Introduction
De laatste jaren hebben ons begrip van neuron en neuronale circuitfunctie een revolutie door verscheidene optogenetic hulpmiddelen die neuronale exciteerbaarheid controleren. Een dergelijk instrument is het licht geactiveerd kationenkanaal, channelrhodopsin-2 (ChR2): neuronen uitdrukken ChR2 brand actiepotentialen in reactie op licht stimulatie 1-3. Omdat neuronen gewoonlijk niet lichtgevoelig Deze opmerkelijke vermogen opent nieuwe mogelijkheden voor de nauwkeurige temporele en ruimtelijke controle over de activiteit van genetisch gedefinieerde populaties van neuronen 4 en sterk versneld onderzoek van hersenfunctie. ChR2 is toegepast op cel onderzoek voor verschillende doeleinden voort, van het toezicht op neuronale ontwikkeling 5 te reguleren activiteit van neurale netwerken 6.
Hier gebruikten we ChR2 het nut van een neuronale co-cultuur te verhogen. Co-cultuur systemen maken het mogelijk de beoordeling van de interacties tussen verschillende celtypen.Co-culturen van neuronen en glia, de belangrijkste celtypen van het zenuwstelsel, worden gewoonlijk gebruikt om te onderzoeken signalering tussen deze verschillende celtypen, alsook de betekenis van deze signalering om fysiologische responsen evalueren verspreiding van schade en aan de studie moleculaire mechanismen die mogelijk betrokken zijn bij deze signalering 7. Een eerdere studie toonde aan dat menselijke iPSCs differentiëren zeer snel in neuronen in de aanwezigheid van rat corticale primaire kweek bevattende neuronen, astrocyten, oligodendrocyten en microglia 8.
In dit protocol, tonen we een methode die ChR2 gebruikt in een co-cultuur systeem om synaptische verbindingen tussen de rat corticale neuronen en neuronen afgeleid van humane geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) ondervragen. We beschrijven stappen te ontleden en oogsten hersenweefsel 9 en muis neurale stamcellen handhaven en differentiëren (NPC) in astrocyten en menselijke NPC into neuronen de co-cultuur systeem. Om deze co-cultuur systeem, gebruikten we de integratie vrije herprogrammering beschreven door Okita et al. 10 menselijke iPSCs genereren. Deze iPSCs werden vervolgens efficiënt gedifferentieerd in NPCs in chemisch gedefinieerde omstandigheden met behulp van kleine moleculen remmers zoals beschreven door Li et al. 11
In de co-culturen, kunnen de verschillende populaties van neuronen worden geïdentificeerd via detectie van ChR2 meningsuiting in corticale neuronen en tagging van iPSC-afgeleide neuronen via de fluorescerende eiwit, tandem dimeer Tomaat (tdTomato). Combineren elektrofysiologische opnames van iPSC afgeleide neuronen met optogenetic fotostimulering van de corticale neuronen maakt beoordeling van het vermogen van deze twee typen neuronen circuits met elkaar vormen. Specifiek fotostimulering van ChR2 expressie corticale neuronen roepen synaptische responsen in iPSC afgeleide neuronen die synaptische circuits gevormdde photostimulated corticale neuron netwerk. We laten zien dat verhoogde postsynaptische stromingen inderdaad worden gedetecteerd in iPSC-afgeleide neuronen onder dergelijke omstandigheden. Dit protocol maakt de beoordeling van synaptische schakelingen onder verschillende experimentele condities, waaronder recapitulatie van verschillende neurologische ziektemodellen met iPSCs afgeleid van fibroblasten van patiënten met de ziekte.
Protocol
OPMERKING: Alle experimenten worden uitgevoerd volgens de protocollen door de Institutional Animal Care en gebruik Comite op SingHealth goedgekeurd.
1. Oogsten vroege postnatale Mouse Brains
- Voor dissectie Bereid de hippocampus weefsel ontsluitingsoplossing: 10 gl papaïne per 1 ml 1x Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) (+ 1% HEPES) met Deoxyribonuclease I (DNase I) (250 U / ml) en Dispase II (1 U / ml). Voeg ongeveer 2,5 ml van het weefsel ontsluitingsoplossing en filteren met behulp van een 0,20 um filter. Bewaar de oplossing warm bij 37 ° C tot gebruik.
- Verdoven van de postnatale dag 5 (P5) muizen pups door ze in ijs gedurende 5 min. Verwijderen uit ijs en test voor de pijn reflex via teen of staart knijpen. Spuit de pups met 70% ethanol. Onthoofden de pups en plaats de kop in een petrischaaltje over ijs.
- Een insnijding in de huid langs de middellijn van de basis van de schedel aan de neus, met een paar kleine scissors of fijne ontleden tang. Schil open de huid en maakt een soortgelijke incisie door de schedel. Voeg twee extra horizontale sneden aan elke kant van de schedel, een rostrale (bij bregma) en een caudaal (de lambda).
- Schil open de schedel langs de ingesneden lijnen om de onderliggende hersenen bloot te leggen. Gebruik een pincet om de schedel bovenop de olfactorische bollen, en eventuele middellijn bot tussen hen te verwijderen. Doe dit terwijl de kop stabiel met een pincet in de niet-ontleden de hand.
- Gemak het platte gedeelte van een spatel tussen het ventrale deel van de hersenen en de basis van de schedel aan het caudale einde. Houd de spatel evenwijdig aan de basis van de schedel onder de hersenen, verplaatst richting het rostrale einde van de schedel om eventuele verklevingen tussen de hersenen en de basis van de schedel verbreken.
- Schep de hersenen met de spatel en plaats deze in een petrischaal met ijskoude 1x EBSS (+ 1% HEPES). Houd weefsels ondergedompeld te allen tijde.
- Voor iedereenmicro-dissectie stappen, werken onder een dissectie microscoop en gebruik een paar fijne ontleden pincet in elke hand, één voor het snijden van weefsel, en de andere voor het houden van het weefsel stabiel.
- Maak een snee juist achter de hersenschors te scheiden van de achterhersenen. Knip langs de middellijn aan de hersenschors te scheiden in de twee hersenhelften. Verwijder de hersenvliezen uit de cerebrale hemisferen.
- Plaats een hemisfeer mediale zijde en plaats de tang in de laterale ventrikel onder de hippocampus. Snijd de middenhersenen weg.
- Maak snijdt op de bovenste en onderste uiteinden van de hippocampus, en bij de dentate / entorhinale cortex knooppunt de hippocampus van de cortex isoleren. Verzamel de hippocampus in een schotel met ijskoude 1x EBSS (+ 1% HEPES).
2. hippocampus Tissue Dissociatie
- Breng de hippocampus naar een schotel met de voorverwarmde hippocampus weefsel spijsvertering oplossing. Mince thij hippocampale weefsels zo fijn mogelijk en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C.
- Zacht dissociëren weefsels in afzonderlijke cellen door mechanische pipetteren en overdracht cellen in een 15 ml centrifugebuis.
- Centrifugeer bij 200 xg gedurende 5 minuten en verwijder het supernatant.
- Resuspendeer celpellet in 20 ml 0,5 x Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) met sucrose (0,9 M) en gecentrifugeerd bij 200 xg gedurende 10 min.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer celpellet in 2 ml NPC onderhoud medium (tabel 1), die bovenop 10 ml 4% runderserumalbumine (BSA) in 1X EBSS-oplossing en centrifugeer bij 200 xg gedurende 5 minuten.
- Verwijder supernatant en voeg muis NPC onderhoudsmedium (tabel 1) de cel pellet. Zachtjes pipet op en neer 5-10 keer om ervoor te zorgen cel pellet is opgedeeld in enkele cellen.
- Overdracht medium dat cellen in vooraf Matrigel beklede platen en voeg epidermale groeifactor (EGF) en fibroblast groeifactor 2 (FGF2) (beide 20 ng / ml) heparine (5 mg / ml). Incubeer de platen bij 37 ° C en 5% CO2.
3. Onderhoud van Adherent Mouse hippocampus NPCs
- Bereid de gecoate platen / flessen minstens een uur voorafgaand aan de passage muis hippocampus NPCs. Voeg genoeg Matrigel aan het oppervlak van elke plaat of kolf bedekken en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
- Verwijder het afdrukmateriaal uit 90% samenvloeiende muis NPC culturen en een keer wassen met 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), dan zuigen PBS uit.
- Voeg genoeg cel onthechting oplossing zodat iedere put / kolven en incubeer gedurende 5 min bij 37 ° C.
- Zorg ervoor dat alle cellen hebben losgemaakt door te kijken onder een omgekeerde helder veld microscoop bij 10X vergroting. Als er nog steeds cellen bevestigd, incubeer cultuur schip voor een verdere 1-2 min en laat cellen weer. Voeg twee keer zoveel Dulbecco's Modified Eagle Medium / Ham's F-12 Nutrient Mixture (DMEM / F-12)als cel onthechting oplossing van de putjes / flessen nadat alle cellen losgemaakt.
- Transfer DMEM / F-12 bevattende cellen in een 15 ml centrifugebuis en centrifugeer bij 200 xg gedurende 5 minuten.
- Verwijder supernatant en resuspendeer celpellet in 5 ml muis NPC onderhoudsmedium (Tabel 1). Zachtjes pipet op en neer te breken cel pellet in enkele cellen.
- Plaat een derde van de totale cellen in nieuwe cultuur putten / flessen en vul voldoende kweekmedium aangevuld met EGF en FGF2. Kweekvaten Incubeer bij 37 ° C en 5% CO2. Vullen medium elke tweede dag en splitsen cellen 1: 3 om de 3 tot 4 dagen. Vermijd overmatige groei van de muis NPC culturen om aggregatie en onthechting te voorkomen.
4. differentiatie van muis NPCs in Astrocyten
- Bereid poly-L-lysine (PLL) / laminin gecoate 12 mm dekglaasjes minstens een dag van tevoren voor het initiëren van differentiatie van de muis NPCs in astrocyten. Cov toevoegenerslips in een 24-well plaat en bedekken gehele oppervlak van putjes met voldoende PLL (1 mg / ml in boraatbuffer).
- Incubeer de plaat overnacht bij 4 ° C. De volgende dag, verwijder PLL en een keer wassen met 1x PBS.
- Voeg laminine (1 mg / ml in ijskoude DMEM / F-12), weer die het gehele oppervlak van elk putje en vervolgens geïncubeerd gedurende ten minste 4 uur bij 37 ° C.
- Verwijder het afdrukmateriaal uit de muis NPC culturen en een keer wassen met 1x PBS vervolgens te zuigen PBS uit.
- Voeg genoeg cel onthechting oplossing zodat iedere put / kolven en incubeer gedurende 5 min bij 37 ° C.
- Zorg ervoor dat alle cellen dan hebben losgemaakt voeg tweemaal de hoeveelheid DMEM / F-12 als cel onthechting oplossing van de putjes / kolven.
- Transfer DMEM / F-12 bevattende cellen in een 15 ml centrifugebuis en centrifugeer bij 200 xg gedurende 5 minuten.
- Verwijder supernatant en resuspendeer cellen in 5 ml astrocyten differentiatie medium (tabel 1). Zachtjes pipet cel suspension op en neer te breken cel pellet in enkele cellen. Tel het aantal afzonderlijke cellen met een hemocytometer.
- Plate cellen bij 5 x 10 4 cellen / cm2 in 500 pl medium per putje van een 24-wells plaat. Incubeer de platen bij 37 ° C en 5% CO2. Vervang de helft van het medium met vers medium om de dag. Muis NPCs snel differentiëren tot astrocyten binnen 2 dagen en worden gedifferentieerd voor een week voor aanvang van verdere experimenten.
5. Oogsten Embryonale Rat Brains en Cortical Tissue Dissociatie
- Verwijder astrocyt differentiatie medium (tabel 1) van astrocyten en vervang primaire neuron medium (tabel 1) ten minste 4 uur voor het begin oogst van embryonale rattenhersenen.
- Voor dissectie Bereid de corticale weefsel ontsluitingsoplossing: 10 gl papaïne per 1 ml 1x EBSS (+ 1% HEPES) met 12,1 mg / ml L-cysteïne. Maken ongeveer 20,5 ml van het weefsel ontsluitingsoplossing en filteren met behulp van een 0,20 um filter. Bewaar de oplossing warm bij 37 ° C tot gebruik.
- Euthanaseren de zwangere dam door kooldioxide stikken met behulp van samengeperst gas. Test voor de pijn reflex via teen of staart knijpen.
- Leg het dier ventrale zijde naar boven op een absorberend kussen en genieten van haar buikstreek met 70% ethanol. Huidplooi met een pincet en een laterale incisie met een paar chirurgische schaar, breed genoeg om de buik bloot. Pak het buikvlies met de tang en opengesneden de buikholte.
- Til de baarmoeder hoorn met de tang en snijd deze gratis langs de mesometrium. Plaats de ontleed baarmoeder in een petrischaal over ijs. Scheid elk embryo hierdoor de baarmoeder weefsel daartussen.
- Maak een insnijding in de embryonale weg. Voorzichtig de dop van de foetus door de opening. Onthoofden de foetus en plaats het hoofd in een petrischaal over ijs.
- Om embryon oogstenic de hersenen van ratten, volg dan de beschrijving van de stappen 1,3 tot 1,5.
- Om corticale weefsels ontleden, plaats een hersenhelft laterale kant naar boven. Snijd het halfrond in twee zijdelings uit het midden. Gooi helft dichter bij de basis van de hersenen. Trim het weggesneden weefsel aan de middenhersenen te verwijderen.
- Breng de corticale weefsel om een schotel met de voorverwarmde corticale weefsel spijsvertering oplossing. Hak de corticale weefsels zo fijn mogelijk en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C.
- Breng het corticale weefsel van het weefsel ontsluitingsoplossing in een 50 ml centrifugebuis die 10 ml voorverwarmde primaire neuron medium (tabel 1). Distantiëren de corticale weefsels door herhaaldelijk pipetteren ze op en neer in een serologische pipet tot een homogene oplossing zonder stukken weefsel wordt verkregen.
- Passeert het weefsel oplossing door een 70 micrometer cel zeef om te filteren op de resterende weefsel klonten. Aliquot het weefsel oplossing in 15 mlcentrifugebuizen, toevoeging van ongeveer 3 ml per buisje.
- Voeg 800 gl 7,5% BSA in 1x PBS onderaan elke buis, die twee lagen met het weefsel oplossing boven en BSA onderaan.
- Centrifugeer bij 200 xg gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant, opzuigen van het grensvlak van de twee lagen. Storen de cel pellet op de bodem van de buis.
- Resuspendeer elk celpellet in 1 ml primaire neuron medium (tabel 1) en gecombineerd in 15 ml centrifugebuis. Bepaal de celdichtheid met behulp van een hemocytometer.
6. Electroporatie en Plating van primaire corticale neuronen
OPMERKING: Genoverdracht kan worden verkregen door verschillende werkwijzen, waaronder elektroporatie, calciumfosfaat transfectie en virale transductie. In dit protocol beschrijven we elektroporatie leveren ChR2 construct in primaire corticale neuronen.
- Centrifuge 6 x 10 6 rat corticale een neuronenT 200 xg gedurende 5 minuten en verwijder het supernatant. Ten minste 6 x 10 6 corticale neuronen vereist elektroporatie om de vorming van een neuronaal netwerk te verzekeren door overlevende neuronen.
- Voeg 100 ul van elektroporatie oplossing voor pellet cel en opnieuw in suspensie voorzichtig. Combineer 100 pi van de celsuspensie met 6 ug pLenti-synapsine-hChR2 (H134R) -EYFP-WPRE 4 plasmide opnemen en overbrengen naar een gecertificeerd cuvet. Vermijd het produceren van luchtbellen tijdens de overdracht.
- Selecteren en geschikt programma aanvragen elektroporatie volgens de instructies van de fabrikant.
- Na elektroporatie, voeg 500 pl MEM naar cel / DNA suspensie aan de cuvet. Breng het monster in 11,5 ml primaire neuron medium (tabel 1) en opnieuw in suspensie voorzichtig. De totale hoeveelheid media is voldoende voor een volledige 24-wells plaat. Aliquot 500 ul van medium voor elke well van een 24-wells plaat. Incubeer plaat bij 37 ° C en 5% CO2. 7. Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen
- Cultuur humane fibroblasten in DMEM aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) in 6-well platen.
- Voordat met herprogrammering van fibroblasten, laag 6 putjes met Matrigel en incubeer gedurende ten minste een uur bij kamertemperatuur geroerd. Bij 80% samenvloeiing, verwijder media uit fibroblastculturen en een keer wassen met 1x PBS.
- Voeg voldoende 0.25% trypsine-EDTA gehele bord bedekken en incubeer bij 37 ° C gedurende 10 min.
- Wanneer cellen losgeraakt van putten, voeg tweemaal de hoeveelheid DMEM met 10% FBS als trypsine trypsine digestie blussen. Zachtjes pipet celsuspensie op en neer te breken cellen. Tel het aantal afzonderlijke cellen met een hemocytometer.
- Transfer 7 x 10 5 cellen in een 15 ml centrifugebuis en centrifugeer de celsuspensie bij 200 xg gedurende 5min.
- Verwijder supernatant en resuspendeer celpellet in elektroporatie oplossing. Electroporate fibroblasten volgens de instructies van de fabrikant. Resuspendeer cellen in 100 pl elektroporatie buffer en voeg 1 pg van elk episomale vector. Electroporate cellen met de instellingen van 1650 V, 10 ms en 3 keer pulsen.
- Overdracht celsuspensie in DMEM aangevuld met 10% FBS en plaat 5 x 10 4 cellen per putje van een 6-wells plaat. Incubeer de platen bij 37 ° C en 5% CO2.
- Na 48 uur, verwijder media uit getransfecteerde fibroblastculturen en te vervangen door mTeSR medium. Vervang voedingsbodems dagelijks tot geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC) kolonies zijn klaar om te worden geïsoleerd. iPSC kolonies kunnen worden waargenomen na 28-35 dagen.
- Wanneer klaar voor isolatie, mechanisch snijden een iPSC kolonie en zaaien in mTeSR medium met 10 uM Rho-geassocieerde proteïne kinase (ROCK) inhibitor (Y-27632) op een Matrigel beklede 6-well plaat 12. Vervang kweekmedium dagelijks.
- Wanneer iPSC culturen zijn ongeveer 20% samenvloeiing, verwijder mTeSR medium en vervang neurale inductie medium (tabel 1). Vullen elke tweede dag medium.
- Na 7 dagen, verwijder neurale inductie medium en vervang met menselijke NPC onderhoud medium (tabel 1). Vullen medium om de dag tot 7 dagen vóór passage culturen.
- Vóór passeren van culturen, laag platen / kolven met Matrigel bij kamertemperatuur gedurende ten minste een uur.
- Verwijder het afdrukmateriaal uit samenvloeiende menselijke NPC culturen en een keer wassen met 1x PBS vervolgens te zuigen PBS uit.
- Voeg genoeg cel detachement oplossing te dekken alle putjes vervolgens incubeer gedurende 5 minuten bij 37 ° C.
- Zorg ervoor dat alle cellen hebben losgemaakt. Voeg tweemaal het bedrag van DMEM /F-12 als cel onthechting oplossing van de putjes / kolven.
- Transfer DMEM / F-12 bevattende cellen in een 15 ml centrifugebuis en centrifugeer bij 200 xg gedurende 5 minuten.
- Verwijder supernatant en resuspendeer cellen in 5 ml humaan NPC onderhoudsmedium (Tabel 1). Zachtjes pipet celsuspensie op en neer te breken cellen.
- Plaat een derde van de totale cellen in Matrigel gecoate cultuur putten / flessen en vul voldoende medium aangevuld met 10 uM Y-27632. Kweekvaten Incubeer bij 37 ° C en 5% CO2.
- Split kweken 1: 3 om de 3 tot 4 dagen en vullen medium elke andere dag. Handhaaf de menselijke NPC culturen bij hoge dichtheid om differentiatie te voorkomen.
- Voeg de lentivirale vector Synapsin1-tdTomato menselijke NPC cultuur voor het begin van differentiatie in neuronen. Bereid astrocyte / corticale neuron co-cultureneen dag van tevoren vóór differentiëren menselijke NPC's.
- Was menselijke NPC kweken eenmaal met 1x PBS en voeg voldoende mobiele onthechting oplossing aan alle putjes cover / kolven vervolgens geïncubeerd gedurende 5 min bij 37 ° C.
- Zorg ervoor dat alle cellen hebben losgemaakt. Voeg twee keer de hoeveelheid DMEM / F-12 als cel onthechting oplossing van de putjes / kolven. Breng in een 15 ml centrifugebuis. Centrifugeer bij 200 xg gedurende 5 minuten.
- Verwijder supernatant en resuspendeer cellen in 5 ml neuronale differentiatie medium (tabel 1). Zachtjes pipet celsuspensie op en neer te breken cel pellet in enkele cellen. Tel het aantal afzonderlijke cellen met een hemocytometer.
- Zorgvuldig aspireren medium uit astrocyten / corticale neuron culturen. Plate menselijke NPC bij 5 x 10 3 cellen / cm2 in 500 pi van neuronale differentiatie medium (tabel 1) aangevuld met 10 pM Y-27632 per 24-well. Toe zachtjes medium dat de menselijke NPC's in elk putjeom te voorkomen dat het verstoren van de astrocyten en corticale neuronen.
- Incubeer de platen bij 37 ° C en 5% CO2. Vervang de helft van het medium met vers medium elke twee tot drie dagen gedurende ten minste 28 dagen.
- Bevestigen of menselijk iPSCs gedragen als volwassen neuronen.
- Vind cellen onderscheiden van menselijk iPSCs door visualisatie van tdTomato behulp van een rechtopstaande confocale microscoop uitgerust met een 60x (0.9 NA) onderdompeling in water lens.
- Registratiemodule pipet een weerstand van 4-6 M. perfuseren cellen bij kamertemperatuur in een externe oplossing (Tabel 1) geborreld constant met 95% O2 / 5% CO2. Vul de opname micropipet interne oplossing (Tabel 1).
- Patch tdTomato + cel in whole-cell-modus en opnemen actiepotentiaal afvuren in reactie op de huidige injectie (1 sec duur, stappen van 10 Pa) in curhuren klem.
- Bevestigen als actiepotentiaal van corticale cellen die ChR2 betrouwbaar wordt opgeroepen door licht stimulatie.
- Zoek corticale cellen die ChR2 door visualisatie van GFP onder een confocale microscoop. Voeren whole-cell patch clamp opname op corticale cellen door volgende stappen 10.1.2 naar 10.1.3.
- Controleer actiepotentiaal wordt betrouwbaar opgeroepen door licht verlichting met kwik booglamp (100 W). De golflengte van excitatie filter 480/40 nm.
- Voeren optogenetische stimulatie.
- Patch tdTomato + cel in whole-cell-modus en stel de spanning klem op -70mV. Filter huidige signalen op 2 kHz en digitaliseren bij 10 kHz. Monitor serieweerstand variërend van 10 tot 20 M consistentie tijdens opnames.
- Stimuleer hele veld met 100 W kwiklamp met 480/40 nm excitatie filter voor 30 sec.
- Record postsynaptische stromingen (PSC) van gepatchte cel veroorzaakt door fotostimulatie van ChR2 expressie presynaptische corsche neuronen. Detecteren en meten van PSC's. Stel drempel voor amplitude en stromingen gebied op 5 PA en 20 pct, respectievelijk. Handmatig controleren deze gebeurtenissen op elke niet-PSC sporen weggooien.
OPMERKING:. Deze methode is aangepast van Okita et al 10
8. Neurale Inductie en onderhoud van menselijke NPCs
Opmerking. Deze werkwijze is beschreven door Li et al 11
9. Differentiatie van Human NPCs in Neuronen in co-culturen
10. elektrofysiologische registraties van iPSC-afgeleide Neuronen
Representative Results
Hier wordt een protocol waarin de verschillende stappen van het genereren van een co-cultuur bestaat astrocyten corticale neuronen en menselijke neuronen geïllustreerd. Human iPSCs werden verkregen door het herprogrammeren van fibroblasten behulp episomale vectoren 10 en gespecificeerd in een neuraal afstamming met een cocktail van kleine-molecule inhibitoren, waardoor NPC's 11, die werden gehandhaafd op een hoge dichtheid (Figuur 1A). Verschillende stappen zijn nodig om de co-cultuur te genereren: differentiatie van de muis NPCs in astrocyten, beplating van de rat corticale neuronen uiten ChR2, en het zaaien van de menselijke NPCs getagd met tdTomato (Figuur 1B). Op dag 2 van differentiatie kan gliale fibrillair zuur eiwit (GFAP) + astrocyten gemakkelijk worden waargenomen in onze kweken (figuur 1C). Mouse NPC mochten differentiëren voor minstens een week voor electroplating corticale neuronen tot expressie ChR2 op de astrocyten monolaag (figuur 1D). Na 34 weken menselijke NPC differentiatie werden tdTomato + neuronen gedetecteerd in de kweken (figuur 1E).
Deze co-kweeksysteem maakt consistente detectie van postsynaptische stroom individueel iPSC afgeleide neuronen in reactie op licht stimulatie (Figuur 2A). Wanneer gestimuleerd door licht, werden actiepotentialen gegenereerd in corticale neuronen uiten ChR2 (Figuur 2B). iPSC afgeleide neuronen ook prikkelbaar (figuur 2C), met verhoogde actiepotentiaal afvuren als de amplitude van depolariserende stroompulsen verhoogd (Figuur 2D). Zo, deze cellen vertonen volwassen neuronale eigenschappen. Bij afwezigheid van licht, ontvangen iPSC afgeleide neuronen spontane synaptische inputs (figuur 2E). Deze innerlijke postsynaptische stromingen werden voornamelijk gemedieerd door AMPA-receptoren, omdat stromen door GABA-receptoren naar buiten zou zijn en NMDA-receptoren niet dragen stroom eent de holding potentiaal van -70 mV. Tenminste enkele van deze ingangen waren van presynaptische corticale neuronen tot expressie ChR2, omdat licht stimulatie sterk de frequentie van postsynaptische stroom (figuur 2E) verhoogd. Het tijdsverloop van de stijging van synaptische ingang in Figuur 2F: fotostimulering van de corticale neuronen gedurende 30 sec lange lichtflits volgehouden. Terwijl de frequentie van PSC was verhoogd wanneer ChR2 expressie corticale neuronen werden photostimulated (figuur 2G), hun amplitude werd niet beïnvloed (figuur 2H). Samengevat geven deze resultaten aan dat de iPSC afgeleide neuronen vertoonden volwassen neuronale eigenschappen en synaptische verbindingen met presynaptische corticale neuronen kunnen vormen.
Figuur 1: Schema's voor het genereren van co-cultuursysteem. (A) Timeline voor het herprogrammeren van menselijke fibroblasten in iPSCs en neurale inductie naar NPCs. (B) Timeline voor terminale differentiatie van humane NPCs tot rijpe neuronen op corticale neuronen en astrocyten culturen. (C) Muis NPCs snel differentiëren in GFAP + astrocyten na 2 dagen in vitro. (D) Na één week werden corticale neuronen tot expressie ChR2 uitgeplaat op GFAP + astrocyten. (E) 4 tot 5 weken na differentiatie van menselijke NPC, elektrofysiologische opnames werden uitgevoerd op tdTomato + neuronen. Schaalbalken vertegenwoordigen 100 urn.
Figuur 2: optogenetische analyse van functionele synaptische connectiviteit. (A) iPSC-afgeleide cellen gelabeld met tdTomato (rood) werden samen gekweekt met corticale neuronen uiting van de licht-geactiveerdekanaal, ChR2 (groen). Opnames van iPSC-afgeleide neuronen onthulde postsynaptische stroom (PSC) reacties, die zou kunnen komen van zowel de corticale neuronen of andere iPSC-afgeleide neuronen. (B) Verlichting (blauwe balk) opgeroepen een reeks actiepotentialen in corticale neuronen uiten ChR2. ( C) iPSC-afgeleide cellen worden opgeroepen door de huidige injectie. (D) Firing vs huidige curve van iPSC-afgeleide cellen. (E) fotostimulatie van de ChR2 expressie corticale neuronen (blauwe balk) steeg de frequentie van de PSC's in iPSC-afgeleide neuronen . (F) Tijdsverloop van de toename PVC frequentie door fotostimulering. Blauwe balk geeft de tijd van fotostimulatie. (G, H) Terwijl PSC frequentie verhoogd door fotostimulering (G), PSC amplitude beïnvloed (H). * Geeft p <0,05 vergeleken met controle van t-toets.
Discussion
Optogenetics biedt tijdelijke en ruimtelijke precisie voor de activering van bepaalde populaties van neuronen 13. In onze experimenten, het gehele gebied van het microscoopobjectief verlicht werd gedurende 30 sec foto-stimuleren alleen corticale neuronen tot expressie ChR2. Dit liet ons toe om te bepalen of synaptische verbindingen gevormd tussen verschillende populaties van neuronen in de co-cultuur. Onze resultaten lieten zien dat fotostimulering toeneemt PSC frequentie iPSC afgeleide neuronen, hetgeen aantoont dat deze neuronen ontvangen synaptische input van presynaptische corticale neuronen tot expressie ChR2. Dit op zijn beurt vast dat de iPSC afgeleide neuronen succesvol in kringen met de corticale neuronen opgenomen.
Er zijn verschillende kritische stappen voor het genereren van deze co-kweeksysteem. Het is belangrijk dat de muis NPC-afgeleide astrocyten gezond, met minimale celdood, alvorens platingandere celtypen. Corticale neuronen en menselijke NPC's hechten goed op gezonde astrocyten en elektrofysiologische opnames zijn sterk afhankelijk van de kweekomstandigheden. De andere belangrijke stappen in dit protocol zijn de elektroporatie en plating van corticale neuronen op astrocyten culturen. Als een groot aantal cellen sterven na elektroporatie, is het belangrijk dat ten minste 6 miljoen corticale neuronen geëlektroporeerd voor plating op astrocyten in 24-wells platen. We hebben waargenomen dat als er minder dan 6 miljoen cellen werden geëlektroporeerd, het aantal neuronen die overleven niet vormen een dicht netwerk van neuronen, die elektrofysiologische opnames beïnvloed. Het aantal geëlectroporeerd corticale neuronen moet ook consistent zijn voor elke co-cultuur experiment om vergelijkingen tussen verschillende onderzoeken mogelijk te maken. Voor alle stappen waarbij enzymatische digestie, is het noodzakelijk niet aan cellen in digestieve oplossing reactie te lang als het kan leiden tot celdood.
Ditbenadering kan worden gebruikt om het vermogen van neuronen afkomstig van patiëntspecifieke fibroblasten synaptische contacten met andere neuronen vormen screenen. Neuronen afgeleid van fibroblasten van patiënten die lijden aan neurologische aandoening Rett syndroom (RTT) vertonen synaptische transmissie defecten: RTT neuronen vertonen een significante daling PSC frequentie en amplitude vergeleken met gezonde neuronen, waarschijnlijk door minder synaptische connectiviteit 14. Onze co-cultuur systeem maakt het mogelijk onderzoek van effecten van geneesmiddelen op de neuronen weergeven van defecten in de ontwikkeling. U nu door toevoeging van verbindingen van belang verricht tijdens het zaaien van zieke menselijke NPC en tijdens continue blootstelling aan stoffen gedurende de tijd van neuronale differentiatie.
Hoewel deze co-kweeksysteem kan ook worden gebruikt als model voor drug testen, een beperking van deze benadering is dat het proces van onderzoeken van de effecten van elk kandidaat-verbinding lang en vervelend als kan wordenHet is niet een high-throughput screening methode. Na behandeling met kandidaat-verbindingen, iPSC afgeleide neuronen moeten individueel worden toegewezen aan de effecten van elke verbinding op PSC bepalen. Bovendien zijn er momenteel geen vele beschikbare fibroblasten en iPSCs van patiënten. Daarom zal het van belang in de nabije toekomst meer geduld cellen en ook dit protocol voor high throughput screening passen. Bijvoorbeeld door het merken iPSC afgeleide neuronen met een indicator, bijvoorbeeld genetisch gecodeerde sensoren van ionen of membraanpotentiaal, het zou mogelijk zijn om de doorvoersnelheid aanzienlijk verlengen door-side stappen tijdrovende elektrofysiologische procedure. Zoals het hele proces van het genereren van deze co-cultuur systeem, van de herprogrammering fibroblasten tot het uitvoeren van elektrofysiologische opnames, is meer nodig dan 90 dagen, is het raadzaam dat ofwel de mens iPSCs of NPC's worden uitgebreid, na de herprogrammering en neurale inductie stappen respectievelijken gecryopreserveerd de tijd die nodig is voor toekomstige experimenten verminderen.
In onze experimenten hebben wij op ChR2 in corticale neuronen onder synapsin1 promoter. Omdat deze promotor is pan-neuronale, we vermoedelijk werden fotostimulerende zowel remmende en prikkelende corticale neuronen. Als het doel van toekomstige experimenten specifiek ondervragen ofwel remmend of exciterende schakelingen, meer specifiek kunnen promoters worden gebruikt. Als alternatief zou corticale neuronen worden verkregen uit transgene (of-virus ingespoten muizen) waar ChR2 expressie specifiek is gericht op genetisch bepaalde subpopulaties van neuronen. Bijvoorbeeld, het oogsten corticale weefsel van een muis die Cre recombinase is uitgedrukt in parvalbumin bevattende interneuronen (PV interneuronen) die gekruist met een muis met floxed ChR2 een situatie waarin alleen corticale neuronen tot expressie ChR2 zal PV interneuronen 15 opleveren. Het gebruik van dergelijke ChR2 expressie interneuronen in onze co-culture systeem zal de bepaling van de vraag of een gepatchte iPSC-afgeleide neuron is in staat om op te nemen in een circuit met PV interneuronen in te schakelen.
Gebaseerd op een eerdere studie 9 corticale neuronen volwassen met overlappende dendrieten na 14 dagen in vitro. Dus als fotostimulering geen antwoord van een patched iPSC afgeleide neuron wekken, moet aangeven dat het neuron de mogelijkheid om synaptische verbindingen met corticale neuronen heeft. Een iPSC-afgeleide neuron is in staat om synaptische input te krijgen, hetzij van andere iPSC-afgeleide neuronen of corticale neuronen. Als traditionele patch clamp opnames werden gebruikt, zou het niet mogelijk zijn om onderscheid te maken waar de synaptische ingang vandaan komt. Het voordeel van ons systeem is dat postsynaptische antwoorden van corticale presynaptische ingang selectief kan worden opgeroepen en geïdentificeerd. De hier geschetste werkzaamheden een eenvoudige benadering van het vermogen van iPSC afgeleide neuronen evalueren integrerenin een bepaalde neuronale netwerk.
Acknowledgments
Wij danken K. Deisseroth en S. Je voor de ChR2 en Synapsin1-tdTomato lentivirale constructen respectievelijk C. Chai voor het delen van expertise en protocol over iPSC generatie, WY Leong voor technische ondersteuning, de leden van de Goh lab voor het delen van reagentia en expertise. Dit werk werd ondersteund door Abbott Nutrition en de Academic Centre of Excellence (ACE) onderzoek award van GlaxoSmithKline (GSK) voor ELG, door de National Research Foundation Singapore onder zijn Competitive Research Program (NRF 2008 NRF-CRP 002-082) om ELG en GJA, en door de World Class Institute (WCI) Programma van de National Research Foundation Korea (NRF), gefinancierd door het Ministerie van Onderwijs, Wetenschap en Technologie van Korea (MEST) (NRF Grant Aantal: WCI 2009-003) om GJA
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurocult Proliferation Kit (Mouse) | STEMCELL Technologies | 5702 | Contains NSC Basal Medium and NSC Proliferation Supplement |
| Epi5 Episomal iPSC Reprogramming Kit | Invitrogen | A15960 | |
| DMEM/F12 | Lonza | 12719F | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103049 | |
| MEM without glutamine | Invitrogen | 11090081 | |
| N2 | Invitrogen | 17502048 | |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030081 | |
| GlutaMAX supplement | Invitrogen | 35050061 | |
| PenStrep | Invitrogen | 15140122 | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| Human LIF | Invitrogen | PHC9484 | |
| CHIR99021 | Miltenyi Biotech | 130103926 | |
| SB431542 | Sigma | S4317 | |
| Compound E | Merck Millipore | 565790 | |
| EGF | Merck Millipore | 324856 | |
| FGF2 | R&D Systems | 233FB025 | |
| Research Grade FBS | Thermo Scientific | SV30160.03 | For astrocyte differentiation medium |
| Defined FBS | Thermo Scientific | SH30070.03 | For primary neuron medium |
| PBS | Thermo Scientific | SH30028.02 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | For primary neuron medium |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Heparin | EMD Millipore | 375095 | |
| Papain | Worthington | 3126 | |
| HBSS | Invitrogen | 14175095 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| Dispase II | STEMCELL Technologies | 7923 | |
| HEPES | Gibco | 15630080 | For harvesting brains |
| EBSS | Invitrogen | 14155063 | |
| L-Cysteine | Sigma | C7352 | |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200056 | |
| 70 µm cell strainer | BD Biosciences | 352350 | |
| 20 µm filter unit | Sartorius Stedim | 16534K | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| NaH2PO4 | Fluka | 71505 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| CaCl2 | Sigma | C1016 | |
| D(+)-Glucose | Sigma | G7520 | For electrophysiological studies |
| K-gluconate | Sigma | P1847 | |
| KOH | KANTO Chemical | 3234400 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | For electrophysiological studies |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Na2ATP | Sigma | A7699 | |
| Na3GTP | Sigma | G8877 | |
| Borosilicate glass capillaries | World precision instruments, Inc | 1604323 | |
| 15 ml centrifuge tube | BD Biosciences | 352096 | |
| 50 ml centrifuge tube | BD Biosciences | 352070 | |
| 24-well plates | Corning | 9761146 | |
| 6-well plates | Corning | 720083 | |
| T25 flasks | Corning | 430641 | |
| 12 mm cover glasses | Marienfeld-Superior | 111520 | |
| AMAXA Rat Neuron Nucleofector Kit | Lonza | VPG1003 | For electroporation of primary cortical neurons |
| Neon Transfection System | Invitrogen | MPK5000 | For electroporation of human fibroblasts |
| Mini Analysis | Synaptosoft | Mini Analysis v.6 | For measurement of PSCs |
| Normal Dermal Human Fibroblasts | PromoCell | C12300 | |
| pLenti-Synapsin-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE | Addgene | 20945 | |
| Mercury short-arc lamp | OSRAM | HBO 103 W/2 |
References
- Wang, H., et al. High-speed mapping of synaptic connectivity using photostimulation in Channelrhodopsin-2 transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (19), 8143-8148 (2007).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (24), 13940-13945 (2003).
- Zhang, F., et al. Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry. Nature. 446 (7136), 633-639 (2007).
- Stroh, A., et al. Tracking stem cell differentiation in the setting of automated optogenetic stimulation. Stem Cells. 29 (1), 78-88 (2011).
- Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, S. -C. Human embryonic stem cell-derived neurons adopt and regulate the activity of an established neural network. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (50), 20189-20194 (2011).
- Viviani, B. Preparation and coculture of neurons and glial cells. Curr Protoc Cell Biol. 32, 2.7.1-2.7.2.1 (2006).
- Braun, H., Günther-Kern, A., Reymann, K., Onteniente, B. Neuronal differentiation of human iPS-cells in a rat cortical primary culture. Acta Neurobiologiae Experimentalis. 72 (30), 219-229 (2012).
- Shivaraj, M. C., et al. Taurine induces proliferation of neural stem cells and synapse development in the developing mouse brain. PLoS ONE. 7, e42935 (2012).
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
- Li, W., et al. Rapid induction and long-term self-renewal of primitive neural precursors from human embryonic stem cells by small molecule inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (20), 8299-8304 (2011).
- Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (50), 424-429 (2011).
- Packer, A. M., Roska, B., Hausser, M. Targeting neurons and photons for optogenetics. Nature Neuroscience. 16 (7), 805-815 (2013).
- Marchetto, M. C. N., et al. A Model for neural development and treatment of Rett Syndrome using human induced pluripotent stem cells. Cell. 143 (4), 527-539 (2010).
- Asrican, B., et al. Next-generation transgenic mice for optogenetic analysis of neural circuits. Frontiers in Neural Circuits. 7, 160 (2013).
