Introduction
I de siste årene har vår forståelse av nevroner og nevronale krets funksjon blitt revolusjonert av flere optogenetic verktøy som styrer nevronale eksitabilitet. Et slikt verktøy er lys-aktivert kation kanal, channelrhodopsin-2 (ChR2): nevroner som uttrykker ChR2 brann aksjonspotensialer i respons til lys stimulering 1-3. Fordi neuroner er normalt ikke følsom for lys, åpner denne bemerkelsesverdige evne nye muligheter for nøyaktig tidsmessig og romlig kontroll av aktiviteten av genetisk definerte populasjoner av neuroner 4 og har sterkt akselerert studier av hjernefunksjon. ChR2 har blitt brukt til stamcelleforskning for ulike formål, fra overvåking neuronal utvikling 5 til å regulere aktiviteten av nevrale nettverk 6.
Her brukte vi ChR2 for å øke nytten av en neuronal ko-kultur-system. Co-kultur systemer gjør vurderingen av interaksjoner mellom ulike celletyper.Ko-kulturer av neuroner og gliaceller, hovedcelletyper i nervesystemet, blir ofte brukt til å undersøke signalering mellom disse forskjellige celletyper, i tillegg til å evaluere betydningen av denne signalisering for fysiologiske responser, forplantning av skade, og for å undersøke molekylære mekanismer som er potensielt involvert i dette signaliserer 7. En tidligere studie viste at menneske iPSCs skille svært raskt inn i nerveceller i nærvær av rotte kortikale primære kultur inneholder nevroner, astrocytter oligodendrocytes og mikroglia 8.
I denne protokollen, viser vi en metode som benytter ChR2 i en co-kultur system for å avhøre synaptiske forbindelser mellom rotte kortikale nevroner og nevroner som stammer fra menneskeskapte pluripotente stamceller (iPSCs). Vi beskriver fremgangsmåten for å dissekere og høste hjernevev 9 samt å opprettholde og skille mus nevrale stamceller (NPC) i astrocytter og menneske NPCer into neuroner for å skape den ko-kultur-system. Å etablere denne co-kultur system, brukte vi integreringen frie omprogrammering metode beskrevet av Okita et al. 10 for å generere menneskelige iPSCs. Disse iPSCs ble så effektivt differensiert i NPCer i kjemisk definerte tilstander ved hjelp av små-molekyl-hemmere som beskrevet av Li et al. 11
I co-kulturer, kan de ulike populasjoner av nerveceller bli identifisert via påvisning av ChR2 uttrykk i kortikale nevroner og merking av IPSC-avledet nevroner via fluorescerende protein, tandem dimer Tomato (tdTomato). Ved å kombinere elektroopptak fra IPSC-avledet nerveceller med optogenetic photostimulation av de kortikale nevroner tillater vurdering av evnen til disse to typer av nerveceller for å danne kretser med hverandre. Spesielt photostimulation av ChR2-uttrykke kortikale nevroner fremkalle synaptiske responser i IPSC-avledet nevroner som har dannet synaptiske kretsermed photostimulated kortikale nevroner nettverk. Vi viser at økt postsynaptiske strømninger er faktisk påvist i IPSC-avledet nevroner under slike forhold. Denne protokollen tillater vurdering av synaptiske kretser under forskjellige eksperimentelle betingelser, inkludert gjentagelse av ulike nevrologiske sykdomsmodeller ved hjelp iPSCs avledet fra fibroblaster fra sykdom pasienter.
Protocol
MERK: Alle forsøkene er utført følgende protokoller godkjent av Institutional Animal Care og bruk Utvalget ved SingHealth.
1. Høsting Tidlig Postnatal Muse Brains
- Før disseksjon, forberede hippocampus vevsfordøyelse løsning: 10 ul papain pr 1 ml 1x Earles Balanced Salt Solution (EBSS) (+ 1% HEPES) med deoksyribonuklease I (DNase I) (250 U / ml) og Dispase II (1 U / ml). Gjør ca 2,5 ml av vevsfordøyelse løsning og filtrere det ved hjelp av en 0,20 mikrometer filter enhet. Hold løsningen varm ved 37 ° C før bruk.
- Bedøve de postnatal dag 5 (P5) mus valper ved å sette dem i isen for 5 min. Fjern fra is og test for smerte refleks via tå eller hale knipe. Spray valpene med 70% etanol. Halshogge valpene og legg hodene i en petriskål over isen.
- Lage et snitt i huden langs midtlinjen, fra bunnen av hodeskallen til nesen, med et par små scissors eller fine dissecting tang. Trekk av huden og gjøre en lignende snitt gjennom skallen. Foreta ytterligere to horisontale kutt på hver side av hodet, en rostral (ved bregma) og en caudal (i lambda).
- Peel åpne skallen langs radert linjer for å avsløre underliggende hjernen. Bruke en pinsett for å fjerne skallen liggende olfactory pærer, og en hvilken som helst midtlinjen bein mellom dem. Gjør dette mens du holder hodet stabilt med en pinsett i den ikke-dissekere hånd.
- Lette den flate delen av en spatel mellom den ventrale del av hjernen og basen av skallen ved haleenden. Holde spatel parallelt med bunnen av hodeskallen under hjernen, beveger den mot rostrale enden av skallen for å bryte noen adhesjon mellom hjernen og basen av skallen.
- Scoop hjernen ut med slikkepott og legg den i en petriskål med iskald 1x EBSS (+ 1% HEPES). Hold vev vann til enhver tid.
- For allemikro-disseksjon trinn, arbeid under en disseksjonsmikroskop og bruke et par av fine dissecting tang i hver hånd, en for å kutte vev, og den andre for å holde vevet stabil.
- Gjør et kutt bare posterior til hjernebarken for å skille den fra hindbrain. Skjær langs midtlinjen for å skille hjernebarken i sine to halvkuler. Fjern hjernehinnene fra hjernehemisfærene.
- Plasser en halvkule medial side opp og sett pinsett inn i den laterale ventrikkel under hippocampus. Skjær bort midthjernen.
- Gjøre kutt på de øvre og nedre ende av hippocampus, og nær dentate / entorhinal cortex veikryss å isolere hippocampus fra hjernebarken. Samle hippocampi i en skål med iskald 1x EBSS (+ 1% HEPES).
2. hippocampus Tissue Dissosiasjon
- Overfør hippocampi til en skål inneholdende den forvarmede hippocampus vevsfordøyelse løsning. Kjøttdeig tHan hippokampale vev til så fine som mulig, og inkuber i 30 min ved 37 ° C.
- Forsiktig distansere vev i enkeltceller ved mekaniske pipettering og overføre celler inn i en 15 ml sentrifugerør.
- Sentrifuger ved 200 xg i 5 minutter og fjerne supernatanten.
- Resuspender cellepelleten i 20 ml 0,5x Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) inneholdende sakkarose (0,9 M) og sentrifuger ved 200 xg i 10 min.
- Fjern supernatanten og resuspender cellepelleten i 2 ml NPC opprettholdelsesmedium (Tabell 1), plassert på toppen av 10 ml 4% bovint serumalbumin (BSA) i 1X EBSS-oppløsning og sentrifuger ved 200 xg i 5 min.
- Fjern supernatant og tilsett mus NPC opprettholdelsesmedium (Tabell 1) til cellepelleten. Forsiktig pipettere opp og ned 5 til 10 ganger for å sikre cellepellet er delt opp i enkeltceller.
- Førende medium inneholdende celler i pre-coated Matrigel plater og tilsett epidermal vekstfaktor (EGF) og fibroblast-vekstfaktor 2 (FGF2) (begge 20 ng / ml) i heparin (5 mg / ml). Inkuber platene ved 37 ° C og 5% CO2.
3. Vedlikehold av Adherent Mouse hippocampus NPCer
- Forberede de belagte plater / kolber minst en time før aging mus hippocampus NPCer. Tilsett nok Matrigel for å dekke arealet av hver plate eller kolbe og inkuberes ved romtemperatur i 1 time.
- Fjern media fra 90% sammenflytende muse NPC kulturer og vaske en gang med 1x Fosfatbufret saltvann (PBS) og deretter aspirer PBS av.
- Legg nok celle avløsning løsning for å dekke alle brønner / kolber og inkuberes i 5 min ved 37 ° C.
- Sørg for at alle cellene er frittliggende ved å se under en invertert lyse feltet mikroskop på 10X forstørrelse. Hvis det fremdeles er cellene festet, inkubere kulturen fartøyet i ytterligere 1-2 minutter, og kontrollerer på nytt cellene. Legg dobbelt så mye av Dulbeccos Modified Eagle Medium / Hams F-12 Nutrient Blanding (DMEM / F-12)som den for cellen løsgjøring løsning til brønnene / kolber når alle celler er frittliggende.
- Overfør DMEM / F-12 inneholdende celler i et 15 ml sentrifugerør og sentrifuger ved 200 xg i 5 min.
- Fjern supernatant og resuspender cellepelleten i 5 ml muse NPC opprettholdelsesmedium (Tabell 1). Forsiktig pipettere opp og ned for å bryte opp celle-pelleten i enkeltceller.
- Plate en tredjedel av de totale celler inn i nye kultur brønner / kanner og topp opp tilstrekkelig dyrkingsmedium supplert med EGF og FGF2. Inkuber dyrkingsbeholdere ved 37 ° C og 5% CO2. Fylle medium annenhver dag og dele celler 1: 3 hver 3 til 4 dager. Unngå overvekst av mus NPC kulturer å hindre aggregering og løsrivelse.
4. Differensiering av Mouse NPCer inn Astrocytter
- Forberede poly-L-lysin (PLL) / laminin belagt 12 mm dekkglass minst en dag i forveien før du starter differensiering av muse NPCer i astrocytter. Legg coverslips inn i en 24-brønners plate og dekker hele overflaten av brønner med nok PLL (1 mg / ml i boratbuffer).
- Platen inkuberes over natten ved 4 ° C. Dagen etter, fjerne PLL og vaske en gang med 1x PBS.
- Legg laminin (1 mg / ml i iskald DMEM / F-12), igjen dekker hele overflatearealet til hver brønn, og deretter inkuberes i minst 4 timer ved 37 ° C.
- Fjern media fra mus NPC kulturer og vaske en gang med 1x PBS deretter aspirer PBS av.
- Legg nok celle avløsning løsning for å dekke alle brønner / kolber og inkuberes i 5 min ved 37 ° C.
- Sørg for at alle cellene er frittliggende og deretter legge det dobbelte av DMEM / F-12 som for celle avløsning løsning til brønnene / kolber.
- Overfør DMEM / F-12 inneholdende celler i et 15 ml sentrifugerør og sentrifuger ved 200 xg i 5 min.
- Fjern supernatant og resuspender cellene i 5 ml astrocytt differensieringsmedium (Tabell 1). Forsiktig pipette celle suspension opp og ned for å bryte opp celle-pelleten i enkeltceller. Telle antall enkeltceller med en hemocytometer.
- Tallerken cellene ved 5 x 10 4 celler / cm2 i 500 ul medium for hver brønn i en 24-brønners plate. Inkuber platene ved 37 ° C og 5% CO2. Erstatte halvparten av mediet med friskt medium hver annen dag. Mus NPCer raskt differensiere i astrocytter innen 2 dager og er differensiert for en uke før du begynner ytterligere eksperimenter.
5. Høsting Embryonic rottehjerner og Kortikal Tissue Dissosiasjon
- Fjern astrocyte differensiering medium (tabell 1) fra astrocyttkulturer og erstatte med primær nevron medium (tabell 1) minst fire timer før du starter innhøstingen av embryonale rottehjerner.
- Før disseksjon, forberede kortikale vevsfordøyelse løsning: 10 pl papain per 1 ml 1x EBSS (+ 1% HEPES) med 12,1 mg / ml L-cystein. Gjør ca 20,5 ml av vevsfordøyelse løsning og filtrere det ved hjelp av en 0,20 mikrometer filter enhet. Hold løsningen varm ved 37 ° C før bruk.
- Avlive den gravide demningen ved karbondioksidasfyksiering hjelp av komprimert gass. Test for smerte refleks via tå eller hale knipe.
- Lå dyret ventral side opp på en absorberende pute og suge sin mageområdet med 70% etanol. Knip huden med en pinsett og gjøre en lateral snitt med et par av kirurgiske saks, bred nok til å eksponere magen. Ta tak i peritoneum med tang og kutte åpne bukhulen.
- Løft opp livmor horn med tang og klippe det fri langs mesometrium. Plasser dissekert livmoren i en petriskål over is. Skille hver embryo ved å kutte livmorvevet mellom dem.
- Lage et snitt i den embryonale sac. Forsiktig skall fosteret ut gjennom åpningen. Halshogge fosteret og plassere hodet i en petriskål over isen.
- Å høste embryonic rottehjerner, følg beskrivelsen fra trinn 1.3 til 1.5.
- Å dissekere kortikale vev, plasserer en hjerne halvkule lateral side opp. Skjær halvkule i to lateralt fra midten. Kast den halve nærmere bunnen av hjernen. Trimme den utskårede vev for å fjerne midthjernen.
- Overfør de kortikale vev til en skål inneholdende den forvarmede kortikalt vev fordøyelsen løsning. Hakke kortikale vev til så fine som mulig, og inkuber i 30 min ved 37 ° C.
- Overfør de kortikale vev fra vevsfordøyelse oppløsning til et 50 ml sentrifugerør inneholdende 10 ml forvarmet primær neuron medium (Tabell 1). Dissosiere de kortikale vev ved gjentatte ganger å pipettere dem opp og ned i en serologisk pipette, inntil en homogen oppløsning uten vev stykker oppnås.
- Passere vevet løsning gjennom en 70 mikrometer celle sil for å filtrere ut gjenværende vev klumper. Alikvoter av vev løsning i 15 mlsentrifugerør, og legger ca 3 ml i hvert rør.
- Legg 800 ul 7,5% BSA i 1 x PBS til bunnen av hvert rør, og danner to lag med vevet løsning på toppen og BSA i bunnen.
- Sentrifuger ved 200 xg i 5 min. Fjern supernatanten, aspirere fra grenseflaten mellom de to lag. Unngå å forstyrre cellepelleten på bunnen av røret.
- Resuspender cellepelleten i hver 1 ml primære neuron-medium (tabell 1) og kombinere dem i et 15 ml sentrifugerør. Bestemme celletetthet ved hjelp av et hemocytometer.
6. Electroporation og plating of Primary kortikale nevroner
MERK: Genoverføring kan oppnås ved hjelp av flere metoder, inkludert elektroporering, kalsiumfosfat transfeksjon og viral transduksjon. I denne protokollen beskriver vi elektroporering å levere ChR2 konstruere inn i primære kortikale nevroner.
- Sentrifuge 6 x 10 6 rotte kortikale nevroner ent 200 xg i 5 minutter og fjerne supernatanten. Minst 6 x 10 6 kortikale neuroner er nødvendig for elektroporering for å sikre dannelsen av en neuronal nettverk ved overlevende neuroner.
- Tilsett 100 mL av elektroporering løsning til celle pellet og resuspender forsiktig. Kombiner 100 mL av cellesuspensjonen med 6 mikrogram av pLenti-synapsin-hChR2 (H134R) -EYFP-WPRE 4 plasmid og overføre til en sertifisert kyvette. Unngå å produsere luftbobler under overføringen.
- Velge og bruke riktig program for elektroporering i henhold til produsentens instruksjoner.
- Etter elektroporering, tilsett 500 mL av MEM til celle / DNA suspensjon til kyvetten. Overføre prøven i 11,5 ml primære neuron-medium (tabell 1) og resuspender forsiktig. Den totale mengde av mediet er tilstrekkelig for en hel 24-brønners plate. Alikvoter 500 ul medium for hver brønn i en 24-brønners plate. Inkuber platen ved 37 ° C og 5% CO2. 7. generasjon av Induced Pluripotent stamceller
- Kultur humane fibroblaster i DMEM supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) i 6-brønners plater.
- Før igangsetting omprogrammering av fibroblaster, jakke 6-brønner med Matrigel og inkuberes i minst en time i romtemperatur. Ved 80% samløpet, fjerne media fra fibroblastkulturer og vaske en gang med 1x PBS.
- Tilsett tilstrekkelig 0,25% trypsin-EDTA for å dekke hele platen og inkuber ved 37 ° C i 10 min.
- Når cellene har løsnet fra brønner, tilsett to ganger mengden av DMEM med 10% FBS som den for trypsin for å slukke trypsin fordøyelsen. Forsiktig pipette cellesuspensjon opp og ned for å bryte opp celler. Telle antall enkeltceller med en hemocytometer.
- Overføring 7 x 10 5 celler i et 15 ml sentrifugerør og sentrifuger cellesuspensjonen ved 200 xg i 5min.
- Fjern supernatant og resuspender cellepelleten i elektroporering løsning. Electroporate fibroblaster i henhold til produsentens instruksjoner. Resuspender cellene i 100 pl buffer elektroporering og tilsett 1 ug av hver episomal vektor. Electroporate celler med innstillingene for 1650 V, 10 ms og 3 tids pulser.
- Overføring cellesuspensjonen i DMEM supplert med 10% FBS og platen 5 x 10 4 celler pr brønn i en 6-brønns plate. Inkuber platene ved 37 ° C og 5% CO2.
- Etter 48 timer, fjerne media fra transfekterte fibroblastkulturer og erstatte med mTeSR medium. Erstatte kultur media daglig inntil indusert pluripotent stamcelle (IPSC) kolonier er klar til å bli isolert. IPSC kolonier kan observeres etter 28 til 35 dager.
- Når du er klar for isolasjon, mekanisk kuttet en IPSC koloni og reseed i mTeSR medium med 10 mm Rho-assosiert protein kinase (ROCK) inhibitor (Y-27632) på en Matrigel belagt seks-brønns plate 12. Erstatte kultur medium daglig.
- Når IPSC kulturer er rundt 20% samløpet, fjerne mTeSR medium og erstatte med nevrale induksjon medium (tabell 1). Fylle medium annenhver dag.
- Etter 7 dager, fjerne nevrale induksjon medium og erstatte med menneskelig NPC vedlikehold medium (tabell 1). Fylle medium annenhver dag opp til 7 dager før passering kulturer.
- Før passering kulturer, frakk plater / flasker med Matrigel ved romtemperatur i minst en time.
- Fjern media fra konfluent menneskelige NPC kulturer og vaske en gang med 1x PBS deretter aspirer PBS av.
- Legg nok celle løsgjøring løsning for å dekke alle brønnene inkuberes deretter i 5 minutter ved 37 ° C.
- Sørg for at alle cellene er frittliggende. Legg dobbelt så mye DMEM /F-12 som den for cellen løsgjøring løsning til brønnene / kolber.
- Overfør DMEM / F-12 inneholdende celler i et 15 ml sentrifugerør og sentrifuger ved 200 xg i 5 min.
- Fjern supernatant og resuspender cellene i 5 ml humant NPC opprettholdelsesmedium (Tabell 1). Forsiktig pipette cellesuspensjon opp og ned for å bryte opp celler.
- Plate en tredjedel av de totale celler inn Matrigel belagt kultur brønner / kanner og topp opp tilstrekkelig medium supplert med 10 mm Y-27632. Inkuber dyrkingsbeholdere ved 37 ° C og 5% CO2.
- Split kulturer 1: 3 hver 3 til 4 dager og etterfylle medium annenhver dag. Opprettholde menneske NPC kulturer med høy tetthet for å hindre differensiering.
- Legg til lentiviral vektor Synapsin1-tdTomato til menneskelig NPC kultur før oppstart differensiering i nerveceller. Forberede astrocyte / kortikale nevroner co-kultureren dag i forveien før differensiere menneskelige NPCer.
- Vask menneskelige NPC kulturer gang med 1x PBS og legger nok celle avløsning løsning for å dekke alle brønner / kolber deretter inkuberes i 5 min ved 37 ° C.
- Sørg for at alle cellene er frittliggende. Legg dobbelte av DMEM / F-12 som den for cellen løsgjøring løsning til brønnene / kolber. Overfør til et 15 ml sentrifugerør. Sentrifuger ved 200 xg i 5 min.
- Fjern supernatant og resuspender cellene i 5 ml neuronal differensiering medium (Tabell 1). Forsiktig pipette cellesuspensjon opp og ned for å bryte opp celle-pelleten i enkeltceller. Telle antall enkeltceller med en hemocytometer.
- Aspirere nøye medium fra astrocyttkulturer / kortikale nevroner kulturer. Tallerken humane NPC på 5 x 10 3 celler / cm2 i 500 ul av neuronal differensiering medium (tabell 1) supplert med 10 uM Y-27632 for hver 24-brønn. Tilsett medium som inneholder menneskelige NPCer i hver brønnfor å unngå å forstyrre astrocytter og kortikale nevroner.
- Inkuber platene ved 37 ° C og 5% CO2. Erstatte halvparten av mediet med friskt medium hver to til tre dager i minst 28 dager.
- Bekrefte om menneske iPSCs oppføre seg som modne nevroner.
- Finn celler differensiert fra menneskelige iPSCs av visualisering av tdTomato bruker en oppreist konfokal mikroskop utstyrt med en 60x (0,9 NA) vann nedsenking linse.
- Trekk opptak pipette til en motstand på 4 til 6 M. perfuse celler ved romtemperatur i en ekstern oppløsning (tabell 1) bobles kontinuerlig med 95% O2 / 5% CO2. Fylle opptaks mikropipette med intern oppløsning (tabell 1).
- Patch tdTomato + celle i hel-celle-modus og rekord aksjonspotensialet avfyring i respons til dagens injeksjon (1 sek varighet, 10 Pa intervaller) i curleie klemme.
- Bekrefte om aksjonspotensiale av kortikale celler som uttrykker ChR2 er pålitelig fremkalt av lys stimulering.
- Finn kortikale celler som uttrykker ChR2 av visualisering av GFP under et konfokal mikroskop. Utføre hel-celle patch clamp opptak på kortikale celler ved å følge trinn 10.1.2 til 10.1.3.
- Sjekk aksjonspotensialet er pålitelig fremkalt av lys belysning med kvikksølv arc lampe (100 W). Bølgelengden til eksitasjon filter er 480/40 nm.
- Utføre optogenetic stimulering.
- Patch tdTomato + celle i hel-celle-modus og satt spenning klemme på -70mV. Filtrere strømsignaler ved 2 kHz og digitalisere ved 10 kHz. Overvåke seriemotstander fra 10 til 20 M for konsistens under opptak.
- Stimulere hele feltet med 100 W kvikksølvlampe med 480/40 nm eksitasjon filter for 30 sek.
- Rekord postsynaptiske strømmer (PSC avtaler) av lappet celle indusert av photostimulation av ChR2-uttrykke presynaptiske cortiske nevroner. Oppdage og måle PSC avtaler. Satt terskel for amplitude og strømninger område på 5 pA og 20 PC, henholdsvis. Manuelt inspisere disse hendelsene til å forkaste ethvert ikke-PSC spor.
MERK:. Denne metoden har blitt tilpasset fra Okita et al 10
8. Neural Induksjon og vedlikehold av menneske NPCer
MERK:. Denne metoden har blitt beskrevet av Li et al 11
9. Differensiering av menneske NPCer i nevroner i Co-kulturer
10. Elektro Opptak av IPSC-avledet Nevroner
Representative Results
Her, en protokoll som beskriver flere trinn involvert i å generere en co-kultur bestående astrocytter, kortikale nevroner og menneskelige nevroner er illustrert. Menneskelige iPSCs ble oppnådd ved å omprogrammere fibroblaster hjelp episomale vektorer 10 og spesifisert i en neural avstamning med en cocktail av små-molekyl hemmere, noe som gjør NPCer 11 som ble opprettholdt ved høy tetthet (figur 1A). Flere trinn er nødvendig for å generere co-kultur: differensiering av muse NPCer i astrocytter, plating av rotte kortikale nevroner som uttrykker ChR2, og såing av menneskelige NPCer tagget med tdTomato (figur 1B). På dag 2 av differensiering, kan Glial Fibrillary Surt Protein (GFAP) + astrocytter lett observeres i våre kulturer (figur 1C). Mus NPCer fikk lov til å differensiere i minst en uke før plating kortikale nevroner som uttrykker ChR2 på astrocyte monolayer (figur 1D). Etter tretil 4 uker etter menneskelig NPC differensiering, ble tdTomato + nevroner oppdaget i kulturer (Figur 1E).
Dette co-kultur systemet tillater konsistent deteksjon av postsynaptiske strømninger fra enkelt IPSC-avledet nevroner i respons til lys stimulering (Figur 2A). Når stimulert av lys, ble aksjonspotensialer som genereres i kortikale nevroner som uttrykker ChR2 (figur 2B). IPSC-avledet neuroner er også eksiterbart (figur 2C), som viser øket virkningspotensial avfyring som amplituden av depolariserende strømpulser ble øket (figur 2D). Dermed disse cellene vise modne nevronale egenskaper. I fravær av lys, IPSC-avledet neuroner mottatt spontane synaptiske innganger (figur 2E). Disse innad postsynaptiske strømmene ble overveiende formidles av AMPA-reseptorer, fordi strømmene gjennom GABA reseptorer ville være utover og NMDA-reseptorer ikke bære en strømt holding potensialet i -70 mV. I det minste noen av disse innganger var fra presynaptiske kortikale nevroner som uttrykker ChR2, fordi lys stimulering betydelig økt hyppighet av postsynaptisk strøm (figur 2E). Tidsforløpet av denne økningen i synaptic innspill er vist i figur 2F: photostimulation av kortikale nevroner vedvarte gjennom hele 30 sek lang lys flash. Selv om frekvensen av pscs ble hevet når ChR2-uttrykkende kortikale neuroner ble photostimulated (figur 2G), deres amplitude var upåvirket (figur 2H). Oppsummert viser disse resultatene at IPSC-avledet nevroner utstilt modne nevronale egenskaper og kan danne synaptiske forbindelser med presynaptiske kortikale nevroner.
Figur 1: Skjematisk diagrammer for generering av co-kultursystem. (A) Tidslinje for omprogrammering humane fibroblaster inn iPSCs og nevrale induksjon til NPCer. (B) Tidslinje for terminal differensiering av menneskelige NPCer i modne nevroner på kortikale nevroner og astrocyttkulturer. (C) Mouse NPCer raskt differensiere i GFAP + astrocytter etter to dager in vitro. (d) Etter en uke ble det kortikale nevroner som uttrykker ChR2 utsådd på GFAP + astrocytter. (E) Ved 4 til 5 uker etter differensiering av humane NPC, ble elektrofysiologiske opptak utført på tdTomato + neuroner. Skala barer representerer 100 mikrometer.
Figur 2: optogenetic analyse av funksjonelle synaptiske tilkobling. (A) IPSC-deriverte celler som er merket med tdTomato (rød) var co-kultivert med kortikale nevroner uttrykker lysaktivertkanal, ChR2 (grønn). Opptak fra IPSC-avledet nevroner avslørte postsynaptiske strøm (PSC) svar, som kan komme fra enten kortikale nevroner eller andre IPSC-avledet nevroner. (B) Belysning (blå søyle) vakte en serie av aksjonspotensialer i kortikale nevroner som uttrykker ChR2. ( C) IPSC-avledet celler er fremkalt av dagens injeksjon. (D) Firing vs nåværende kurve av IPSC-avledet celler. (E) Photostimulation av ChR2-uttrykker kortikale nevroner (blå søyle) økte frekvensen av PSC avtaler i IPSC-avledet nevroner . (F) Tidsforløp av økningen i PSC frekvens som produseres av photostimulation. Blå linjen angir tidspunktet for photostimulation. (G, H) Mens PSC frekvensen ble øket med photostimulation (G), PSC amplitude var upåvirket (H). * Indikerer p <0,05 sammenlignet med kontroll med student t-test.
Discussion
Optogenetics gir tids- og steds presisjon for aktivering av definerte populasjoner av nerveceller 13. I våre eksperimenter, ble hele feltet av mikroskopobjektiv belyst i 30 sekunder til foto stimulere bare kortikale nevroner som uttrykker ChR2. Dette tillot oss å avgjøre om synaptiske forbindelser ble dannet mellom ulike populasjoner av nerveceller innenfor co-kultur. Våre resultater viser at photostimulation øker frekvensen PSC i IPSC-avledet nevroner, som viser at disse nevronene motta synaptic innspill fra presynaptiske kortikale nevroner som uttrykker ChR2. Dette i sin tur fastslått at de IPSC-avledet neuroner med hell inkorporert i kretser med de kortikale nevroner.
Det er flere viktige skritt for generering av denne co-kultur system. Det er viktig å sikre at mus NPC-avledet astrocyttkulturer er sunt, med minimal celledød, før du fortsetter med platingav andre celletyper. Kortikale nevroner og menneskelige NPCer feste godt på sunne astrocytter og elektrofysiologiske opptak avhenge sterkt på kultur forhold. De andre viktige skritt i denne protokollen er elektroporering og plating av kortikale nevroner på astrocyttkulturer. Når et stort antall celler dør etter elektroporering, er det viktig å sikre at minst 6.000.000 kortikale neuroner elektroporert for belegging på astrocyttkulturer i 24-brønners plater. Vi har observert at når færre enn 6 millioner celler ble elektroporert, gjorde antall nevroner som overlever ikke danner et tett nevronale nettverk, som påvirket elektrofysiologiske opptak. Antallet elektroporerte kortikale nevroner bør også være ensartet for hvert ko-kultur eksperiment for å tillate sammenligning mellom forskjellige studier. For alle trinn som involverer enzymatisk oppslutning, er det viktig ikke å la cellene i fordøyelses løsning for lenge, da det kan føre til celledød.
Dettetilnærmingen kan brukes til å screene evnen til neuroner avledet fra pasientspesifikke fibroblaster til å danne synaptiske kontakter med andre nerveceller. Neuroner avledet fra fibroblaster fra pasienter som lider av en nevrologisk forstyrrelse Retts syndrom (RTT) oppviser synaptisk transmisjon defekter: RTT neuroner oppviser en betydelig reduksjon i PSC frekvens og amplitude sammenlignet med friske nerveceller, antagelig på grunn av mindre synaptiske tilkobling 14. Vår co-kultur systemet tillater undersøkelse av narkotika effekter på nevroner som viser utviklingsmessige defekter. Dette kan utføres via tilsetning av forbindelser av interesse under såing av syke menneskelige NPC så vel som under kontinuerlig eksponering for forbindelser gjennom hele den tiden av neuronal differensiering.
Mens denne co-kultur systemet kan også brukes som en modell for narkotika testing, en begrensning med denne tilnærmingen er at prosessen med å undersøke effektene av hver kandidat forbindelsen kan være lang og kjedelig somdet er ikke en high-throughput screening-metoden. Etter behandling med kandidatforbindelser, IPSC-avledet nerveceller har til å være individuelt lappet for å bestemme effekten av hver forbindelse på pscs. Dessuten er det i dag ikke mange ledige fibroblaster og iPSCs fra pasienter. Derfor vil det være av interesse i nær fremtid til å ha mer pasientceller og også for å tilpasse denne protokollen for høy gjennomstrømming screening. For eksempel ved merking IPSC-avledet neuroner med en aktivitetsindikator, for eksempel genetisk kodede sensorer av ioner eller membranpotensialet, ville det være mulig å øke gjennomstrømningshastigheten i det vesentlige ved side-pass den tidkrevende elektro prosedyre. Som hele prosessen med å generere denne co-kultur system, fra omprogrammering fibroblaster å utføre elektrofysiologiske opptak, krever mer enn 90 dager, anbefales det at enten den menneskelige iPSCs eller NPCer bli utvidet, etter omprogrammering og nevrale induksjon skritt henholdsvisog kryopreservert å redusere tiden det tar for fremtidige eksperimenter.
I våre eksperimenter, uttrykte vi ChR2 i kortikale nevroner under synapsin1 promoter. Fordi dette promoter er pan-nevronale, vi antagelig ble photostimulating både hemmende og eksitatoriske kortikale nevroner. Hvis målet med fremtidige eksperimenter er å spesifikt avhøre enten hemmende eller eksitatoriske kretser, kan mer spesifikke arrangører brukes. Alternativt kan kortikale nevroner fås fra transgen (eller virus-injisert mus) hvor ChR2 uttrykk er spesielt rettet mot genetisk definerte subpopulasjoner av nevroner. For eksempel høsting kortikale vev fra en mus som har Cre rekombinase uttrykt i parvalbumin holdige interneuroner (PV) interneuroner som krysses med en mus med floxed ChR2 vil gi en situasjon der de eneste kortikale nevroner som uttrykker ChR2 blir PV interneuroner 15. Bruken av en slik ChR2-uttrykk interneuroner i vår samtidige cuLTURE systemet vil gjøre det mulig å bestemme om en oppdatert IPSC-avledet nevron er i stand til å innlemme i en krets med PV interneuroner.
Basert på en tidligere studie 9, kortikale nevroner er modne med overlapp dendritter etter 14 dager in vitro. Dermed, hvis photostimulation ikke fremkaller en respons fra en oppdatert IPSC-avledet neuron, bør det indikere at neuron ikke har evnen til å gjøre synaptiske forbindelser med cortical neurons. En IPSC-avledet nevron er i stand til å motta synaptic innspill enten fra andre IPSC-avledet nevroner eller kortikale nevroner. Hvis tradisjonelle patch clamp opptakene ble brukt, ville det ikke være mulig å skille hvor den synaptiske innspill kommer fra. Fordelen med vårt system er at postsynaptiske svar fra cortical presynaptiske inngang kan selektivt fremkalt og identifisert. Prosedyrene skissert her gi en enkel metode for å evaluere evnen til IPSC-avledet nevroner å integrereinn i et definert nevronale nettverk.
Acknowledgments
Vi takker K. Deisseroth og S. Je for ChR2 og Synapsin1-tdTomato lentiviral konstruksjoner henholdsvis C. Chai for deling av kompetanse og protokollen på IPSC generasjon, WY Leong for teknisk support, medlemmer av Goh lab for deling av reagenser og kompetanse. Dette arbeidet ble støttet av Abbott Ernæring og Academic Centre of Excellence (ACE) forskningspris fra GlaxoSmithKline (GSK) til ELG, ved National Research Foundation Singapore under sin Competitive Research Program (NRF 2008 NRF-CRP 002-082) til ELG og GJA, og av World Class Institute (WCI) Program av National Research Foundation of Korea (NRF) finansiert av departementet for utdanning, vitenskap og teknologi i Korea (MEST) (NRF Grant Antall: WCI 2009-003) til GJA
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurocult Proliferation Kit (Mouse) | STEMCELL Technologies | 5702 | Contains NSC Basal Medium and NSC Proliferation Supplement |
| Epi5 Episomal iPSC Reprogramming Kit | Invitrogen | A15960 | |
| DMEM/F12 | Lonza | 12719F | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103049 | |
| MEM without glutamine | Invitrogen | 11090081 | |
| N2 | Invitrogen | 17502048 | |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030081 | |
| GlutaMAX supplement | Invitrogen | 35050061 | |
| PenStrep | Invitrogen | 15140122 | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| Human LIF | Invitrogen | PHC9484 | |
| CHIR99021 | Miltenyi Biotech | 130103926 | |
| SB431542 | Sigma | S4317 | |
| Compound E | Merck Millipore | 565790 | |
| EGF | Merck Millipore | 324856 | |
| FGF2 | R&D Systems | 233FB025 | |
| Research Grade FBS | Thermo Scientific | SV30160.03 | For astrocyte differentiation medium |
| Defined FBS | Thermo Scientific | SH30070.03 | For primary neuron medium |
| PBS | Thermo Scientific | SH30028.02 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | For primary neuron medium |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Heparin | EMD Millipore | 375095 | |
| Papain | Worthington | 3126 | |
| HBSS | Invitrogen | 14175095 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| Dispase II | STEMCELL Technologies | 7923 | |
| HEPES | Gibco | 15630080 | For harvesting brains |
| EBSS | Invitrogen | 14155063 | |
| L-Cysteine | Sigma | C7352 | |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200056 | |
| 70 µm cell strainer | BD Biosciences | 352350 | |
| 20 µm filter unit | Sartorius Stedim | 16534K | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| NaH2PO4 | Fluka | 71505 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| CaCl2 | Sigma | C1016 | |
| D(+)-Glucose | Sigma | G7520 | For electrophysiological studies |
| K-gluconate | Sigma | P1847 | |
| KOH | KANTO Chemical | 3234400 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | For electrophysiological studies |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Na2ATP | Sigma | A7699 | |
| Na3GTP | Sigma | G8877 | |
| Borosilicate glass capillaries | World precision instruments, Inc | 1604323 | |
| 15 ml centrifuge tube | BD Biosciences | 352096 | |
| 50 ml centrifuge tube | BD Biosciences | 352070 | |
| 24-well plates | Corning | 9761146 | |
| 6-well plates | Corning | 720083 | |
| T25 flasks | Corning | 430641 | |
| 12 mm cover glasses | Marienfeld-Superior | 111520 | |
| AMAXA Rat Neuron Nucleofector Kit | Lonza | VPG1003 | For electroporation of primary cortical neurons |
| Neon Transfection System | Invitrogen | MPK5000 | For electroporation of human fibroblasts |
| Mini Analysis | Synaptosoft | Mini Analysis v.6 | For measurement of PSCs |
| Normal Dermal Human Fibroblasts | PromoCell | C12300 | |
| pLenti-Synapsin-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE | Addgene | 20945 | |
| Mercury short-arc lamp | OSRAM | HBO 103 W/2 |
References
- Wang, H., et al. High-speed mapping of synaptic connectivity using photostimulation in Channelrhodopsin-2 transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (19), 8143-8148 (2007).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (24), 13940-13945 (2003).
- Zhang, F., et al. Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry. Nature. 446 (7136), 633-639 (2007).
- Stroh, A., et al. Tracking stem cell differentiation in the setting of automated optogenetic stimulation. Stem Cells. 29 (1), 78-88 (2011).
- Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, S. -C. Human embryonic stem cell-derived neurons adopt and regulate the activity of an established neural network. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (50), 20189-20194 (2011).
- Viviani, B. Preparation and coculture of neurons and glial cells. Curr Protoc Cell Biol. 32, 2.7.1-2.7.2.1 (2006).
- Braun, H., Günther-Kern, A., Reymann, K., Onteniente, B. Neuronal differentiation of human iPS-cells in a rat cortical primary culture. Acta Neurobiologiae Experimentalis. 72 (30), 219-229 (2012).
- Shivaraj, M. C., et al. Taurine induces proliferation of neural stem cells and synapse development in the developing mouse brain. PLoS ONE. 7, e42935 (2012).
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
- Li, W., et al. Rapid induction and long-term self-renewal of primitive neural precursors from human embryonic stem cells by small molecule inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (20), 8299-8304 (2011).
- Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (50), 424-429 (2011).
- Packer, A. M., Roska, B., Hausser, M. Targeting neurons and photons for optogenetics. Nature Neuroscience. 16 (7), 805-815 (2013).
- Marchetto, M. C. N., et al. A Model for neural development and treatment of Rett Syndrome using human induced pluripotent stem cells. Cell. 143 (4), 527-539 (2010).
- Asrican, B., et al. Next-generation transgenic mice for optogenetic analysis of neural circuits. Frontiers in Neural Circuits. 7, 160 (2013).
