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Chemistry

Boc-अला-अला-ASP-एस-Bzl की hydrolysis: एक वर्णमिति विशेष रूप से granzyme बी proteolytic गतिविधि उपाय है कि परख

doi: 10.3791/52419 Published: November 28, 2014

Introduction

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Granzymes प्राकृतिक हत्यारा (एन.के.) कोशिकाओं और साइटोटोक्सिक टी lymphocytes (सीटीएल) 1 के स्रावी लाइसोसोम में पाया सेरीन प्रोटिएजों के एक परिवार के हैं। पांच अलग granzymes मनुष्य (ए, बी, एच, कश्मीर और एम) में मौजूद हैं, और चूहों में दस (ए - जी, कश्मीर, एम और एन) 2,3। Granzyme ए और granzyme बी (GzmA, GzmB) सबसे प्रचुर मात्रा में हैं और बड़े पैमाने पर मानव और कृंतक सेटिंग में जांच की गई है।

GzmB की क्लासिक समारोह लक्ष्य सेल cytosol चार तक पहुँचने के लिए granzyme परमिट जो ताकना बनाने प्रोटीन perforin, के साथ संयोजन के रूप में क्रियान्वित लक्ष्य कोशिकाओं में apoptosis के शामिल है। GzmB अभिव्यक्ति स्पष्ट साइटोटोक्सिक लिम्फोसाइटों में पाया जाता है, हाल के अध्ययनों से बेसोफिल 6, मस्तूल कोशिकाओं 7, plasmacytoid वृक्ष के समान कोशिकाओं 8, और बी कोशिकाओं 9, लेकिन सहित केरेटिनकोशिकाओं 5 तक ही सीमित नहीं है, अन्य GzmB व्यक्त सेल प्रकार की एक किस्म को संबोधित किया गया है, 10।इस संदर्भ में, गैर apoptotic GzmB कार्यों सूजन प्रक्रियाओं, ऊतक remodeling और अन्य immunoregulatory गुण 11-14 में भाग लेने से लेकर पता चला रहे थे।

एक व्यापक जैविक भूमिका पहले से संदिग्ध से GzmB के लिए प्रस्तावित किया गया है कि यह देखते हुए, शोधकर्ताओं ने इसकी जांच के लिए विश्वसनीय और विशेष उपकरण की आवश्यकता होती है। लाभ के यूकेरियोटिक सेरीन प्रोटिएजों 15 के बीच में अद्वितीय Aspartic एसिड के अवशेष, एक संपत्ति की कार्बाक्सिल पक्ष पर फोड़ना GzmB की विशेष आवश्यकता है। माउस, मानव और चूहे GzmB हालांकि माउस GzmB की विस्तारित सब्सट्रेट विशिष्टता टर्मिनल (P1) में एएसपी के साथ कुछ सामान्य substrates के GzmB द्वारा कुशलतापूर्वक cleaved किया जा सकता है जिसका मतलब है कि दोनों मानव और चूहे 16 के उस से आसानी से अलग है, संरचनात्मक रूप बहुत समान हैं सभी तीन प्रजातियों से, नदी के ऊपर P1 के और अधिक जटिल दृश्यों के साथ अन्य substrates जबकि व्यापक रूप से चर परिणाम दे सकता है। अतीत और अधिक हाल ही में ली दोनों मेंterature, इस तथ्य को ध्यान से नियंत्रित है, भले ही काफी भ्रम और कुछ प्रयोगात्मक निष्कर्षों की जैविक महत्व के अशुद्ध अर्थ के कारण होता है, काइनेटिक पढ़ाई की स्थिति में 17 को सही करने की मांग की है।

इस पत्र में हम दो व्यावसायिक रूप से उपलब्ध substrates के, अर्थात् Boc-अला-अला-ASP-SBzl और एन एसिटाइल-इले-ग्लू-प्रो-ASP-P-nitroanilide का उपयोग कर इन बिंदुओं को वर्णन करने की मांग की है। दो अभिकर्मकों दरार (एक फ्लोरोसेंट मुक्त paranitroanilide बनाम एक मुक्त sulphydryl) निम्नलिखित विभिन्न प्रतिक्रियाशील समूहों उत्पन्न करते हैं, लेकिन इस प्रोटियोलिटिक दरार पर कोई प्रभाव नहीं है जो कुछ भी किया है। वर्णित प्रोटोकॉल एक बहुत पुराना प्रोटोकॉल 18 के एक आधुनिक रूपांतरण है, लेकिन ऐसे भी GzmA और GzmH के रूप में अन्य granzymes, की गतिविधि का पता लगाने के लिए एक methodological ढांचा उपलब्ध कराने, जबकि जांचकर्ताओं, उचित रूप से अलग GzmB substrates का उपयोग करने के लिए मदद करनी चाहिए।

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Protocol

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नोट: चूहों से प्राप्त किए गए Spleens (उम्र के 6-10 सप्ताह) और सभी पशु प्रयोगों पीटर MacCallum कैंसर सेंटर (E486) के पशु नैतिकता के दिशा-निर्देशों के अनुसार प्रदर्शन किया गया।

नमूने के 1. तैयारी।

  1. सक्रिय माउस एन.के. कोशिकाओं की तैयारी।
    1. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग नकारात्मक चयन द्वारा (GzmB जीन नल) चूहों - / - C57BL 6 / या B6.GrzmB की spleens की एकल कोशिका निलंबन से प्राथमिक अनुभवहीन एन.के. कोशिकाओं को अलग।
    2. 'निर्माताओं प्रोटोकॉल का पालन करें। संक्षेप में, चुंबकीय ऐसी टी और बी कोशिकाओं, वृक्ष के समान कोशिकाओं, granulocytes, मैक्रोफेज, और उनके विशिष्ट सतह मार्कर के खिलाफ बायोटिन संयुग्मित एंटीबॉडी का उपयोग लाल रक्त कोशिकाओं के रूप में "गैर-एन.के." कोशिकाओं लेबल। "गैर एन.के." कोशिकाओं खाली करने के लिए विरोधी बायोटिन मोतियों के साथ चुंबकीय जुदाई का प्रयोग करें।
    3. संस्कृति 24 अच्छी तरह से प्लेट में 700,000 कोशिकाओं / एमएल पर आईएल -2 (1000 यू / एमएल) युक्त मीडिया में 5-7 दिनों के लिए एन.के. कोशिकाओं को अलग-थलग37 पर   सी।
    4. वैकल्पिक रूप से, उपयोग 19 टी कोशिकाओं, OT1 टी सेल रिसेप्टर ट्रांसजेनिक चूहों 20 से प्राथमिक प्रतिजन प्रतिबंधित सीटीएल, सीटीएल स्रावित GzmB 19 की गतिविधि को निर्धारित करने के लिए सक्रिय एन.के. कोशिकाओं से मिश्रित लिम्फोसाइट संस्कृतियों 21, या supernatants में उत्पन्न सक्रिय।
  2. मानव एन.के. सेल लाइन और प्राथमिक एन.के. कोशिकाओं के अलगाव का रखरखाव।
    1. 10% भ्रूण बछड़ा सीरम के साथ पूरक रोसवेल पार्क मेमोरियल संस्थान (RPMI) मध्यम में मानव एन.के. ल्यूकेमिया (yt कोशिकाओं) बनाए रखें। वैकल्पिक रूप से, स्वस्थ विषयों के परिधीय रक्त से प्राथमिक एन.के. कोशिकाओं को शुद्ध और पहले 22 में वर्णित के रूप में आईएल -2 100 यू / एमएल युक्त मध्यम में 2-3 दिनों के लिए प्रोत्साहित करना।
  3. सेल lysates का सृजन।
    1. पीबीएस (7.4 पीएच) में कोशिकाओं को तीन बार धोएं, तो Nonidet पी-40 lysis बफर में निलंबित (0.1% एनपी 40, 250 मिमी NaCl, 25 मिमी Hepes, 2.5 मिमी EDTA)। आदर्श रूप में, 5 एक्स 10 6 की एक न्यूनतम lyse 7 टी कोशिकाओं> ऊपर। प्रोटीज इनहिबिटर्स जोड़ नहीं है, के रूप में कई ऐसे GzmA के रूप में अपरिवर्तनीय सेरीन proteases की अवरोधकों, और विशेष रूप से tryptases में हैं। 20 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं, और फिर 10 मिनट के लिए 15,000 XG पर एक microcentrifuge में नाभिक गोली। परमाणु गोली त्यागें और एक ताजा ट्यूब स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला।
  4. Lysates के प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण।
    1. ऐसे ब्रैडफोर्ड या bicinchoninic एसिड (बीसीए), के रूप में पसंद का एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्रोटोकॉल का उपयोग करें और प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण। एकाग्रता ~ 2 मिलीग्राम / एमएल न्यूनतम है कि सुनिश्चित करें। जब तक आवश्यक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर lysates (granzyme गतिविधि -20 डिग्री सेल्सियस पर कई महीनों के लिए स्थिर है)।

2. granzyme बी गतिविधि परख

  1. अभिकर्मकों की तैयारी
    1. DMSO में substrates के (बीओसी-एएडी-एस-Bzl या एसी-IEPD-PNA) के एक 10 मिमी स्टॉक तैयार करें (~ 5 मिलीग्राम / एमएल) -20 & # पर aliquots में और दुकान176, सी। हौसले से काम कर रहे एक कमजोर पड़ने को तैयार है और बीओसी-एएडी-एस-Bzl आंशिक रूप से DMSO में भंडारण पर hydrolyzes के रूप में, प्रत्येक दिन के बाद त्यागें।
    2. -20 डिग्री सेल्सियस पर एक 250 मिमी DMSO में वर्णमिति अभिकर्मक (5,5'-dithio बीआईएस (2-nitrobenzoic एसिड), DTNB) के शेयर (0.09 ग्राम / एमएल) और दुकान तैयार करें। प्रत्येक दिन एक नए सिरे से काम करने की कमजोर पड़ने को तैयार है। यह अभिकर्मक केवल SBzl सूचक समूहों, नहीं PNA साथ substrates के लिए आवश्यक है।
    3. ताजा बफर (0.1M HEPES, 0.05 एम 2 MgCl, पीएच 7.3) हर 2-3 सप्ताह अप करें।
  2. कमरे के तापमान को DTNB और सिंथेटिक substrates के लाओ। पतला substrates (01:16, जैसे 1.6 बफर के मिलीलीटर में 100 μl) और DTNB (1: 250, जैसे 10 2.5 एमएल बफर में μl) और अच्छी तरह मिक्स।
  3. 160 μl के अंतिम मात्रा करने के लिए बफर में प्रत्येक नमूने की 100 माइक्रोग्राम प्रति प्रोटीन lysate के एक न्यूनतम पतला। एक multichannel विंदुक का प्रयोग एक '' यू '' नीचे vinyl के 96 अच्छी तरह से थाली में (~ 33.3 माइक्रोग्राम प्रति / अच्छी तरह से) तीन प्रतियों में अच्छी तरह से प्रति 50 μl जोड़ें।एक 'बफर केवल "नियंत्रण शामिल हैं (यह भी तीन प्रतियों में)।
  4. एसी-IEPD-PNA के साथ काम कर जब नमूने / बफर नियंत्रण करने के लिए पतला DTNB के 100 μl जोड़ें (यह कदम न आना।
    नोट: GzmB द्वारा एसी-IEPD-PNA की दरार सीधे fluorogenic PNA (4B चित्रा) विज्ञप्ति।
  5. फिर जल्दी बफर किसी भी नकारात्मक नियंत्रण के साथ शुरू करने और उम्मीद की सकारात्मक नमूनों के साथ परिष्करण, triplicates के प्रत्येक सेट के लिए पतला substrates के 50 μl जोड़ने के लिए एक multichannel विंदुक का प्रयोग करें।
  6. प्लेट रीडर में थाली रखें। आयुध डिपो 405 एनएम पर एक microplate रीडर में Boc-अला-अला-ASP-एस-Bzl / एसी IEPD-PNA की hydrolysis द्वारा ASP-एएसई गतिविधि को मापने। 25 रीडिंग, हर 15 सेकंड (सीए 6 मिनट कुल समय पढ़ने) लेने के लिए, एक काइनेटिक परख प्रोटोकॉल का उपयोग करें।
  7. थाली-पाठक का सॉफ्टवेयर Vmax के लिए एक मूल्य उत्पन्न नहीं कर सकते अगर मैन्युअल रूप से सब्सट्रेट दरार की दर की गणना करने के लिए हर समय बिंदु पर उत्पन्न absorbance के रीडिंग का प्रयोग करें।

दा 3. विश्लेषणप्रादेशिक सेना

नोट: समय के साथ आयुध डिपो के परिवर्तन (मॉड / मिनट) के रूप में परिभाषित अधिकतम वेग के रूप में प्रस्तुत किया जाता है उत्पन्न डेटा,।

  1. डेटा का विश्लेषण करने के लिए, absorbance के में परिवर्तन की दर से गणना की है, जो सब्सट्रेट दरार, की अधिकतम दर निर्धारित करते हैं। स्वचालित रूप से आम तौर पर इस विकल्प है, जो प्लेट रीडर सॉफ्टवेयर का उपयोग कर, यह मत करो।
  2. वैकल्पिक रूप से मैन्युअल रूप से, प्लेट रीडर पर गतिज परख के दौरान उत्पन्न कर रहे हैं, जो absorbance के में परिवर्तन, की गतिज भूखंडों को देखने के बाद तेज सीधी रेखा दे जो डेटा बिंदुओं का चयन करें। सबसे assays के लिए अधिकतम दर परख के पहले दो मिनट के भीतर हासिल की है।
  3. समय के अंतराल से इस सीधी रेखा और विभाजन पर उच्चतम आयुध डिपो पढ़ने से प्रारंभिक आयुध डिपो पढ़ने घटाना। सांख्यिकीय विश्लेषण और ग्राफिक प्रदर्शन के लिए माइक्रोसॉफ्ट एक्सेल ग्राफ / पैड के लिए कच्चे डेटा स्थानांतरण।

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Representative Results

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Boc-एएडी-एस-Bzl सब्सट्रेट GzmB के लिए विशिष्ट है

सेरीन प्रोटीज GzmB साइटोटोक्सिक लिम्फोसाइटों (सीटीएल और एन.के. कोशिकाओं) के एक प्रमुख घटक है और इस तरह के वायरस से संक्रमित है या बदल कोशिकाओं के रूप में लक्ष्य कोशिकाओं में तेजी apoptotic मौत उत्प्रेरण के लिए मुख्य रूप से जिम्मेदार है। इस वजह से चयनित प्रोटीन में कुछ विशिष्ट aspartate अवशेषों के बाद दरार के लिए अपने सब्सट्रेट पसंद करने के लिए बड़े पैमाने पर है, एक विशेषता यह भी aspartate अवशेषों के बाद फोड़ना लेकिन प्रोटिएजों का एक अलग वर्ग है, सिस्टीन प्रोटीज परिवार 15 में से हैं जो caspases, साथ साझा की है। प्रोटियोलिटिक तंत्र में यह अंतर एएडी-SBzl किसी भी कस्पासे द्वारा cleaved नहीं किया जा सकता है कि इसका मतलब है। GzmB अभिव्यक्ति इन कोशिकाओं (चित्रा 1) से तैयार सेल lysates में नजर रखी जा सकती साइटोटोक्सिक लिम्फोसाइटों और enzymatic गतिविधि के सक्रियण निम्नलिखित प्रेरित किया जाता है। granzyme जीन पीटा चूहों की उपलब्धता हमें लगता है कि स्थापित करने की अनुमति दी गई हैसिंथेटिक पेप्टाइड सब्सट्रेट Boc-अला-अला-एएसपी (एएडी) - thiobenzyl एस्टर (एस Bzl) विशेष रूप से GzmB द्वारा HYDROLYSED है। सिंथेटिक सब्सट्रेट के मजबूत दरार बी -6 प्राथमिक एन.के. कोशिकाओं से एक सेल lysate में मापा जाता है, लेकिन नहीं B6.GrzmB में किया जा सकता है - / - एन.के. कोशिकाओं। एन-α-सी बी जेड एल Lysine (बीएलटी) की hydrolysis द्वारा मापा ट्रिप्सिन की तरह (tryptase) सब्सट्रेट विशिष्टता है और दोनों lysates में मौजूद है जो एक नियंत्रण, GzmA के proteolytic गतिविधि के रूप में, बराबर था -S- Bzl।

प्रजाति विशिष्ट GzmB सब्सट्रेट मान्यता अनुक्रम

यह माउस और मानव GzmB P1 के aspartate 23 के आसपास के मानचित्रण के अवशेष के रूप में कई 8-10 रूप से निर्धारित होता है जो एक थोड़ा बदल सब्सट्रेट मान्यता पसंद है, उभरा है कि जब तक GzmB द्वारा cleaved संभावित लक्ष्य सेल अणुओं का वर्णन प्रारंभिक अध्ययन में कुछ भ्रम का कारण बना। इस समर्थक apoptotic BH3-ही की दरार की जांच की है कि पढ़ाई में विशेष रूप से स्पष्ट हो गया थामाउस GzmB से अब तक कम कुशलतापूर्वक मानव द्वारा कुशलतापूर्वक cleaved, लेकिन हो सकता है, जो अणु बोली,। बरकरार कोशिकाओं में, इस अंतर को प्रत्यक्ष कस्पासे सक्रियण के माध्यम से मानव माइटोकॉन्ड्रियल मार्ग के माध्यम से अधिमान्यतया ऑपरेटिंग GzmB, और माउस GzmB के साथ, अलग सेल मौत रास्ते की सक्रियता का परिणाम है। Tetrapeptide दृश्यों का विश्लेषण मानव नहीं बल्कि माउस GzmB मानव और माउस बोली 16 दोनों में मान्यता अनुक्रम से मेल खाता है जो अनुक्रम IEPD, के बाद फोड़ना सकता है कि पता चला। दोनों साहित्य में और वाणिज्यिक उत्पाद tetrapeptide सब्सट्रेट कैटलॉग में, एसी IEPD-PNA GzmB गतिविधि (तालिका 1) के लिए परीक्षण करने के लिए सामान्य रूप से इस्तेमाल किया गया है। यह whilst के मानव और माउस दोनों बहुत समान दक्षता के साथ, BOC-एएडी-एस-Bzl फोड़ना कर सकते हैं कि अब यह स्पष्ट है, एन.के. सेल lysates में माउस GzmB (चित्रा 2) कुशलतापूर्वक hydrolyse एसी IEPD-PNA में विफल रहता है। इसके विपरीत, 30 माइक्रोग्राम प्रति 10 माइक्रोग्राम प्रति से मानव एन.के. YT lysate की मात्रा कम अभी भी resulteपर्याप्त GzmB में डी एसी IEPD-PNA सब्सट्रेट (चित्रा 3) hydrolyse करने के लिए।

चित्रा 1
चित्रा 1:। ग्रेन्युल एंजाइम गतिविधि murine एन.के. कोशिकाओं में granzyme बी (ऊपरी पैनल) और बी -6 wildtype और B6.GrzmB पीटा चूहों से एन.के. सेल lysates में granzyme ए (कम पैनल) गतिविधि Boc- की hydrolysis की अधिकतम दर से निर्धारित किया गया था अला-अला ASP-एस-Bzl और एन α-सी बी जेड एल-एस-Bzl लाइसिन पेप्टाइड substrates के। डाटा तीन प्रतियों (एन> 3) में प्रदर्शन एक प्रतिनिधि प्रयोग को दर्शाती है।

चित्रा 2
चित्रा 2:। एसी-IEPD- PNA सब्सट्रेट माउस और मानव GzmB की प्रजाति विशिष्ट hydrolysis के समान रूप से Boc-अला-अला-ASP-एस-Bzl HYDROLYSED लेकिन केवल मानव GzmB एसी IEPD-PNA HYDROLYSED। इंसानएन.के. सेल लाइन YT और प्राथमिक आईएल -2 सक्रिय माउस एन.के. GzmB के एक स्रोत के रूप में इस्तेमाल किया गया। बार ग्राफ (एन> 3) तीन प्रतियों में प्रदर्शन एक प्रतिनिधि प्रयोग से पता चलता है।

चित्रा 3
चित्रा 3:। GzmB गतिविधि रद्द नहीं किया, प्रोटीन एकाग्रता में कमी मानव GzmB द्वारा प्रेरित एसी IEPD-PNA की hydrolysis की दर YT एन.के. सेल लाइन lysate के घटते प्रोटीन एकाग्रता का उपयोग करने की तुलना में किया गया था। N> 3 के लिए प्रयोग प्रतिनिधि।

चित्रा 4
चित्रा 4:। परख सिद्धांत की चित्रमय चित्रण GzmB cleaves Boc-एएडी-एस-Bzl (ए) और एसी IEPD-PNA (बी) P1 के aspartate के बाद, जिससे रिहा substrates के लिए या तो बदले में साथ सूचना का आदान प्रदान, जो एक लोबान mercaptan, डीTNB एक fluorogenic 3-carboxy-4-nitrophenoxide आयन (ए) के रूप है, या करने के लिए सीधे एक क्रोमोफोर ही (बी) है जो पी-nitroanilide, जारी करके। दोनों इन अणुओं के प्रतिदीप्ति उत्सर्जन 405 एनएम का पता लगाया जा सकता है।

सेरीन प्रोटीज सब्सट्रेट कार्यकलाप
Granzyme एक एन-α-सी बी जेड एल Lysine (बीएलटी) thiobenzyl एस्टर (एस Bzl) Tryptase 22
Granzyme बी 1. Boc-अला-अला-एएसपी (एएडी) एस-Bzl ASPase 14
2. एन एसिटाइल-इले-ग्लू-प्रो-एएसपी (IEPD) -p-nitroanilide (PNA)
Granzyme एच सफलता-Phe-लियू-Phe-एस-Bzl Chymase 23

तालिका 1:। GzmA की granzyme गतिविधि का पता लगाने के लिए उपलब्ध substrates की सूची Tryptase गतिविधि विशिष्ट एन α-सी बी जेड एल Lysine की hydrolysis (बीएलटी) thiobenzyl एस्टर से पता लगाया जा सकता है (एस Bzl) । GzmB विशेष रूप से या तो Boc-अला-अला-एएसपी (एएडी) की hydrolysis द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है, जो aspartate अवशेषों (एएसपी-एएसई), के बाद cleaves एस-Bzl (पता लगाता माउस और मानव GzmB गतिविधि), या एन एसिटाइल-Ile- ग्लू-प्रो-एएसपी (IEPD) -p-nitroanilide (PNA) (केवल मानव GzmB गतिविधि का पता लगाता है)। GzmH की Chymase गतिविधि सफलता-Phe-लियू-Phe-एस-Bzl की दरार द्वारा मूल्यांकन किया है।

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Discussion

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ऐतिहासिक दृष्टि से granzymes लक्ष्य कोशिकाओं में तेजी से apoptotic मौत उत्प्रेरण में सक्षम साइटोटोक्सिक लिम्फोसाइटों (सीटीएल और एन.के. कोशिकाओं) के प्रमुख प्रेरक अणुओं के रूप में पहचान की गई। इस वजह से aspartate (डी) अवशेषों पर लक्ष्य सब्सट्रेट अणुओं cleaved और इस प्रकार उनके बहाव के लक्ष्य के कई है, साथ ही दोनों cleaving समर्थक caspases द्वारा कस्पासे झरना सक्रिय करने में सक्षम था जो GzmB की कार्रवाई करने के लिए मुख्य रूप से किया गया था। हालांकि, यह अब GzmB अभिव्यक्ति ल्य्म्फोइड साइटोटोक्सिक कोशिकाओं तक ही सीमित नहीं है और अपने कार्य को अच्छी तरह से लक्ष्य सेल मान्यता और कोशिका मृत्यु से आगे बढ़ाया जा सकता है की सराहना की है।

इस पत्र में हम एक सरल वर्णमिति परख का उपयोग माउस और मानव सीटीएल / एन.के. कोशिकाओं दोनों से ली गई कोशिका lysates में सक्रिय GzmB का पता लगाने के लिए सक्षम बनाता है कि एक प्रोटोकॉल का वर्णन है। इस प्रोटोकॉल के आवेदन अन्य स्रोत से सेलुलर नमूनों में GzmB की जांच करने की अनुमति देते हैं कि इन निष्कर्षों से पता लगाया के रूप में इस परख की सादगी और विशिष्टताएस। हालांकि, यह सेलुलर lysates कम से कम 2mg / एमएल के एक प्रोटीन एकाग्रता है, और उपयुक्त सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल में शामिल हैं जो महत्वपूर्ण है। गतिविधि (चित्रा 1) पूरी तरह से खो दिया है के रूप में GzmB के लिए Boc-एएडी-SBzl अभिकर्मक की विशिष्टता, GzmB अशक्त जानवरों से व्युत्पन्न lysate में सब्सट्रेट-दरार गतिविधि की कमी से स्पष्ट है। किसी भी भविष्य के अध्ययनों में यह इस तरह के एक नकारात्मक नियंत्रण (एस। प्रोटोकॉल अनुभाग 1.1) का पता चला किसी भी गतिविधि GrzB के लिए विशिष्ट है कि यह पुष्टि करने के लिए प्रयोग किया जाता है कि सिफारिश की है। (नोट: GRB तरह, caspases P1 के स्थिति में aspartate अवशेषों में दरार के लिए एक पूर्ण विशिष्टता है हालांकि पी 4 अमीनो एसिड भी विशिष्टता 24 का एक महत्वपूर्ण निर्धारक है जहां, वरीय substrates के tetrapepetides कर रहे हैं।)। पुनः संयोजक सामग्री एलनाइन उत्परिवर्ती प्रोटीज (सक्रिय एंजाइम के रूप में ठीक उसी तरह तैयार निष्क्रिय प्रोटीज) के लिए सक्रिय साइट सेरीन की जांच अगर मैं होना चाहिएncluded, और इस गैर स्तनधारी सेल lysates, खमीर या बैक्टीरियल कोशिकाओं से विशेष रूप से उन परख करने की क्रिया अगर विशेष रूप से महत्वपूर्ण है।

स्तनधारी कोशिकाओं के assays के लिए ऊपर प्रोटोकॉल का प्रयोग, GzmB गतिविधि के रूप में अच्छी तरह से ली गई कोशिकाओं में सक्रिय साइटोटोक्सिक लिम्फोसाइटों (सीएल) 25 में विनियमित ऊपर बहुत हो सकता है जो अंतर्जात आत्मीय सेरीन प्रोटीज इनहिबिटर्स (serpins) की उपस्थिति, से कम नहीं है बदल कोशिकाओं 26 सहित गैर प्रतिरक्षा ऊतकों, से। साइटोसोलिक serpinB9, (पूर्व में गड़बड़ी -9) मानव GzmB के लिए अत्यधिक विशिष्ट है; हालांकि माउस में, serpin B9, या SPI-6 माउस GzmB 27 के लिए महत्वपूर्ण निरोधात्मक गतिविधि है, जिनमें से कई लेस करीब लेकिन विशिष्ट orthologues कर रहे हैं। एनपी 40 बफर में सेल 37 डिग्री सेल्सियस पर GzmB और serpin, ऊष्मायन के बीच एक अपरिवर्तनीय बातचीत पैदा करने के लिए स्वतंत्र हो सकता है इष्टतम जटिल गठन 28 के लिए आवश्यक है। हम वीं में जटिल गठन का पता नहीं लगाप्रोटीज गतिविधि की हानि में परिणाम होगा जो पश्चिमी धब्बा, द्वारा ई lysates। यह प्रोटोकॉल, ठेठ परिवेश प्रयोगशाला के तापमान पर किया जाता है करने के लिए ~ 22 डिग्री सेल्सियस के ऊपर।

इन assays प्रदर्शन कर अनुभव के 20 से अधिक वर्षों से हम Boc-एएडी-SBzl अभिकर्मक के वाणिज्यिक स्रोत, लगातार संवेदनशील और विश्वसनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए अत्यंत महत्व का है कि मिल गया है। अन्य वाणिज्यिक सूत्रों ने यह भी अन्य granzymes की गतिविधि का पता लगाने के लिए आवश्यक substrates के लिए उपयुक्त हैं, हालांकि हम केवल, हम संदर्भित किया है सप्लायर की सिफारिश करेंगे। इस पत्र में वर्णित प्रोटोकॉल आसानी से 1 टेबल में सूचीबद्ध के रूप में एक उचित मान्यता अनुक्रम के साथ सिंथेटिक पेप्टाइड substrates के हाइड्रोलिसिस द्वारा अन्य दाना सेरीन proteases की प्रोटीज गतिविधि का निर्धारण करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता। एन α-सी बी जेड एल Lysine-एस Bzl सब्सट्रेट सीएल माउस में माउस और मानव सीएल और सैद्धांतिक रूप से GzmK में दोनों GzmA की tryptase गतिविधि का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। GzmK mRNA अभिव्यक्ति इन्फ्लूएंजा पेप्टाइड्स 29 के जवाब में GzmAB जीन पीटा चूहों से उत्पन्न हत्यारा कोशिकाओं में आरटी पीसीआर द्वारा प्रदर्शन किया गया है, हम अन्य physiologically प्रासंगिक संदर्भ इस या किसी में सूचित किया गया होने GzmK प्रोटीज गतिविधि की जानकारी नहीं है। पुनः संयोजक मानव GzmH, या एन.के. कोशिकाओं से शुद्ध प्रोटीज, या तो की गतिविधि के साथ मूल्यांकन किया जा सकता सफलता-Phe-लियू-Phe-एस-Bzl 30 है, लेकिन यह विशेष रूप से इस granzyme में करने के लिए इस सब्सट्रेट की hydrolysis मानो करना संभव नहीं है सेल lysates। लिम्फोसाइटों ऐसे भी काइमोट्रिप्सिन की तरह (chymase) गतिविधि होगा जो cathepsins, के रूप में अन्य endolysosomal proteases की एक संख्या में होते हैं। माउस में, GzmH जीन जीन (Gzms सीएफ) समान (chymase) गतिविधि के लिए भविष्यवाणी की सभी के एक समूह द्वारा बदल दिया है।

मानव GzmB प्रभावी ढंग से इस प्रकार बोली BH3-केवल समर्थक apoptotic अणु फोड़ना, और पाया गया था हालांकि सीधे माइटोकॉन्ड्रियल संलग्नमौत मार्ग 31, जाहिरा तौर पर परस्पर विरोधी परिणामों शुरू में माउस GzmB के साथ प्राप्त किया गया। इस भ्रम, प्रोटिएजों 16 के समग्र अनुक्रम समरूपता के उच्च स्तर (~ 80%) के बावजूद, वरीय सब्सट्रेट मान्यता अनुक्रम माउस और मानव (और चूहा) GzmB के बीच मतभेद निर्धारित किया है कि जो जांचकर्ताओं की एक संख्या से सुरुचिपूर्ण अध्ययन के द्वारा हल किया गया था 17,23। मानव GzmB के लिए इष्टतम मान्यता अनुक्रम / वी, ई / एम / क्यू, पी / XAA मैं है (एस / टी) माउस GzmB के लिए यह है जबकि पी 1 की स्थिति में और डी एल / मैं / वी, ई, एफ / y / क्यू, डी 16,17। विशेष रूप से पी GzmB सब्सट्रेट बाध्यकारी फांक द्वारा समायोजित किया जा नहीं होगा माउस GzmB, इसलिए माउस बोली (IEPD 75) दरार साइट से सहन नहीं किया है के रूप में बड़ा फर्क है, P2 की स्थिति में था। इसके अलावा, सिंथेटिक पेप्टाइड substrates के नियमित GzmB के लिए विशिष्ट रूप में वर्णित IEPD-PNA, और IETD-PNA, खराब माउस GzmB द्वारा hydrolyzed कर रहे हैं। हम आगे दूसरों 23 का उपयोग कर रहे द्वारा की गई खोज समेकित हैcombinant मानव GzmB, लेकिन माउस एन.के. और सीटीएल hydrolyse IETD-PNA और IEPD-PNA में मौजूद GzmB नहीं कि granzymes। Kaiserman एट अल। 17 पुनः संयोजक मानव की दरार गतिविधि की तुलना में और माउस GRB एसी IETD-PNA substrates के साथ Boc-एएडी-SBzl का उपयोग कर, Pichia pastoris में उत्पादन किया। इसी तरह, लेखकों तुलनीय दक्षता, माउस GRB द्वारा एसी-IETD-PNA की hydrolysis के साथ Boc-एएडी-SBzl cleaved दोनों एंजाइमों, whilst कम कुशल 30 गुना था कि पाया। इस p2 स्थिति में टी और पी (और साथ ही एस) मानव GzmB द्वारा पसंद कर रहे हैं, whilst वे माउस GzmB सहन नहीं कर रहे हैं। इसके विपरीत करके, हम स्पष्ट रूप से और अधिक सामान्य Boc-एएडी-SBzl अभिकर्मक का उपयोग करते हुए मानव और माउस एन.के. सेल lysates दोनों में तुलना GzmB गतिविधि का प्रदर्शन किया। हालांकि, केवल मानव GzmB गतिविधि IEPD-PNA अभिकर्मक के साथ पाया जा सकता है।

एक साथ इन निष्कर्षों को विभिन्न प्रजातियों के GzmB के ठीक विशिष्टता के मतभेद का चयन करने पर एक प्रमुख प्रभाव हो सकता है कि इस तथ्य को उजागरइन विट्रो विश्लेषण के लिए एक उपयुक्त सब्सट्रेट। माउस, मानव या चूहा GzmB गतिविधि का पता लगाने की जांच की जाती है तो सारांश में,, BOC-एएडी-SBzl पसंद के सब्सट्रेट है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl SM Biochemicals LLC, CA SMSB05 Granzyme B substrate (mouse and human)
Ac-IEPD-pNA  SM Biochemicals LLC, CA SMPNA009 Granzyme B substrate (only human)
N-α-CBZ-L-lysine-S-Bzl Sigma-Aldrich C3647 Granzyme A substrate
Suc-Phe-Leu-Phe-S-Bzl SM Biochemicals LLC, CA SB025 Granzyme H substrate
5,5’-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid)  Sigma-Aldrich D8130 DTNB, Ellman’s Reagent
NK cell isolation kit II mouse Miltenyi Biotec GmbH 130-096-892 negative selection kit
NK cell isolation kit human Miltenyi Biotec GmbH 130-092-657 negative selection kit
Plate reader Biorad iMark Biorad Microplate Manager Software Version MPM6.3
Serocluster U-bottom vinyl 96-well plate Corning, MA, USA 2797

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References

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Boc-अला-अला-ASP-एस-Bzl की hydrolysis: एक वर्णमिति विशेष रूप से granzyme बी proteolytic गतिविधि उपाय है कि परख
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Hagn, M., Sutton, V. R., Trapani, J. A. A Colorimetric Assay that Specifically Measures Granzyme B Proteolytic Activity: Hydrolysis of Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl. J. Vis. Exp. (93), e52419, doi:10.3791/52419 (2014).More

Hagn, M., Sutton, V. R., Trapani, J. A. A Colorimetric Assay that Specifically Measures Granzyme B Proteolytic Activity: Hydrolysis of Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl. J. Vis. Exp. (93), e52419, doi:10.3791/52419 (2014).

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