Abstract
インフルエンザ感染は約36000人が死亡、米国では20万人以上の入院毎年と関連している。突然変異再類別による新しいインフルエンザウイルス株の連続的な出現は、ウイルスの制御を複雑にし、新規薬剤およびワクチンの永久的な開発を必要とする。インフルエンザの実験室ベースの研究では、ウイルスの増殖のための信頼性とコスト効果的な方法が必要です。ここで、総合的なプロトコルは、一貫して高い力価のウイルスストックをもたらす肥沃鶏卵におけるインフルエンザAウイルスの増殖のために提供される。 11日目 - 要するに、血清病原体フリー（SPF）ニワトリ受精卵を37℃、10 55〜60％の湿度でインキュベートする。この期間、胚発生を容易に卵キャンドラーを用いてモニターすることができる。ウイルス接種針を用いて、尿膜腔へのウイルスストックを注入することにより行われる。 37℃でのインキュベーションの2日後、卵は4℃で少なくとも4時間冷却した。気嚢と漿尿膜上卵殻を注意深く開かれ、ウイルスを含む尿膜液を採取する。流体は、遠心分離によってデブリからクリア等分し、長期保存のために-80°Cに転送される。大量（卵あたりウイルス液5-10）に溶解し、通常、このプロトコルを用いて達成される、高ウイルス力価は、ウイルス調製物のために大量に必要とするin vitro試験のために、特に我々の有利な方法は、卵の使用を行っているウイルスの同じウイルスストックの高用量が必要とされている。
Introduction
インフルエンザAは、ヒトの健康に対する大きな脅威であり続けている。これは、大規模なグローバルな負担が世界中で毎年150万の死亡までの原因と潜在的に壊滅的な呼吸器疾患である。インフルエンザウイルスは、オルトミクソウイルス科にあり、それらのゲノム1,2- 8ネガティブセンス一本鎖RNAを運ぶ。ウイルスゲノムの高い可変性（ すなわち 、抗原性「ドリフト」）は、長期的な免疫を防ぐことができます。また、インフルエンザは、抗ウイルス薬3にますます抵抗性がある。
2009年新型インフルエンザのパンデミックは、インフルエンザ疾患（パンデミック株、抗ウイルス耐性、遅延ワクチン製造）に関連するすべての困難な問題を強調した。ワクチン製剤は最も可能性の高い病原性インフルエンザ株4（H1N1、H3N2およびB型インフルエンザ用に1つずつ）のために世界保健機関が毎年決定 されます。この方法は、予測されたインフルエンザ株に基づいているのでsは、病原性株は時折間違って識別され、ワクチンの有効性は劇的に低下する。また、新型インフルエンザ株の出現はパンデミック病気2を引き起こすこれらの予防プログラムを回避することができます。
ユニバーサルインフルエンザワクチンの作成 は5とらえどころのないされている。そのため、研究は肺損傷の病因の理解に続けなければならない。施設研究室の研究のために、いくつかの方法は、ウイルスの単離および増殖6のために開発されている。ヒトインフルエンザウイルスは、哺乳動物細胞、種々の基材に増幅することができる。しかし、大量に発生する高力価のウイルスは、最高の孵化卵内で達成される。以下のプロトコルは、インフルエンザのために既存のウイルスストックからのウイルスの伝播とストレージを技術が記載されている。
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Protocol
注：総論：無菌条件下で卵の操作に関連するすべての手順を実行し、滅菌技術がそれに応じて使用する必要があります。使用前に70％エタノールを用いたプレクリーンなすべての機器。一般的には、インフルエンザウイルス接種および収穫はBSL-2の実験室で実施されるべきである。しかし、このプロトコルは、多くの病原性インフルエンザウイルス（ 例えば 、パンデミックおよびプレパンデミック株は、家禽および家畜への危険をもたらす菌株、高病原性鳥インフルエンザ株、1918 H1N1株）、高い生物学的安全性レベルを伝播するために使用された場合にいくつかのケースでは、バイオセキュリティの注意事項および権限が必要です。地元の機関バイオセーフティ委員会は、インフルエンザウイルスが関与するすべての研究を承認する必要があります。
接種のための卵の調製
- 適切なベンダーからの血清病原体フリー（SPF）たての受精卵鳥類の卵を入手します。一般的に、ニワトリの卵が使用されます。卵は私たちでなければなりません到着後すぐにエド。
- 定期的に卵を回転させる自動卵ターナー加湿卵のインキュベーターで到着地の卵時に。自動卵ターナーが使用できない場合は、手動で（手袋を着用し、できるだけ無菌のすべてを維持することを確認してください）は、少なくとも1日2〜3回卵を回転させる。
- 10〜11日間、37℃で55〜60％の湿度で卵をインキュベートする。
2.検卵
- インキュベーションの約7〜8日後にキャンドリングによって不妊のための卵を確認するために、暗い部屋で明るい光に対して卵を検査するために卵キャンドラーを使用してください。
- 70％エタノールで卵キャンドラーを拭きます。多くの場合、手袋を変更して病原体による汚染の危険性を最小限にするために70％エタノールで消毒する。
- インキュベーターから卵を取り出し、空の卵のカートンに配置します。
- 部屋の照明をオフにします。
- キャンドラーに対して一度に各卵1の大端を持ってください。
- 決定する際に、卵を守ってEそれは肥沃または不妊の場合は。
注：豆の形胚につながる細い血管がはっきりと見えるはずです。未受精卵は、目に見える卵黄の小さな血液スポットとして表示されます。
- 未受精卵である卵を破棄し、インキュベーターに実行可能な卵を返す。 30分以上のためのインキュベーターの外に卵を放置しないでください。卵の状態が確認できない場合は、それをマークし、後でそれを観察する。
ウイルス接種の調製
- 10 mMのHEPES（pHは7.4）を含有する滅菌PBS中で10 4 pfu / mlで-約10 3インフルエンザウイルスストックを希釈する。重要なステップ：使用直前にウイルスストックを希釈し、氷の上のすべての時間を希釈したウイルスを保つ。
尿膜経路を介し4.インフルエンザウイルス接種
- ウイルス接種（10日または11）の日には、再び卵をキャンドル、デッド胚を排除する。ライブ胚を区別する卵内部の動きを探して。
- インキュベーターから3卵を取り出し、気嚢を上にして別々のホルダーに卵を配置する。
- 永久的なマーカーで卵のエアスペースをマークします。
- 70％エタノールで空気層の上に卵の殻を洗ってください。
- 卵のカートンとバイオセーフティーフード（BSL-2）への空気のスペースを上にして卵を入れてください。
- 各卵の気嚢上の殻に小さな穴をパンチするために無菌の18G針を使用してください。胚または卵黄を刺し避けるためにあまりにも深く針を挿入しないように注意してください。
- 無菌の1mlシリンジに希釈したインフルエンザウイルスを策定し、22Gの針を取り付けます。
- 尿膜腔に45°の角度で針で注射器を慎重に進める。
- 希釈されたインフルエンザウイルスを0.2ml注入する。
- 他の二つの卵を注射を繰り返し、その後、注射器と針を捨てる。
- グルーガンから接着剤の滴（または溶融パラフィンワックス）で穴をシール。 B電子接着剤が卵の中に漏れないように注意してください。
- エアスペースを上に指摘して卵のインキュベーターに卵をバックに配置します。
- すべての卵が接種されてきたまでは4.12 - を繰り返して、4.2を繰り返します。
5.培養時間
- 37℃、〜60％の湿度で切らずに感染した卵をインキュベートする。
- インフルエンザウイルスの種類に応じて最適なインキュベーション時間を選択する。 48時間インフルエンザAをインキュベートする。 72時間インフルエンザBとCをインキュベートする。
6.インフルエンザウイルスの収穫
- インキュベーション期間の後、胚を死滅させ、血液に感染した尿膜液を汚染する危険性を低減するために、血管を収縮するために4時間（またはO / N）の最小4℃で卵を冷やす。収量が減少したウイルスを、吸収するから赤血球を防ぐためにこれを行います。 -20℃で30分間、あるいは、冷却卵。しかし、これは血液汚染のリスクを増大させる。
- 卵が十分に冷えたされた後に、バイオセーフティフードに卵を移す。気嚢が上を向くようにしてしっかりしたホルダーに卵を置きます。 70％エタノールで卵の表面を清掃してください。
- 気嚢の上に卵の殻を開くために、無菌のハサミを使用してください。漿尿膜を破壊しないように注意しながら気嚢の周りにシェルを削除します。
- 無菌の鈍鉗子で絨毛尿膜を開きます。そっと小さなへらやスプーンを持つ胚と卵黄嚢を脇に移動します。卵黄を破裂しないように注意してください。
- 1ミリリットルエッペンドルフピペットを用いて、慎重に尿膜液を集める。必要に応じて、できるだけ多くの液体を収集するためにビット側に卵を傾ける。
- 50ミリリットルプラスチック製コニカルチューブにすべての卵から尿膜液を組み合わせる。ウイルス収集中、常に氷上にチューブを保管してください。わずかに黄色がかった流体10mlの - One卵利回り5。
- 4で10分間千×gでウイルス含有尿膜液をスピン6; Cは破片をペレット化する。新しい50mlチューブに透明な流体を移送氷上に保持。 BSL-2廃棄物容器に卵を処分してください。
7.ストレージ
- すぐに明らかになっ尿膜液（ 例えば、50、100または500 ulのアリコート）をアリコートし、スナップ凍結し、液体窒素中。凍結されたウイルスストックの長期保存のために-80℃の冷凍庫に転送します。
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Representative Results
複数の方法は、インフルエンザウイルスを滴定するために開発されている。適切な方法を選択する一つの考慮事項は、他の人が実行可能なビリオンを評価する感染性、（ 例えば 、プラークアッセイ）6に基づいているのに対し、いくつかは関係なく実行可能性（ 例えば 、赤血球凝集素アッセイ）の合計粒子を決定することである。ここでは、マウス適合インフルエンザウイルス（A / PR / 8/34）を接種した鶏卵から採取した尿膜液のウイルス力価はプラークアッセイ（ 図1）及び赤血球凝集アッセイ（ 図2）により決定した。
インフルエンザウイルス感染は細胞の単層上に形成するプラークを生じる細胞変性効果（溶解した細胞の輪帯）を引き起こす。プラークを、クリスタルバイオレットで細胞を染色して可視化し、そして65プラークは、ウイルスの10 -12希釈（ 図1）とよく中で計数した。希釈されたウイルスストックの500 Lのwので、細胞上に置かれるように、最終力価は1.3×10 14 PFU / mlである。
赤血球凝集アッセイは、赤血球の表面に付着するウイルスの能力にインフルエンザウイルスの塩基を滴定するための方法である。ウイルス懸濁液は、この懸濁液から沈降することを防ぐ、赤血球を凝集させるであろう。 96ウェルプレート（V-または丸底のいずれか）におけるウイルスの連続希釈を使用して、赤血球を一定量添加することにより、ウイルス力価を決定することができる。 50μlの（ 図2）におけるウイルスの2 10倍希釈はっきり否定結果が1で観察された。したがって、最終力価は2.1×10 4 HAU / mlである。
図1.定量プラークアッセイによるPR8のウイルス力価の。MDCK細胞の単層が10倍セリアに感染したPR8 lの希釈液（10 -1 - 10 -12）で1時間、洗浄した後、0.6％アガロース溶液を重層。 72時間37℃でインキュベートした後、寒天を注意深く除去し、細胞を固定し、0.25％クリスタルバイオレットで染色した。プラーク形成は、感染していないコントロール（CTR）と比較した。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
価卵由来のPR8インフルエンザウイルスに対する図2赤血球凝集（HA）アッセイ。PR8ウイルスを連続PBSで2倍に希釈し、0.5％シチメンチョウ赤血球50リットルと混合した。希釈物を四連で調製し、そして写真をRTで1時間のインキュベーション後に採取した。陰性の結果が陽性の結果に対し、井戸の中央にドットとして表示されますうまく渡って均一な赤みを帯びた色を形成している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
インフルエンザは、疾患の大規模なグローバル負担が発生し、作業が肺損傷7の病因を理解することに継続する。この致命的な疾患で容易に研究し、種々の方法は、インフルエンザウイルス6を伝播するために開発されている。ここでは、鶏卵中でインフルエンザウイルスを製造する技術が記載されている。この方法の利点は、それが高度に再現可能であることであり、多くのインビトロ研究のために必要である高力価のインフルエンザウイルス株、大量になる。
ほとんどの研究室は、最小限の立ち上げ費用を迅速かつ簡単にこのプロトコルを開発することができるようになります。我々は自動ターナーと卵のインキュベーターに投資をお勧めしますが、このプロトコルは、そのような装置なしで完了することができますが、より面倒になります。我々はまた、卵の一貫性と無菌性を保証するために受精卵の購入のための商業研究のベンダーを使用することをお勧めします。 Laboratのオフィス実験動物の愛護管理と使用上の公衆衛生局（PHS）政策のORY動物福祉（OLAW）解釈はPHSポリシーは孵化後にのみ適用され、ライブ孵化鳥類の卵の研究用述べている。そのため、ほとんどの機関は、このプロトコルのための動物実験委員会の承認を必要としません。しかし、政策は機関によって異なり、制度バイオセーフティ委員会の承認は、このプロトコルを開始する前に必要となります。
ウイルスを使用する場合は、それが感染した発育卵から尿膜液を収穫した後、4℃でウイルスを維持するために最も重要です。各卵の尿膜腔液5〜10mlの間で生じることが予想、及び力価は、インフルエンザウイルスの株に依存している。私たちの研究室では、日常的にマウス適合新型インフルエンザ株（A / PR / 8/34）を伝播するためにこのメソッドを使用しています。このプロトコルは、臨床サンプルにも使用することができるが、このような状況において、羊水の接種に起因pは好ましいかもしれない羊水ライニング8,9内結合のために必要とされる2,6結合シアル酸のresence。別の考慮事項は、この方法による胚の病原性に伝播鳥インフルエンザウイルス（ 例えば 、H5N1株）のために理想的ではないかもしれないということである。
インフルエンザウイルスを滴定する種々の方法は、それぞれの長所と短所を持っている全てが開発されてきた。実際、ウイルスの定量は、タンパク質ベース（ 例えば 、赤血球凝集素アッセイ、ELISA）、核酸に基づく（ 例えば 、定量PCR）、または機能的（ 例えば 、ウイルスプラークアッセイ）6であることができる。非機能アッセイは関係なく、彼らが生きているか死んでウイルス粒子された場合の合計ウイルス力価を決定します。したがって、インフルエンザウイルスの感染活動のためのテストは、生きたウイルスを測定し、ロット間で比較可能な機能的同等性を可能にします。プラーク形成アッセイは、生インフルエンザVIRの力価を評価することができる一般的に使用されるアッセイである私たちが、10を実行するのに時間がかかり、面倒なことができます。比較では、赤血球凝集素アッセイはシンプルで簡単ですが、生存率を評価し、すべてのインフルエンザ粒子を決定していません。
ここで、我々は、高い力価のインフルエンザウイルスを増殖させるために、比較的簡単な方法を提供する。実験室では、このプロトコルのデノボ開始が簡単であり、そして出発物質および装置は、比較的安価である。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Cellgro | 21-040-CV | |
| serum pathogen-free (SPF) fertilized chicken eggs | VALO BioMedia | ||
| humidified egg incubator | FARM iNNOVATORS | Model 2100 | |
| automatic egg turner | FARM iNNOVATORS | Model 3200 | |
| egg candler | FARM iNNOVATORS | Model 3300 | |
| 1 ml syringe | BD Bioscience | 309659 | |
| 18G needle | BD Bioscience | 305196 | |
| 20G / 22G needle | BD Bioscience | 305176 / 305156 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Ethanol>99.5% | Sigma-Aldrich | 459844 | diluted to 70% using water |
| glue gun "Ad tech Hi Temp Project Pro" | Ad tech, Adhesive Technologies, Inc. | Model 1105 | |
| glue "Ad tech MINI SIZE, Multi Temp" | Ad tech, Adhesive Technologies, Inc. | 220-34ZIP30 | |
| MDCK cells | ATCC | CRL-2935 | |
| Washed Pooled Turkey Red Blood Cells, 10% | Lampire Biological Laboratories | 724908 |
References
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