Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Chemistry

Колориметрический анализ, что меры частности Гранзим протеолитической активности: Гидролиз Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl

doi: 10.3791/52419 Published: November 28, 2014

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Гранзимы представляют собой семейство сериновых протеаз, обнаруженных в секреторных лизосомах естественных киллеров (NK) клетки и цитотоксические Т-лимфоциты (CTL) 1. Существует пять различных гранзимы в организме человека (A, B, H, K и М), и десять мышей (- G, K, M и N), 2,3. Granzyme и Гранзим (GzmA, GzmB) являются наиболее распространенными и широко исследованы в условиях человека и грызунов.

Классический функция GzmB является индукция апоптоза в клетках-мишенях, выполненных в сочетании с белком перфорина порообразующего, что позвол ет Granzyme доступа в цитозоль клетки-мишени четыре. Хотя выражения GzmB однозначно найти в цитотоксических лимфоцитов, недавние исследования были решении различных других GzmB экспрессирующих типов клеток, в том числе, но не ограничиваясь кератиноцитов 5, 6 базофилов, тучных клеток 7, плазмоцитов дендритных клеток, 8 и 9-клеток, 10.В этом контексте, не-апоптотических функции GzmB были обнаружены в пределах от участия в воспалительных процессах, ремоделировании ткани и других иммунорегуляторных свойств 11-14.

Учитывая, что более широкое биологическая роль была предложена для GzmB, чем предполагалось ранее, исследователи требуют надежных и конкретные инструменты для его обнаружения. Из преимуществом является конкретное требование GzmB на расщепляют на карбоксильной стороне остатков аспарагиновой кислоты, собственности уникальных среди эукариотических сериновых протеаз 15. Мышь, человека и крысы GzmB структурно очень похожими, однако расширенный субстратной специфичности мыши GzmB тонко отличается от обоих человека и крысы 16, что означает, что некоторые общие субстраты с Asp на терминале (P1) могут быть расщеплены эффективно GzmB из всех трех видов, в то время как для других поверхностей с более сложными последовательностями перед Р1 может дать широко переменные результаты. В обоих прошлом и более поздних Literature, этот факт вызвал значительную путаницу и разночтения биологической значимости некоторых экспериментальных результатов, хотя тщательно контролируется, кинетические исследования пытались исправить ситуацию 17.

В этой статье мы стремились проиллюстрировать эти точки, используя два коммерчески доступных веществ, а именно Вос-Ala-Ala-Asp-SBzl и N-ацетил-Ile-Glu-Pro-Asp-р-нитроанилид. Два реагенты сделать генерировать различные реактивные группы после расщепления (бесплатно Сульфгидрильные против флуоресцентного свободного paranitroanilide), но это не имеет никакого влияния на протеолитического расщепления. Описанный протокол является современной адаптация очень старый протокол 18, но должно помочь исследователям использовать различные субстраты GzmB надлежащим образом, а также обеспечивает методологическую основу для определения активности других гранзимы, таких как GzmA и GzmH.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ПРИМЕЧАНИЕ: селезенки были получены от мышей (6-10 недель), и все эксперименты на животных были проведены в соответствии с этикой животных руководящих принципов MacCallum центра рака Питер (E486).

1. Получение образцов.

  1. Подготовка активированных клеток мыши Нагорного Карабаха.
    1. Изолировать первичных наивные клетки NK от одноклеточных суспензий селезенке мышей C57BL / 6 или B6.GrzmB - / - (GzmB ген NULL) мышей негативной селекции с использованием коммерчески доступных наборов.
    2. Следуйте протоколу производителя. Вкратце, магнитно-LABEL "не-НК» клетки, такие как Т- и В-клеток, дендритные клетки, гранулоциты, макрофаги и красных кровяных клеток, используя биотин-сопряженных антител против своих конкретных поверхностных маркеров. Используйте магнитную сепарацию с анти-биотин бисером истощать "Non-НК" клетки.
    3. Культура изолированных NK клеток в течение 5-7 дней в среде, содержащей IL-2 (1000 ед / мл) при 700000 клеток / мл в 24-луночных планшетахна 37   ° С.
    4. Кроме того, использование активированных Т-клеток 19, основным антиген-ограничено ЦТЛ от клеточного рецептора трансгенных мышей ОТ1 Т 20, CTL, генерируется в смешанных культурах лимфоцитов 21, или супернатантов, активированных клеток NK, чтобы определить активность секретируемого GzmB 19.
  2. Обслуживание линии и изоляции первичных клеток NK человека НК клеток.
    1. Поддержание лейкемии человека (NK клетки) YT в Roswell Park Memorial Institute (RPMI) среде, дополненной 10% фетальной телячьей сыворотки. Альтернативно, очистки первичных клеток NK из периферической крови здоровых людей и стимулировать в течение 2-3 дней в среде, содержащей IL-2, в 100 ед / мл, как описано выше 22.
  3. Поколение клеточных лизатов.
    1. Промывают клетки три раза в PBS (рН 7,4), а затем приостановить Nonidet Р-40 лизирующего буфера (0,1% NP-40, 250 мМ NaCl, 25 мМ HEPES, 2,5 мМ ЭДТА). В идеале, лизировать минимум 5 х 10 6 7 Т-клеток в 100 мкл буфера. Не следует добавлять ингибиторы протеазы, как многие из них необратимые ингибиторы сериновых протеаз и, в частности, такие как tryptases GzmA. Инкубируют на льду в течение 20 мин, а затем гранулы ядра в микроцентрифуге при 15000 х г в течение 10 мин. Отменить ядерного осадка и передачи супернатант в новую пробирку.
  4. Определить концентрацию белка в лизатах.
    1. Используйте имеющийся в продаже протокол выбора, таких как, Брэдфорд или бицинхониновой кислоты (BCA) и определения концентрации белка. Убедитесь, что концентрация составляет ~ 2 мг минимальное / мл. Магазин лизаты при -20 ° С до требуемой активности (гранзимом стабилен в течение многих месяцев при температуре -20 ° С).

2. Гранзим Анализ активности

  1. Подготовка реагентов
    1. Подготовка 10 мМ запас субстратов (Boc-АСР-S-Bzl или Ac-IEPD-PNA) в ДМСО (~ 5 мг / мл) и хранить в аликвотах при -20 & #176; С. Подготовьте рабочее разведение недавно и отказаться после каждого дня, так как Вос-AAD-S-Bzl частично гидролизуется на хранение в ДМСО.
    2. Приготовьте 250 мМ запас колориметрического реагента (5,5'-дитио-бис (2-нитробензойной кислоты), DTNB) в ДМСО (0,09 г / мл) и хранят при -20 ° С. Подготовьте новую рабочую разбавления каждый день. Этот реагент требуется только для субстратов с SBzl группами индикации, не PNA.
    3. Макияж свежий буфера (0,1 М HEPES, 0,05 М MgCl 2, рН 7,3) каждые 2-3 недели.
  2. Доведите DTNB и синтетические субстраты до комнатной температуры. Развести основания (1:16, например, 100 мкл в 1,6 мл буфера) и DTNB (1: 250, например, 10 мкл в 2,5 мл буфера) и хорошо перемешать.
  3. Развести минимум 100 мкг белка лизата каждого образца в буфере до конечного объема 160 мкл. Используя многоканальную пипетку добавить 50 мкл на лунку в трех повторах (~ 33,3 мкг / лунку) в '' U '' нижней винилового 96-луночного планшета.Включить "буферная только для" контроля (также в трех экземплярах).
  4. Добавить 100 мкл разбавленного DTNB контролю образцы / буфера (пропустите этот шаг при работе с Ac-IEPD-ПНА.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Расщепление Ac-IEPD-ОНУ по GzmB непосредственно релизы флуорогенный PNA (рис 4б).
  5. Использование многоканальную пипетку, чтобы быстро добавить 50 мкл разбавленных субстратов к каждому набору трех повторах, начиная с буфером затем каких-либо отрицательных контролей и заканчивая ожидаемых положительных образцов.
  6. Поместите пластину в ридере. Измерьте Asp-азы путем гидролиза Вос-Ala-Ala-Asp-S-Bzl / AC-IEPD-ОНУ в микроплаты на OD 405 нм. Используйте протокол кинетическую анализа, возьмите 25 показаний, каждые 15 секунд (примерно 6 мин Общее время чтения).
  7. Используйте оптической плотности, генерируемых в каждый момент времени вручную рассчитать скорость подложки расщепления, если программное обеспечение пластинчатого читателя не может генерировать значение для Vmax.

3. Анализ Daта

ПРИМЕЧАНИЕ: Данные, полученные представлен в виде максимальной скорости, определяется как изменение ОД с течением времени (MOD / мин).

  1. Для анализа данных, определения максимальной скорости подложки расщепления, который рассчитывается от скорости изменения оптической плотности. Сделайте это автоматически с помощью программного обеспечения ридере, который, как правило, имеет эту опцию.
  2. Кроме того, после просмотра кинетические кривые изменения оптической плотности, которые генерируются на кинетическом анализе на ридере вручную выбрать точки данных, которые дают самый крутой прямую линию. Для большинства анализов максимальная скорость достигается в течение первых 2 минут данного анализа.
  3. Вычтите начальное чтение OD с самой высокой чтении OD на этой прямой и разделите на интервале времени. Передачи необработанных данных в Microsoft Excel / Graph площадку для статистического анализа и графического дисплея.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Вос-ААР-S-Bzl субстрат является специфическим для GzmB

Серин-протеазы GzmB является основным компонентом цитотоксических лимфоцитов (CTL и NK-клетки), и, в основном, ответственны за быстрое индукции апоптоз в клетках-мишенях, таких как вирус-инфицированных или трансформированных клетках. Это в значительной степени из-за его предпочтения субстрата для расщепления после некоторых специфических аспартат остатков в отдельных белков, атрибут совместно с каспаз, которые также расщепляют после аспартат остатков, но которые из другого класса протеаз, цистеин протеазы семьи 15. Это различие в механизме протеолитического означает, что ААР-SBzl не может быть расщеплена любой каспазы. Выражение GzmB индуцируется после активации цитотоксических лимфоцитов и ферментативной активности можно контролировать клеточных лизатов, приготовленных из этих клеток (рисунок 1). Наличие мышей с генными гранзим позволило установить, чтоСинтетический пептидный субстрат Boc-Ala-Ala-Asp (ААР) - thiobenzyl эфир (S-Bzl) специально гидролизуют GzmB. Прочный расщепление синтетического субстрата может быть измерена в клеточного лизата от В6 первичных клеток NK, но не в B6.GrzmB - / - NK-клетки. В качестве контроля протеолитической активности GzmA, который имеет трипсина, как (триптазы) субстратной специфичностью и присутствует в обоих лизатах было эквивалентно, как измерено путем гидролиза N-α-CBZ-L-лизина (BLT) -S- Bzl.

Последовательность GzmB признание субстрат видоспецифической

Ранние исследования, описывающие потенциальные молекулы клеток-мишеней расщепляются GzmB вызвало некоторое замешательство, пока не выяснилось, что мыши и человека GzmB есть предпочтение слегка измененный распознавания субстрат, который диктуется как многие, как 8-10 остатков отображение вокруг P1 аспартат 23. Это было особенно заметно в исследованиях, которые изучали расщепление про-апоптическая ВН3 толькоМолекула торгов, которые могут быть расщеплены эффективно человеком, но гораздо менее эффективно, мыши GzmB. В интактных клетках, это различие приводит к активации различных путей клеточной гибели, с человеческой GzmB операционной преимущественно через митохондриальную пути, и мыши GzmB через активацию каспазы прямой. Анализ тетрапептида последовательностей показал, что человек, но не GzmB мыши может расщеплять после последовательности IEPD, который соответствует последовательности распознавания в обоих человеческих и мышиных Bid 16. В обоих литературе и в коммерческий продукт, каталоги тетрапептида подложку, Ac-IEPD-пНА был использован в общем смысле для проверки GzmB активности (Таблица 1). Теперь ясно, что в то время как человек и мышь могут расщеплять Вос-AAD-S-Bzl, с очень похожим эффективности, мышь GzmB в клеточных лизатов NK удается эффективно гидролизуют Ac-IEPD-PNA (Рисунок 2). В отличие от этого, уменьшение количества человеческого NK-YT лизата от 30 мкг до 10 мкг еще resulted в достаточном GzmB для гидролиза Ac-IEPD-PNA подложку (рисунок 3).

Рисунок 1
Рисунок 1:. Гранулы активность фермента в мышиных клеток NK Гранзим (верхняя панель) и гранзим (нижняя панель) активность в NK клеточных лизатов от B6 дикого типа и мышей с B6.GrzmB определяли по максимальной скорости гидролиза Boc- Ala-Ala-Asp-S-Bzl и N-α-CBZ-L-лизин-S-Bzl пептидные субстраты. Данные изобразить одну репрезентативную эксперимент, выполненный в трех экземплярах (п> 3).

Фиг.2
Рисунок 2:. Видоспецифической гидролиз Ac-IEPD- пНА субстрат мыши и человека GzmB гидролизу Вос-Ala-Ala-Asp-S-Bzl одинаково, но только человек GzmB гидролизу Ac-IEPD-ПНА. ЧеловекЛиния клеток NK YT и первичной ИЛ-2 мыши активируется НК были использованы в качестве источника GzmB. Гистограмма показывает одно представительство эксперимент, выполненный в трех экземплярах (п> 3).

Рисунок 3
Рисунок 3:. Снижение концентрации белка не отменить GzmB активности скорость гидролиза Ac-IEPD-пНА индуцированного человеческим GzmB сравнивали с использованием уменьшением концентрации белка YT NK-клеточной линии лизата. Представитель Эксперимент для п> 3.

Рисунок 4
Рисунок 4:. Графическое изображение принципа анализа GzmB расщепляет субстраты Вос-ААР-S-Bzl (А) и Ас-IEPD-пНА (В) после P1 аспартата, тем самым освобождая либо бензилмеркаптан, которые, в свою очередь, взаимодействует с DTNB с образованием флуорогенный 3-карбокси-4-nitrophenoxide ион (А), или непосредственно выпуская п-нитроанилид, который сам по себе хромофора (В). Выбросы флуоресценции обеих этих молекул могут быть обнаружены при 405 нм.

Серин протеазы Подложка Деятельность
Granzyme N-α-CBZ-L-лизина (BLT) thiobenzyl эфир (S-Bzl) Триптаза 22
Гранзим 1. Boc-Ala-Ala-Asp (ААР) -S-Bzl ASPase 14
2. N-ацетил-Ile-Glu-Pro-Asp (IEPD) -п-нитроанилид (PNA)
Granzyme H Suc-Phe-Leu-Phe-S-Bzl Химаза 23

Таблица 1:. Список доступных субстратов для обнаружения активности гранзимом Триптаза активность GzmA могут быть обнаружены путем гидролиза конкретного N-α-CBZ-L-лизина (BLT) thiobenzyl эфира (S-Bzl) , GzmB специально расщепляет после аспартат остатков (Asp-ASE), которая может быть оценена путем гидролиза либо Boc-Ala-Ala-Asp (САД) -S-Bzl (обнаруживает мышь и GzmB деятельности человека), или N-ацетил-Иле Glu-Pro-Asp (IEPD) -п-нитроанилид (PNA) (обнаруживает только человеческое GzmB активность). Химаза активность GzmH оценивают путем расщепления Suc-Phe-Leu-Phe-S-Bzl.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Исторически гранзимы были определены в качестве ключевых эффекторных молекул цитотоксических лимфоцитов (CTL и NK-клетки), способных индуцировать быстрый апоптоз в клетках-мишенях. Это было в основном за счет действия GzmB, который расщепленного субстрата цель на аспартат (D) остатки и, таким образом, смог активировать каспазы каскад обеими расщепляющих про-каспазы, а также некоторые из их нижестоящих мишеней. Тем не менее, в настоящее время в виду, что выражение GzmB не ограничивается лимфоидных клеток цитотоксическими и его функция может быть продлен за рамки распознавания клеток-мишеней и гибели клеток.

В этой статье мы опишем протокол, который позволяет обнаружение активных GzmB в клеточных лизатов, полученных как от мыши и человека CTL / NK, используя одну простую колориметрического анализа. Простота и специфичность этого теста, как констатировали этих выводов позволяют применение этого протокола для рассмотрения GzmB в сотовых образцов из другого источникас. Тем не менее, важно, что клеточные лизаты имеют концентрацию белка, по меньшей мере 2 мг / мл, а также соответствующие положительный и отрицательный контроли, включены в протоколе. Специфика реагента Вос-AAD-SBzl для GzmB очевидно, из-за отсутствия субстрата расщепления деятельности в лизата, полученного из GzmB нулевых животных, а активность полностью теряется (рис 1). В любых будущих исследованиях рекомендуется, что такое отрицательный контроль (с. Раздел протокола 1.1) используется для проверки того, что какой-либо деятельности, выявленные является специфичным для GrzB. (Примечание: Хотя, как и GRB, каспазы имеют абсолютной специфичностью для расщепления на аспартат остатков в положении Р1, предпочтительные субстраты tetrapepetides где P4 аминокислота также является важным фактором, определяющим специфику 24.). Если рассматривать рекомбинантного материала активного сайта серина на аланин мутантной протеазы (неактивного протеазы приготовлен точно таким же образом, как активного фермента) должен быть ямикробатареях, и это особенно важно, если тестировани не млекопитающих клеточных лизатов, особенно из дрожжей или бактериальных клеток.

Используя описанную выше протокол для анализов клеток млекопитающих, GzmB активность не снижается из-за присутствия эндогенных родственных ингибиторов сериновых протеаз (серпины), который может быть значительно повышающей регуляции в активированных цитотоксических лимфоцитов (CL) 25, а также в клетках, полученных от не иммунных тканей, в том числе трансформированных клеток 26. Цитозольный serpinB9 (ранее PI-9) весьма специфичен для человеческого GzmB; Однако в мыши, есть несколько близких, но ле конкретные ортологи из которых Серпин b9 или SPI-6 оказывает существенное ингибиторной активностью для мыши GzmB 27. Хотя лизиса в NP-40 буфер может быть разрешающим для генерирования необратимое взаимодействие между GzmB и Серпин, инкубации при 37 ° С требуется для оптимального комплексообразования 28. Мы не обнаружить образование комплекса в гое лизаты помощью Вестерн-блоттинга, что приведет к потере активности протеазы. Этот протокол проводят при типичной температуре окружающей среды лаборатории, до ~ 22 ° С.

Из более чем 20-летним опытом, выполняющего эти анализы мы обнаружили, что коммерческим источником реагента Вос-AAD-SBzl имеет первостепенное значение для получения согласованных, чувствительные и надежные результаты. Мы только рекомендуем поставщика мы ссылается, хотя другие коммерческие источники также подходит для субстратов, необходимых для определения активности других гранзимы. Протокол, описанный в данном документе, могут быть легко адаптированы для определения протеазной активности других сериновых протеаз гранул путем гидролиза синтетических пептидных субстратов с соответствующей последовательности распознавания, которые перечислены в таблице 1. N-α-CBZ-L-лизин-S- Bzl субстрат может быть использован для обнаружения триптазы активность как GzmA в мышиных и человеческих CL и теоретически GzmK у мышей CL, Хотя выражение GzmK мРНК была продемонстрирована RT-PCR в клетки-киллеры, полученных от GzmAB ген мышей с в ответ на пептиды гриппа 29, мы не знаем активности протеазы GzmK того, было сообщено в этой или любой другой физиологически соответствующем контексте. Активность либо рекомбинантного человеческого GzmH или протеазы, выделенной из клеток NK, может быть оценена с SUC-Phe-Leu-Phe-S-Bzl 30, однако это не возможно приписывать гидролиз этого субстрата в частности к этому гранзима в Клеточные лизаты. Лимфоциты содержат ряд других endolysosomal протеаз, таких как катепсинов, которые также будут иметь химотрипсиноподобную (химазы) активность. У мышей, ген GzmH заменяется кластера генов (Gzms CF) все были предсказаны аналогичные (химазы) деятельности.

Хотя человек GzmB было установлено, эффективно расщепляют BH3-только проапоптотического молекулу Bid, и, таким образом, прямое участие митохондриальнуюсмерть путь 31, по-видимому противоречивые результаты были первоначально получены с мышью GzmB. Эта путаница была решена изящных работ по ряду исследователей, которые определяют, что предпочтительным последовательность узнавания субстрата отличались между мышью и человеком (и крысы) GzmB, несмотря на высокую степень (~ 80%) от общего гомологии последовательности протеаз 16, 17,23. Оптимальное последовательность узнавания для человеческого GzmB является I / V, E / M / Q, P / Хаа (S / T) и D в положении P1, тогда как для мыши GzmB оно L / I / V, Е, F / Y / Q, D 16,17. Основное различие было в положении Р2, а P, в частности, не допускается мышью GzmB, следовательно мыши торгов (IEPD 75) расщепления сайта не может быть обеспечена путем связывания GzmB субстрат щели. Кроме того, синтетические пептидные субстраты IEPD-PNA, обычно описывается как специфичные для GzmB и IETD-PNA, плохо гидролизуется мыши GzmB. Мы более укрепили вывод, сделанные другими 23 с помощью повторныхcombinant Гранзимы, что человек GzmB, но не GzmB присутствует в мыши НК и CTL гидролиза IETD-ПНА и IEPD-ПНА. Kaiserman и др. 17 сравнивали расщепления активности рекомбинантного человеческого и мышиного GrB производится в Pichia pastoris, используя Вос-AAD-SBzl с подложками Ac-IETD-ПНА. Кроме того, авторы обнаружили, что в то время обоих ферментов расщепляться Вос-AAD-SBzl с сопоставимой эффективностью, гидролиза Ac-IETD-ОНУ с помощью мыши GrB был в 30 раз менее эффективно. В то время как Т и Р (а также S) в положении P2 предпочитают человека GzmB, они не переносятся мыши GzmB. С другой стороны, мы ясно продемонстрировали сравнимую GzmB активность как клеточных лизатов человека и мыши NK, используя более общий Вос-AAD-SBzl реагента. Тем не менее, только человек GzmB деятельность может быть обнаружена с реагентом IEPD-ПНА.

Все вместе эти данные подчеркивают тот факт, что различия в тонкой специфичности GzmB различных видов может иметь большое влияние на как выбратьсоответствующим субстратом для анализа ин витро. Таким образом, если обнаружение мыши, крысы или человека GzmB активности исследована, Вос-ААР-SBzl является субстратом выбора.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl SM Biochemicals LLC, CA SMSB05 Granzyme B substrate (mouse and human)
Ac-IEPD-pNA  SM Biochemicals LLC, CA SMPNA009 Granzyme B substrate (only human)
N-α-CBZ-L-lysine-S-Bzl Sigma-Aldrich C3647 Granzyme A substrate
Suc-Phe-Leu-Phe-S-Bzl SM Biochemicals LLC, CA SB025 Granzyme H substrate
5,5’-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid)  Sigma-Aldrich D8130 DTNB, Ellman’s Reagent
NK cell isolation kit II mouse Miltenyi Biotec GmbH 130-096-892 negative selection kit
NK cell isolation kit human Miltenyi Biotec GmbH 130-092-657 negative selection kit
Plate reader Biorad iMark Biorad Microplate Manager Software Version MPM6.3
Serocluster U-bottom vinyl 96-well plate Corning, MA, USA 2797

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Trapani, J. A., Browne, K. A., Dawson, M., Smyth, M. J. Immunopurification of functional Asp-ase (natural killer cell granzyme B) using a monoclonal antibody). Biochem Biophys Res Commun. 195, (2), 910-920 (1993).
  2. Ewen, C. L., Kane, K. P., Bleackley, R. C. A quarter century of granzymes. Cell Death Differ. 19, (1), 28-35 (2012).
  3. Hoves, S., Trapani, J. A., Voskoboinik, I. The battlefield of perforin/granzyme cell death pathways. J Leukoc Biol. (2009).
  4. Peters, P. J., et al. Cytotoxic T lymphocyte granules are secretory lysosomes, containing both perforin and granzymes. J Exp Med. 173, (5), 1099-1109 (1991).
  5. Berthou, C., et al. Acquisition of granzyme B and Fas ligand proteins by human keratinocytes contributes to epidermal cell defense. J Immunol. 159, (11), 5293-5300 (1997).
  6. Tschopp, C. M., et al. Granzyme B, a novel mediator of allergic inflammation: its induction and release in blood basophils and human asthma. Blood. 108, (7), 2290-2299 (2006).
  7. Strik, M. C., et al. Human mast cells produce and release the cytotoxic lymphocyte associated protease granzyme B upon activation. Mol Immunol. 44, (14), 3462-3472 (2007).
  8. Jahrsdorfer, B., et al. Granzyme B produced by human plasmacytoid dendritic cells suppresses T cell expansion. Blood. (2009).
  9. Hagn, M., et al. Human B cells secrete granzyme B when recognizing viral antigens in the context of the acute phase cytokine IL-21. J Immunol. 183, (3), 1838-1845 (2009).
  10. Hagn, M., et al. Human B cells differentiate into granzyme B-secreting cytotoxic B lymphocytes upon incomplete T-cell help. Immunol Cell Biol. 90, (4), 457-467 (2012).
  11. Froelich, C. J., Pardo, J., Simon, M. M. Granule-associated serine proteases: granzymes might not just be killer proteases. Trends Immunol. 30, (3), 117-123 (2009).
  12. Hagn, M., Jahrsdorfer, B. Why do human B cells secrete granzyme B? Insights into a novel B-cell differentiation pathway. Oncoimmunology. 1, (8), 1368-1375 (2012).
  13. Susanto, O., Trapani, J. A., Brasacchio, D. Controversies in granzyme biology. Tissue Antigens. 80, (6), 477-487 (2012).
  14. Walch, M., et al. Cytotoxic cells kill intracellular bacteria through granulysin-mediated delivery of granzymes. Cell. 157, (6), 1309-1323 (2014).
  15. Odake, S., et al. Human and murine cytotoxic T lymphocyte serine proteases: subsite mapping with peptide thioester substrates and inhibition of enzyme activity and cytolysis by isocoumarins. Biochemistry. 30, (8), 2217-2227 (1991).
  16. Casciola-Rosen, L., et al. Mouse and human granzyme B have distinct tetrapeptide specificities and abilities to recruit the bid pathway. J Biol Chem. 282, (7), 4545-4552 (2007).
  17. Kaiserman, D., et al. The major human and mouse granzymes are structurally and functionally divergent. J Cell Biol. 175, (4), 619-630 (2006).
  18. Powers, J. C., Kam, C. M. Peptide thioester substrates for serine peptidases and metalloendopeptidases. Methods Enzymol. 248, 3-18 (1995).
  19. Hagn, M., et al. Activated mouse B cells lack expression of granzyme. B. J Immunol. 188, (2), 3886-3892 (2012).
  20. Konjar, S., et al. Human and mouse perforin are processed in part through cleavage by the lysosomal cysteine proteinase cathepsin L. Immunology. 131, (2), 257-267 (2010).
  21. Sutton, V. R., et al. Residual active granzyme B in cathepsin C-null lymphocytes is sufficient for perforin-dependent target cell apoptosis. J Cell Biol. 176, (4), 425-433 (2007).
  22. Trapani, J. A., Smyth, M. J., Apostolidis, V. A., Dawson, M., Browne, K. A. Granule serine proteases are normal nuclear constituents of natural killer cells. J Biol Chem. 269, (28), 18359-18365 (1994).
  23. Cullen, S. P., Adrain, C., Luthi, A. U., Duriez, P. J., Martin, S. J. Human and murine granzyme B exhibit divergent substrate preferences. J Cell Biol. 176, (4), 435-444 (2007).
  24. Thornberry, N. A., et al. A combinatorial approach defines specificities of members of the caspase family and granzyme B. Functional relationships established for key mediators of apoptosis. J Biol Chem. 272, (29), 17907-17911 (1997).
  25. Bird, C. H., et al. Selective regulation of apoptosis: the cytotoxic lymphocyte serpin proteinase inhibitor 9 protects against granzyme B-mediated apoptosis without perturbing the Fas cell death pathway. Mol Cell Biol. 18, (11), 6387-6398 (1998).
  26. Bots, M., Medema, J. P. Serpins in T cell immunity. J Leukoc Biol. 84, (5), 1238-1247 (2008).
  27. Sun, J., et al. A new family of 10 murine ovalbumin serpins includes two homologs of proteinase inhibitor 8 and two homologs of the granzyme B inhibitor (proteinase inhibitor 9). J Biol Chem. 272, (24), 15434-15441 (1997).
  28. Bird, C. H., Hitchen, C., Prescott, M., Harper, I., Bird, P. I. Immunodetection of granzyme B tissue distribution and cellular localisation. Methods Mol Biol. 844, 237-250 (2012).
  29. Jenkins, M. R., et al. Visualizing CTL activity for different CD8+ effector T cells supports the idea that lower TCR/epitope avidity may be advantageous for target cell killing. Cell Death Differ. 16, (4), 537-542 (2009).
  30. Edwards, K. M., Kam, C. M., Powers, J. C., Trapani, J. A. The human cytotoxic T cell granule serine protease granzyme H has chymotrypsin-like (chymase) activity and is taken up into cytoplasmic vesicles reminiscent of granzyme B-containing endosomes. J Biol Chem. 274, (43), 30468-30473 (1999).
  31. Sutton, V. R., et al. Initiation of apoptosis by granzyme B requires direct cleavage of bid, but not direct granzyme B-mediated caspase activation. J Exp Med. 192, (10), 1403-1414 (2000).
Колориметрический анализ, что меры частности Гранзим протеолитической активности: Гидролиз Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hagn, M., Sutton, V. R., Trapani, J. A. A Colorimetric Assay that Specifically Measures Granzyme B Proteolytic Activity: Hydrolysis of Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl. J. Vis. Exp. (93), e52419, doi:10.3791/52419 (2014).More

Hagn, M., Sutton, V. R., Trapani, J. A. A Colorimetric Assay that Specifically Measures Granzyme B Proteolytic Activity: Hydrolysis of Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl. J. Vis. Exp. (93), e52419, doi:10.3791/52419 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter