A protocol to generate a co-culture system consisting of neurons derived from induced pluripotent stem cells (iPSCs), primary cortical neurons and astrocytes is described. This co-culture system allows detection of the formation of synaptic contacts and circuits between new, iPSC-derived neurons and pre-existing cortical neurons expressing channelrhodopsin-2.
Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are reprogrammed from human fibroblasts using episomal vectors. Colonies of iPSCs can be observed 30 days after initiation of fibroblast reprogramming. Pluripotent colonies are manually picked and grown in neural induction medium to permit differentiation into neural progenitor cells (NPCs). iPSCs rapidly convert into neuroepithelial cells within 1 week and retain the capability to self-renew when maintained at a high culture density. Primary mouse NPCs are differentiated into astrocytes by exposure to a serum-containing medium for 7 days and form a monolayer upon which embryonic day 18 (E18) rat cortical neurons (transfected with channelrhodopsin-2 (ChR2)) are added. Human NPCs tagged with the fluorescent protein, tandem dimer Tomato (tdTomato), are then seeded onto the astrocyte/cortical neuron culture the following day and allowed to differentiate for 28 to 35 days. We demonstrate that this system forms synaptic connections between iPSC-derived neurons and cortical neurons, evident from an increase in the frequency of synaptic currents upon photostimulation of the cortical neurons. This co-culture system provides a novel platform for evaluating the ability of iPSC-derived neurons to create synaptic connections with other neuronal populations.
I de siste årene har vår forståelse av nevroner og nevronale krets funksjon blitt revolusjonert av flere optogenetic verktøy som styrer nevronale eksitabilitet. Et slikt verktøy er lys-aktivert kation kanal, channelrhodopsin-2 (ChR2): nevroner som uttrykker ChR2 brann aksjonspotensialer i respons til lys stimulering 1-3. Fordi neuroner er normalt ikke følsom for lys, åpner denne bemerkelsesverdige evne nye muligheter for nøyaktig tidsmessig og romlig kontroll av aktiviteten av genetisk definerte populasjoner av neuroner 4 og har sterkt akselerert studier av hjernefunksjon. ChR2 har blitt brukt til stamcelleforskning for ulike formål, fra overvåking neuronal utvikling 5 til å regulere aktiviteten av nevrale nettverk 6.
Her brukte vi ChR2 for å øke nytten av en neuronal ko-kultur-system. Co-kultur systemer gjør vurderingen av interaksjoner mellom ulike celletyper.Ko-kulturer av neuroner og gliaceller, hovedcelletyper i nervesystemet, blir ofte brukt til å undersøke signalering mellom disse forskjellige celletyper, i tillegg til å evaluere betydningen av denne signalisering for fysiologiske responser, forplantning av skade, og for å undersøke molekylære mekanismer som er potensielt involvert i dette signaliserer 7. En tidligere studie viste at menneske iPSCs skille svært raskt inn i nerveceller i nærvær av rotte kortikale primære kultur inneholder nevroner, astrocytter oligodendrocytes og mikroglia 8.
I denne protokollen, viser vi en metode som benytter ChR2 i en co-kultur system for å avhøre synaptiske forbindelser mellom rotte kortikale nevroner og nevroner som stammer fra menneskeskapte pluripotente stamceller (iPSCs). Vi beskriver fremgangsmåten for å dissekere og høste hjernevev 9 samt å opprettholde og skille mus nevrale stamceller (NPC) i astrocytter og menneske NPCer into neuroner for å skape den ko-kultur-system. Å etablere denne co-kultur system, brukte vi integreringen frie omprogrammering metode beskrevet av Okita et al. 10 for å generere menneskelige iPSCs. Disse iPSCs ble så effektivt differensiert i NPCer i kjemisk definerte tilstander ved hjelp av små-molekyl-hemmere som beskrevet av Li et al. 11
I co-kulturer, kan de ulike populasjoner av nerveceller bli identifisert via påvisning av ChR2 uttrykk i kortikale nevroner og merking av IPSC-avledet nevroner via fluorescerende protein, tandem dimer Tomato (tdTomato). Ved å kombinere elektroopptak fra IPSC-avledet nerveceller med optogenetic photostimulation av de kortikale nevroner tillater vurdering av evnen til disse to typer av nerveceller for å danne kretser med hverandre. Spesielt photostimulation av ChR2-uttrykke kortikale nevroner fremkalle synaptiske responser i IPSC-avledet nevroner som har dannet synaptiske kretsermed photostimulated kortikale nevroner nettverk. Vi viser at økt postsynaptiske strømninger er faktisk påvist i IPSC-avledet nevroner under slike forhold. Denne protokollen tillater vurdering av synaptiske kretser under forskjellige eksperimentelle betingelser, inkludert gjentagelse av ulike nevrologiske sykdomsmodeller ved hjelp iPSCs avledet fra fibroblaster fra sykdom pasienter.
Optogenetics gir tids- og steds presisjon for aktivering av definerte populasjoner av nerveceller 13. I våre eksperimenter, ble hele feltet av mikroskopobjektiv belyst i 30 sekunder til foto stimulere bare kortikale nevroner som uttrykker ChR2. Dette tillot oss å avgjøre om synaptiske forbindelser ble dannet mellom ulike populasjoner av nerveceller innenfor co-kultur. Våre resultater viser at photostimulation øker frekvensen PSC i IPSC-avledet nevroner, som viser at disse nevronene motta synaptic innspill fra presynaptiske kortikale nevroner som uttrykker ChR2. Dette i sin tur fastslått at de IPSC-avledet neuroner med hell inkorporert i kretser med de kortikale nevroner.
Det er flere viktige skritt for generering av denne co-kultur system. Det er viktig å sikre at mus NPC-avledet astrocyttkulturer er sunt, med minimal celledød, før du fortsetter med platingav andre celletyper. Kortikale nevroner og menneskelige NPCer feste godt på sunne astrocytter og elektrofysiologiske opptak avhenge sterkt på kultur forhold. De andre viktige skritt i denne protokollen er elektroporering og plating av kortikale nevroner på astrocyttkulturer. Når et stort antall celler dør etter elektroporering, er det viktig å sikre at minst 6.000.000 kortikale neuroner elektroporert for belegging på astrocyttkulturer i 24-brønners plater. Vi har observert at når færre enn 6 millioner celler ble elektroporert, gjorde antall nevroner som overlever ikke danner et tett nevronale nettverk, som påvirket elektrofysiologiske opptak. Antallet elektroporerte kortikale nevroner bør også være ensartet for hvert ko-kultur eksperiment for å tillate sammenligning mellom forskjellige studier. For alle trinn som involverer enzymatisk oppslutning, er det viktig ikke å la cellene i fordøyelses løsning for lenge, da det kan føre til celledød.
Dettetilnærmingen kan brukes til å screene evnen til neuroner avledet fra pasientspesifikke fibroblaster til å danne synaptiske kontakter med andre nerveceller. Neuroner avledet fra fibroblaster fra pasienter som lider av en nevrologisk forstyrrelse Retts syndrom (RTT) oppviser synaptisk transmisjon defekter: RTT neuroner oppviser en betydelig reduksjon i PSC frekvens og amplitude sammenlignet med friske nerveceller, antagelig på grunn av mindre synaptiske tilkobling 14. Vår co-kultur systemet tillater undersøkelse av narkotika effekter på nevroner som viser utviklingsmessige defekter. Dette kan utføres via tilsetning av forbindelser av interesse under såing av syke menneskelige NPC så vel som under kontinuerlig eksponering for forbindelser gjennom hele den tiden av neuronal differensiering.
Mens denne co-kultur systemet kan også brukes som en modell for narkotika testing, en begrensning med denne tilnærmingen er at prosessen med å undersøke effektene av hver kandidat forbindelsen kan være lang og kjedelig somdet er ikke en high-throughput screening-metoden. Etter behandling med kandidatforbindelser, IPSC-avledet nerveceller har til å være individuelt lappet for å bestemme effekten av hver forbindelse på pscs. Dessuten er det i dag ikke mange ledige fibroblaster og iPSCs fra pasienter. Derfor vil det være av interesse i nær fremtid til å ha mer pasientceller og også for å tilpasse denne protokollen for høy gjennomstrømming screening. For eksempel ved merking IPSC-avledet neuroner med en aktivitetsindikator, for eksempel genetisk kodede sensorer av ioner eller membranpotensialet, ville det være mulig å øke gjennomstrømningshastigheten i det vesentlige ved side-pass den tidkrevende elektro prosedyre. Som hele prosessen med å generere denne co-kultur system, fra omprogrammering fibroblaster å utføre elektrofysiologiske opptak, krever mer enn 90 dager, anbefales det at enten den menneskelige iPSCs eller NPCer bli utvidet, etter omprogrammering og nevrale induksjon skritt henholdsvisog kryopreservert å redusere tiden det tar for fremtidige eksperimenter.
I våre eksperimenter, uttrykte vi ChR2 i kortikale nevroner under synapsin1 promoter. Fordi dette promoter er pan-nevronale, vi antagelig ble photostimulating både hemmende og eksitatoriske kortikale nevroner. Hvis målet med fremtidige eksperimenter er å spesifikt avhøre enten hemmende eller eksitatoriske kretser, kan mer spesifikke arrangører brukes. Alternativt kan kortikale nevroner fås fra transgen (eller virus-injisert mus) hvor ChR2 uttrykk er spesielt rettet mot genetisk definerte subpopulasjoner av nevroner. For eksempel høsting kortikale vev fra en mus som har Cre rekombinase uttrykt i parvalbumin holdige interneuroner (PV) interneuroner som krysses med en mus med floxed ChR2 vil gi en situasjon der de eneste kortikale nevroner som uttrykker ChR2 blir PV interneuroner 15. Bruken av en slik ChR2-uttrykk interneuroner i vår samtidige cuLTURE systemet vil gjøre det mulig å bestemme om en oppdatert IPSC-avledet nevron er i stand til å innlemme i en krets med PV interneuroner.
Basert på en tidligere studie 9, kortikale nevroner er modne med overlapp dendritter etter 14 dager in vitro. Dermed, hvis photostimulation ikke fremkaller en respons fra en oppdatert IPSC-avledet neuron, bør det indikere at neuron ikke har evnen til å gjøre synaptiske forbindelser med cortical neurons. En IPSC-avledet nevron er i stand til å motta synaptic innspill enten fra andre IPSC-avledet nevroner eller kortikale nevroner. Hvis tradisjonelle patch clamp opptakene ble brukt, ville det ikke være mulig å skille hvor den synaptiske innspill kommer fra. Fordelen med vårt system er at postsynaptiske svar fra cortical presynaptiske inngang kan selektivt fremkalt og identifisert. Prosedyrene skissert her gi en enkel metode for å evaluere evnen til IPSC-avledet nevroner å integrereinn i et definert nevronale nettverk.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker K. Deisseroth og S. Je for ChR2 og Synapsin1-tdTomato lentiviral konstruksjoner henholdsvis C. Chai for deling av kompetanse og protokollen på IPSC generasjon, WY Leong for teknisk support, medlemmer av Goh lab for deling av reagenser og kompetanse. Dette arbeidet ble støttet av Abbott Ernæring og Academic Centre of Excellence (ACE) forskningspris fra GlaxoSmithKline (GSK) til ELG, ved National Research Foundation Singapore under sin Competitive Research Program (NRF 2008 NRF-CRP 002-082) til ELG og GJA, og av World Class Institute (WCI) Program av National Research Foundation of Korea (NRF) finansiert av departementet for utdanning, vitenskap og teknologi i Korea (MEST) (NRF Grant Antall: WCI 2009-003) til GJA
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Neurocult Proliferation Kit (Mouse) | STEMCELL Technologies | 5702 | Contains NSC Basal Medium and NSC Proliferation Supplement |
Epi5 Episomal iPSC Reprogramming Kit | Invitrogen | A15960 | |
DMEM/F12 | Lonza | 12719F | |
Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
Neurobasal medium | Invitrogen | 21103049 | |
MEM without glutamine | Invitrogen | 11090081 | |
N2 | Invitrogen | 17502048 | |
B27 | Invitrogen | 17504044 | |
L-glutamine | Invitrogen | 25030081 | |
GlutaMAX supplement | Invitrogen | 35050061 | |
PenStrep | Invitrogen | 15140122 | |
BSA | Sigma | A7906 | |
Human LIF | Invitrogen | PHC9484 | |
CHIR99021 | Miltenyi Biotech | 130103926 | |
SB431542 | Sigma | S4317 | |
Compound E | Merck Millipore | 565790 | |
EGF | Merck Millipore | 324856 | |
FGF2 | R&D Systems | 233FB025 | |
Research Grade FBS | Thermo Scientific | SV30160.03 | For astrocyte differentiation medium |
Defined FBS | Thermo Scientific | SH30070.03 | For primary neuron medium |
PBS | Thermo Scientific | SH30028.02 | |
Glucose | Sigma | G8270 | For primary neuron medium |
Sucrose | Sigma | S0389 | |
Heparin | EMD Millipore | 375095 | |
Papain | Worthington | 3126 | |
HBSS | Invitrogen | 14175095 | |
DNase I | Roche | 10104159001 | |
Dispase II | STEMCELL Technologies | 7923 | |
HEPES | Gibco | 15630080 | For harvesting brains |
EBSS | Invitrogen | 14155063 | |
L-Cysteine | Sigma | C7352 | |
Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200056 | |
70 µm cell strainer | BD Biosciences | 352350 | |
20 µm filter unit | Sartorius Stedim | 16534K | |
NaCl | Sigma | S7653 | |
KCl | Sigma | P5405 | |
NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
NaH2PO4 | Fluka | 71505 | |
MgCl2 | Sigma | M8266 | |
CaCl2 | Sigma | C1016 | |
D(+)-Glucose | Sigma | G7520 | For electrophysiological studies |
K-gluconate | Sigma | P1847 | |
KOH | KANTO Chemical | 3234400 | |
HEPES | Sigma | H3375 | For electrophysiological studies |
EGTA | Sigma | E3889 | |
Na2ATP | Sigma | A7699 | |
Na3GTP | Sigma | G8877 | |
Borosilicate glass capillaries | World precision instruments, Inc | 1604323 | |
15 ml centrifuge tube | BD Biosciences | 352096 | |
50 ml centrifuge tube | BD Biosciences | 352070 | |
24-well plates | Corning | 9761146 | |
6-well plates | Corning | 720083 | |
T25 flasks | Corning | 430641 | |
12 mm cover glasses | Marienfeld-Superior | 111520 | |
AMAXA Rat Neuron Nucleofector Kit | Lonza | VPG1003 | For electroporation of primary cortical neurons |
Neon Transfection System | Invitrogen | MPK5000 | For electroporation of human fibroblasts |
Mini Analysis | Synaptosoft | Mini Analysis v.6 | For measurement of PSCs |
Normal Dermal Human Fibroblasts | PromoCell | C12300 | |
pLenti-Synapsin-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE | Addgene | 20945 | |
Mercury short-arc lamp | OSRAM | HBO 103 W/2 | |