchauffé. Émincer les tissus corticaux à la plus fine possible et incuber pendant 30 min à 37 ° C.
- Transférer les tissus corticaux de la solution de digestion du tissu dans un tube de centrifugation de 50 ml contenant 10 ml de milieu neuronal primaire préchauffé (tableau 1). Dissocier les tissus corticaux en les pipetant plusieurs fois de haut en bas dans une pipette sérologique, jusqu'à ce qu'une solution homogène sans morceaux de tissu est obtenu.
- Faire passer la solution de tissu à travers un tamis cellulaire de 70 um pour filtrer les touffes restantes de tissus. Aliquoter la solution de tissu dans 15 mltubes de centrifugation, en ajoutant environ 3 ml dans chaque tube.
- Ajouter 800 ul de 7,5% de BSA dans du PBS 1x au fond de chaque tube, formant deux couches avec la solution de tissu sur le dessus et au fond de BSA.
- Centrifuger à 200 g pendant 5 min. Eliminer le surnageant, aspirant de l'interface des deux couches. Ne pas perturber le culot cellulaire au fond du tube.
- Remettre en suspension chaque culot cellulaire dans 1 ml de milieu neuronal primaire (tableau 1) et de les combiner dans un tube de 15 ml de la centrifugeuse. Déterminer la densité cellulaire en utilisant un hémocytomètre.
6. électroporation et Placage des primaires neurones corticaux
NOTE: Le transfert de gènes peut être réalisée en utilisant plusieurs procédés, y compris l'électroporation, la transfection au phosphate de calcium et la transduction virale. Dans ce protocole, nous décrivons l'électroporation pour délivrer CHR2 construction dans les neurones corticaux primaires.
- Centrifugeuse 6 x 10 6 neurones corticaux de rat unT 200 g pendant 5 min et éliminer le surnageant. Au moins 6 x 10 6 neurones corticaux sont nécessaires pour l'électroporation d'assurer la formation d'un réseau neuronal par les neurones survivants.
- Ajouter 100 ul de solution d'électroporation à culot cellulaire et remettre en suspension doucement. Mélanger 100 ul de la suspension cellulaire avec 6 pg de pLenti-Synapsin-hChR2 (H134R) -EYFP-WPRE 4 plasmide et transférer dans une cuvette certifié. Éviter de produire des bulles d'air pendant le transfert.
- Choisir et appliquer programme approprié pour l'électroporation selon les instructions du fabricant.
- Après électroporation, ajouter 500 pi de MEM à la cellule / ADN suspension à la cuvette. Transférer l'échantillon dans 11,5 ml de milieu neuronal primaire (tableau 1) et remettre en suspension doucement. Le montant total des médias est suffisant pour une plaque de 24 puits entier. Aliquoter 500 pi de milieu pour chaque puits d'une plaque de 24 puits. Incuber la plaque à 37 ° C et 5% de CO 2. 7. Génération de l'induite cellules souches pluripotentes
- Des fibroblastes humains de culture dans du DMEM supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS) dans des plaques à 6 puits.
- Avant de commencer la reprogrammation des fibroblastes, manteau 6 puits avec du Matrigel et incuber pendant au moins une heure à température ambiante. À 80% de confluence, retirer les supports des cultures de fibroblastes et laver une fois avec PBS 1x.
- Ajouter une quantité suffisante de trypsine-EDTA 0,25% à couvrir toute la plaque et incuber à 37 ° C pendant 10 min.
- Une fois que les cellules ont délogé de puits, ajouter deux fois la quantité de DMEM avec 10% de FBS comme celle de la trypsine pour étancher digestion par la trypsine. Délicatement la pipette suspension cellulaire de haut en bas pour briser les cellules. Comptez le nombre de cellules individuelles avec un hémocytomètre.
- Transfert 7 x 10 5 cellules dans un tube de centrifugeuse de 15 ml et on centrifuge la suspension de cellules à 200 xg pendant 5min.
- Retirer le surnageant et remettre en suspension culot cellulaire dans une solution d'électroporation. Électroporer les fibroblastes selon les instructions du fabricant. Resuspendre les cellules dans 100 ul de tampon d'électroporation et ajouter 1 ug de chaque vecteur épisomique. Électroporer cellules avec des paramètres de 1650 V, 10 ms et trois impulsions de temps.
- Transfert suspension cellulaire dans du DMEM supplémenté avec 10% de FBS et de la plaque 5 x 10 4 cellules par puits d'une plaque à 6 puits. Incuber les plaques à 37 ° C et 5% de CO 2.
- Après 48 heures, retirer les supports des cultures de fibroblastes transfectées et le remplacer par un milieu mTeSR. Remplacer les milieux de culture tous les jours jusqu'à cellules souches pluripotentes induites (iPSC) colonies sont prêts à être isolé. colonies iPSC peuvent être observés après 28 à 35 jours.
- Lorsque vous êtes prêt pour l'isolement, couper mécaniquement une colonie iPSC et réensemencer en milieu mTeSR avec 10 uM Rho-kinase associée de protéines (ROCK) inhibiteur (Y-27632) sur revêtu une plaque à 6 puits Matrigel 12. Remplacer milieu de culture quotidienne.
- Lorsque les cultures iPSC sont environ 20% de confluence, éliminer le milieu mTeSR et le remplacer par un milieu d'induction neurale (tableau 1). Reconstituer moyenne tous les deux jours.
- Après sept jours, éliminer le milieu de l'induction neurale et le remplacer par un milieu d'entretien PNJ humaine (tableau 1). Reconstituer moyenne tous les deux jours jusqu'à 7 jours avant repiquage cultures.
- Avant de repiquage des cultures, des plaques de manteau / flacons avec Matrigel à la température ambiante pendant au moins une heure.
- Retirez tout support de cultures confluentes NPC humains et laver une fois avec 1x PBS, puis aspirer hors PBS.
- Ajouter suffisamment de solution de détachement cellulaire pour couvrir tous les puits, puis incuber pendant 5 min à 37 ° C.
- Veiller à ce que toutes les cellules ont détaché. Ajouter deux fois la quantité de DMEM /F-12 que celui de la solution de détachement cellulaire aux puits / flacons.
- Transfert du DMEM / F-12 contenant les cellules dans un tube de centrifugation et centrifuger 15 ml à 200 xg pendant 5 min.
- Éliminer les cellules surnageant et remettre en suspension dans 5 ml de milieu humaine PNJ de maintenance (tableau 1). Délicatement la pipette suspension cellulaire de haut en bas pour briser les cellules.
- Plate tiers du nombre total de cellules en culture revêtues Matrigel puits / flacons et l'appoint de taille suffisante complété avec 10 uM Y-27632. Incuber des récipients de culture à 37 ° C et 5% de CO 2.
- cultures Split 1: 3 tous les 3 à 4 jours et reconstituer moyenne tous les deux jours. Maintenir cultures NPC humaines à haute densité pour empêcher la différenciation.
- Ajouter le vecteur lentiviral Synapsin1-tdTomato à la culture humaine PNJ avant de lancer la différenciation en neurones. Préparer astrocytes / neurones corticaux co-culturesune journée à l'avance avant de différenciation PNJ humains.
- Laver cultures NPC humains une fois avec PBS 1x et ajouter suffisamment de solution de détachement cellulaire pour couvrir tous les puits / flacons puis incuber pendant 5 min à 37 ° C.
- Veiller à ce que toutes les cellules ont détaché. Ajouter deux fois la quantité de DMEM / F-12 que celui de la solution de détachement cellulaire aux puits / flacons. Transférer dans un tube de centrifugeuse de 15 ml. Centrifuger à 200 g pendant 5 min.
- Éliminer les cellules du surnageant et remettre en suspension dans 5 ml de milieu de différenciation neuronale (tableau 1). Délicatement la pipette suspension cellulaire de haut en bas pour briser culot cellulaire en cellules individuelles. Comptez le nombre de cellules individuelles avec un hémocytomètre.
- Aspirer soigneusement milieu à partir des cultures de neurones corticaux d'astrocytes /. Plate PNJ humains à 5 x 10 3 cellules / cm 2 à 500 pi de milieu de différenciation neuronale (tableau 1) complété avec 10 uM Y-27632 pour chaque 24 puits. Ajouter délicatement milieu contenant PNJ humains dans chaque puitspour éviter de perturber les astrocytes et les neurones corticaux.
- Incuber les plaques à 37 ° C et 5% de CO 2. Remplacer la moitié du milieu par du milieu frais tous les deux à trois jours pendant au moins 28 jours.
- Vérifiez si CSPi humaines se comportent comme des neurones matures.
- Trouver cellules différenciées de CSPi humaines par la visualisation de tdTomato utilisant un microscope confocal verticale équipé d'un 60X (0,9 NA) de lentille à immersion de l'eau.
- Tirer pipette d'enregistrement à une résistance de 4 à 6 cellules M. perfuser à température ambiante dans une solution externe (tableau 1) barboter continuellement avec 95% O 2/5% CO 2. Remplir la micropipette avec une solution d'enregistrement interne (tableau 1).
- Cellulaire Patch tdTomato + en mode cellule entière et l'action d'enregistrement tir potentiel en réponse à l'injection de courant (une durée de 10 secondes, par incréments PA) dans curlouer pince.
- Confirmez si le potentiel des cellules corticales exprimant ChR2 d'action est fiable évoquée par la stimulation lumineuse.
- Trouver cellules corticales exprimant ChR2 par visualisation de la GFP sous un microscope confocal. Effectuer cellule entière enregistrement patch clamp sur des cellules corticales en suivant les étapes 10.1.2 à 10.1.3.
- Vérifiez potentiel d'action est fiable évoquée par éclairage en lumière avec une lampe à arc au mercure (100 W). La longueur d'onde de filtre d'excitation 480/40 nm est.
- Effectuer une stimulation optogenetic.
- Patch tdTomato + cellulaire en mode cellule entière et mettre pince de tension à -70mV. Filtrer les signaux actuels à 2 kHz et de numériser à 10 kHz. Surveiller les résistances en série allant de 10 à 20 m de cohérence pendant les enregistrements.
- Stimuler champ entier de 100 W filtre lampe au mercure à 480/40 nm d'excitation pendant 30 sec.
- Courants postsynaptiques enregistrement (PSC) de la cellule patchée induite par photostimulation de ChR2 exprimant cor présynaptiqueneurones tiques. Détecter et mesurer les CSP. Définir seuil de l'amplitude et de la zone de courants à 5 Pa et 20 pc respectivement. Inspecter manuellement ces événements pour annuler les traces non-CFP.
NOTE:. Cette méthode a été adaptée à partir Okita et al 10
8. Neural induction et le maintien des droits de PNJ
NOTE:. Cette méthode a été décrite par Li et al 11
9. Différenciation des PNJ humaines en neurones dans Co-cultures
10. électrophysiologiques enregistrements de neurones iPSC dérivés
Representative Results
Ici, un protocole décrivant les multiples étapes de génération d'une co-culture consistant en les astrocytes, des neurones corticaux humains et des neurones est illustré. CSPi humaines ont été obtenues par la reprogrammation des fibroblastes en utilisant épisomique des vecteurs 10 et précisées dans une lignée de neurones avec un cocktail d'inhibiteurs de petites molécules, faisant 11 PNJ qui ont été maintenues à haute densité (figure 1A). Plusieurs étapes sont nécessaires pour générer la co-culture: la différenciation des PNJ de souris en astrocytes, le placage de neurones corticaux de rat exprimant ChR2, et l'ensemencement de PNJ humains marqués avec tdTomato (figure 1B). Au jour 2 de la différenciation, la protéine acide fibrillaire gliale (GFAP) + astrocytes peuvent être facilement observés dans les cultures (figure 1C). Souris PNJ ont été autorisés à différencier pendant au moins une semaine avant l'étalement des neurones corticaux exprimant ChR2 sur l'astrocyte monocouche (figure 1D). Après 34 semaines de différenciation PNJ humain, les neurones tdTomato + ont été détectés dans les cultures (Figure 1E).
Ce système de co-culture permet une détection cohérente des courants post-synaptiques de neurones iPSC dérivés individuels en réponse à une stimulation lumineuse (figure 2A). Quand ils sont stimulés par la lumière, des potentiels d'action ont été générées dans les neurones corticaux exprimant CHR2 (figure 2B). iPSC dérivés neurones sont également excitables (figure 2C), montrant une action accrue tir potentiel que l'amplitude des impulsions de courant de dépolarisation a été augmenté (figure 2D). Ainsi, ces cellules présentent des propriétés de neurones matures. En l'absence de lumière, les neurones iPSC dérivés reçu entrées synaptiques spontanés (figure 2E). Ces courants intérieure post-synaptiques ont été principalement médiées par des récepteurs AMPA, parce courants à travers les récepteurs GABA serait vers l'extérieur et récepteurs NMDA ne portent pas un courantt le potentiel de maintien de -70 mV. Au moins certains de ces entrées étaient de neurones corticaux présynaptiques exprimant ChR2, parce que la stimulation de lumière considérablement augmenté la fréquence des courants postsynaptiques (figure 2E). Le cours de temps de cette augmentation de l'apport synaptique est illustré à la figure 2F: photostimulation des neurones corticaux a été soutenue tout au long du 30 sec à long flash de lumière. Bien que la fréquence des CSP a été élevé lors ChR2 exprimant neurones corticaux ont été photostimulée (figure 2G), leur amplitude n'a pas été affectée (figure 2H). En résumé, ces résultats indiquent que les neurones COPSi dérivés présentaient des propriétés de neurones matures et pourraient former des connexions synaptiques avec les neurones corticaux présynaptiques.
Figure 1: Représentation schématique pour la production de co-culturesystème. (A) Timeline pour reprogrammer des fibroblastes humains en CSPi et l'induction neurale aux PNJ. (B) Échéancier de différenciation terminale des PNJ humaines en neurones matures sur neurones et astrocytes cultures corticales. (C) Souris PNJ différencier rapidement dans GFAP + astrocytes après deux jours in vitro. (D) Après une semaine, les neurones corticaux exprimant ChR2 ont été étalées sur GFAP + astrocytes. (E) À 4-5 semaines après la différenciation des PNJ humains, les enregistrements électrophysiologiques ont été réalisées sur tdTomato + neurones. Barres d'échelle représentent 100 um.
Figure 2: Analyse optogénétiques de la connectivité synaptique fonctionnelle. (A) iPSC-cellules dérivées marqués avec tdTomato (rouge) ont été co-cultivées avec des neurones corticaux exprimant le activé par la lumièrecanal, ChR2 (vert). Enregistrements de neurones iPSC dérivés révélé (CFP) réponses actuelles post-synaptiques, qui pourrait provenir soit les neurones corticaux ou d'autres neurones iPSC dérivés. (B) Illumination (barre bleue) a évoqué une série de potentiels d'action dans les neurones corticaux exprimant ChR2. ( cellules C) iPSC dérivés sont évoqués par injection de courant. (D) vs tir courbe de courant de cellules iPSC dérivés. (E) Photostimulation des neurones corticaux ChR2 exprimant (barre bleue) a augmenté la fréquence des guichets uniques dans les neurones iPSC dérivés . bien sûr (F) Temps de l'augmentation de la fréquence produite par photostimulation CFP. Bleu barre indique moment de photostimulation. (G, H) Bien que la fréquence de la CFP a été augmenté de photostimulation (G), l'amplitude de la CFP n'a pas été affectée (H). * Indique p <0,05 par rapport à contrôler avec le t-test de Student.
Discussion
Optogenetics fournit la précision temporelle et spatiale pour l'activation de populations définies de neurones 13. Dans nos expériences, la totalité du champ de l'objectif du microscope a été illuminée pendant 30 sec à seulement neurones corticaux photo-stimuler exprimant CHR2. Cela nous a permis de déterminer si les connexions synaptiques ont été formés entre les différentes populations de neurones dans le co-culture. Nos résultats ont révélé que la photostimulation augmente la fréquence de la CFP dans les neurones iPSC dérivés, ce qui démontre que ces neurones reçoivent entrée synaptique de neurones corticaux présynaptiques exprimant ChR2. Ceci, à son tour, a établi que les neurones iPSC dérivés intégrés avec succès dans des circuits avec les neurones corticaux.
Il ya plusieurs étapes critiques pour la génération de ce système de co-culture. Il est important de se assurer que les cultures d'astrocytes souris NPC dérivées sont en bonne santé, à la mort cellulaire minimal, avant de procéder à placaged'autres types de cellules. Les neurones corticaux et PNJ humains attachent bien sur astrocytes sains et enregistrements électrophysiologiques dépendent fortement des conditions de culture. Les autres étapes clés de ce protocole sont les électroporation et le placage des neurones corticaux sur les cultures d'astrocytes. Comme un grand nombre de cellules meurent après électroporation, il est important de se assurer qu'au moins 6.000.000 neurones corticaux sont électroporation pour le placage sur des cultures d'astrocytes dans des plaques à 24 puits. Nous avons observé que lorsque moins de 6 millions de cellules ont été soumises à une électroporation, le nombre de neurones qui survivent ne forme pas un réseau neuronal dense, qui a touché des enregistrements électrophysiologiques. Le nombre de neurones corticaux électroporation devrait aussi être compatible pour chaque expérience de co-culture à permettre une comparaison entre les différentes études. Pour toutes les mesures impliquant la digestion enzymatique, il est essentiel de ne pas laisser des cellules en solution digestif pendant trop longtemps car il peut conduire à la mort cellulaire.
Cetteapproche peut être utilisée pour cribler la capacité des neurones à partir de fibroblastes dérivés spécifiques au patient pour former des contacts synaptiques avec d'autres neurones. Les neurones issus de fibroblastes de patients atteints de troubles neurologiques du développement du syndrome de Rett (RTT) présentent des défauts de transmission synaptique: RTT neurones présentent une diminution significative de la fréquence et de l'amplitude de la CFP par rapport aux neurones sains, probablement en raison de la connectivité synaptique moins 14. Notre système de co-culture permet l'examen des effets des médicaments sur les neurones présentant des défauts de développement. Ceci peut être réalisé par addition de composés d'intérêt au cours de l'ensemencement de NPC humains malades ainsi que pendant une exposition continue à des composés pendant toute la durée de la différenciation neuronale.
Bien que ce système de co-culture peut également être utilisé comme modèle pour le dépistage de drogues, une limitation de cette approche est que le processus d'étudier les effets de chaque composé candidat peut être long et fastidieux quece ne est pas une méthode de criblage à haut débit. Après le traitement avec des composés candidats, les neurones iPSC dérivés doivent être patché individuellement afin de déterminer les effets de chaque composé sur les CSP. En outre, il ne existe actuellement pas beaucoup de fibroblastes disponibles et CSPi de patients. Par conséquent, il sera d'un intérêt dans un avenir proche pour avoir plus de cellules de patients et aussi pour adapter ce protocole pour le criblage à haut débit. Par exemple, par marquage de neurones COPSi dérivés avec un indicateur d'activité, tels que des capteurs génétiquement codés d'ions ou de potentiel de membrane, il serait possible d'augmenter le débit sensiblement côte-pas à pas de la procédure d'électrophysiologie de temps. Comme l'ensemble du processus de génération de ce système de co-culture, de la reprogrammation des fibroblastes d'effectuer des enregistrements électrophysiologiques, nécessite plus de 90 jours, il est recommandé que soit les CSPi humaines ou PNJ être élargis, après la reprogrammation et les étapes de l'induction neurale, respectivement,cryoconservés et de réduire le temps nécessaire pour les expériences futures.
Dans nos expériences, nous avons exprimé dans les neurones corticaux ChR2 sous le promoteur de synapsin1. Parce que ce promoteur est pan-neuronal, nous étions sans doute photostimuler deux neurones corticaux excitateurs et inhibiteurs. Si le but est de futures expériences d'interroger spécifiquement circuits excitateurs ou inhibiteurs soit, les promoteurs plus spécifiques peuvent être utilisés. Alternativement, les neurones corticaux peuvent être obtenus à partir transgénique (ou virus injecté les souris) où l'expression ChR2 se adresse particulièrement aux sous-populations génétiquement définies de neurones. Par exemple, les tissus corticaux récolte d'une souris qui a Cre recombinase exprimés en interneurones contenant parvalbumin-(interneurones PV) qui est croisé avec une souris avec floxé ChR2 donnera une situation où les seuls neurones corticaux exprimant ChR2 seront interneurones PV 15. L'utilisation de ces interneurones exprimant CHR2 dans notre co-cusystème de lture permettra de déterminer si un neurone iPSC dérivés patchée est capable d'intégrer dans un circuit avec interneurones PV.
Basé sur une étude précédente 9, les neurones corticaux sont matures avec chevauchement dendrites après 14 jours in vitro. Ainsi, si photostimulation ne suscite pas une réponse d'un neurone iPSC dérivés patchée, il doit indiquer que le neurone n'a pas la capacité de faire des connexions synaptiques avec les neurones corticaux. Un neurone iPSC dérivés est capable de recevoir une entrée synaptique soit d'autres neurones iPSC dérivés ou neurones corticaux. Si les enregistrements de patch clamp classique ont été utilisés, il ne serait pas possible de distinguer l'entrée synaptique où vient. L'avantage de notre système est que les réponses post-synaptiques depuis l'entrée présynaptique corticale peuvent être évoqués de manière sélective et identifiés. Les procédures décrites ici fournissent une approche simple pour évaluer la capacité des neurones iPSC dérivés d'intégrerdans un réseau neuronal définie.
Acknowledgments
Nous remercions K. et S. Je Deisseroth pour les constructions lentiviraux ChR2 et Synapsin1-tdTomato respectivement, C. Chai pour le partage de l'expertise et du protocole sur la génération iPSC, WY Leong pour le support technique, les membres du laboratoire Goh pour partager des réactifs et de l'expertise. Ce travail a été soutenu par Abbott Nutrition et le Centre universitaire d'excellence (ACE) de bourse de recherche de GlaxoSmithKline (GSK) pour ELG, par la National Research Foundation de Singapour en vertu de son programme de recherche concurrentiel (NRF 2008 NRF-CRP 002-082) pour ELG et GJA, et par le (WCI) Programme Institut de classe mondiale de la National Research Foundation de Corée (NRF) financé par le ministère de l'éducation, de la science et de la technologie de Corée (MEST) (NRF Nombre Grant: WCI 2009-003) pour GJA
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurocult Proliferation Kit (Mouse) | STEMCELL Technologies | 5702 | Contains NSC Basal Medium and NSC Proliferation Supplement |
| Epi5 Episomal iPSC Reprogramming Kit | Invitrogen | A15960 | |
| DMEM/F12 | Lonza | 12719F | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103049 | |
| MEM without glutamine | Invitrogen | 11090081 | |
| N2 | Invitrogen | 17502048 | |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030081 | |
| GlutaMAX supplement | Invitrogen | 35050061 | |
| PenStrep | Invitrogen | 15140122 | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| Human LIF | Invitrogen | PHC9484 | |
| CHIR99021 | Miltenyi Biotech | 130103926 | |
| SB431542 | Sigma | S4317 | |
| Compound E | Merck Millipore | 565790 | |
| EGF | Merck Millipore | 324856 | |
| FGF2 | R&D Systems | 233FB025 | |
| Research Grade FBS | Thermo Scientific | SV30160.03 | For astrocyte differentiation medium |
| Defined FBS | Thermo Scientific | SH30070.03 | For primary neuron medium |
| PBS | Thermo Scientific | SH30028.02 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | For primary neuron medium |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Heparin | EMD Millipore | 375095 | |
| Papain | Worthington | 3126 | |
| HBSS | Invitrogen | 14175095 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| Dispase II | STEMCELL Technologies | 7923 | |
| HEPES | Gibco | 15630080 | For harvesting brains |
| EBSS | Invitrogen | 14155063 | |
| L-Cysteine | Sigma | C7352 | |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200056 | |
| 70 µm cell strainer | BD Biosciences | 352350 | |
| 20 µm filter unit | Sartorius Stedim | 16534K | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| NaH2PO4 | Fluka | 71505 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| CaCl2 | Sigma | C1016 | |
| D(+)-Glucose | Sigma | G7520 | For electrophysiological studies |
| K-gluconate | Sigma | P1847 | |
| KOH | KANTO Chemical | 3234400 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | For electrophysiological studies |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Na2ATP | Sigma | A7699 | |
| Na3GTP | Sigma | G8877 | |
| Borosilicate glass capillaries | World precision instruments, Inc | 1604323 | |
| 15 ml centrifuge tube | BD Biosciences | 352096 | |
| 50 ml centrifuge tube | BD Biosciences | 352070 | |
| 24-well plates | Corning | 9761146 | |
| 6-well plates | Corning | 720083 | |
| T25 flasks | Corning | 430641 | |
| 12 mm cover glasses | Marienfeld-Superior | 111520 | |
| AMAXA Rat Neuron Nucleofector Kit | Lonza | VPG1003 | For electroporation of primary cortical neurons |
| Neon Transfection System | Invitrogen | MPK5000 | For electroporation of human fibroblasts |
| Mini Analysis | Synaptosoft | Mini Analysis v.6 | For measurement of PSCs |
| Normal Dermal Human Fibroblasts | PromoCell | C12300 | |
| pLenti-Synapsin-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE | Addgene | 20945 | |
| Mercury short-arc lamp | OSRAM | HBO 103 W/2 |
References
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