En kolorimetrisk analys som Specifikt Åtgärder Granzyme B Proteolytisk Aktivitet: Hydrolys av Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl
Summary
We describe a simple, quantitative colorimetric assay that specifically measures the proteolytic activity of human, mouse or rat Granzyme B (GzmB). This protocol can be easily adapted for determining protease activity of other granule serine proteases by the hydrolysis of other synthetic peptide substrates with an appropriate recognition sequence.
Abstract
The serine protease Granzyme B (GzmB) mediates target cell apoptosis when released by cytotoxic T lymphocytes (CTL) or natural killer (NK) cells. GzmB is the most studied granzyme in humans and mice and therefore, researchers need specific and reliable tools to study its function and role in pathophysiology. This especially necessitates assays that do not recognize proteases such as caspases or other granzymes that are structurally or functionally related. Here, we apply GzmB’s preference for cleavage after aspartic acid residues in a colorimetric assay using the peptide thioester Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl. GzmB is the only mammalian serine protease capable of cleaving this substrate. The substrate is cleaved with similar efficiency by human, mouse and rat GzmB, a property not shared by other commercially available peptide substrates, even some that are advertised as being suitable for this purpose. This protocol is demonstrated using unfractionated lysates from activated NK cells or CTL and is also suitable for recombinant proteases generated in a variety of prokaryotic and eukaryotic systems, provided the correct controls are used. This assay is a highly specific method to ascertain the potential pro-apoptotic activity of cytotoxic molecules in mammalian lymphocytes, and of their recombinant counterparts expressed by a variety of methodologies.
Introduction
Granzymes är en familj av serinproteaser som finns i de sekretoriska lysosomer naturliga mördarceller (NK) och cytotoxiska T-lymfocyter (CTL) en. Fem olika granzymes existerar hos människor (A, B, H, K och M), och tio i möss (A – G, K, M och N) 2,3. Granzym A och Granzyme B (GzmA, GzmB) är den mest förekommande och har undersökts i den mänskliga och gnagare inställning.
Den klassiska funktionen för GzmB är induktionen av apoptos i målceller utförda i samband med det porbildande protein perforin, som tillåter att granzym att komma åt målcellen cytosol 4. Fastän GzmB uttryck entydigt hittas i cytotoxiska lymfocyter, har nyligen gjorda studier har adresse en mängd andra GzmB-uttryckande celltyper, inklusive men inte begränsat till keratinocyter 5, basofiler 6, mastceller 7, plasmacytoid dendritceller 8, och B-celler 9, 10.I detta sammanhang har icke-apoptotiska GzmB funktioner avslöjat allt från deltagande i inflammatoriska processer, vävnadsombildning och andra immun fastigheter 11-14.
Med tanke på att en bredare biologisk roll har föreslagits för GzmB än tidigare misstänkt, forskare kräver tillförlitliga och specifika verktyg för sin upptäckt. Av fördel är GzmB specifika krav på att klyva på karboxylsidan av asparaginsyrarester, en fastighets unika bland eukaryota serinproteaser 15. Mus, människa och råtta GzmB är strukturellt mycket lika, men den förlängda substratspecificitet av mus GzmB skiljer subtilt från den hos både människa och råtta 16, vilket innebär att vissa generiska substrat med Asp i terminalen (P1) kan klyvas på ett effektivt sätt genom GzmB från alla tre arter, medan andra substrat med mer komplicerade sekvenser uppströms i P1 kan ge vitt olika resultat. I både det förflutna och nyare literature, har detta faktum orsakat stor förvirring och feltolkningar av den biologiska betydelsen av vissa experimentella fynd, trots noggrant kontrollerad, har kinetiska studier försökt korrigera situationen 17.
I denna uppsats har vi försökt att belysa dessa punkter med hjälp av två kommersiellt tillgängliga substrat, nämligen Boc-Ala-Ala-Asp-SBzl och N-acetyl-Ile-Glu-Pro-Asp-p-nitroanilid. De två reagenser gör genererar olika reaktiva grupper efter klyvning (en fri sulfhydrylgrupp kontra ett fluorescerande fri paranitroanilid), men detta har ingen effekt oavsett om proteolytisk klyvning. Den beskrivna protokollet är en modern anpassning av en mycket gammal protokoll 18, men bör hjälpa utredarna att använda de olika GzmB substrat lämpligt, och samtidigt ge en metodisk ram för detektering av aktiviteten hos andra granzymes såsom GzmA och GzmH.
Protocol
Representative Results
Discussion
Historiskt de granzymes identifierades som viktiga effektormolekyler av cytotoxiska lymfocyter (CTL och NK-celler) som kan inducera en snabb apoptotisk död i målceller. Detta berodde i huvudsak på grund av inverkan av GzmB som klyvs målsubstrat molekyler vid aspartat (D) rester och därmed kunde aktivera kaspaskaskaden både klyvnings pro-kaspaser, liksom flera av sina nedströms mål. Dock är det nu uppskattat att GzmB uttryck inte är begränsat till lymfoida cytotoxiska celler och dess funktion kan förlängas l…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work received support through grant HA 6136/1-1 from the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) to MH. JAT is supported by Program and Project Grants from the National Health and Medical Research Council of Australia.
Materials
| Product | Company | Catalogue number | Comment/description |
| Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl | SM Biochemicals LLC, CA | SMSB05 | Granzyme B substrate (mouse and human) |
| Ac-IEPD-pNA | SM Biochemicals LLC, CA | SMPNA009 | Granzyme B substrate (only human) |
| N-a-CBZ-L-lysine-S-Bzl | Sigma-Aldrich | C3647 | Granzyme A substrate |
| Suc-Phe-Leu-Phe-S-Bzl | SM Biochemicals LLC, CA | SB025 | Granzyme H substrate |
| 5,5’-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid) | Sigma-Aldrich | D8130 | DTNB, Ellman’s Reagent |
| NK cell isolation kit II mouse | Miltenyi Biotec GmbH | 130-096-892 | negative selection kit |
| NK cell isolation kit human | Miltenyi Biotec GmbH | 130-092-657 | negative selection kit |
| Plate reader | Biorad iMark | Biorad Microplate Manager Software Version MPM6.3 | |
| Serocluster U-bottom vinyl 96-well plate | Corning, MA, USA | 2797 |
References
- Trapani, J. A., Browne, K. A., Dawson, M., Smyth, M. J. Immunopurification of functional Asp-ase (natural killer cell granzyme B) using a monoclonal antibody). Biochem Biophys Res Commun. 195 (2), 910-920 (1993).
- Ewen, C. L., Kane, K. P., Bleackley, R. C. A quarter century of granzymes. Cell Death Differ. 19 (1), 28-35 (2012).
- Hoves, S., Trapani, J. A., Voskoboinik, I. The battlefield of perforin/granzyme cell death pathways. J Leukoc Biol. , (2009).
- Peters, P. J., et al. Cytotoxic T lymphocyte granules are secretory lysosomes, containing both perforin and granzymes. J Exp Med. 173 (5), 1099-1109 (1991).
- Berthou, C., et al. Acquisition of granzyme B and Fas ligand proteins by human keratinocytes contributes to epidermal cell defense. J Immunol. 159 (11), 5293-5300 (1997).
- Tschopp, C. M., et al. Granzyme B, a novel mediator of allergic inflammation: its induction and release in blood basophils and human asthma. Blood. 108 (7), 2290-2299 (2006).
- Strik, M. C., et al. Human mast cells produce and release the cytotoxic lymphocyte associated protease granzyme B upon activation. Mol Immunol. 44 (14), 3462-3472 (2007).
- Jahrsdorfer, B., et al. Granzyme B produced by human plasmacytoid dendritic cells suppresses T cell expansion. Blood. , (2009).
- Hagn, M., et al. Human B cells secrete granzyme B when recognizing viral antigens in the context of the acute phase cytokine IL-21. J Immunol. 183 (3), 1838-1845 (2009).
- Hagn, M., et al. Human B cells differentiate into granzyme B-secreting cytotoxic B lymphocytes upon incomplete T-cell help. Immunol Cell Biol. 90 (4), 457-467 (2012).
- Froelich, C. J., Pardo, J., Simon, M. M. Granule-associated serine proteases: granzymes might not just be killer proteases. Trends Immunol. 30 (3), 117-123 (2009).
- Hagn, M., Jahrsdorfer, B. Why do human B cells secrete granzyme B? Insights into a novel B-cell differentiation pathway. Oncoimmunology. 1 (8), 1368-1375 (2012).
- Susanto, O., Trapani, J. A., Brasacchio, D. Controversies in granzyme biology. Tissue Antigens. 80 (6), 477-487 (2012).
- Walch, M., et al. Cytotoxic cells kill intracellular bacteria through granulysin-mediated delivery of granzymes. Cell. 157 (6), 1309-1323 (2014).
- Odake, S., et al. Human and murine cytotoxic T lymphocyte serine proteases: subsite mapping with peptide thioester substrates and inhibition of enzyme activity and cytolysis by isocoumarins. Biochemistry. 30 (8), 2217-2227 (1991).
- Casciola-Rosen, L., et al. Mouse and human granzyme B have distinct tetrapeptide specificities and abilities to recruit the bid pathway. J Biol Chem. 282 (7), 4545-4552 (2007).
- Kaiserman, D., et al. The major human and mouse granzymes are structurally and functionally divergent. J Cell Biol. 175 (4), 619-630 (2006).
- Powers, J. C., Kam, C. M. Peptide thioester substrates for serine peptidases and metalloendopeptidases. Methods Enzymol. 248, 3-18 (1995).
- Hagn, M., et al. Activated mouse B cells lack expression of granzyme. B. J Immunol. 188 (2), 3886-3892 (2012).
- Konjar, S., et al. Human and mouse perforin are processed in part through cleavage by the lysosomal cysteine proteinase cathepsin L. Immunology. 131 (2), 257-267 (2010).
- Sutton, V. R., et al. Residual active granzyme B in cathepsin C-null lymphocytes is sufficient for perforin-dependent target cell apoptosis. J Cell Biol. 176 (4), 425-433 (2007).
- Trapani, J. A., Smyth, M. J., Apostolidis, V. A., Dawson, M., Browne, K. A. Granule serine proteases are normal nuclear constituents of natural killer cells. J Biol Chem. 269 (28), 18359-18365 (1994).
- Cullen, S. P., Adrain, C., Luthi, A. U., Duriez, P. J., Martin, S. J. Human and murine granzyme B exhibit divergent substrate preferences. J Cell Biol. 176 (4), 435-444 (2007).
- Thornberry, N. A., et al. A combinatorial approach defines specificities of members of the caspase family and granzyme B. Functional relationships established for key mediators of apoptosis. J Biol Chem. 272 (29), 17907-17911 (1997).
- Bird, C. H., et al. Selective regulation of apoptosis: the cytotoxic lymphocyte serpin proteinase inhibitor 9 protects against granzyme B-mediated apoptosis without perturbing the Fas cell death pathway. Mol Cell Biol. 18 (11), 6387-6398 (1998).
- Bots, M., Medema, J. P. Serpins in T cell immunity. J Leukoc Biol. 84 (5), 1238-1247 (2008).
- Sun, J., et al. A new family of 10 murine ovalbumin serpins includes two homologs of proteinase inhibitor 8 and two homologs of the granzyme B inhibitor (proteinase inhibitor 9). J Biol Chem. 272 (24), 15434-15441 (1997).
- Bird, C. H., Hitchen, C., Prescott, M., Harper, I., Bird, P. I. Immunodetection of granzyme B tissue distribution and cellular localisation. Methods Mol Biol. 844, 237-250 (2012).
- Jenkins, M. R., et al. Visualizing CTL activity for different CD8+ effector T cells supports the idea that lower TCR/epitope avidity may be advantageous for target cell killing. Cell Death Differ. 16 (4), 537-542 (2009).
- Edwards, K. M., Kam, C. M., Powers, J. C., Trapani, J. A. The human cytotoxic T cell granule serine protease granzyme H has chymotrypsin-like (chymase) activity and is taken up into cytoplasmic vesicles reminiscent of granzyme B-containing endosomes. J Biol Chem. 274 (43), 30468-30473 (1999).
- Sutton, V. R., et al. Initiation of apoptosis by granzyme B requires direct cleavage of bid, but not direct granzyme B-mediated caspase activation. J Exp Med. 192 (10), 1403-1414 (2000).
