Introduction
Under de senaste åren har vår förståelse av neuron och nervkretsfunktion revolutionerats av flera optogenetic verktyg som styr neuronal retbarhet. Ett sådant verktyg är ljusaktiverat katjon kanal, channelrhodopsin-2 (ChR2): nervceller som uttrycker ChR2 brand aktionspotentialer som svar på ljusstimulering 1-3. Eftersom nervceller vanligen inte känslig för ljus, öppnar denna anmärkningsvärd förmåga nya vägar för exakt tids- och rums kontroll av aktiviteten hos genetiskt definierade populationer av nervceller 4 och har kraftigt påskyndat studier av hjärnans funktion. ChR2 har tillämpats på stamcellsforskning för olika ändamål, från övervakning neuronal utveckling 5 till reglera aktiviteten hos neurala nätverk 6.
Här har vi använt ChR2 att öka användbarheten av en neuronal samodlingssystemet. Co-odlingssystem möjliggöra utvärdering av samverkan mellan olika celltyper.Co-kulturer av nervceller och glia, de huvudsakliga celltyper i nervsystemet, används ofta för att undersöka signalering mellan dessa olika celltyper, samt att utvärdera betydelsen av denna signalering för fysiologiska reaktioner, fortplantning av skador och att undersöka molekylära mekanismer som potentiellt är involverade i denna signalering 7. En tidigare studie visade att mänskliga iPSCs differentierar mycket snabbt till neuron i närvaro av råtta kortikala primära kultur innehåller neuroner, astrocyter oligodendrocyter och mikroglia 8.
I detta protokoll visar vi en metod som utnyttjar ChR2 i en samodlingssystemet att förhöra synaptiska kopplingar mellan råtta kortikala neuron och neuron härrör från mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs). Vi beskriver steg för att dissekera och skörd hjärnvävnader 9 samt att underhålla och differentiera mus neurala stamceller (NPC) i astrocyter och mänskliga NPCs into neuroner att skapa samodlingssystemet. För att upprätta denna samodlingssystemet använde vi integrationen fria omprogrammering metod som beskrivs av Okita et al. 10 för att generera mänskliga iPSCs. Dessa iPSCs sedan effektivt differentieras till NPCs i kemiskt definierade förhållanden med hjälp småmolekylära hämmare som beskrivs av Li et al. 11
I co-kulturer, kan de olika populationer av nervceller identifieras via detektion av ChR2 uttryck i kortikala neuron och taggning av iPSC-härledda nervceller via fluorescerande proteinet, tandem dimer Tomat (tdTomato). Kombinera elektrofysiologiska inspelningar från iPSC-härledda nervceller med optogenetic photostimulation av de kortikala neuron medger bedömning av förmågan hos dessa två typer av nervceller för att bilda kretsar med varandra. Specifikt photostimulation av ChR2-uttryck kortikalneuroner framkalla synaptiska svar i iPSC-härledda nervceller som har bildats synaptiska kretsarmed photostimulated kortikala neuron nätverk. Vi visar att ökade postsynaptiska strömmar verkligen upptäcks i iPSC-härledda nervceller under sådana förhållanden. Detta protokoll möjliggör bedömningen av synaptiska kretsar under olika experimentella förhållanden, inklusive rekapitulation av olika modeller neurologiska sjukdoms med hjälp iPSCs härledda från fibroblaster från patienter sjukdoms.
Protocol
OBS: Alla experiment utförs efter protokoll som godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén vid SingHealth.
1. Skörd tidig postnatal Mouse Brains
- Före dissektion, förbereda hippocampusvävnad matsmältningen lösning: 10 pl papain per 1 ml 1x Earles balanserade saltlösning (EBSS) (+ 1% HEPES) med deoxiribonukleas I (DNas I) (250 U / ml) och Dispase II (1 U / ml). Gör ca 2,5 ml av vävnads matsmältningen lösningen och filtrera den med användning av ett 0,20 | im filterenhet. Förvara lösningen varm vid 37 ° C fram till användning.
- Bedöva den postnatal dag 5 (P5) möss valpar genom att sätta dem i is i 5 min. Ta bort från is och test för smärtreflex via tå eller svans nypa. Spraya valparna med 70% etanol. Halshugga valparna och placera huvudena i en petriskål på is.
- Gör ett snitt i huden längs mittlinjen, från basen av skallen till näsan, med ett par små scissors eller fina dissekera pincett. Peel öppna huden och göra en liknande snitt genom skallen. Gör ytterligare två horisontella snitt på varje sida av skallen, en rostralt (vid bregma) och en caudal (vid lambda).
- Peel öppna skallen längs de uppskurna linjer för att exponera den underliggande hjärnan. Använd en pincett för att ta bort skallen liggande lukt lökar, och varje mittlinjen ben mellan dem. Gör detta samtidigt som du håller huvudet stabilt med en pincett i den icke-dissekera handen.
- Ease den plana delen av en spatel mellan den ventrala delen av hjärnan och basen vid stjärtfenan änden. Att hålla spateln parallellt med basen av skallen under hjärnan, flytta den mot den rostrala änden av skallen för att avskilja eventuella adhesioner mellan hjärnan och basen av skallen.
- Scoop hjärnan ut med spatel och placera den i en petriskål med iskall 1x EBSS (+ 1% HEPES). Håll vävnader nedsänkta hela tiden.
- För allamikro-dissektion steg, arbete under ett dissekera mikroskop och använda ett par fina dissekera pincett i varje hand, en för att skära vävnad, och den andra för att hålla vävnaden stabil.
- Gör ett snitt strax posteriort hjärnbarken att skilja den från bakhjäman. Klipp längs mittlinjen för att separera hjärnbarken i sina två halvklot. Ta mening från hjärnhalvorna.
- Placera en halvklotet mediala sidan uppåt och för in pincetten i den laterala ventrikeln under hippocampus. Skär bort mitthjärnan.
- Gör nedskärningar på de överlägsna och underlägsna ändar hippocampus, och nära dentate / entorhinal cortex korsningen för att isolera hippocampus från cortex. Samla hippocampi i en skål med iskallt 1x EBSS (+ 1% HEPES).
2. hippocampus vävnadsdissociering
- Överför hippocampi till en maträtt som innehåller den förvärmda hippocampus vävnad matsmältningen lösning. Mal than hippocampal vävnad till så fint som möjligt och inkubera under 30 minuter vid 37 ° C.
- Dissociera försiktigt vävnader i enstaka celler genom mekaniska pipettering och överföra celler till en 15 ml centrifugrör.
- Centrifugera vid 200 xg under 5 min och avlägsna supernatanten.
- Resuspendera cellpelleten i 20 ml 0,5X Hanks balanserade saltlösning (HBSS) innehållande sackaros (0,9 M) och centrifugera vid 200 xg under 10 min.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 2 ml av NPC underhållsmedium (tabell 1), placerades ovanpå 10 ml 4% bovint serumalbumin (BSA) i 1X EBSS-lösning och centrifugera vid 200 xg under 5 minuter.
- Avlägsna supernatanten och till mus NPC underhållsmedium (tabell 1) till cellpelleten. Pipettera försiktigt upp och ned 5-10 gånger för att säkerställa cellpellet bryts upp i enskilda celler.
- Överföringsmedium innehållande celler i förbelagda Matrigel plattor och lägg epidermal tillväxtfaktor (EGF) och fibroblast tillväxtfaktor 2 (FGF2) (båda 20 ng / ml) i heparin (5 mg / ml). Inkubera plattorna vid 37 ° C och 5% CO2.
3. Underhåll av vidhäftande Mouse hippocampus NPCs
- Förbered de belagda plattor / kolvar minst en timme före passage mus hippocampus NPC. Tillsätt tillräckligt Matrigel för att täcka ytan av varje platta eller kolv och inkubera vid rumstemperatur under 1 h.
- Ta ut mediet från 90% sammanflytande mus NPC kulturer och tvätta en gång med 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) sedan aspirera PBS off.
- Tillsätt tillräckligt celllösgör lösning för att täcka alla brunnar / kolvar och inkubera under 5 min vid 37 ° C.
- Se till att alla celler har lossnat genom att titta under ett inverterat ljusa fält mikroskop vid 10x förstoring. Om det fortfarande finns celler fästa, inkubera odlingskärl i ytterligare 1-2 minuter och kolla cellerna igen. Lägg dubbla mängden Dulbeccos Modified Eagle Medium / Hams F-12 Nutrient Mixture (DMEM / F-12)som för cell lossnar lösning till brunnarna / flaskor när alla celler har lossnat.
- Överför DMEM / F-12 innehållande celler i en 15 ml centrifugrör och centrifugera vid 200 xg under 5 minuter.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 5 ml mus NPC underhållsmedium (tabell 1). Pipett försiktigt upp och ner för att bryta upp cellpelleten i enskilda celler.
- Plate en tredjedel av de totala celler till nya odlingsbrunnar / kolvar och fyll tillräckligt odlingsmedium kompletterat med EGF och FGF2. Inkubera odlingskärl vid 37 ° C och 5% CO2. Fyll medel varannan dag och delade celler 1: 3 var 3 till 4 dagar. Undvik överväxt av mus NPC kulturer för att förhindra aggregering och lossnar.
4. differentiering av Mouse NPCs till astrocyter
- Förbered poly-L-lysin (PLL) / lamininbelagda 12 mm täckglas minst en dag i förväg innan du initierar differentiering av mus NPCs i astrocyter. Lägg coverslips in i en 24-brunnars platta och täcker hela ytan av brunnar med tillräckligt PLL (1 mg / ml i boratbuffert).
- Inkubera plattan över natten vid 4 ° C. Följande dag, ta bort PLL och tvätta en gång med 1x PBS.
- Lägg laminin (1 mg / ml i iskall DMEM / F-12), återigen täcker hela ytan av varje brunn, sedan inkubera i minst 4 timmar vid 37 ° C.
- Ta ut mediet från mus NPC kulturer och tvätta en gång med 1x PBS sedan aspirera PBS off.
- Tillsätt tillräckligt celllösgör lösning för att täcka alla brunnar / kolvar och inkubera under 5 min vid 37 ° C.
- Säkerställ att alla celler har lossnat sedan lägga dubbla mängden DMEM / F-12 som den för cell lossnar lösning till brunnarna / kolvar.
- Överför DMEM / F-12 innehållande celler i en 15 ml centrifugrör och centrifugera vid 200 xg under 5 minuter.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera celler i 5 ml av astrocyter differentieringsmedium (tabell 1). Försiktigt pipett cell suspension upp och ner för att bryta upp cellpelleten i enskilda celler. Räkna antalet enstaka celler med en hemocytometer.
- Plate celler vid 5 x 10 4 celler / cm 2 i 500 | il medium för varje brunn i en 24-brunnars platta. Inkubera plattorna vid 37 ° C och 5% CO2. Ersätt hälften av mediet med färskt medium varannan dag. Mus NPCs snabbt differentiera till astrocyter inom 2 dagar och differentieras för en vecka innan de börjar ytterligare experiment.
5. Skörd Embryonala Rat Brains och Kortikal vävnadsdissociering
- Ta astrocyternas differentiering medium (tabell 1) från astrocyternas kulturer och ersätta med primär neuron medium (tabell 1) minst 4 h före påbörjas skörd av embryonala råtthjärnor.
- Före dissektion, förbereda kortikal vävnad matsmältningen lösning: 10 pl papain per 1 ml 1x EBSS (+ 1% HEPES) med 12,1 mg / ml L-cystein. Gör cirka 2.5 Ml av vävnads matsmältningen lösningen och filtrera den genom ett 0,20 ìm filterenhet. Förvara lösningen varm vid 37 ° C fram till användning.
- Euthanize den gravida dammen genom kvävning med koldioxid med hjälp av komprimerad gas. Test för smärtreflex via tå eller svans nypa.
- Lägg djuret ventrala sidan upp på en absorberande dyna och njuta sin buken med 70% etanol. Nyp huden med en pincett och göra en lateralt snitt med ett par av kirurgiska saxar, tillräckligt brett för att exponera buken. Tag i bukhinnan med tången och klipp öppna bukhålan.
- Lyft upp livmoderhornet med pincett och skär den fria längs mesometrium. Placera dissekerade livmodern i en petriskål på is. Separera varje embryo genom att skära livmodervävnad mellan dem.
- Gör ett snitt i den embryonala sac. Skal försiktigt fostret ut genom öppningen. Halshugga fostret och placera huvudet i en petriskål på is.
- Att skörda Embryonenic råtthjärnor, följ beskrivningen från steg 1,3-1,5.
- Att dissekera kortikala vävnader, placera en hjärnhalvan lateral sida upp. Skär halvklotet i två i sidled från mitten. Släng hälften närmare basen av hjärnan. Trimma utskurna vävnaden för att ta bort mellanhjärnan.
- Överför de kortikala vävnaderna till en skål innehållande den förvärmda kortikalvävnad matsmältningen lösning. Finhacka kortikala vävnader till så fin som möjligt och inkubera under 30 minuter vid 37 ° C.
- Överför de kortikala vävnader från vävnaden matsmältningen lösningen till en 50 ml centrifugrör innehållande 10 ml förvärmda primära neuron medel (tabell 1). Dissociera kortikala vävnader genom pipettera dem upp och ner i en serologisk pipett, tills en homogen lösning utan vävnadsbitar erhålles.
- Passera vävnaden lösningen genom ett 70 ìm cell sil för att filtrera bort återstående vävnads klumpar. Alikvotera vävnaden lösningen i 15 mlcentrifugrör, tillsätta ungefär 3 ml i varje rör.
- Lägg 800 pl 7,5% BSA i 1 x PBS till botten av varje rör, som bildar två lager med vävnaden lösningen på toppen och BSA vid botten.
- Centrifugera vid 200 xg under 5 minuter. Avlägsna supernatanten, aspire från gränsytan i de två skikten. Undvik att störa cellpelleten vid botten av röret.
- Resuspendera varje cellpelleten i 1 ml primära neuron-medium (tabell 1) och kombinera dem på ett 15 ml centrifugrör. Bestäm celldensitet med användning av en hemocytometer.
6. Elektroporation och plätering av primär kortikal nervceller
OBS: Genöverföring kan uppnås med användning av flera metoder, inkluderande elektroporering, kalciumfosfat-transfektion och viral transduktion. I detta protokoll, beskriver vi elektroporering för att leverera ChR2 konstruera i primära kortikala neuroner.
- Centrifugera 6 x 10 6 råtta kortikala neuron at 200 xg under 5 min och avlägsna supernatanten. Minst 6 x 10 6 kortikala neuroner erfordras för elektroporering för att säkerställa bildandet av ett neuronalt nätverk genom överlevande neuroner.
- Lägg 100 pl elektroporering lösning för att cellpelleten och slamma försiktigt. Kombinera 100 pl av cellsuspensionen med 6 pg av pLenti-synapsin-hChR2 (H134R) -EYFP-WPRE 4 plasmid och överför till en certifierad kyvett. Undvik producera luftbubblor under överföringen.
- Välj och tillämpa lämpliga program för elektroporering enligt tillverkarens anvisningar.
- Efter elektroporering, tillsätt 500 | il av MEM till cell / DNA-suspensionen till kyvetten. Överför provet i 11,5 ml primära neuron medium (tabell 1) och slamma försiktigt. Den totala mängden av media är tillräckligt för en hel 24-brunnsplatta. Alikvot 500 ul av mediet för varje brunn i en 24-brunnsplatta. Inkubera plattan vid 37 ° C och 5% CO2. 7. Generering av inducerade pluripotenta stamceller
- Kultur humana fibroblaster i DMEM kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS) i 6-brunnars plattor.
- Innan påbörjas omprogrammering av fibroblaster, coat 6-brunnar med Matrigel och inkubera i minst en timme i rumstemperatur. Vid 80% sammanflödet, ta bort media från fibroblastkulturer och tvätta en gång med 1x PBS.
- Tillsätt tillräckligt med 0,25% trypsin-EDTA för att täcka hela plattan och inkubera vid 37 ° C under 10 min.
- När cellerna har lossnat från brunnar, lägga dubbelt så mycket DMEM med 10% FBS som trypsin att släcka trypsin matsmältningen. Försiktigt pipett cellsuspension upp och ner för att bryta upp cellerna. Räkna antalet enstaka celler med en hemocytometer.
- Överför 7 x 10 5 celler i ett 15 ml centrifugrör och centrifugera cellsuspensionen vid 200 xg under 5min.
- Avlägsna supernatanten och slamma cellpelleten i elektroporering lösning. Electroporate fibroblaster enligt tillverkarens anvisningar. Resuspendera cellerna i 100 | il av elektroporation buffert och tillsätt 1 g av varje episomal vektor. Electroporate celler med inställningarna för 1650 V, 10 ms och 3 tidspulser.
- Överför cellsuspensionen i DMEM kompletterat med 10% FBS och plattan 5 x 10 4 celler per brunn i en 6-brunnsplatta. Inkubera plattorna vid 37 ° C och 5% CO2.
- Efter 48 timmar, ta bort media från transfekterade fibroblastkulturer och ersätta med mTeSR medium. Byt odlingsmedia dagligen tills inducerade pluripotenta stamceller (IPSC) kolonier är redo att vara isolerad. IPSC kolonier kan observeras efter 28-35 dagar.
- När färdig för isolering, mekaniskt skära en iPSC koloni och reseed i mTeSR medium med 10 | iM Rho-associerat proteinkinas (ROCK) hämmare (Y-27632) på en Matrigel belagd 6-brunnar 12. Byt odlingsmedium dagligen.
- När IPSC kulturer är omkring 20% sammanflödet, ta bort mTeSR medium och ersätta med neural induktion medium (tabell 1). Fyll på mediet varannan dag.
- Efter 7 dagar, ta bort neural induktion medium och ersätta med humant NPC underhåll medium (tabell 1). Fyll medel varannan dag upp till 7 dagar innan passage kulturer.
- Före passage kulturer, päls plattor / kolvar med Matrigel i rumstemperatur i minst en timme.
- Ta ut mediet från sammanflytande humana NPC kulturer och tvätta en gång med 1x PBS sedan aspirera PBS off.
- Tillsätt tillräckligt celllösgör lösning för att täcka alla brunnar inkubera sedan under 5 minuter vid 37 ° C.
- Se till att alla celler har lossnat. Lägg dubbla mängden DMEM /F-12 som den för cell lossnar lösning till brunnarna / kolvar.
- Överför DMEM / F-12 innehållande celler i en 15 ml centrifugrör och centrifugera vid 200 xg under 5 minuter.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera cellerna i 5 ml human NPC underhållsmedium (tabell 1). Försiktigt pipett cellsuspension upp och ner för att bryta upp cellerna.
- Plate en tredjedel av de totala celler i Matrigel belagda odlingsbrunnar / kolvar och fyll tillräckligt medium kompletterat med 10 iM Y-27.632. Inkubera odlingskärl vid 37 ° C och 5% CO2.
- Split kulturer 1: 3 var 3 till 4 dagar och fylla medel varannan dag. Behåll humana NPC kulturer med hög densitet för att förhindra differentiering.
- Till lentivirusvektorn Synapsin1-tdTomato till humant NPC kultur innan du initierar differentiering till neuroner. Förbered astrocyt / kortikala neuron samkultureren dag i förväg innan differentiera mänskliga NPCs.
- Tvätta humana NPC kulturer gång med 1 x PBS och tillsätt tillräckligt celllösgör lösning för att täcka alla brunnar / kolvar inkubera sedan under 5 minuter vid 37 ° C.
- Se till att alla celler har lossnat. Lägg dubbla mängden DMEM / F-12 som den för cell lossnar lösning till brunnarna / kolvar. Överför till en 15 ml centrifugrör. Centrifugera vid 200 xg under 5 minuter.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera cellerna i 5 ml neuronal differentieringsmedium (tabell 1). Försiktigt pipett cellsuspension upp och ner för att bryta upp cellpelleten i enskilda celler. Räkna antalet enstaka celler med en hemocytometer.
- Försiktigt aspirera medium från astrocyternas / kortikala neuron kulturer. Plate humana NPC vid 5 x 10 3 celler / cm 2 i 500 | il av neuronal differentiering medium (tabell 1) kompletterat med 10 | iM Y-27632 för varje 24-brunn. Försiktigt till medium innehållande humana NPC i varje brunnatt undvika att störa de astrocyter och kortikala neuron.
- Inkubera plattorna vid 37 ° C och 5% CO2. Ersätt hälften av mediet med färskt medium var 2-3 dagar under minst 28 dagar.
- Bekräfta om mänskliga iPSCs beter sig som mogna nervceller.
- Hitta celler differentierade från humana iPSCs genom visualisering av tdTomato använder en upprätt konfokalmikroskop utrustad med en 60X (0,9 NA) nedsänkning i vatten lins.
- Dra inspelning pipett till en resistans av 4-6 M. perfundera celler vid rumstemperatur i en extern lösning (tabell 1) bubblades konstant med 95% O2 / 5% CO2. Fyll inspelnings mikropipett med intern lösning (tabell 1).
- Patch tdTomato + cell i hel-cellsläge och spela aktionspotential bränning som svar på aktuella injektion (1 sek varaktighet, 10 Pa steg) i curhyra klämman.
- Bekräfta om handlingspotential kortikala celler som uttrycker ChR2 är tillförlitligt framkallade av ljus stimulering.
- Hitta kortikala celler som uttrycker ChR2 genom visualisering av GFP under ett konfokalmikroskop. Utför hel-cell patch clamp inspelning på kortikala celler genom att följa stegen 10.1.2 till 10.1.3.
- Kontrollera aktionspotential är tillförlitligt framkallade av ljus belysning med kvicksilverbåglampa (100 W). Våglängden på exciteringsfilter är 480/40 nm.
- Utför optogenetic stimulering.
- Patch tdTomato + cell i hel-cellsläge och ställ spänningsklämma på -70mV. Filter strömsignaler vid 2 kHz och digitalisera vid 10 kHz. Övervaka seriemotstånd från 10 till 20 miljoner för konsekvens under inspelningarna.
- Stimulera hela fältet med 100 W kvicksilverlampa med 480/40 nm excitation filter för 30 sek.
- Spela postsynaptiska strömmar (PSC) av lappade cell induceras genom fotostimulering av ChR2-uttryck presynaptisk cortiska neuroner. Identifiera och mäta PSC. Ställ tröskel för amplitud och strömmar område vid 5 pA och 20 pC, respektive. Inspektera manuellt dessa händelser att göra sig av alla icke-PSC spår.
OBS:. Denna metod har anpassats från Okita et al 10
8. Neural Induktion och underhåll av mänskliga NPCs
OBS:. Denna metod har beskrivits av Li et al 11
9. Differentiering av mänskliga NPCs i nervceller i Samkulturer
10. Elektro Inspelningar av iPSC-härledda neuroner
Representative Results
Här, ett protokoll som beskriver de olika stegen i att skapa en co-kultur bestående astrocyter, är kortikalneuroner och mänskliga nervceller illustrerade. Mänskliga iPSCs erhölls genom omprogrammering fibroblaster med användning av episomala vektorer 10 och specificeras i en neural härstamning med en cocktail av små-molekylhämmare, vilket gör NPC 11 som bibehållits vid hög densitet (Figur 1A). Flera steg krävs för att generera samodlingen: differentiering av mus NPCs i astrocyter, plätering av råtta kortikala neuron uttrycker ChR2 och sådd av mänskliga NPCs taggade med tdTomato (Figur 1B). Vid dag 2 av differentiering, kan lätt observeras gliafibrillärt Surt Protein (GFAP) + astrocyter i våra kulturer (Figur 1C). Mus NPC tilläts differentiera under åtminstone en vecka innan plätering kortikala neuroner som uttrycker ChR2 på astrocyt monoskiktet (figur 1D). Efter 3till 4 veckors mänsklig NPC differentiering, var tdTomato + nervceller upptäcktes i kulturer (Figur 1E).
Denna samodlingssystemet tillåter konsekvent detektering av postsynaptiska strömmar från enskilda iPSC-härledda neuroner som svar på ljus stimulering (Figur 2A). När stimuleras av ljus, var verkningspotentialer som genereras i kortikala neuroner som uttrycker ChR2 (Figur 2B). iPSC-derived nervceller är också lättretad (figur 2C), som visar ökad aktionspotential bränning som amplituden av depolariserande strömpulser ökades (figur 2D). Således är dessa celler uppvisar mogna neuronala egenskaper. I frånvaro av ljus, erhöll iPSC-härledda neuroner spontana synaptiska ingångar (Figur 2E). Dessa inåt postsynaptiska strömmar var främst förmedlas av AMPA-receptorer, eftersom strömmarna genom GABA-receptorer skulle vara utåt och NMDA-receptorer bär inte aktuell at innehavet potential -70 mV. Åtminstone några av dessa ingångar var från presynaptiska kortikala neuroner som uttrycker ChR2, eftersom ljus stimulering ökade i hög grad frekvensen av postsynaptiska strömmar (Figur 2E). Tidsförloppet av denna ökning av synaptiska ingång visas i figur 2F: photostimulation av de kortikala neuron bibehölls under 30 sek långa ljusblixt. Medan frekvensen av PSC upphöjdes då ChR2-uttryck kortikala neuroner photostimulated (figur 2G), deras amplitud var opåverkad (Figur 2H). Sammanfattningsvis indikerar dessa resultat att IPSC-härledda neuroner uppvisade mogna neuronala egenskaper och skulle kunna bilda synaptiska anslutningar med presynaptiska kortikala neuroner.
Figur 1: Schematiskt diagram för alstring av samodlingsystemet. (A) Tidslinje för omprogrammering mänskliga fibroblaster i iPSCs och neural induktion till NPCs. (B) Tidslinje för terminal differentiering av mänskliga NPCs till mogna nervceller på kortikala neuron och astrocyternas kulturer. (C) Mouse NPCs snabbt differentiera till GFAP + astrocyter efter 2 dagar in vitro. (D) Efter en vecka, var kortikala neuroner som uttrycker ChR2 ströks ut på GFAP + astrocyter. (E) Vid 4 till 5 veckor efter differentiering av humana NPC gjordes elektrofysiologiska inspelningar utfördes på tdTomato + neuroner. Skalstrecken representerar 100 ^ m.
Figur 2: optogenetic analys av funktionella synaptiska uppkoppling. (A) iPSC härledda celler taggade med tdTomato (röd) samodlades med kortikala neuroner som uttrycker den ljusaktiveratkanal, ChR2 (grön). Inspelningar från iPSC-härledda neuroner avslöjade postsynaptiska nuvarande (PSC) svar, vilket kan komma från antingen kortikalneuroner eller andra iPSC-härledda nervceller. (B) Belysning (blå stapel) framkallade en rad aktionspotentialer i kortikala neuron uttrycker ChR2. ( C) iPSC-härledda celler framkallas genom ströminjektion. (D) Firing vs strömkurvan av iPSC-härledda celler. (E) photostimulation av ChR2-uttryck kortikala neuroner (blå stapel) ökade frekvensen av PSC i iPSC-härledda neuroner . (F) Tidsförloppet av ökningen i PSC frekvens produceras genom fotostimulering. Blå stapel visar tiden för fotostimulering. (G, H) Medan PSC frekvensen ökades genom fotostimulering (G), PSC amplitud var opåverkad (H). * Indikerar p <0,05 jämfört med kontroll med students t-test.
Discussion
Optogenetik ger tid och rum precision för aktivering av definierade populationer av nervceller 13. I våra experiment, var hela fältet av mikroskopet målet upplyst i 30 sekunder till foto stimulera endast kortikala neuron uttrycker ChR2. Detta tillät oss att avgöra om synapsförbindelser bildades mellan olika populationer av nervceller inom co-kultur. Våra resultat visade att photostimulation ökar PSC frekvens i iPSC-härledda neuroner, vilket visar att dessa nervceller får synaptiska input från presynaptiska kortikala neuron uttrycker ChR2. Detta, i sin tur, fastställdes att de iPSC-härledda neuroner framgångsrikt införlivas kretsar med de kortikala neuroner.
Det finns flera viktiga steg för generering av denna samodlingssystemet. Det är viktigt att se till att musen NPC-härledda astrocyternas kulturer är friska, med minimal celldöd, innan du fortsätter med pläteringav andra celltyper. Kortikala neuron och mänskliga NPCs fäster bra på friska astrocyter och elektrofysiologiska inspelningar är starkt beroende av odlingsbetingelser. De andra viktiga steg i detta protokoll är elektroporering och plätering av kortikala neuron på astrocyternas kulturer. Som ett stort antal celler dör efter elektroporering, är det viktigt att se till att åtminstone 6 miljoner kortikala nervceller elektro för plätering på astrocyternas kulturer i 24-hålsplattor. Vi har observerat att när färre än 6 miljoner celler elektro, gjorde att antalet nervceller som överlever inte bildar ett tätt neuronala nätverket, vilket påverkade elektrofysiologiska inspelningar. Antalet elektroporerade kortikalneuroner bör också vara konsekvent för varje samodling experiment för att möjliggöra jämförelser mellan olika studier. För alla steg som involverar enzymatisk nedbrytning, är det viktigt att inte lämna celler i mag-lösning för länge eftersom det kan leda till celldöd.
Dettakan användas tillvägagångssätt för att screena förmåga nervceller härrör från patientspecifika fibroblaster att bilda synaptiska kontakter med andra nervceller. Nervceller som härrör från fibroblaster från patienter som lider av den neuroutvecklingsstörning Rett syndrom (RTT) uppvisar synaptiska defekter överförings: RTT nervceller uppvisar en signifikant minskning av PSC frekvens och amplitud jämfört med friska nervceller, förmodligen på grund av mindre synaptiska anslutningar 14. Vår samodlingssystemet möjliggör undersökning av läkemedelseffekter på nervceller visar utvecklingsdefekter. Detta kan genomföras genom tillsats av föreningar av intresse under ympning av sjuka humana NPC samt under kontinuerlig exponering för föreningar under tiden för neuronal differentiering.
Även om detta samodlingssystemet även kan användas som en modell för drogtester, är en begränsning med denna metod att processen för att undersöka effekterna av varje kandidatförening kan vara lång och mödosam somdet är inte en high-throughput screening metoden. Efter behandling med kandidatföreningar, iPSC-härledda nervceller måste vara individuellt lappat att bestämma effekterna av varje förening på PSC. Dessutom finns det för närvarande inte många tillgängliga fibroblaster och iPSCs från patienter. Därför kommer det att vara av intresse i en nära framtid att ha mer patientceller och också att anpassa detta protokoll för högkapacitetsscreening. Till exempel, genom att märka iPSC-härledda neuroner med en aktivitetsindikator, såsom genetiskt kodade sensorer av joner eller membranpotential, skulle det vara möjligt att öka genomströmningshastigheten väsentligt genom förbigår den tidskrävande elektrofysiologiska procedur. Eftersom hela processen att skapa denna samodlingssystemet, från omprogrammering fibroblaster att utföra elektrofysiologiska inspelningar, kräver mer än 90 dagar, rekommenderas att antingen mänskliga iPSCs eller NPC utökas, efter omprogrammering och neurala induktionssteg respektive,och kryokonserverades att minska den tid som behövs för framtida experiment.
I våra experiment, uttryckte vi ChR2 i kortikala neuron under synapsin1 promotorn. Eftersom denna promotor är pan-neuronal, vi förmodligen var photostimulating både hämmande och excitatoriska kortikala neuron. Om målet för framtida experiment är att specifikt förhöra antingen hämmande eller stimulerande kretsar, kan mer specifika promotorer användas. Alternativt kunde kortikalneuroner erhållas från transgena (eller virus injicerade möss) där ChR2 uttryck specifikt i genetiskt definierade subpopulationer av neuroner. Till exempel, skörd kortikala vävnader från en mus som har Cre-rekombinas som uttrycks i parvalbumin innehållande intemeuroner (PV interneuroner) som korsas med en mus med floxed ChR2 kommer att ge en situation där de enda kortikala neuroner som uttrycker ChR2 blir PV interneuronen 15. Användningen av en sådan ChR2-uttryck interneuronen i vår samtidigt culture systemet gör det möjligt att fastställa huruvida en patchad iPSC-derived neuron kan införliva en krets med PV interneuronen.
Baserat på en tidigare studie 9, kortikala neuron är mogen med överlappande dendriter efter 14 dagar in vitro. Således, om fotostimulering inte framkalla ett svar från en uppdaterad iPSC-härledda neuron, bör det ange att neuronen inte har förmågan att göra synaptiska anslutningar med kortikala neuroner. En IPSC-härledda neuron kan ta emot synaptiska input antingen från andra iPSC-härledda neuroner eller kortikala neuroner. Om traditionell patch clamp inspelningar användes, skulle det inte vara möjligt att skilja där synaptiska input kommer ifrån. Fördelen med vårt system är att postsynaptiska svar från kortikal presynaptisk ingång kan selektivt framkallas och identifieras. De förfaranden som beskrivs här ger en enkel metod för att utvärdera förmågan hos iPSC-härledda nervceller att integrerain en definierad neuronala nätverket.
Acknowledgments
Vi tackar K. Deisseroth och S. Je för ChR2 och Synapsin1-tdTomato Lentiviral konstruktioner respektive C. Chai för att dela kunskap och protokoll om iPSC generation, WY Leong för teknisk support, medlemmar av Goh labbet för att dela reagenser och expertis. Detta arbete stöddes av Abbott Nutrition och Akademiska Centre of Excellence (ACE) utmärkelse forskning från GlaxoSmithKline (GSK) till ELG, av National Research Foundation Singapore under dess konkurrenskraftig forskning Program (NRF 2008 NRF-CRP 002-082) till ELG och GJA och av World Class Institute (WCI) Program för National Research Foundation of Korea (NRF) som finansieras av ministeriet för utbildning, vetenskap och teknik Korea (MEST) (NRF Grant Antal: WCI 2009-003) till GJA
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurocult Proliferation Kit (Mouse) | STEMCELL Technologies | 5702 | Contains NSC Basal Medium and NSC Proliferation Supplement |
| Epi5 Episomal iPSC Reprogramming Kit | Invitrogen | A15960 | |
| DMEM/F12 | Lonza | 12719F | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103049 | |
| MEM without glutamine | Invitrogen | 11090081 | |
| N2 | Invitrogen | 17502048 | |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030081 | |
| GlutaMAX supplement | Invitrogen | 35050061 | |
| PenStrep | Invitrogen | 15140122 | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| Human LIF | Invitrogen | PHC9484 | |
| CHIR99021 | Miltenyi Biotech | 130103926 | |
| SB431542 | Sigma | S4317 | |
| Compound E | Merck Millipore | 565790 | |
| EGF | Merck Millipore | 324856 | |
| FGF2 | R&D Systems | 233FB025 | |
| Research Grade FBS | Thermo Scientific | SV30160.03 | For astrocyte differentiation medium |
| Defined FBS | Thermo Scientific | SH30070.03 | For primary neuron medium |
| PBS | Thermo Scientific | SH30028.02 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | For primary neuron medium |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Heparin | EMD Millipore | 375095 | |
| Papain | Worthington | 3126 | |
| HBSS | Invitrogen | 14175095 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| Dispase II | STEMCELL Technologies | 7923 | |
| HEPES | Gibco | 15630080 | For harvesting brains |
| EBSS | Invitrogen | 14155063 | |
| L-Cysteine | Sigma | C7352 | |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200056 | |
| 70 µm cell strainer | BD Biosciences | 352350 | |
| 20 µm filter unit | Sartorius Stedim | 16534K | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| NaH2PO4 | Fluka | 71505 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| CaCl2 | Sigma | C1016 | |
| D(+)-Glucose | Sigma | G7520 | For electrophysiological studies |
| K-gluconate | Sigma | P1847 | |
| KOH | KANTO Chemical | 3234400 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | For electrophysiological studies |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Na2ATP | Sigma | A7699 | |
| Na3GTP | Sigma | G8877 | |
| Borosilicate glass capillaries | World precision instruments, Inc | 1604323 | |
| 15 ml centrifuge tube | BD Biosciences | 352096 | |
| 50 ml centrifuge tube | BD Biosciences | 352070 | |
| 24-well plates | Corning | 9761146 | |
| 6-well plates | Corning | 720083 | |
| T25 flasks | Corning | 430641 | |
| 12 mm cover glasses | Marienfeld-Superior | 111520 | |
| AMAXA Rat Neuron Nucleofector Kit | Lonza | VPG1003 | For electroporation of primary cortical neurons |
| Neon Transfection System | Invitrogen | MPK5000 | For electroporation of human fibroblasts |
| Mini Analysis | Synaptosoft | Mini Analysis v.6 | For measurement of PSCs |
| Normal Dermal Human Fibroblasts | PromoCell | C12300 | |
| pLenti-Synapsin-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE | Addgene | 20945 | |
| Mercury short-arc lamp | OSRAM | HBO 103 W/2 |
References
- Wang, H., et al. High-speed mapping of synaptic connectivity using photostimulation in Channelrhodopsin-2 transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (19), 8143-8148 (2007).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (24), 13940-13945 (2003).
- Zhang, F., et al. Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry. Nature. 446 (7136), 633-639 (2007).
- Stroh, A., et al. Tracking stem cell differentiation in the setting of automated optogenetic stimulation. Stem Cells. 29 (1), 78-88 (2011).
- Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, S. -C. Human embryonic stem cell-derived neurons adopt and regulate the activity of an established neural network. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (50), 20189-20194 (2011).
- Viviani, B. Preparation and coculture of neurons and glial cells. Curr Protoc Cell Biol. 32, 2.7.1-2.7.2.1 (2006).
- Braun, H., Günther-Kern, A., Reymann, K., Onteniente, B. Neuronal differentiation of human iPS-cells in a rat cortical primary culture. Acta Neurobiologiae Experimentalis. 72 (30), 219-229 (2012).
- Shivaraj, M. C., et al. Taurine induces proliferation of neural stem cells and synapse development in the developing mouse brain. PLoS ONE. 7, e42935 (2012).
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
- Li, W., et al. Rapid induction and long-term self-renewal of primitive neural precursors from human embryonic stem cells by small molecule inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (20), 8299-8304 (2011).
- Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (50), 424-429 (2011).
- Packer, A. M., Roska, B., Hausser, M. Targeting neurons and photons for optogenetics. Nature Neuroscience. 16 (7), 805-815 (2013).
- Marchetto, M. C. N., et al. A Model for neural development and treatment of Rett Syndrome using human induced pluripotent stem cells. Cell. 143 (4), 527-539 (2010).
- Asrican, B., et al. Next-generation transgenic mice for optogenetic analysis of neural circuits. Frontiers in Neural Circuits. 7, 160 (2013).
